uv vis

Spectroscopyเป็ นเทคนิคท่วี ัดการเปล่ียนแปลงของพลังงานคล่ืนแม่เหลก็ ไฟฟ้ า(แสง) ท่ถี กู ดดู กลืนด้วยสารตัวอย่างโครงสร้างของสารเป็ นตวั บ่งชี้ว่า สารนัน้ ดดู กลืนคล่ืนแสงช่วงไหน และอย่างไร 1

การพสิ ูจน์โครงสร้างสารด้วยวธิ ีทางสเปกโตรสโคปี • Spectroscopy overview • Ultra-violet/visible (UV-vis) • Infra-Red (IR) • Nuclear Magnetic Resonance (NMR) • Mass Spectrometry(MS) 2

คล่ืนแม่เหลก็ ไฟฟ้ า E = h = hc/ E = พลังงาน h = 6.63 x10-34 J.s -1  = ความถ่ี หน่ววย Hz c = ความเร็วของคล่ืน มีค่า 3x108m/s = ความยาวคล่ืน 3

คล่ืนแม่เหล็กไฟฟ้ า NMR IR UV 4

การดดู กลืนคล่ืนแม่เหล็กไฟฟ้ า 5

การดูดกลืนคล่ืนแม่เหลก็ ไฟฟ้ า Energy DEhttp://en.wikipedia.org/wiki/Absorption_%28electromagnetic_radiation%29 Energy 6 Before After

Spectroscopy techniques ช่วงความยาว เทคนิค การเปล่ียนแปลง คล่ืน X– Ray Inner- shell electronic transitionsX-ray Spectroscopy Diffraction and reflection of X- ray radiation10 pm to 10 nm form atomic layersVisible UV – Visible Electronic energy changes380 -750nm Spectroscopy Impinging monoenergetic electron causing valence-electronUV excitation10 -380 nmInfrared Infrared and Rotational of molecules750 nm to 1 mm Vibration of molecules Raman Electronic transition (Some large molecules only ) Spectroscopy IRRadio frequency Nuclear Magnetic Nuclear spin coupling with an applied100 mm to Resonance magnetic field10,000 km NMR 7

UV – Visible SpectroscopyVisible Electronic energy changes380 -750nm Impinging monoenergetic electron causing valence-electron excitationUV10 -380 nm 8

UV – Visible Spectroscopy In a typical experiment, the molecules or atoms start at lower energy and go to a higher energy level upon absorption of radiation of appropriate wavelength. AfterEnergy Before DE Energy 9

UV – Visible Spectroscopy การวเิ คราะหโ์ ดยใช้ UV-Visible spectrophotometer จะอาศยั หลกั การพน้ื ฐาน คอื เมอ่ื โมเลกุลไดร้ บั พลงั งานคลน่ื แสงในชว่ ง UV-Visible 190-800 นาโนเมตร อเิ ลคตรอนทอ่ี ยภู่ ายใน โมเลกุล จะถกู กระตุน้ ใหม้ รี ะดบั พลงั งานทส่ี งู ขน้ึBut in all cases : 10

UV – Visible SpectroscopyOrbitals of Butadiene Again note that lowest energyAnti-bonding Energy H H transition may H lie in visible.Bonding H HH But we can also excite to 11 higher orbitals with sufficiently energetic (UV) photons.

UV – Visible Spectroscopy Electronic Transmissions in Formaldehydehttp://www.agilent.com/en-us/products/uv-vis-uv-vis-nir/tutorial

UV – Visible Spectroscopyเป็ นเทคนิคท่ีวดั การดดู กลืนแสงหรือรังสีในชว่ งอลั ตร้าไวโอเลตและวสิ เิ บลิ โดยมีช่ือเรียก “เคร่ืองยวู ีวิสเิ บลิ ”• ใช้แสงที่มีความยาวคลื่นที่ 190-800 nm “อยใู่ นชว่ ง ยวู ี และ วิสเิ บลิ ”• สารที่สามารถดดู กลืนรังสีได้แก่พวกสารอินทรีย์ (Organic compound), สารประกอบเชิงซ้อน (Complex compound), สารประกอบอนินทรีย์ (Inorganic compound)• วเิ คราะห์สารทงั้ ที่มีสี และไม่มีสี ในรูปธาตหุ รือโมเลกลุ• วิเคราะห์ทงั้ เชิงคณุ ภาพ (ต้องใช้ร่วมกบั เทคนิค IR, NMR spectroscopy) และเชิงปริมาณ

