Introduction of Gel Electrophoresis

1 คำนำ การปฏบิ ตั ิงานในหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทางการแพทยแ์ ต่ละคร้ัง สง่ิ ทผ่ี ู้ปฏิบัตงิ านไม่อยาก ให้เกดิ ข้ึน น้ันคือ “ปญั หา” ไมว่ ่าจะเป็นปญั หาในระหวา่ งการทางาน หรอื ปญั หาท่ีทาออก มาแลว้ ผลปฏิบัตงิ านไมด่ ี เมอื่ เจอปญั หาเราต้องหาสาเหตขุ องปัญหานน้ั ๆ ซ่ึงแต่ละคนจะใช้ เวลาในการแก้ไขปญั หาชา้ หรือเร็ว แตกต่างกนั ออกไป ขนึ้ อยู่กบั ประสบการณก์ ารทางาน ในระหวา่ งทแ่ี ก้ไขปญั หานน้ั ทาให้เราสญู เสยี ทง้ั วัสดุ อุปกรณ์ เวลา รวมถงึ แรงงาน และที่ แยไ่ ปกว่านนั้ คือ หากเราไม่สามารถแกไ้ ขปญั หาเหลา่ น้ันได้ ปัญหาเหล่านนั้ ก็จะนามาซึ่ง ความทอ้ แท้ สญู เสียกาลังใจ ความม่นั ใจในการทางาน เทคนคิ Gel electrophoresis เปน็ เทคนิคหนง่ึ ท่ผี ู้ปฏบิ ตั ิงานสว่ นใหญพ่ บเจอปัญหา ในรูปแบบทีแ่ ตกตา่ งกนั ออกไป แม้เทคนคิ น้มี ขี นั้ ตอนไมย่ ุ่งยากซับซ้อน แตใ่ นแต่ละข้ันตอน นน้ั เมือ่ เราลงมอื ปฏบิ ตั แิ ลว้ จะพบวา่ มีหลายๆจดุ ท่เี ป็น Critical point ของขนั้ ตอน ซึง่ เรา ต้องหาวธิ ี เพ่อื ลดหรอื แก้ไขปัญหา ท่อี าจเกิดขน้ึ ในแตล่ ะขน้ั ตอนออกไป เช่น ในขน้ั ตอนการ เตรียมเจล เจลหลอมละลายดแี ล้วหรอื ไม่ เทเจลอย่างไรให้ผิวหน้าเจลเรียบ ไม่เป็นคลนื่ ไม่ เป็นฟองอากาศ หรือการดงึ หวีขึ้นจากเจลไมใ่ ห้เจลฉกี ขาด เป็นตน้ นอกจากนี้สารเคมบี าง ชนิดยงั ก่อให้เกดิ อนั ตรายต่อผูป้ ฏิบตั งิ าน ซงึ่ ผปู้ ฏิบัติงานจาเปน็ ต้องรู้ถึงระดับความอันตราย ของสารแตล่ ะชนิดที่ใช้ รวมถงึ ข้อควรระวัง เพื่อป้องกันอนั ตรายแกต่ นเอง และผู้อืน่ ค่มู ือ “เทคนิคพิชติ Gel electrophoresis” #ฉบับเด็กใหม่ เล่มน้ี จดั ทาขึ้นเพอ่ื ช่วย ชแ้ี นวทางแกไ้ ขปัญหาทีจ่ ะเกดิ ขน้ึ ในแต่ละขั้นตอนของการทา Gel electrophoresis ซ่ึงได้ รวบรวมปญั หา และแนวทางการแกไ้ ขปญั หา จากประสบการณข์ องผปู้ ฏิบัติงานจริง ท่ีได้ ประสบกับปัญหาเหล่านน้ั แลว้ ไดร้ บั คาแนะนาจากพ่ีๆนกั วิจัยจนสามารถแก้ไขปญั หาทตี่ า่ งๆ ท่ีเกดิ ขึน้ ได้ ทางคณะผู้จดั ทาหวงั เป็นอยา่ งย่งิ วา่ ค่มู ือ “เทคนคิ พชิ ิต Gel electrophoresis” #ฉบับเด็กใหม่ เลม่ น้ี จะให้ความรู้ และเปน็ ประโยชน์ตอ่ ผทู้ เ่ี ข้ามาปฏิบตั ิงานใหม่ หรอื ผู้ท่ี ต้องปฏิบตั งิ านโดยใชเ้ ทคนิค Gel electrophoresis ไดท้ าการศึกษาวธิ กี าร และเมอ่ื พบเจอ ปัญหาสามารถใชค้ ่มู อื เลม่ นแ้ี ก้ไขปญั หาทพี่ บได้ เพอ่ื ให้ไดผ้ ลการปฏบิ ตั งิ านตรงตามเปา้ หมาย สงู สดุ คณะผจู้ ดั ทา

