การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

การดำรงชีวิตและครอบครัว เรื่องการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ จัดทำโดย นางสาวพัชราภา ใบพะออม เลขที่ 20 นางสาวสิริการย์ คะละตัน เลขที่ 22 ชั้นมัธยมศึกษาปีที่ 6/5 เสนอ นางสาวกายทิพย์ แจ่มจันทร์

คำนำ ปัจจุบันมีการนำเทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมาใช้ประโยชน์เพื่อผลิต ขยายพันธุ์ พืชในเชิงการค้าและอุตสาหกรรมเพิ่มมากขึ้น โดยเฉพาะในกลุ่มไม้ดอก ไม้ประดับ เช่น กล้วยไม้ เบญจมาศ หน้าวัว เป็นต้น แต่ก็ยังอยู่ในวงจำกัด ด้วยปัจจัยหลายประการ เช่น ต้นทุนสูง ต้องใช้ความรู้และทักษะเฉพาะด้าน การปฏิบัติค่อนข้างยุ่งยากซับซ้อนและเป็น วิทยาศาสตร์มากเกินไป เป็นต้น เพื่อแก้ปัญหาที่เป็นข้อจำกัดดังกล่าว กรมส่งเสริมการเกษตร จึงได้นำร่องขยายผลเทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อพัฒนา การเกษตรกรสู่เกษตร อุตสาหกรรม และเพื่อเปิดโอกาสให้ ผู้สนใจทุกภาคส่วนที่เกี่ยวข้องสามารถเข้าถึงองค์ความรู้ ได้ง่ายขึ้น หนังสือเล่มนี้จัดทำขึ้นเพื่อเผยแพร่และถ่ายทอดองค์ความรู้ ทักษะ และ ประสบการณ์ที่ได้จากการทำงาน การแลกเปลี่ยนเรียนรู้ และการศึกษาทดสอบประยุกต์และ พัฒนาเทคโนโลยี จนได้ เทคนิควิธีที่มีประสิทธิภาพเหมาะสมแก่ผู้ที่สนใจนำเทคโนโลยี การ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ไปใช้เพื่อพัฒนาอาชีพการเกษตร และ เพื่อให้ผู้อ่านเข้าใจง่ายขึ้น หากมี เนื้อหาที่ผิดพลาดประการใดขออภัย ณ ที่นี้ด้วย จัดทำโดย นางสาวพัชราภา ใบพะออม นางสาวสิริการย์ คะละตัน

สารบัญ หน้า ปหกขบเ2้้ทาออรร0รระดคงขตกกตขกวโคขีณััเปิร่ัแโ้้ธภนนาาาวอวนยีคฏกลรรรอาทากตติาแโเเเาะนบมยาลพตตออขยลุ่ัรขราสกตยรรนนพอ้าเะิีีเงีอพัำยยรกะกจกกงแผนเมคมมัาเารกาสาามงัลิธะีีญญรตอรรราห์้ยลยัพเ้เเเเราวนพอืขเพพตงงืตหเกช้ศเงพอิรอ่าาานับีอาโปืตยเะะงะ้ดารอยนโรืฏมกเเเะต่เูยลอลเิมทปพีีอยาบเี้้ืกยขล่ยัล่ใสฏราีอาต็้นางิองยเดะิหำคบเกพรเสงงันเคนาวืเลตาพืัเภ้าีพริ้อญร้นืรอยงืะชสาม้เเาาเอูงทเยีพพตยืีนลกะเื่่เีอ่นตา้อรยทเืายิืีล้ะ่ดอ่ีรพอคงm้ยเืจมเเลวชยัีนงืด้าืsบ่ยอ้เอกกนง(คัืเบุ้าเอ1ยมนืรืต่เ้ออส้ลยนืิ่เภตอยพืาร่ือชพพ)ืทีช่เหมาะสม 11135213445 11119768 22