UV – Visible Spectroscopyภายในเคร่ือง UV-Visiblespectrophotometer ซง่ึ ประกอบด้วยแหลง่ กาเนิดแสง 2 ชนิดคือ Deuterium (D2) lamp ซง่ึ ให้คลนื่ แสงในช่วง UV และ Tungsten (W) lamp ซง่ึ ให้คลน่ื แสงในชว่ ง visible หลกั การทางาน นาสารตวั อยา่ งใสใ่ นเซลควอร์ตซ์ ( quart ) แล้ววางในบริเวณใกล้แหลง่ กาเนิดแสง สารตวั อยา่ งจะดดู กลนื รังสี หรือแสงบางสว่ นไว้ แสงท่ีไมด่ ดู กลืนจะผา่ นออกมายงั เครื่องวดั แสง (photomultiplier tube ) เครื่องวดั แสงจะทาการวดั ปริมาณแสงที่ออกมา โดยการหกั ล้างกบัปริมาณของแสงก่อนดดู กลนื จากนนั้ จะทาการประมวลผลเป็น curve หรือสเปกตรัม ซง่ึ แสดงความสมั พนั ธ์ระหวา่ งคา่ การดดู กลืนแสง ( absorbance ) และคา่ ความยาวคลน่ื 14

UV – Visible Spectroscopyสว่ นประกอบหลกั ของเคร่ืองยวู ี-วสิ เิ บิล สเปกโทรโฟโตมเิ ตอร์ มีอยู่ 5 สว่ น1. แหลง่ กาเนดิ แสง (light source)2. สว่ นเลอื กความยาวคล่นื (wavelength selector)3. ภาชนะใสส่ าร (cell หรือ cuvette)4. ตวั ตรวจจบั สญั ญาณ (detector)5. สว่ นบนั ทกึ และแปรผลสญั ญาณ (recorder and processor ) 15http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page4_2.html

ส่วนประกอบหลักของเคร่ืองUV – Visible Spectroscopy1.แหล่งกาเนิดแสง (light source) แหลง่ กาเนิดแสงในเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์จะต้องให้รังสีในชว่ งความยาวคลื่นที่ต้องการอย่างตอ่ เนื่องและคงที่ตลอดเวลา รวมทงั้ มีความเข้มแสงท่ีมากพอด้วย สาหรับความยาวคลื่นในชว่ งอลั ตราไวโอเลตจะใช้หลอดดิวเทอเรียม (deuterium lamp) เป็นแหลง่ กาเนิดแสง ซง่ึ ให้แสงในชว่ ง 185-375 nm หลกั การคือทาให้อะตอมดวิ เทอเรียมที่อย่ใู นสภาวะเร้าคายพลงั งานออกมาสว่ นหลอดทงั สเตน (tungsten filament lamp) จะให้ความยาวคลืน่ ครอบคลมุ ชว่ งแสงท่ีมองเห็นได้ คอื ตงั้ แต่320-2500 nm หลกั การจะคล้ายกบั หลอดไฟทงั สเตนธรรมดาคอื ให้กระแสไฟฟ้ าผา่ นเข้าไปจนกระทง่ั ลวดทงั สเตนร้อนและเปลง่ รังสอี อกมา โดยปกติจะเปิดเคร่ืองทิง้ ไว้ก่อนใช้งานประมาณ 30 นาที เพอื่ ให้แนใ่ จว่าหลอดดวิ เทอเรียมหรือหลอดทงั สเตนให้แสงที่มีความเข้มสม่าเสมอ 16http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page4_2.html

ส่วนประกอบหลักของเคร่ืองUV – Visible Spectroscopy2. ส่วนเลือกความยาวคล่ืน (wavelength selector) เป็นสว่ นที่ใช้แยกความยาวคลืน่ ท่ีออกมาจากแหลง่ กาเนิดแสง ซงึ่ เป็นแสงที่มีหลายๆความยาวคลนื่ (polychromatic wavelength) ให้เป็นแถบแสงในช่วงแคบๆ หรือ เป็นความยาวคล่ืนเด่ียว (monochromatic wavelength)เคร่ืองมือสมยั ก่อนจะใช้ปริซมึ หรือ 17ฟิลเตอร์สาหรับแยกความยาวคลน่ื แต่ http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page4_2.htmlปัจจบุ นั เปล่ยี นมาใช้ monochromaterแบบ grating สะท้อนแสงซงึ่ มีลกั ษณะเป็นร่องเลก็ ๆ ขนานกนั จานวนมาก แสงจากแหลง่ กาเนิดแสงจะตกกระทบลงบนผิวหน้าของร่อง แล้วสะท้อนออกมาท่ีมมุ ตา่ งๆ เฉพาะความยาวคลื่นท่ีเราเลือกเท่านนั้ จงึ จะผา่ น ช่องแสงออก(exit slit) ไปสสู่ ารตวั อยา่ ง