2 บทนำ Introduction of Gel Electrophoresis เมื่อนักวิทยาศาสตรส์ ามารถโคลนดเี อน็ เอ หรอื แยกดเี อน็ เอตา่ งๆได้แลว้ มีคาถามท่ตี ามมา คือ - DNA ทไี่ ดน้ ัน้ คอื อะไร? - ประกอบด้วยลาดับนวิ คลีโอไทดอ์ ะไรบา้ ง? เราจะตอบคาถามเหล่านี้ได้ ต้องมีการวิเคราะห์ดีเอ็นเอ (DNA analysis) ซ่ึงการ วิเคราะห์นีต้ อ้ งอาศัยความรพู้ ้นื ฐานการแยกโมเลกุลของดีเอ็นเอท่มี ปี ระจุ และรปู รา่ งแตกตา่ ง กันออกจากกันในสนามไฟฟ้าผ่านตัวกลาง เรียกวิธีนี้ว่า เจลอิเลกโทรโฟริซิส (Gel electrophoresis) รปู ท่ี 1. เครอื่ งแยกดีเอ็นเอดว้ ยกระแสไฟฟา้ (Gel electrophoresis) (ท่ีมา: http://www.yourgenome.org/facts/what-is-gel-electrophoresi

2 Arne Tiselius Arne Wilhelm Kaurin Tiselius หรือ Arne Tiselius นกั วทิ ยาศาสตรช์ าวสวีเดน ผู้ คดิ คน้ เทคนิค electrophoresis ข้ึน ในปี ค.ศ.1930 โดยการแยกโปรตีนจากซีรัม ได้สรา้ ง อปุ กรณ์พเิ ศษซึง่ มีลกั ษณะเปน็ รปู ตวั ยู (U- shaped cell) ทส่ี ามารถตอ่ เข้ากับเครื่องกาเนดิ ไฟฟ้า ทาใหเ้ ขาสามารถแยก และวเิ คราะห์โปรตนี ตา่ งๆจากซีรมั ได้ ทาให้เขาไดร้ ับรางวัลโนเบล ในปี ค.ศ.1948 เทคนคิ electrophoresis เปน็ ทน่ี ยิ มกันอยา่ งแพร่หลายในเวลาตอ่ มา และไดด้ ดั แปลง ให้มคี วามเหมาะสม กับคณุ สมบตั ิของสารที่ต้องการแยกและวิเคราะห์

3 Gel Electrophoresis คือ เทคนิคท่ีใช้แยกสารพวกโปรตีน กรดนิวคลีอิค หรือ macromolecule โดยอาศัย หลกั การเคลือ่ นทข่ี องสารบนเจลภายใตส้ นามไฟฟ้า กำรจำแนกชนิดของอิเลกโทรโฟรรซิ สี 1. กำรรันเจลในแนวต้งั (Vertical gel electrophoresis) นิยมใชแ้ ยกโปรตีน และดีเอ็นเอขนาดเลก็ รูปที่ 2. ลักษณะการ run gel ในแนวตงั้ (Vertical gel electrophoresis) (ที่มา: http://www.coloss.org/beebook/I/physiology/1/3/2) 2. กำรรันเจลในแนวนอน (Horizontal gel electrophoresis) นิยมใชใ้ นการแยกดีเอ็นเอ และอารเ์ อ็นเอ รปู ท่ี 3. ลักษณะการ run gel ในแนวนอน (Horizontal gel electrophoresis) (ท่มี า: http://www.stinciclab.com/gel/) “เทคนคิ Horizontal Gel Electrophoresis ใชก้ ันมากในศนู ย์ CBMB ซึง่ เราอธิบายเทคนิคนี้ให้เขา้ ใจมากขึน้ ในค่มู อื เลม่ นี้”