เทคโนโลยีการเพาะเมล็ด 1 ความสำคัญ การเพาะเลี้ยงเนื้ อเยื่ อเป็ นวิธีขยายพันธุ์พืชแบบไม่ใช้เพศวิธีหนึ่ งที่มี ประสิทธิภาพสูง สามารถผลิตพืชได้จำนวนมากในเวลาอันรวดเร็ว ต้นพืชมี ความสม่ำเสมอ สมบูรณ์แข็งแรง ตรงตามพันธุ์ และสะอาดปราศจากโรค แมลงศัตรูพืช ปัจจุบันมีการนำมาใช้เพื่อขยาย พันธุ์พืชในเชิงการค้าอย่าง กว้างขวางและส่งเสริมเป็นอาชีพ เริ่มจากนำมาใช้กับกล้วยไม้ จนกลาย เป็นพืชอุตสาหกรรมที่สำคัญของประเทศ ต่อมาจึงได้มีการนำมาใช้ขยาย พันธุ์พืชอื่นๆ ในเชิงการค้า เช่น กล้วย หน่อไม้ฝรั่ง สับปะรด ไผ่ เยอบีร่า หน้ าวัว เบญจมาศ บอนสี ปทุมมา กระเจียว กุหลาบ สตรอว์เบอร์รี่ ขนุน และไม้สัก เป็นต้น รวมถึงได้นำมาใช้ เพื่อการผลิตขยายพันธุ์ปลอดโรค ซึ่ง มีสาเหตุจากเชื้อไวรัส ไฟโตพลาสม่า และเชื้อแบคทีเรีย ที่มักติดมากับหัว พันธุ์หรือท่อนพันธุ์ ก่อให้เกิดความเสียหายทางเศรษฐกิจอย่างมหาศาล เทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ถึงแม้จะมีการนำเทคนิคการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อพืชมาใช้ประโยชน์เพื่อการผลิตขยาย พันธุ์พืชในเชิงการค้าและ อุตสาหกรรมเพิ่มมากขึ้นก็ตาม แต่ด้วยข้อจำกัดต่างๆ เช่น ต้นทุน การ ผลิตสูง บุคลากรมีจำกัด ผู้ใช้ต้องใช้ความรู้และทักษะเฉพาะด้าน การ ปฏิบัติค่อนข้าง ยุ่งยากและเป็นวิทยาศาสตร์มากเกินไป รวมถึงช่องทาง เข้าถึงเทคโนโลยียังมีไม่เพียงพอ ด้วยเหตุนี้ กรมส่งเสริมการเกษตร จึงได้ นำร่องขยายผลเทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยการส่งเสริม สนับสนุนให้เกษตรกร และผู้สนใจได้มีโอกาสเข้าถึงเทคโนโลยีฯ โดยตรง ด้วยการนำมาประยุกต์ใช้เพื่อการผลิตขยายพืชพันธุ์ดี ซึ่งเป็นปัจจัยที่มี ความสำคัญยิ่ง ต่อธุรกิจเกษตร เพื่อให้สามารถรองรับความต้องการของ ตลาดทั้งภายในและต่างประเทศ การนำ เทคโนโลยีฯ ไปใช้ให้เกิดผลสำเร็จ ในเชิงอุตสาหกรรมนั้น จำเป็นอย่างยิ่งต้องมีธุรกิจต่อเนื่อง รองรับครบ วงจร และเพื่อให้เห็นถึงประโยชน์ของการนำข้อดีของงานเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อ ไปใช้ประโยชน์ได้อย่างเป็นรูปธรรม จึงได้นำตัวอย่างผู้ประสบ ความสำเร็จในธุรกิจ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ทั้งทางตรงและทางอ้อม เช่น เป็นผู้ที่ทำงานกับผู้ประกอบการธุรกิจ ผู้ประกอบการธุรกิจ ผู้ประกอบการ ตลาดสินค้าเกษตรอุตสาหกรรม ผู้ประกอบการธุรกิจ โรงเรือนเพาะชำ และ เกษตรกรผู้ปลูกพืชเชิงการค้า เป็นต้น

2 การขยายพันธ์พืชโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เป็นการขยายพันธุ์พืชแบบไม่ใช้เพศ วิธีหนึ่ง ทำโดยการนำชิ้นส่วนต่างๆ ของพืช เช่น ตาข้าง ตายอด หน่ออ่อนใบ เมล็ดมาเพาะเลี้ยง ในอาหารสังเคราะห์ ประกอบด้วยเกลือแร่ น้ำตาล วิตามิน และ สารควบคุมการเจริญเติบโต ภายใต้สภาพ แวดล้อมที่ควบคุมได้ ปลอดจาก เชื้อ จุลินทรีย์ให้พัฒนาเป็นต้นพืชที่สมบูรณ์ เป็นวิธีการขยายพันธุ์พืชที่มีประสิทธิภาพ สามารถผลิตพืชได้จำนวนมากในเวลาที่ กำหนด ต้นพืชสมบูรณ์แข็งแรง ปลอดโรค ที่มีสาเหตุ จากเชื้อไวรัส เชื้อราและเชื้อ แบคทีเรีย ที่อาจติดมากับต้นพันธุ์ ตลอด จนการอนุรักษ์ พันธุกรรมพืช และการ ปรับปรุงพันธุ์พืช พืชที่นิยมขยายพันธุ์ด้วยวิธีนี้ ได้แก่ ไม้ยืนต้น เช่น ยูคาลิปตัส ไผ่ สัก เป็นต้น • พืชผัก เช่น ขิง หน่อไม้ฝรั่ง และปูเล่ เป็นต้น ไม้ผล เช่น กล้วย สับปะรด สตรอว์เบอร์รี่ และส้ม เป็นต้น ไม้ดอกไม้ประดับ เช่น หน้าวัว เบญจมาศ กล้วยไม้ ว่านสี่ทิศ เยอบีร่า เฮลิโคเนีย และ ฟิโลเดน ดรอน เป็นต้น พืชกินแมลง เช่น หยาดน้ำค้าง กาบหอยแครง และหม้อข้าวหม้อแกงลิง เป็นต้น