ส่วนประกอบหลักของเคร่ืองUV – Visible Spectroscopy3. ภาชนะใส่สารตัวอย่าง (cell หรือ cuvette) ภาชนะใสส่ ารตวั อยา่ งสาหรับสเปกโทรโฟโตมิเตอร์จะเรียกวา่ เซลล์หรือคิวเวทท์ (cuvette) มีหลายแบบหลายขนาดด้วยกนั ขนึ ้ กบั การใช้งาน หลกั สาคญั ในการเลอื กใช้ก็คือ การวดัในช่วงแสงอลั ตราไวโอเลต จะต้องใช้เซลล์ท่ีทาจากควอตซ์(quartz) เทา่ นนั้ เนื่องจากแก้วสามารถดดู กลืนแสงในชว่ งอลั ตราไวโอเลตได้ สว่ นเซลล์ที่ทาจากแก้วจะใช้วดั ในช่วงแสงท่ีมองเหน็ ได้ นน่ั หมายความวา่ ถ้าเราต้องการวดั สารในชว่ งแสงที่มองเหน็ ได้กค็ วรจะใช้เซลล์ที่ทาจากแก้ว การใช้เซลล์ควอตซ์ไมไ่ ด้มีผลให้การวดั แสงดีขนึ ้ แตจ่ ะสนิ ้ เปลอื งเปล่า ประโยชน์เพราะควอตซ์ราคาแพง กวา่ แก้วมาก 18 http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page4_2.html

ส่วนประกอบหลักของเคร่ืองUV – Visible Spectroscopy4. ตวั ตรวจจับสัญญาณ (detector) เคร่ืองตรวจจบั สญั ญาณทด่ี ีต้องมีสภาพไวสงู คือแม้ปริมาณแสงจะเปล่ียนไปเลก็ น้อยกส็ ามารถตรวจจบั สญั ญาณความแตกตา่ งได้ ปัจจบุ นั เคร่ืองสเปกโทรโฟโตมเิ ตอร์สว่ นใหญ่นิยมใช้ตวั ตรวจจบั สญั ญาณ 2 ชนิดคือ 4.1 หลอดโฟโตมัลตพิ ลายเออร์ (photomultiplier tube; PMT) 4.2 โฟโตไดโอดอาร์เรย์ (photodiode arrays; PDA) ตวั ตรวจจบั สญั ญาณชนิดนีส้ ามารถจบั สญั ญาณได้ครอบคลมุ ทงั้ สเปกตรัมโดยใช้ไดโอดนี ้มาเรียงตอ่ กนั เป็นแถว ซง่ึ สามารถวดั ครอบคลมุ สเปกตรัมได้ตงั้ แต่ 200-1100 nm 19 http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page4_2.html

ชนิดของเคร่ืองUV – Visible SpectroscopySingle-Beam Spectrophotometer. 20 http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page4_2.html

ชนิดของเคร่ืองUV – Visible SpectroscopyDouble-Beam Spectrophotometer. 21 http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page4_2.html

ชนิดของเคร่ืองUV – Visible SpectroscopyDiode Array Spectrometer 22 http://www.il.mahidol.ac.th/e-media/color-light/page4_2.html

UV – Visible SpectroscopyUV-Visible spectrophotometer สามารถวิเคราะห์ได้ทงั้ ทางด้านคณุ ภาพและปริมาณคุณภาพวิเคราะห์ การทา calibration curve เพอ่ื วเิ คราะหห์ าความยาวคล่ืนของแสงท่ีถูกดดู กลืนจะ ปรมิ าณของสารสามารถใช้ใน การ identify ชนิดของสาร ปริมาณวเิ คราะห์ ปริมาณการดดู กลืนแสง จะใช้ในการบอก ปริมาณของ สารท่ีนามาวเิ คราะห์ 23

UV – Visible Spectroscopyปริมาณวเิ คราะห์ปริมาณการดูดกลืนแสง จะใช้ในการบอกปริมาณของ สารท่นี ามาวเิ คราะห์ การวิเคราะห์หาปริมาณของสารตวั อยา่ งทาได้ โดยเตรียมสารละลายมาตรฐานที่ทราบความ เข้มข้นที่แน่นอน 3-5 ความเข้มข้น และนามา วิเคราะห์หาคา่ การดดู กลืนแสงที่ได้ จากนนั้ สร้างกราฟระหวา่ งคา่ การดดู กลนื และคา่ ความ เข้มข้นของสารละลายมาตรฐานท่ีระดบั ความ เข้มข้นตา่ งๆ (Calibration curve) ซง่ึ เม่ือนา คา่ การดดู กลนื คล่นื แสงของตวั อยา่ งมา เปรียบเทียบกบั สมการท่ีได้จากกราฟของ สารละลายมาตรฐาน ก็จะสามารถวเิ คราะห์ หาปริมาณสารตวั อยา่ งได้ 24

