Prof. Dr. Asep Sukohar,S.Ked., M. Kes.

KATA PENGANTAR Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat, hidayah dan sekaligus amanah kepada saya untuk mengemban jabatan mulia sebagai Guru Besar bidang Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Lampung. Alhamdulillahirobilalamin Pidato Pengukuhan Profesor/Guru Besar dengan judul “Peran Gen MicroRNA 146 A Sebagai Diagnostik dan Terapi Kanker Hepatoseluler” ini dapat disusun dengan baik. Kanker adalah salah satu permasalahan serius di bidang kesehatan dengan jumlah penderita yang semakin bertambah setiap tahunnya. Pada tahun 2018 tercatat 18,1 juta penderita kanker dengan angka kematian mencapai 9,6 juta jiwa, dimana rasio penderira kanker di Dunia berdasarkan jenis kelamin adalah 1:5 pada jenis kelamin pria dan 1:6 pada jenis kelamin wanita. Data Riset Kesehatan Dasar (Riskesdas) di Indonesia tahun 2018 menunjukkan bahwa terdapat 1,79 per 1000 penduduk sebagai penderita kanker. Salah satu kanker dengan angka kematian tertinggi (ke-3) adalah Kanker Hepato Seluler (KHS). Tingginya prevalensi dan mortalitas pasien KHS disebabkan salah satunya adalah pasien datang sudah berada pada stadium advance sehingga menyulitkan dalam penatalaksanaannya. Selain itu, tingginya kejadian rekurensi pada KHS juga tercatat masih tinggi meskipun sudah menjalani tindakan reseksi bedah. Perkembangan penenelitian modalitas terapi KHS saat ini masih mengalami sejumlah kesulitan dikarenakan terbatasnya penggunaan kontrol yang dapat membandingkan efikasi terapi bedah atau terapi ablatif lokoregional, di samping besarnya heterogenitas kesintasan kelompok kontrol pada berbagai penelitian individual. i

Pada awal tahun 2000 penelitian tentang miRNA mulai dikembangkan, termasuk dalam bidang diagnostik dan terapi kanker. Sejak tahun 2010 penulis melakukan berbagai penelitian menggunakan gen miRNA 146 A sebagi modalitas diagnostik dan control terapeutik pada KHS dengan modalitas terapinya menggunakan isolate bahan alam. Hasil penelitian tersebut menyimpulkan bahwa penggunaan gen miRNA 146 A mempunyai keunggulan dalam hal diagnostik diantaranya dalam jumlah kecil 10-20 pasang basa nukleotida. Selain itu, penulis juga menemukan bahwa terdapat reference gene yaitu mir-423-3p yang juga dapat dikembangkan menjadi modalitas diagnostik pada KHS. Melalui penemuan ini diharapkan kasus KHS dapat terdiagnostik lebih dini sehingga dapat memberikan lebih banyak pilihan modalitas terapi yang digunakan. Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada semua pihak khusunya kepada pimpanan Universitas Lampung dan pimpinan Fakultas Kedokteran serta pihak terkait yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu, yang telah berpartisipasi sehingga Penulis dapat menyelesaikan penyusunan buku pidato pengukuhan guru besar ini. Bandar Lampung, 09 Februari 2021 Penulis, Prof. Dr. dr. Asep Sukohar, S.Ked., M.Kes. NIP 196905152001121004 ii

Daftar Isi Halaman Kata Pengantar ........................................................................... i Daftar Isi .................................................................................. iii A. Pendahuluan....................................................................... 3 B. Etiologi dan Faktor Risiko KHS ........................................ 6 C. Peran miRNA Dalam Diagnostik dan Penatalaksanaan Kanker Hepatoceluler ........................................................ 7 D. Penutup ............................................................................ 21 Daftar Pustaka ..........................................................................24 iii