4 ชนดิ ของเจล มี 2 ชนดิ คือ 1. Agarose gel โดยท่วั ไปการแยกโมเลกุลของดีเอ็นเอจะใช้ Agarose gel เปน็ ส่วนใหญ่ เพราะ มีช่วงท่ีใช้ได้มากกว่า การเตรียมทาได้ง่าย และไม่มีอันตรายเมื่อเทียบกับ Polyacrylamide รปู ที่ 4. โครงสร้างของ Agarose (ที่มา: https://en.wikipedia.org/wiki/Agarose) 2. Polyacrylamide gel เป็นโมเลกุลท่ีสังเคราะห์ขึ้นทางเคมี จึงมีความสม่าเสมอควบคุมได้ ไม่ ทาปฏิกิริยากับสารเคมีใด มีความใส มีความคงตัวของ pH อุณหภูมิ และมี ionic strength กว้าง สามารถปรับขนาดของช่องในโพลีเมอร์ ได้ จงึ เหมาะสาหรับเปน็ ตวั กลางในการแยกโมเลกุลของโปรตนี และดี เอ็นเอ รูปที่ 5. โครงสรา้ งของ Polyacrylamide (ทม่ี า: https://en.wikipedia.org/wiki/Polyacrylamide)

5 อุปกรณ์ปอ้ งกนั สว่ นบุคคล (Personal Protective Equipment, PPE) เป็นสงิ่ ทสี่ าคญั สาหรบั ป้องกนั ผู้สวมใสจ่ ากอันตรายที่ เกดิ จากการปฏบิ ัติการ พงึ ระลึกเสมอว่าอุปกรณ์เหล่านี้ ไม่ได้ช่วยลด หรอื กาจดั ความเป็นอันตรายของสารเคมีแต่ อยา่ งใดเพียงแคท่ าหนา้ ทปี่ ้องกนั ผู้สวมใส่เทา่ น้ัน Hair net Protection Eye Protection Respiratory Protection Protective Clothing Protective Gloves Foot Protection

อปุ กรณ์ 6 Equipment 9 1 10 11 2 12 45 6 3 78 16 14 15 13 17 1 = Microwave 9 = Power supply 2 = Waste tank 10 = Gel Casting Stand 3 = Pipette tip 11 = Gel Tray 4 = Flask 12 = Comb 5 = Bottle 13 = Rack 6 = Cylinder 14 = Parafilm 7 = Centrifuge 15 = Micropipette 8 = Gel box 16 = Precision balance 17 = Gel documentation

7 กำรเตรยี มเจล (Casting of Gel) Tips&Tricks ชง่ั อะกำโรสบนกระดำษช่ังสำร ถำ้ ชงั่ อะกำโรสเกนิ ??? ตำมปรมิ ำตรทตี่ ้องกำรเตรยี ม เทลงในขวดดแู รน จะทำกำรคำนวณแลว้ หรือฟลำสก์ เตรยี มทง้ั หมดทช่ี ัง่ ได้ เช่น ตอ้ งกำร 2 g. แลว้ เติมบฟั เฟอรล์ งไป ผสมใหเ้ ข้ำกนั แต่ชัง่ จรงิ ได้ 2.2 g. ก็จะเตรยี ม 2.2 g. เลย กำรเตรยี มเจล หรือตกั ส่วนเกนิ นัน้ ท้งิ เจลแผน่ ใหญ่ จะใช้ 30 mL/tray จะไม่ตกั คนื ในขวดเดมิ ดังน้นั ตอ้ งคอ่ ยๆตกั (เตรียมเผอ่ื เป็น 35 mL) ออกมำทีละนิดเพ่อื ไมใ่ ห้ เจลแผน่ เลก็ จะใช้ 15 mL/tray นำ้ หนักเกนิ (เตรยี มเผือ่ เปน็ 20 mL) ถ้ำเทบัฟเฟอรเ์ กนิ ??? เทคนื ในขวดเดิมได้ Ex. เตรยี มเจลแผ่นใหญ่ 1% agarose ใน TBE buffer ปรมิ ำตร 35 ml จะตอ้ งชั่ง agarose = 35 ml × 1 100 = 0.35 g หรือ 35 mg