ข้อดีและข้อเสียของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 3 ข้อดี 1. สามารถเพิ่มปริมาณพันธุ์พืชที่ต้องการได้ในเวลาอันสั้น 2. ต้นกล้าที่ได้มีลักษณะที่สม่ำเสมอ (genetic uniformity) 3. ต้นพืชที่ได้ปราศจากเชื้อแบคทีเรียและเชื้อรา 4. ผลิตต้นกล้าได้ทั้งปี โดยไม่ต้องคำนึงถึงสภาพดินฟ้าอากาศหรือฤดูกาลใน 5. ช่วยในการขยายพันธุ์พืชในพืชที่ขยายพันธุ์เองได้ยากในสภาพปกติใน ธรรมชาติ เช่น กล้วยไม้ และสน 6. ใช้ในการผลิตยาและสารเคมีจากพืชบางชนิดสามารถผลิตสารที่มี คุณสมบัติ ทางยาหรือมีประโยชน์ทางด้านอุตสาหกรรม เช่น ทำน้ำมันหอมระเหย โดย ปกติเนื้อสาร ออกฤทธิ์ที่ต้องการจะมีอยู่ในปริมาณที่น้อยมาก 7. สามารถใช้เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อในการปรับปรุงพันธุ์พืช คัดเลือกสาย พันธุ์พืชที่ทนทาน 8. ใช้ศึกษาทางชีวเคมี สรีรวิทยาและพันธุศาสตร์ ต้นพืชที่เลี้ยงในหลอด ทดลอง สามารถติดตามการพัฒนาและเปลี่ยนแปลงได้ง่าย ชัดเจน และถูกต้องแม่นยำ 9. ใช้เพื่อเก็บรักษาและรวบรวมพันธุ์พืช เพื่อการอนุรักษ์พันธุ์พืชที่หายากหรือ กำลังใกล้จะสูญพันธุ์ในสภาพตามธรรมชาติ 10. เพื่อเมล็ดเทียมหรือเมล็ดสังเคราะห์ ข้อเสีย 1. มีึขั้นตอนและวิธีการที่ยุ่งยาก 2. ต้นทุนสูงกว่าการขยายพันธุ์พืชโดยวิธีอื่น 3. เสี่ยงต่อความเสียหายจากศัตรูพืชเนื่องจากพืชต้นใหม่ที่ได้มีจำนวนมาก และมี ลักษณะทางพันธุกรรมเหมือนกัน ทำให้การระบาดของโรคและแมลงศัตรูพืช เกิดได้ง่าย 4. การแปรปรวนทางพันธุกรรม

โรคและแมลงศัตรูที่สำคัญที่ติดมากับต้นพืช 4 ชนิดพืช โรคและแมลงศัตรูพืช กล้วย โรคตายพราหยนโอรนคกเหอี่ยว ด้วงงวง มันสำปะหลัง โรคใบขาวและกอตะไคร้อ้อย หนอนกอ คริสต์มาส โรคใบราด่กาเงน่โารหคัวพุเอ่้นมอ่าแยจเ้พมันลี้ยสำแปป้ะงหลัง อ้อย รากเน่าโคนเน่า แมลงหวี่ขาว

ประเภทของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 5 พืชประกอบไปด้วยอวัยวะต่างๆ มากมาย ซึ่งแต่ละอวัยวะประกอบ ด้วยเนื้อเยื่อ หลายชนิด ประเภทของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อแบ่งตามส่วน ของพืชที่นำมาขยายพันธุ์ได้เป็น 7 ประเภท ดังนี้ 1. การเพาะเลียงคัพภะ (embryo culture) การเพาะเลี้ยงคัพภะ หมายถึง การนำเอาคัพภะ หรือต้นอ่อนของพืช ที่เพิ่งเริ่ม พัฒนาที่ เกิดขึ้นตามธรรมชาติจากถุงรังไข่ของพืชมาเพาะเลี้ยงบนอาหาร สังเคราะห์ เพื่อให้เกิดเป็น แคลลัส หรือเกิดเป็นต้นพืชโดยตรง รวม ทั้งการชักนำให้เกิดคัพภะจากเซลล์หรืออวัยวะอื่น เช่น ใบเลี้ยง ช่อ ดอกอ่อน เมล็ดอ่อน โดยชักนำให้เกิดคัพภะโดยตรง หรือชักนำให้เกิด แคลลัสแล้ว พัฒนาเป็นคัพภะต่อไป การเพาะเลี้ยงคัพภะนำมาแก้ไข ปัญหาอัตราความงอก ของเมล็ดที่ต่ำใน เมล็ดพืชบางชนิด หรือใน เมล็ดของพืชที่เกิดจากการผสมข้ามชนิด หรือข้ามสกุลที่ยากต่อการ เจริญเติบโตและพัฒนา ในสภาพตามธรรมชาติ รวมทั้งแก้ไขปัญหา การพักตัวที่ยาวนานของเมล็ด พืชบางชนิด