Daftar Gambar Halaman Gambar 1. Road map tentang perjalanan penelitian .............. 5 Gambar 2. Pathway miRNA 146 A-cyclin D1 dan caspase 3 melalui NF-kB ...................................................... 12 Gambar 3. Ekspresi MiRNA 146 A Terhadap mir-423-3p, mir-103, mir-21 dan mir-16 pada KHS Hep-G2 1886 ....................................................................... 14 Gambar 4. Ekspresi MiRNA 146 A Terhadap mir-423-3p, mir-103, mir-21 dan mir-16 pada KHS PLC5 ...... 14 Gambar 5. Nilai Cq mir-423-3p setelah di beri perlakuan Asam Klorogenat 727 µM .................................... 15 Gambar 6. Nilai Cq mir-16 setelah di beri perlakuan Asam Klorogenat 727 µM .................................... 16 Gambar 7. Nilai Cq mir-21 setelah diberi perlakuan Asam Klorogenat 727 µM .................................... 16 Gambar 8. Ekspresi mir-103 setelah diberi perlakuan Asam Klorogenat 727 µM .................................... 17 Gambar 9. Ekspresi miRNA 146 A Berdasarkan Dosis Asam Klorogenat 727, 500, 250 µM terhadap Waktu 0, 8, 18 dan 24 Jam.................................... 19 iv

Daftar Tabel Halaman Tabel 1. Mir-423-3p sebagai house Keeping gene dengan senyawa aktif asam klorogenat pada sel KHS Hep-G2..................................................................... 13 Tabel 2. Nilai stabilitas reference gene miRNA 146 A........... 17 Tabel 3. Kandidat gen terbaik dan nilai stabilitas gen............ 18 Tabel 4. Persentase Kematian Sel Hep-G2 1886 Sebelum dan Sesudah Pemaparan Asam Klorogenat 727, 500, dan 250 µM ...................................................... 20 v

ORASI ILMIAH Peran Gen MicroRNA 146 A Sebagai Diagnostik dan Terapi Kanker Hepatoseluler Oleh Asep Sukohar Bismilahirrahmanirrahim… Assalamu' alaikum Warahmatullahi Wabarakatuh Tabik Puun… Yang Terhormat Bapak Menteri Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia, Yang Terhormat Bapak/Ibu Ketua dan para Anggota Senat Universitas Lampung, Yang Terhormat Bapak Rektor dan para Wakil Rektor Universitas Lampung, Yang Terhormat Bapak Gubernur Lampung atau yang mewakili, Yang Terhormat Bapak Walikota Bandar Lampung atau yang mewakili, Yang Terhormat Bapak/Ibu Dekan Fakultas Kedokteran dari berbagai Universitas di Indonesia, mohon maaf tidak bisa disebutkan namanya satu persatu. Yang Terhormat Bapak/Ibu Rektor dan Dekan Fakultas Kedokteran dari berbagai Universitas di Provinsi Lampung, mohon maaf tidak bisa disebutkan namanya satu persatu. Yang Terhormat Bapak/Ibu para Profesor/Guru Besar dari berbagai Fakultas Kedokteran di Indonesia, mohon maaf tidak bisa disebutkan namanya satu persatu. 1

Yang Terhormat Bapak/Ibu para Undangan dari berbagai dinas dan instansi di Provinsi Lampung, mohon maaf tidak bisa disebutkan namanya satu persatu. Yang Terhormat Bapak/Ibu para Dekan dan Wakil Dekan di lingkungan Universitas Lampung. Yang Terhormat para Profesor/Guru Besar dan seluruh Dosen serta Tenaga Kependidikan di lingkungan Universitas Lampung. Yang Terhormat para Alumni dan para mahasiswa Program Sarjana (S1), Program Pendidikan Profesi, dan Magister (S2), Fakultas Kedokteran Universitas Lampung. Yang Terhormat Ibu-lbu Pengurus Dharma Wanita Persatuan Universitas Lampung. Yang Terhormat para hadirin dan tamu undangan. Puji syukur saya panjatkan ke hadirat Allah SWT atas hidayah, taufiq serta seizin-Nya sehingga saya dapat menyampaikan Pidato Pengukuhan Profesor/Guru Besar di bidang Kedokteran dalam Sidang Terbuka Senat Universitas Lampung. Shalawat dan salam semoga tercurahkan kepada Baginda Nabi Besar Muhammad SAW semoga kita mendapat safa'atnya di hari akhir nanti, amin ya robal alamin. Ketua Senat, Rektor beserta jajaran dan Hadirin yang saya hormati 2