8 Tips&Tricks นำสำรละลำยเจลไปตม้ ในไมโครเวฟ ต้มสำรละลำยเจลใหใ้ ส ที่ไฟปำนกลำง (300 วัตต)์ ไม่มีเมด็ วนุ้ จนสำรละลำยใส ไมม่ เี มด็ วุ้น ตอ้ งคลำยเกลยี วฝำขวด ***ตอ้ งคลำยเกลียวฝำขวดทุกคร้ัง*** กอ่ นนำเขำ้ ไมโครเวฟ ***กอ่ นนำเข้ำไปตม้ ในไมโครเวฟ*** เพ่อื ปลอ่ ยแรงดันภำยในขวดออกมำ มฉิ ะนัน้ ขวดอำจจะ.....ระเบดิ ไดจ้ ้ำ... ระหวำ่ งที่หลอมละลำยในไมโครเวฟ สำมำรถหยุดเป็นระยะๆ แล้วนำขวดออกมำแกวง่ เพื่อใหส้ ำรละลำยเข้ำกนั ไดด้ ีมำกข้ึน จำกน้นั นำกลบั เขำ้ ไปละลำยต่อจนสำรละลำยใส

9 อุณหภมู ิของเจล ก่อนจะเทลงในถำดเจล ควรอยู่ทป่ี ระมำณ 55-60°C หรอื พอท่ีมือเรำสำมำรถจับได้ Tips&Tricks ขณะเทเจลใหส้ งั เกตว่ำมี ฟองอำกำศเกดิ ขน้ึ หรอื ไม่ ??? ถ้ำมีฟองอำกำศ ให้รบี ใชป้ ลำยทปิ จม้ิ ฟองใหแ้ ตกขณะเจล ยังรอ้ นอยู่ เทเจลท่เี ตรียมไว้อย่ำงชำ้ ๆ ลงในถำดเจลที่ เตรียมไว้ ค่อยๆใหเ้ จลไหลไปท่ัวถำด แล้วต้งั ทิ้งไว้ท่ี อุณหภูมหิ ้อง นำนประมำณ 20-30 นำที หรือ จนกวำ่ เจลจะแข็งตวั

10 ขั้นตอนกำรโหลดตัวอยำ่ ง (Loading of sample) Tips&Tricks ดงึ หวีออกจำกเจลขน้ึ ตรงๆ คอ่ ยๆ ไมใ่ หเ้ จลขำด หำกดึงหวีออกแลว้ เจลขำด ?? นำเจลไปตม้ แลว้ นำ กลบั มำใช้ใหมไ่ ด้ ในขณะดงึ หวีแล้วรู้สึกว่ำแนน่ กลัวเจลขำด?? สำมำรถเทบฟั เฟอร์ ลงไปบนเจล เพอ่ื ใหด้ งึ หวีง่ำยข้นึ นำเจลวำงลงบนบล็อกรนั เจล โดยให้ส่วนทใ่ี สต่ วั อยำ่ ง อยทู่ ำงขว้ั ลบจำกนน้ั เทบฟั เฟอรใ์ หท้ ว่ มเจลข้ึนมำเล็กนอ้ ย

นำตัวอยำ่ งทตี่ อ้ งกำรรนั เจล 11 มำปั่นผสมเพอื่ ให้ตวั อยำ่ งผสมเข้ำกันดี และนำไป ป่ันตกอกี ครัง้ เพอ่ื ไมใ่ ห้มตี ัวอย่ำงเหลอื ตดิ ขำ้ งหลอด Tips&Tricks ควรหยด loading dye ให้ มรี ะยะห่ำง เพอื่ ไม่ใหม้ พี นื้ ท่ี ในกำรผสมกับตัวอย่ำง ขณะดดู ผสม loading dye กบั ตัวอย่ำง ให้ปเิ ปตขนึ้ ลง อยำ่ งช้ำๆ ระวงั ไมใ่ หเ้ กิด ฟอง ผสม loading dye ทีห่ ยดไวบ้ นพำรำฟิลม์ กบั ตวั อยำ่ งใหเ้ ข้ำกนั