Trace Metals Environmental Applications λ (nm) 535 Analyte Method react with Eriochrome cyanide R dye at pH6; forms red to pink complexaluminumarsenic reduce to AsH3 using Zn and react with silver diethyldithiocarbamate; forms red complex 535cadmium extract into CHCl3 containing dithizone from a sample made basic with NaOH; forms pink to red 518 complexchromium oxidize to Cr(VI) and react with diphenylcarbazide; forms red-violet product 540copper react with neocuprine in neutral to slightly acid solution and extract into CHCl3/CH3OH; forms 457 yellow complexiron reduce to Fe2+ and react with o-phenanthroline; forms orange-red complex 510lead extract into CHCl3 containing dithizone from sample made basic with NH3/NH4+ buffer; forms 510manganese cherry red complex 525 oxidize to MnO4– with persulfate; forms purple solutionmercury extract into CHCl3 containing dithizone from acidic sample; forms orange complex 492zinc react with zincon at pH 9; forms blue complex 620 25http://chemwiki.ucdavis.edu/Core/Analytical_Chemistry/Analytical_Chemistry_2.0/10_Spectroscopic_Methods/10C%3A_UV%2F%2FVis_and_IR_Spectroscopy

Environmental ApplicationsInorganic NonmetalsAnalyte Method λ (nm)ammonia reaction with hypochlorite and phenol using a manganous salt catalyst; 630 forms blue indophenol as product 578 570cyanide react with chloroamine-T to form CNCl and then with a pyridine-barbituric 592 acid; forms a red-blue dye 543 690fluoride react with red Zr-SPADNS lake; formation of ZrF62– decreases color of the red lakechlorine react with leuco crystal violet; forms blue product(residual)nitrate react with Cd to form NO2– and then react with sulfanilamide and N-(1- napthyl)-ethylenediamine; forms red azo dyephosphate react with ammonium molybdate and then reduce with SnCl2; forms molybdenum blue 26http://chemwiki.ucdavis.edu/Core/Analytical_Chemistry/Analytical_Chemistry_2.0/10_Spectroscopic_Methods/10C%3A_UV%2F%2FVis_and_IR_Spectroscopy

Organics Environmental Applications λ (nm) Analyte Methodphenol react with 4-aminoantipyrine and K3Fe(CN)6; forms yellow antipyrine 460 dye 65anionicsurfacta react with cationic methylene blue dye and extract into CHCl3; formsnt blue ion pair 27http://chemwiki.ucdavis.edu/Core/Analytical_Chemistry/Analytical_Chemistry_2.0/10_Spectroscopic_Methods/10C%3A_UV%2F%2FVis_and_IR_Spectroscopy

UV – Visible Spectroscopy สารท่ีนามาวเิ คราะห์ด้วยเคร่ือง UV-Vis ต้องมี คุณสมบตั ดิ ดู กลืนแสงได้ เช่น สารประกอบอนิ ทรีย์ สารประกอบเชงิ ซ้อน และสารอนินทรีย์ ซ่งึ สารประกอบ ดังกล่าวมักเป็ นสารท่เี รียกว่า “Chromophores” เช่น สารประกอบไฮโดรคาร์บอนชนิด ไม่อ่มิ ตัว คือ มีหมู่ C=C, C≡C, C=O, N=O,C-X (X=Br,I) , Benzene ring และมี Lone pair electron เป็ นต้น beta-Carotene OH 28 H NOOO N OMe OMe16,17-DimethoxyViolanthrone H2N N N Xanthopterin