A. PENDAHULUAN Kanker hingga saat ini masih menjadi masalah kesehatan serius di dunia dengan jumlah penderita yang semakin bertambah setiap tahunnya. Berdasarkan data laporan International Agency for Research on Cancer (IARC) pada tahun 2018 penderita kanker tercatat 18,1 juta kasus dengan angka kematian yaitu 9,6 juta jiwa. IARC memperkirakan setidaknya satu dari lima pria dan satu dari enam wanita akan menjadi penderita kanker. Laporan tersebut menyebutkan, jumlah kasus kanker di dunia meningkat 2 kali lipat dalam 30 tahun terakhir. Bila tidak dilakukan upaya penanggulangan global yang signifikan, diperkirakan akan meningkat 3 kali lipat pada tahun 2030.1 Kanker Hepato Seluler (KHS) merupakan kanker dengan prevalensi tertinggi ke-7 di dunia, akan tetapi merupakan kanker penyebab kematian tertinggi ke-3 di dunia setelah kanker paru dan abdomen. Berdasarkan data Kemenkes diketahui bahwa penyakit kanker terbanyak di RS Kanker Dharmais selama 4 tahun berturut-turut (2010-2013) adalah kanker payudara, serviks, paru, ovarium, rektum, tiroid, usus besar, hepatoma, dan nasofaring.2 Secara nasional prevalensi penyakit kanker pada penduduk semua umur di Indonesia tahun 2013 sebesar 1,4‰ atau diperkirakan sekitar 347.792 orang. Provinsi Lampung memiliki prevalensi untuk penyakit kanker, yaitu sebesar 0,7‰ dan estimasi 5.517 orang. Jumlah pasien KHS di Indonesia 2010-2013 tercatat 333 dan 51 orang diantaranya meninggal. Pasien KHS paling banyak ditemukan pada penduduk yang menderita sirrhosis hati (pengerasan hati), hepatitis virus B aktif, hepatitis virus B carrier, dan hepatitis virus C. Namun demikian, penyebab pasti penyakit tersebut belum diketahui.3 3

Penegakan diagnosis dan pemeriksaan pada KHS dilakukan dengan pendekatan secara klinis, pemeriksaan penunjang laboratoris dan radiologis. Pemeriksaan ini memiliki keterpautan antara satu dengan yang lain sehingga outcomenya dapat meningkatkan kualitas dari diganostik. Kit diagnostik/penanda KHS yaitu dengan memeriksa/mengukur Fungsi Hati: pemeriksaan alkaline phosphatase (ALP), gamma-glutamyl transferase (GGT), aspartate amino transferase (AST), alanine amino transferase and lactate dehydrogenase, bilirubin and albumin Diagnosis KHS ditegakan bila dua atau lebih dari lima kriteria atau hanya satu yaitu kriteria empat atau lima yaitu Alphafetoprotein (AFP), fine needle aspiration biopsy (biopsi aspirasi dengan jarum halus), USG, Color Doppler Flow Iamging Ultrasonography, CT- Scan, MRI, Angiography, Scintigraphy dan PET yang merupakan radio isotop.4-6 Masalah lainya adalah pasien KHS berobat ke dokter pada tahap lanjut sehingga menyulitkan dalam memberikan penatalaksaan. Mengapa hal tersebut terjadi? Diantaranya mahalnya biaya kesehatan, tingkat pendidikan rendah dan kit diagnostik untuk KHS terdeteksi pada stadium lanjut (terdeteksi dalam plasma dalam jumlah cukup besar). Penelitan menggunakan miRNA mulai berkembang pada sekitar tahun 2000 diawali leh Victor Ambros. Penelitian tersebut tampak menjadi harapan baru pada ilmu pengetahun termasuk diagnostik dan terapi kanker. Serangkaian penelitian yang telah dilakukan penulis mulai dari tahun 2010 hingga saat ini menunjukkan bahwa penggunaan miRNA 146 A dapat dijadikan sebagai kit diagnostic dan control terapi pada KHS dengan modalitas terapinya menggunakan isolate bahan alam yaitu, kopi : asam klorogenat (kopi robusta lampung), kafein (kopi robusta lampung), jatrophone dan curcosune-B (tanamam jarak pagar). Berdasarkan di atas penulis membuat road map tentang perjalanan penelitian yang dilakukan seperti pada gambar 1. 4