6 2.การเพาะเลี้ยงอวัยวะ (organ culture) การเพาะเลี้ยงส่วนต่างๆ ของอวัยวะพืชที่แยกออกมา เช่น ยอด ข้อ ปล้อง ราก ใบ ดอก และ ผล ในสภาพปลอดเชื้อ วิธีการเพาะเลี้ยงแบบนี้ทำได้ง่ายและรวดเร็ว 3.การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเจริญ (meristem culture) การเพาะ เนื้อเยื่อเจริญเป็นการตัดเอาเนื้อเยื่อเจริญที่ปลายยอดมาเลี้ยง เนื้อเยื่อเจริญมีขนาดเล็กมากต้องทำการผ่าตัดภายใต้กล้องจุลทรรศน์ เป็นการเพาะเลี้ยงเพื่อให้ได้ชิ้นส่วน ที่ปลอดไวรัสแล้วนำไป เพาะเลี้ยงเพิ่มปริมาณขยายพันธุ์ต่อไป 4.การเพาะเลี้ยงแคลลัส (callus culture) แคลลัสเป็นเซลล์พื้นฐานที่ อยู่รวมกันเป็นกลุ่ม ยังไม่กำหนดทิศทางการเปลี่ยนแปลง หรือพัฒนาไป เป็นเนื้อเยื่อหรืออวัยวะใด เนื้อเยื่อพืชเกือบทุกชนิดสามารถนำมาชักนำ การสร้าง แคลลัสได้ ซึ่งการชักนำการสร้างแคลลัสเริ่มต้นจากการคัด เลือกเนื้อเยื่อพืชมาทำการเพาะเลี้ยงบน อาหารสังเคราะห์ที่มีธาตุ อาหารพืชร่วมกับสารควบคุมการเจริญเติบโตในระดับที่เหมาะสม เนื้อเยื่อพืชจะเกิดการแบ่งเซลล์พัฒนาเป็นแคลลัส แคลลัสเป็นเนื้อเยื่อ พื้นฐานของระบบการ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช และนำมาใช้ประโยชน์ หลายด้าน เช่น การขยายพันธุ์เพื่อชักนำให้เกิดต้นพืช ปริมาณมาก ใช้ ในกระบวนการผลิตเซลล์ไร้ผนัง (protoplast) การผลิตสารเคมี การ ผลิตพืชให้ ต้านทานต่อโรคแมลงศัตรูพืช และทนทานต่อสภาพแวดล้อม ที่ไม่เหมาะสม รวมทั้งการใช้เป็น เนื้อเยื่อเป้าหมายในการเก็บรักษาเชื้อ พันธุกรรม (cryopreservation)

7 5.การเพาะเลี้ยงโปรโตพลาสต์ (protoplast culture) โปรโตพลาสต์เป็นเซลล์ที่ปราศจากผนังเซลล์ (cell wall) เหลือ แต่เยื่อหุ้มเซลล์ (cell membrane) ห่อหุ้มองค์ประกอบของเซลล์ เอาไว้ สำหรับวิธีการกำจัดผนังเซลล์ที่ใช้อยู่มี ด้วยกัน 2 วิธี คือ วิธี กล (mechanical method) โดยการสร้างบาดแผลหรือทําให้ผนัง เซลล์เกิดการ ฉีกขาดจากใบมีดที่ผ่านการฆ่าเชื้อ แล้วทำให้เซลล์ที่ เหลือหลุดออกจากผนังเซลล์ และวิธีย่อยด้วย เอนไซม์ (enzymatic method) ดังภาพที่ 9.5 เนื้อเยื่อที่มีความเหมาะสม นำมาสกัดเซลล์ไร้ผนัง ได้แก่ เนื้อเยื่อที่มีอายุน้อย เช่น แคลลัส ใบ อ่อน รากอ่อน และละอองเกสรตัวผู้ ประโยชน์ของการ เพาะเลี้ยง โปรโตพลาสต์ได้แก่ การนำมาใช้ในกระบวนการปรับปรุงพันธุ์ และ การสร้างพืชพันธุ์ใหม่ จากพืชต่างสกุลโดยวิธีรวมโปรโตพลาสต์ (protoplast fusion) รวมทั้งใช้เป็นเนื้อเยื่อเป้าหมายใน ระบบ การส่งถ่ายยีน