โครงสร้างสารกับการดูดกลืนแสง UV-VISปัจจยั ท่ีมีผลตอ่ การดดู กลืนแสง1. Chromophore คือโมเลกลุ ของสารอินทรีย์ท่ีมีUnsaturatedfunctional groupซง่ึ ดดู กลืนแสงในชว่ งยวู ี-วสิ ิเบิลและแสดงสมบตั ขิ องมนั มีด้วยกนั 3 แบบ• โครโมฟอร์ท่ีมี multiple bond ระหวา่ ง 2 อะตอมของธาตุ โดยไมม่ ี อิเลก็ ตรอนคโู่ ดดเด่ียว เช่น C=C• โครโมฟอร์ท่ีมี multiple bond ระหวา่ ง 2 อะตอมของธาตุ โดยไมม่ ี อเิ ลก็ ตรอนคโู่ ดดเด่ียว เช่น C=O• โครโมฟอร์ท่ีมี benzene ring ได้แก่สารประกอบพวกอะโรมาติก ไฮโดรคาร์บอน เชน่ benzene, phenol

โครงสร้างสารกับการดูดกลืนแสง UV-VISปัจจยั ท่ีมีผลตอ่ การดดู กลืนแสง2. ออกโซโครม (auxochrome) เป็นกลมุ่ ของธาตทุ ี่ไมด่ ดู กลนื แสง แตส่ ามารถมีผลตอ่ absorption spectrum ของโครโมฟอร์ท่ีมีออกโซโครมเกาะอยู่ ทาให้เกิดผลดงั ตอ่ ไปนี ้• เกิด Bathochromic shift (red shift) ทาให้ spectrum เคลือ่ น ไปทางที่มีความยาวคลน่ื มากขนึ ้ (max เพม่ิ )• เกิด Hypsochromic shift (blue shift) ทาให้spectrum เคลอื่ นไปทางที่มีความยาวคลนื่ ลดลง (max ลด)• เกิด Hyperchromic effect ทาให้เกิดการดดู กลืนแสงมากขนึ ้ (Ɛmax เพิ่มขนึ ้ )• เกิด Hypochromic effect ทาให้ Ɛmax ลดลง

โครงสร้างสารกับการดูดกลืนแสง UV-VISปัจจยั ที่มีผลตอ่ การดดู กลนื แสง3. ตวั ทาละลาย (Solvent effect) ตวั ทาละลายที่มีขวั้ เช่นสารอนิ ทรีย์บางท่ีมีหมคู่ าร์โบนิล (C=O) ทาให้เกิดการเคลือ่ นไปของแถบการดดู กลืนพลงั งานเรียกวา่ solvent shift4. สเตอริกของโมเลกลุ (Steric effect) ผลของโครงสร้างท่ีมีความเกะกะทาให้การเกิดอนั ตรกิริยาของอเิ ลก็ ตรอนเปล่ยี นแปลงสง่ ผลให้การวดั การดดู การแสงเปลยี่ นแปลงเช่นสารประกอบท่ีมีหมู่ฟังก์ชนั ใหญ่ๆ จะทาให้ max เคลื่อนไปทางที่สนั ้ กวา่ และคา่ Ɛmax ลดลง

โครงสร้างสารกับการดดู กลืนแสง UV-VISเม่ือสารมีระบบ conjugate มากๆ จะย่งิ มีค่า max มากขนึ้ 32

เม่ือสารมีระบบ conjugate มากๆ จะย่งิ มีค่า max มากขนึ้ 33

เม่ือสารมีระบบ conjugate มากๆ จะย่งิ มีค่า max มากขนึ้ 34

เม่ือสารมีระบบ conjugate มากๆ จะย่งิ มีค่า max มากขนึ้ 35

โครงสร้างสารท่เี ป็ นอนิ ดเิ คเตอร์เปล่ียนค่า max เปล่ียนChanges in chemical composition can give rise topronounced colour changes since this candramatically alter the energies of the orbitals involvedin the transitions e.g. pH indicators.Phenolphthalein O O O O -2H+ O OH O-HO pink colourless 36

โครงสร้างสารท่เี ป็ นอนิ ดเิ คเตอร์เปล่ียนค่า max เปล่ียนMethyl orange H3C red N NNH3C SO3- H+ H3C H orange-yellow N SO3- +H3C NN 37

โครงสร้างสารกับการดูดกลืนแสง UV-VISSubstituents added to the compound may alter the energy ofthe orbitals which e- is excited from or to.Auxochromes: substituents that alter the wavelength orintensity of the absorption due to the chromophoreO NH2 O NH2 ORANGE PURPLEO O OH O NHCH3 BLUE O NHCH3 38

โครงสร้างสารกับการดดู กลืนแสง UV-VISสรุป UV-VIS Spectroscopy • Unsaturated functional group - double bond - conjugate C = C - C = C - conjugate ระบบใหญ่ • ช่วงการดูดกลืนแสง - double bond น้อยกว่า 200 nm - conjugate 200 – 400 nm - conjugate ระบบใหญ่ เกดิ สารมสี ี 400 – 800 nm326 nm 39