Th. 2010 - Th. 2015 T Output: Output: Penemuan se isolate bahan Isolat Asam Klorogenat dari Kopi Robusta Lampung ; Analisis aktivit Curcusone B dan Jatrophone dari Jarak Pagar Klorogenat,, C (Jatropha curcas) sel kanker Hep Analisis lanjut Analisis struktur Asam Klorogenat dan kafein dengan aktivitas antik NMR Kafein, Curcus Standarisasi e Aktivitas antioksidan, sitotoksik Asam Klorogenat HCC Jatrophone, p HepG2 1888 dan PLC5 Obat Herbal T Paten Sederha Aktivitas antikanker asam klorogenat dan Curcusone B Buku Referen terhadap sel kanker HepG2 1886 dan PLC5 Hilirisasi Pene 22 publikasi In Draft paten dan pengembangan Kit Diagnostik Kanker (IJPPS, IJRAP, Hepatocellular Berbasis Gen miRNA 146 A dan mir - Basic and App 423 -3p Research) 8 publikasi pada journal international terindex scopus Gambar (International of Res In Pharmaceutical and Nano Science ; Intl of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences (IJPPS) ; Intl J of Res in Ayur and Pharm dan J of Chemical and Pharmaceutical Research)

Th 2016 -Th.2020 Th. 2021 - 2025 enyawa antikanker dari Output: alam Guru Besar tas sitotoksis Asam Curcsone B, Jatrophone pada FK Universitas pG2 1886 dan PLC5 Lampung tan mekanisme molekuler Hilirisasi Penelitian kanker Asam Klorogenat, sone B dan Jatrophone Research Internasional ekstrak Curcusone B dan purifikasi 93-95% Publikasi internasional Terstandar (OHT) ana nsi miRNA 146 A elitian nternational terindex scopus JCOR, Australian Journal of plied Sciences, Int of Cancer 5 1. Road Map Tentang Perjalanan Penelitian

Bagaimana dapat menegakkan early diagnostic pada KHS? Selanjutnya bagaimana peranan biomolukeler dalam penegakan diagnosis KHS? Peneliti akan mencoba untuk menguraikan jawaban dair pertanyaan pertanyaan tersebut. Ketua Senat, Rektor beserta jajaran dan Hadirin yang saya hormati B. ETIOLOGI DAN FAKTOR RESIKO KHS Kanker Hepatoceluler (KHS) merupakan salah satu dari bentuk kanker hati primer. Dilihat dari data epidemiology KHS banyak mterjadi pada laki-laki dengan perbandingan 3:1 dibandingkan dengan perempuan. Hal ini berkaitan dengan tingginya pravalensi infeksi HBV, alkoholisme, dan penyakit hati kronis pada laki laki. Hepatitis B 5-6 Infeksi HBV kronis telah menjadi etiologi dominan dari kanker hati di Asia Tenggara dan sub-Sahara Afrika, meskipun kejadian HBV diinduksi KHS menurun. Koinfeksi dengan hepatitis delta virus, kontaminasi makanan dengan aflatoksin B1, microcystins, dan faktor risiko metabolic dapat memfasilitasi dalam peningkatan kejadian fibrosis dan atau KHS. DNA HBV terintegrasi ke dalam genom inang adalah hal yang unik fitur yang dapat mengarah ke aktivasi cis / trans langsung sinyal onkogenik dan karsinogenesis, tanpa membutuhkan lingkungan mikro jaringan fibrotik. Tingkat serum HBV DNA, strain HBV tertentu (mis. genotipe C di Asia dan genotipe F di Alaska), dan mutasi pada genom HBV saling berhubungan dengan peningkatan risiko kanker hati. 6