12 ปลอ่ ยตวั วอยำ่ งลงในหลมุ เจลแตล่ ะหลุมทเ่ี ตรียมไว้ Tips&Tricks √ มือสนั่ อำจทำใหต้ วั อย่ำงไม่ ลงหลุมเกดิ กำรฟงุ้ กระจำย กำรโหลดตัวอยำ่ ง ของตวั อยำ่ ง คอ่ ยๆปลอ่ ยตวั อย่ำง ลงในหลมุ อยำ่ งช้ำๆ เพือ่ ไมใ่ หม้ ีกำรฟุง้ กระจำยของตวั อย่ำง สำมำรถใช้มืออกี ข้ำง จะทำให้เสยี ตัวอย่ำงนน้ั ไป ไม่มผี ลของตวั อยำ่ งนน้ั ประคองปเิ ปตใหน้ ง่ิ หรือผลทไ่ี ดไ้ ม่สมบูรณ์ และไมค่ วรใสป่ ลำยทิป ลงในหลมุ ลกึ จนเกนิ ไป เพรำะจะทำใหเ้ จลขำด หำ้ มปลอ่ ยตัวอยำ่ ง ถ้ำปลำยทิปยงั ไมเ่ ขำ้ ไปใน หลุม เพรำะจะทำให้ ตัวอยำ่ งฟ้งุ กระจำยไปใน บฟั เฟอร์

13 กำรรนั เจล (Gel Electrophoresis) เมือ่ ใส่ตวั อยำ่ งครบทุกหลมุ แลว้ ก็กดปมุ่ สตำรท์ ได้! Tips&Tricks Let’s go!! เสยี บขัว้ ไฟฟำ้ ใหต้ รงตำมข้ัว ขัว้ สดี ำตอ่ เข้ำกบั ช่องสดี ำ ควำมต่ำงศกั ยไ์ ฟฟ้ำทีใ่ ชแ้ ยกขนำดดเี อน็ เอคือ 100 V ขวั้ สแี ดงต่อเข้ำกบั ข้วั สีแดง เวลำท่ใี ชใ้ นกำรเคล่อื นตวั ของดีเอ็นเอข้นึ อยกู่ บั เปอร์เซ็นตเ์ จล แต่จะใชเ้ วลำโดยประมำณ 40-45 นำที ดเี อน็ เอจะเคลื่อนทจี่ ำกขวั้ ลบไปยังขว้ั บวก(บนลงล่ำง) ต๊กิ ตอก ติ๊กตอก ติ๊กตอก !! หำกเสียบข้วั ไฟฟ้ำสลับกนั จะทำใหด้ เี อน็ เอเคลื่อนทไี่ ป ดำ้ นบนจนตกเจล ทำใหไ้ มส่ ำมำรถอ่ำนผลได้ สังเกตวำ่ มีกำรเคลอ่ื นทข่ี องดเี อ็นเอหรือไม!่ ! โดยดจู ำกสขี อง loading dye วำ่ มีกำรเคลือ่ นทหี่ รือไม!่ ! เม่อื ดีเอ็นเอเคลอ่ื นที่ มำถงึ บรเิ วณท่ตี ้องกำรแลว้ ใหก้ ด “หยดุ ” ทีเ่ พำเวอรซ์ พั พลำย ระวงั อยำ่ ใหด้ เี อ็นเอตกเจลนะจ๊ะ!!

14 กำรย้อมและกำรถำ่ ยภำพเจล (Staining and visualization) กำรยอ้ มเจลส่วนใหญ่จะใชส้ ำรละลำยเอธิเดียมโบรไมด์ (Ethidium bromide, EtBr) ซ่งึ เมอ่ื นำเจลไปแชใ่ นสำรละลำย EtBr แลว้ นำไปส่องดว้ ยแสง UV จะเหน็ แถบ DNA ขนำดตำ่ งๆ เพรำะ EtBr ท่ีจบั กบั DNA จะเรืองแสง ทำใหม้ องเหน็ ไดช้ ดั เจน รูปโครงสรำ้ งของเอธิเดยี มโบรไมด์ (ทีม่ ำ: https://www.slideshare.net/MetheeSri/mutation-and-dna-repair) EtBr มผี ลกระทบต่อสขุ ภำพ ในระยะสน้ั คอื สำมำรถซมึ เขำทำงผวิ หนัง และเกดิ กำรระคำยเคอื งตอผิวหนงั ตำ ปำก รวมถงึ ระบบทำงเดินหำยใจสวนบน ในระยะยำว เปน็ สำรทที่ ำใหเกิดกำรกลำยพันธ(ุ mutagen)ทร่ี นุ แรง และเปนสำรกอมะเร็ง ดงั น้ันตอ้ งระมดั ระวงั กำรสมั ผสั กบั EtBr โดยตรง ตองสวมใสอปุ กรณปองกนั อันตรำย สว่ นบคุ คล ไดแก เส้อื กำวน์ รองเทำปดเทำ แวนตำนริ ภยั ถุงมือ nitrile หรือถุงมือพลำสติก ไมควรใชถงุ มอื ยำงธรรมดำ ถำสมั ผสั EtBr ควำมเขมขนสูงนำนๆ จะตองสวมถุงมือสองชัน้ เม่ือ ปฏบิ ัติงำนเสร็จแลวใหถอดถุงมือออกกอนจำกนนั้ จึงลำงมอื ใหสะอำด