8 6.การเพาะเลี้ยงอับเรณูและละอองเรณู(anther and pollen culture) อับเรณูที่ยังเจริญไม่เต็มที่ (immature anther) หรือละออง เรณู (microspore) ซึ่งผ่าน การแบ่งตัวแบบไมโอซิสมาแล้วสามารถนำมา เพาะเลี้ยงให้เกิดเป็นพืชต้นใหม่ได้ ซึ่งต้นพืชที่ได้จะมี โครโมโซมเป็นแฮ พลอยด์ (n) สามารถนำมาทำการเพิ่มจำนวนโครโมโซม วิธีการนี้ทำให้เกิด พืช พันธุ์แท้ (homozygous) 7.การเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย (cell suspension culture) เซลล์ แขวนลอยเป็นเซลล์เดี่ยวๆ หรือกลุ่มเซลล์ขนาดเล็กที่ได้จากการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อพืชในอาหารเหลวบนเครื่องหมุนเหวี่ยงอาหาร เนื้อเยื่อที่เหมาะสม ต่อการชักนำให้เกิดเซลล์ แขวนลอย ได้แก่ เนื้อเยื่อแคลลัส ซึ่งเป็นกลุ่ม เซลล์ที่มีการเกาะตัวกันหลวมๆ ง่ายต่อการกระจาย ออกเป็นเซลล์เดี่ยวๆ การเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอยถูกนำมาใช้ศึกษาถึงกระบวนการเมแทบอลิ ซึม ภายในเซลล์ การศึกษาการทํางานของเอนไซม์และการแสดงออกของ ยีน ตลอดจนเพื่อการผลิต เชลล์ไร้ผนัง และคัพภะเพื่อนำไปใช้ประโยชน์ต่อ ไป

9 8.รูปแบบการเจริญเติบโตและการพัฒนาของเนื้อเยื่อ การเจริญเติบโตและการพัฒนาของชิ้นส่วนพืชที่นำมาเพาะเลี้ยงบน อาหารสังเคราะห์ เพื่อให้เกิดเป็นต้นพืชที่สมบูรณ์ พบว่าเนื้อเยื่อมี กระบวนการเปลี่ยนแปลงเกิดขึ้นในลักษณะต่างๆ ได้ 3 แบบ ดังนี 8.1 เกิดแคลลัส (callus formation) แคลลัสเป็นกลุ่มเซลล์พา เรนไคมาที่ยังไม่มีการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ไป เป็นรากหรือ ลำต้น อาจจะอยู่กันหลวมๆ หรือ เกาะกันแน่น (ภาพที่ 9.6) แคลลัส อาจเกิดจากจาก เซลล์หรืออวัยวะอื่น เช่น ใบเลี้ยง ช่อดอกอ่อน และ เมล็ดอ่อน เป็นต้น

10 8.2 เกิดอวัยวะ หรือออร์แกโนรีเนซิส (organogenesis) ออร์แกโนเจเนซิส (organogenesis) คือ กระบวนการเปลี่ยนแปลงจน กระทั่งได้ เป็นอวัยวะหรือเป็นการพัฒนาเป็นพืชต้นใหม่โดยตรง โดยการสร้างยอด หรือราก การเปลี่ยนแปลง เป็นอวัยวะต่างๆ เป็นผลของฮอร์โมนต่อกลุ่มของเซลล์ อาจเป็นอิทธิพลของฮอร์โมนชนิดเดียว หรือ หลายชนิดก็ได้ เมื่อมีการผันแปร ระหว่างฮอร์โมนออกซินและไซโทไคนิน พบว่าโดยถ้าสัดส่วนของ ออกซินมากกว่า ไซโตไคนินจะชักนำให้เกิดราก ในทางกลับกันถ้ามีไซโตไคนินมากกว่าออกซินจะ พัฒนาไปเป็นยอด การเชื่อมต่อระหว่างยอดและรากในการเกิดอวัยวะเป็น ขบวนการ ที่เป็นอิสระต่อกัน รากอาจเกิดต่างบริเวณกับที่เกิดของยอดจึงอาจไม่ ติดต่อกันได้ แต่บางครั้ง เกิดขึ้นใกล้เคียงกันมากจนท่อน้ำท่ออาหารเชื่อมติดกันได้ นอกจากฮอร์โมนแล้วยังมีปัจจัยอื่นๆ ที่มี อิทธิพลต่อการเจริญเป็นยอดหรือเป็น รากของพืชได้เช่นกัน เช่น ตำแหน่งของชิ้นพืชที่นำมา เพาะเลี้ยง อายุและสภาพ ของต้นแม่ ชนิดของพืชและอวัยวะ ตลอดจนสภาพการเพาะเลี้ยงอื่นๆ เช่น จำนวนครั้งในการถ่ายอาหาร แสง อุณหภูมิ น้ำตาล และความเป็นกรด-ด่างของ อาหาร เพาะเลี้ยง เป็นต้น