15 Tips&Tricks ดันเจลออกจำกถำดรองเจล ขณะเทแผ่นเจลลง แชเ่ จลลงในสำรละลำย EtBr นำน 2 นำที กลอ่ งสำรละลำย EtBr ตอ้ งระวังไม่ให้ ถำดรองเจล สัมผัส กับสำรละลำย EtBr ขณะท่กี ำลงั ย้อมเจล สำมำรถเอียงกลอ่ ง สำรละลำย EtBr ไปมำ เพอ่ื ให้ EtBr ตดิ กบั ดเี อน็ เอที่อยูภ่ ำยในเจลได้ อยำ่ งท่วั ถงึ กำรเตรียม Working Ethidium bromide ปิเปต EtBr ปรมิ ำตร 30 ไมโครลติ ร ลงในน้ำกล่ันปริมำตร 100 มิลลิลติ ร ทอี่ ยใู่ นกลอ่ งพลำสติกซงึ่ ห่อดว้ ยอลูมเิ นยี มฟอยลอ์ ย่ำงมดิ ชิด เพ่อื ป้องกนั แสง ** ระวังอย่ำให้มีกำรปนเป้ือนของ EtBr ในบริเวณทเี่ ตรียม **

เม่ือครบเวลำแลว้ !!... 16 Tips&Tricks EtBr เป็นสำรกอ่ มะเรง็ ตอ้ งมคี วำมระมัดระวังเปน็ อยำ่ งสงู ดังนั้นอปุ กรณ์ทใี่ ชก้ บั EtBr ต้องวำงในพนื้ ท่ี สีแดงเท่ำนนั้ !!!! ใชท้ พั พตี กั เจลแช่ลงในกล่องนำ้ กลนั่ เพอ่ื ล้ำง EtBr ส่วนเกนิ ที่อยใู่ นเจลออก และทำใหแ้ ถบดเี อ็นเอมีควำมคมชดั มำกขน้ึ กำรกำจดั สำรละลำย EtBr ทใี่ ชแ้ ลว้ !!! เทสำรละลำย EtBr ท่ีใช้แลว้ ใส่ในฟลำสกข์ นำด 2 ลติ ร ทม่ี ถี งุ ถำ่ นชำโคลจำนวน 2 ถุง ทง้ิ ไว้อย่ำงน้อย 1 คนื แล้วนำไปกรองผำ่ นกระดำษกรองเบอร์ 3 จำกน้ันเทสว่ นท่ผี ำ่ นกระดำษกรองท้งิ โดยเปิดนำ้ ตำมปรมิ ำณมำกๆ

17 เมอ่ื ลำ้ งเจลเสร็จแลว้ ………… นำเจลไปถำ่ ยรูปโดยใชเ้ ครือ่ ง Gel Doc (รูปท่ี 6) และใชโ้ ปรแกรม Gene snap (รปู ท่ี 7) รูปท่ี 6 เครื่อง Gel Doc รูปที่ 7 โปรแกรม Gene snap

18 ขั้นตอนกำรใชโ้ ปรแกรม Gene snap ปมุ่ ถำ่ ยภำพ 1. เปิดโปรแกรม Gene snap จำกนั้นกดปมุ่ สเี ขยี วเพือ่ เริม่ กำรถำ่ ยภำพ 2. เม่อื กดป่มุ สเี ขยี วจะปรำกฏหนำ้ จอดังภำพ จำกนนั้ นำอะกำโรสเจลทแ่ี ช่ EtBr เสรจ็ แลว้ ไปวำง ในเครอื่ ง Gel doc