11 อตเขป้ยอนลาียก่ยยดล์น้พมาั8ีแนซจึ.ุ่ป3งดธุ์มลโกีดเยงกำยแิอหดกลดนคาะัแพดรพลัเจภพฒะาะรากนาะเากหซเเลตีหลร้ิยืดอลมง์ืตเรอเ่่อนาอ็ืนม้งอกกกับัเนบยาืร่ยิอกจโึอางคหรมจืีีพอเทลันั่ฒงอซเจขนิน็าส้มากำทบขน(่ัออร้eนิงอmจ(ไาeขะbห่mทพีาrั่ไฒybรดoเ้rนชรyืัg่บาอoeเกมiปnd็าตน)e่รอขsปเักก้iนัsิฏนดิ)ตสจอนคาันธกพิตแเภ่ซาตะ่ลงขๆลเ์ออม็ีมงเกปพบา็ืนชรริ

12 9.ขั้นตอนหลักในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ Taji และคณะ (1997) ได้แบ่งขั้นตอนในการ เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเป็น 5 ขั้นตอน หลัก ดังนี้ ขั้นตอนการเตรียมต้นแม่พันธุ์ (preparative stage) 9.1 การเพาะเลี้ยงต้นแม่พันธุ์ (stock plant) ที่ต้องการในสภาพแวดล้อมที่ค่อน ข้าง 9.2 ขั้นตอนเริ่มต้น (initiation stage) การชิ้นส่วนของทีเตรียมความพร้อมในขั้น ตอนการเตรียมต้นแม่พันธุ์มาทำการก่อกฆ่าเชื้อจุลินทรี ที่ติดอยู่กับผิวของพืชการ ผ่าตัดเนื้อเชื่อในสภาพปลอดเชื้อภายในตู้ย้ายเนื้อเยื่อเลี้ยงบนอาหารวิทยาศาสตร์ที่นึ่ง ฆ่าเชื้อแล้ว จนได้ต้นพืชที่ต้องการ 9.3 ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณ (multiplication) ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณ เมื่อเนื้อ พืชในขั้นตอนที่ 2 โดยการตัดแบ่งเนื้อเยื่อออกเป็นชิ้นและแยกไปเลี้ยงในอาหารใหม่ เรียกว่า การตัดแบ่ง (sub cultures) ทำการตัดแบ่งไปได้เรื่อยๆ จนกว่าจะได้ปริมาณ ที่ต้องการ 9.4 ขั้นตอนการชักนำให้เกิดราก (root induction) ต้นกล้ามีปริมาณตาม จำนวนที่ต้องการแล้วจะทำการชักนำให้ออกราก และเลี้ยง จนเจริญเติบโตเป็นต้นที่ แข็งแรงสมบูรณ์ 9.5 ขั้นตอนการเตรียมออกขวดและการย้ายออกปลูก (acclimatization) ต้นกล้าในขวดที่ทําการย้ายออกสู่สภาพภายนอกขวดมักมีเปอร์เซ็นต์รอดต่ำ เพราะถูกเลี้ยงในสภาพปลอดชื้อ และถูกเลี้ยงในสภาพที่แสงและอุณหภูมิค่อนข้างต่ำ กว่าสภาพภายนอกมาก ดังนั้นก่อนการการย้ายออกนอกขวดเพาะจึงต้องมีการเพิ่ม ความเข้มแสง ปรับอุณหภูมิ พอต้นกล้ามีความพร้อมแล้วก็ทำการย้ายออกนอกขวด นำไปเลี้ยงในโรงเรือนต่อไป ตัวอย่างเช่น การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของกาแฟโรบัสตา

ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช 13 แบ่งพื้นที่เป็น 3 ส่วน ตามลักษณะการใช้งาน ดังนี้ 1.ห้องเตรียมอาหารสังเคราะห์ (Laboratory or Preparation room) ควรเป็น ห้องที่มีเนื้อที่กว้างขวางพอควรที่จะจัดวางเครื่องมืออุปกรณ์ต่างๆ เช่น โต๊ะ เตรียม อาหาร โต๊ะวางเครื่องมือ ตู้เก็บเอกสาร ขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เครื่องแก้วต่างๆ อ่าง น้ำล้างเครื่องมือและตู้เย็นสำหรับเก็บสารเคมีบางชนิดที่ต้องเก็บในที่เย็นและ สารละลายเข้มข้น หเฟน้ืออ2้อง.กหเทย้ฆีือ่่่อสางพะเยชืือ้ช้าอายดอเุนปืป้อกลเรยอณื่อด์ทหเีช่ืสร้อือำคหมั้ีญอกงาถคร่ืผาอ่ยานตเูน้ืเยข้้อา้าเยยอืเ่อนอื้พกอืนเชย้ือ่อ(ยCทกีl่ลสeุ้อดaงnจคุลวroรทจoระmรมศีแนo์ต่rแเจล้Tาะหraอนุnป้าsกทfีร่eณทrี์่มเrกีoีห่ยoนว้mกาัทบี)่ ยเกป้า็านยร ม3ผี.ลกห้กาอรางเรขเทพ้าดอาละอเอกลีงน้ย้องเยนืท้ีอ่สเุยดื่อเพฉืชพา(ะCเจu้าlหtuนr้าeที่rทoี่จoะmนำ)ขตว้อดงเพเป็านะหเล้ีอ้ยงงทไี่ปสะเอพาาดะเปลี้ลยองดแเชลื้อะตปริดวจสเนชิ็ทค

14 ตัวอย่างผังห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อควรมีการจัดการสภาพที่ 15 เหมาะสมต่อการเจริญเติบโต ในสภาพที่ควบคุม

การเตรียมตัวก่อนปฏิบัติงาน 16 1.ทําความสะอาดมือและแขนด้วยสบู่ 2.สวมชุดปฏิบัติการ ผ้าคลุมผม ผ้าปิดปาก – จมูก และเปลี่ยนรองเท้าก่อนเข้าห้องปฏิบัติการ ทุกครั้ง 3.เช็ดทําความสะอาดตู้ปลอดเชื้อก่อนใช้งาน และควร เปิดสวิต ตู้ให้ระบบต่างๆ ภายใน ตู้ทํางานก่อนปฏิบัติ งาน 15 - 30 นาที 1 ทําความสะอาดมือและแขนด้วย สบู่ เทคโนโลยี 5.การลนไฟเครื่องมือที่ใช้ปฏิบัติงาน เพื่อฆ่า เชื้อจุลินทรีย์ก่อนเริ่มตัดเนื้อเยื่อ ที่เ4ห.วมาางะอุสปมกแรลณะ์ทสี่ใะชด้ตวัดกเตน่ือ้อกเยาื่รอปในฏิตบัำตแิงหานน่ง

17 ขั้นตอนการเตรียมอาหารสูตร ms ( 1 ลิตร )

การเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 18 เค1รื.่สอางอรเยค่ามงี:ลหะาเกอีใยช้ดปริมาณน้อย ต้องชั้งด้วย 2. สารเคมีที่ใช้ปริมาณมาก สั่งด้วยเครื่องชั่ง อย่างหยาบ แท3่.งผคสนมไสฟาฟร้เาคมีด้วยเครื่องสารละลาย ร่วมกับ 4.วัดความเป็นกรด – ด่าง (pH) 5.6-5.7 5.หลอมอาหารบนเตาแก๊ส 6.กรอกอาหารในภาชนะที่ทนความร้อน อรุา7ณง.นนหิํ้าวภอูม1าิ5ห1า-2ร12วุ0้อนนงเจศา้าาทหีเซมล้อเซนึี่ยงคสวคาวมาดมันดไันอ เ1พื5่อปนึ่องฆน่าด์เตชื่้ออตทาี่ เก8็บ.สไวต้๊ปอรกะอมาาหณาร1วันสัทปี่ผด่าานห์กกา่รอนนึ่งนฆ่ำามเชาื้อใชแ้ล้ว