19 ปุ่มถ่ำยภำพ ปุ่มเพิม่ /ลดขนำดของภำพ ปมุ่ ปรับเพม่ิ /ลดควำมคมชดั ปมุ่ ปรบั เพ่มิ /ลดแสง 3. หลังจำกนั้นหนำ้ จอจะปรำกฏ band ของ DNA ขึน้ สำมำรถปรบั ควำมคมชดั ขนำด และ ควำมสว่ำงของภำพได้ตำมควำมเหมำะสม >>> กดป่มุ ถำ่ ยภำพ ปุ่มตดั ภำพ ปมุ่ ปรับแสง ปุ่ม Crop ภำพ ปมุ่ ปรับเพมิ่ ลดควำมเขม้ ของพืน้ หลงั ภำพ ปุ่มปรับควำมเข้มของภำพ ปุ่มเปลีย่ นพื้นหลงั ขำว/ดำ 4. เมอื่ ถำ่ ยภำพแลว้ สำมำรถตัดภำพ ปรบั เปล่ียนสพี นื้ หลังให้เป็นขำว/ดำ ควำมเขม้ ของพืน้ หลงั ภำพได้ตำมท่ตี อ้ งกำร

20 บนั ทึกภำพ 5 5. ทำกำรบนั ทกึ ภำพทถี่ ่ำย เลือก File >>>>> Save Image As… กดบนั ทึก ใส่ช่ือภำพ 6. เลือก Folder ท่ตี อ้ งกำรจัดเก็บไฟล์ภำพ >>> ใส่ช่อื ทบี่ นั ทกึ ตำมตอ้ งกำร >>> กด Save

21 Print ภำพ 7. กดปรน้ิ รูปภำพ ตัวอยำ่ ง รปู gel ท่ีปริน้ ออกมำในกระดำษ

22 Do You Know? รู้หรอื ไม่ !! ปจั จัยทมี่ ีผลต่อการเคลื่อนท่ขี อง DNA 1. ขนำดของโมเลกุล 2. รปู แบบของ DNA DNA ขนาดเลก็ เคลือ่ นที่ได้ Supercoil linear open circular เร็วกว่ำ DNA ท่ีมขี นานดใหญ่ เคลือ่ นที่ได้ไกล ใกล้ 3. Buffer TAE TPE 4. ควำมต่ำงศักย์ (Tris acetate-EDTA) (Tris phosohate-EDTA) (Voltage) TBE -ไม่เกิดปฏิกริ ยิ ากบั -แยก DNA เรว็ (Tris borate-EDTA) agarose gel ถ้าเพ่มิ ความต่างศกั ย์ไฟฟา้ DNA -แยก DNA ขนาดเลก็ -เกดิ ความร้อนสะสม จะเคลอื่ นทไ่ี ดเ้ รว็ -แบนเล็ก คมชดั นอ้ ย -ยบั ยง้ั จุลินทรีย์ ความตา่ งศกั ย์ไฟฟา้ -ใชซ้ ้าแค่ 1-2 ครงั้ -ตกตะกอนกับ Ethanol สงู DNA เคล่อื นที่เร็ว แต่จะ ข้อเสยี -contaminate งา่ ย แยกขนาดได้ไมด่ ี -เกดิ ปฏกิ ริ ยิ ากับ ต่า DNA เคลอ่ื นทชี่ า้ แยก agarose gel ขนาดดี แต่แถบ DNA ไมค่ มชดั -ความเขม้ ข้นสงู จะตก เพราะเกดิ การแพร่ของ DNA ผลกึ ทวั่ ไปใช้ความต่างศกั ย์ 1-5 5. PERCENTAGE OF AGAROSE GEL โวลต์/เซนติเมตร Percentage of agarose gel Efficient range of separation 0.3% 5 kb – 60 kb 0.6% 1 kb – 20 kb 0.7% 0.9% 800 bp – 10 kb 1.2% 500 bp – 7 kb 1.5% 400 bp – 6 kb 2.0% 200 bp – 3 kb 100 bp – 1.2 kb