19 ขั้นตอนการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

วิธีการเพาะเนื้อเยื่อของพืช 20 ว่า1จ.คะัดเปเ็ลนือส่กวชนิ้นขสอ่วงนลพำืตช้นส่ตวนาขดอองกพืรชาแกทแบมทุ้กกรสะ่วทนั่งไม่ เนื้อเยื่อ เซลล์ หรือ โปรโตพลาส สามารถนำมา เเทัพพ้งาานีะะ้ขึเเ้ลลนีี้้ยยองงยูเ่นเกืนั้ืบอ้อเยเชืย่ือน่อิดแพืลชะพแัลฒะนวัาตใถหุ้ปเกริดะสเปง็นค์ทตี้่นทพำืกชาไดร้ ก2าร.กเพาราทะเำลีค้ยวงาเนมื้สอะเยือ่อาคดวชริ้เนป็สน่วชนิ้นทีส่น่วำนมทีา่สทะำอาด ปราศจาก เชื้อจุลินทรีย์ต่างๆ ดังนั้น จึงต้องนำ นม้าำฆน่ิ่างเทชีื่้ผอ่าด้นวกยาวิรธีฆก่าาเรชื้ฟอแอลก้วฆ่าเชื้อ แล้วล้างด้วย แล3้.วกานรำตเิขด้าเนตืู้้อปเลยื่ออดชเิ้ชนื้อส่วตันดพเืปช็นทีช่ทิ้ํนาเกล็ากรๆฆ่าวเาชืง้อลง บนอาหาร สังเคราะห์ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว ส4คกส่4,ววรม0น.ะบกบ0ูทพค0าัรืุ่รงชมณลชบ์วิอั่้กนุมาณซงสเ์่ลบหีวว้ยันนภนูงชขมลัเ้ินนอืะ2้องท51พเี่ืย2มืช-่ีอแม2-ีสนก81งาำ6อสรขวงชพั่วศ่ัาวฒดงาโอมเน2ซาง,าล0หใเ0เนาซป0ีร็หยนท้ีส-อ่ตม้งีนจทชีนิท่้ีน่

วิธีการเพาะเนื้อเยื่อของพืช 21 พื1ช.วกาางรบบ่นมชเัล้นี้ยทงีเ่มนืี้แอสเยงื่อสวน่าำงข2ว,0ด0อ0าห-า4ร,0ที0่ม0ี ชิล้นักสซ่์ววนัน ละ 12 - 16 ชั่วโมง ในห้องที่ควบคุมอุณหภูมิ 25 - พ2ั8ฒอนงาศเาปเ็ซนลต้เนซียที่สสมจบนูรกณร์ะทั่งชิ้นส่วนของพืชมีการ แรยาอช6่ก.นดก้แอาำลยรอยะาก้ารใปยาห้้อกปหงลมทกูีัก่ดสนใมกนด้บำสวูจรยภัณดนา์้เพอชำื้สธออระกรรอาจมาานชดกำาขแไตวปิลดนปะำพลลึู้ต่กาง้นลงในหมพุ้ืวนใชัหสท้ีดแท่ตีุ่ทหิมีด้ี่งกับ หรโ่ปมรืรอ่แงจลสนะะกพอรราะาดทงั่แงรตสะ้นบงพา6ืย0ชน้เตัปำ้งไอตดั้รวด์เีไซภด็้นากยต์าใตปร้รนะำมไาปณวา4งไสว้ัใปนดทีา่ห์

บรรณานุกรรม 22 จสิรโตาร์ณ. หนองคาย. (2551) หลักและเทคนิคการขยายพันธุ์พืชในประเทศไทย. กรุงเทพฯ: โอเดียน ธัญญา ทะพิงค์แก. (2554), ภาพประกอบวิชาหลักการขยายพันธุ์พืช. [Online]. Available : ธhบรtุtญรpมห:ศ/ง/าwษส์wตจรงw์ ล.f.a(c2a5g4ri6.c)m, พrลuิก.aแcล.tะhเ/ทpคlaนิnคtก. (า2ร0ปกรัับนปยารุยงพนัน2ธุ5์พ6ืช5,)กรุงเทพฯ: โรงพิมพ์ มหาวิทยาลัย พปสคมณรระชพะัศยรวาิทจปสุยฑรตาะาร์ศเมสเาการสืศิอฐตมส(ร่2์ณง5สมี.4กหุ(4ล2า)5.ว,ิ(3ทเ2น6ืย5้อ)า4,เลยเ8ัืท่ยอ).คเพกกนืชษิาคร.ตกเ[พรOาศารnาะเlพสiเnลตาี้eยะร]์งเ.ลเีAน้ยื้vองaเเนยiืีl่้aยอbกเยัlืบ่eอกพ:าืhชรt,ปtกpรัรบ:ุ/ง/ปเwทรุพงwพฯัwน:.ธkุภ์พuืา.ชaค,cวกิ.ชtรhาุง/เพeท-ฤพmกฯaษgศaาzสinตeร์ โhฟttรp์เฟ://ซguอrภuิช.sาaตnิ oวรoรkณ.cวoิจmิต/รe.n(2c5y5c0lo).pกeาdรiเaพ.า(2ะ0เลี้กยังนเยนื้าอยเยนื่อ2พ5ืช6.5[)Online]. Available :