23 แบบทดสอบ 1. ตอ้ งกำรเตรียม 2%อะกำโรสเจล ปรมิ ำตร 50 ml. เมอ่ื หลอมละลำยในไมโครเวฟแลว้ เทลง cylinder พบวำ่ ปริมำตรมีไมถ่ งึ 50 ml เรำควรปอ้ งกันกำรเกดิ ปัญหำนอี้ ย่ำงไรจงึ จะถกู ต้อง ที่สดุ ก. ใช้เจลเท่ำปรมิ ำตรทมี่ ีอยู่ แลว้ เทลงใน tray ข. เติม buffer ลงไปใหถ้ ึง 50 ml. แลว้ เทลงใน tray ค. เททิ้ง แล้วเตรียมใหม่ ง. ควรเตรยี มเผ่อื เปน็ 55-60 ml. เม่ือหลอมละลำยแล้ว เทลงใน cylinder 50 ml แลว้ เทลงใน tray 2. TAE Buffer สำมำรถใชซ้ ำ้ ได้กคี่ รง้ั ก. 1 ครง้ั ข. 10 คร้งั ค. ใชซ้ ้ำไมไ่ ด้ ง. ใช้จนกว่ำบฟั เฟอร์เปลีย่ นเปน็ สี 3. หำกดงึ หวีออกจำกเจลแลว้ เจลเกดิ ฉีกขำด ควรแก้ไขอยำ่ งไร ก. เอำเจลทิ้ง ข. นำเจลไปหลอมละลำย แล้วนำมำเตรยี มใหม่ ค. ใช้เจลเดมิ ในกำร run gel ไดไ้ ม่มีปญั หำ ง. ผิดทุกขอ้ 4. ขอ้ ใดถูกตอ้ ง ก. ดีเอน็ เอขนำดเลก็ เคลือ่ นท่เี ร็วกว่ำดีเอน็ เอขนำดใหญ่ ข. ดีเอ็นเอขนำดใหญ่เคลื่อนท่เี ร็วกว่ำดเี อ็นเอขนำดเล็ก ค. ดเี อน็ เอทกุ ขนำดใช้เวลำในกำรเคลอ่ื นทเี่ ทำ่ กนั ง. ผิดทกุ ขอ้ 5. ข้อใดไมใ่ ชโ่ มเลกลุ ทใี่ ชแ้ ยกดว้ ยวิธี Gel Electrophoresis ก. กรดอะมโิ น ข. กรอนิวคลอี ิก ค. ดเี อน็ เอ ง. ผดิ ทกุ ข้อ

24 6. เม่อื นำเจลไปถำ่ ยรปู แลว้ band ไมค่ มชัด ควรทำอยำ่ งไร .............................................................................................................................................. ............................................................................................................................ ..................................................................................................................................... 7. จงอธิบำย วธิ กี ำรเตรยี ม Working ethidium bromide ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… …………………………………………………………… 8. ถำ้ ขณะ run gel แลว้ เกดิ ไฟดับ ควรแกไ้ ขอย่ำงไร .............................................................................................................................................. .............................................................................................................................................. ................................................................................................................... 9. จงแสดงวธิ คี ำนวนกำรเตรียม 2% agarose gel ใน TAE buffer ปรมิ ำตร 30 ml จะต้องชงั่ agarose gel มำเทำ่ ใด ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… …………………………………………………………… 10. จงอธิบำยวิธกี ำรกำจัด Ethidium bromide แบบสงั เขป ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………

25 เฉลยแบบฝกึ หัด 1. ตอบ ง. 2. ตอบ ก. 3. ตอบ ข. 4. ตอบ ก. 5. ตอบ ง. 6. ตอบ นากลับไปแช่ EtBr อกี คร้งั แลว้ ล้างด้วยน้ากลนั่ 7. ตอบ น้ากลน่ั 100 ml EtBr 30 µl 8. ตอบ นาเจลพรอ้ มถาดรองเจลใสถ่ ุง แล้วนาไปแชต่ เู้ ย็นอณุ หภมู ิ 4ºC ไวก้ ่อน 9. ตอบ TAE buffer 100 ml ใช้อะกาโรส 2 g 30������2 100 ถา้ TAE buffer 30 ml จะตอ้ งช่ังอะกาโรส = 0.6 g 10. ตอบ เท EtBr ทีใ่ ช้แล้วใสใ่ นฟลาสก์ ขนาด 2 ลิตร ท่ีมีถุงถา่ นชาโคลจานวน 2 ถงุ ทงิ้ ไว้อยา่ งน้อย 1 คืน แลว้ นาไปกรองผา่ นกระดาษกรองเบอร์ 3 จากนนั้ เทสว่ นทผ่ี า่ น กระดาษกรองทิ้งโดยเปดิ น้าตามปรมิ าณมากๆ