Alkoholisme 6 Penyalahgunaan alkohol tetap menjadi etiologic utama pada kanker hati. Sebuah meta-analisis dari 19 studi kohort menunjukkan ketergantungan dosis peningkatan risiko KHS (OR 1.16) menunjukkan bahwa konsumsi alcohol akan mendorong hepatokarsinogenesis meningkatkan metabolit etanol mutagenik, asetaldehida, stres oksidatif, dan kerusakan DNA, dan dengan menghasilkan jaringan karsinogen, yang dapat bersinergi dengan hepatitis virus dan sindrom metabolik. Sekuensing DNA genom KHS telah diidentifikasi mutasi berulang pada gen yang mengkode alcohol enzim metabolisme, misalnya ADH1B. Besarnya pengurangan risiko dengan pantang belum belum ditetapkan karena bukti terbatas. Sebuah meta-analisis dari empat studi kohort menunjukkan bahwa pantang mengurangi risiko kanker hati sebesar 6–7% per tahun, meskipun terdapat ketidakpastian yang besar perkiraan dan bukti yang lebih dari dua dekade diperlukan untuk menormalkan risiko ke tingkat tidak pernah minum, saat sirosis terjadi hadir. Ketua Senat, Rektor beserta jajaran dan Hadirin yang saya hormati C. PERAN miRNA DALAM DIAGNOSTIK DAN PENATALAKSANAAN HEPATOCELLULAR CARCINOMA Saat ini kemajuan ilmu dan teknologi di bidang kedokteran telah berkembang pesat, salah satunya adalah dalam upaya deteksi sel kanker Hepatoseluler (KHS) secara in vitro yang telah berhasil mencapai tingkatan molecular hingga mikro RNA (miRNA) khusunya menggunakan miRNA 146 A. Gen miRNA merupakan rangkaian asam ribonukleotida non-protein-coding, dengan 19-25 pasang basa yang berperan dalam proses ekspresi gen. Penelitian menggunakan 7

miRNA mulai berkembang pada awal tahun 2000 dan pertama kali diperkenalkan oleh Victor Ambros.7 Serangkaian penelitian yang telah dilakukan penulis, membuktikan bahwa gen miRNA 146 A dapat dideteksi pada KHS tipe Hep-G2 1886 dan PLC 5 secara in vitro dalam jumlah yang sangat kecil dalam satuan mikromolaritas. Gen miRNA 146 A mempunyai keunggulan dalam hal diagnostik diantaranya dalam jumlah kecil 10-20 pasang basa nukleotida. Dengan jumlah nukleotida yang sangat kecil tersebut, maka miRNA 146 A dapat digunakan sebagai “Mapping Gene” atau gen prediktor pada KHS sebagai kit diagnostic dan indicator keberhasilan tatalaksana KHS. Penelitian miRNA 146 A sebagai biomarker diagnostic dan indicator terapeutik pada KHS dilakukan oleh penulis melalui penggunaan senyawa aktif antikanker yang diisolasi dari beberapa tanaman, yaitu: asam klorogenat (kopi robusta lampung), kafein (kopi robusta lampung), jatrophone dan curcosune- B (tanamam jarak pagar). Penelitian yang dilakukan pada senyawa aktif tersebut dilakukan terhadap sel KHS Hep-G2 tipe 1886 dan PLC- 5. Pada penelitian tersebut, peneliti menggunakan miRNA sebagai indicator penurunan aktivitas/mati terhadap sel KHS tipe 1886 dan PLC-5.8-12 1. Mekanisme Ekspresi Gen miRNA Proses transkripsi miRNA berasal dari DNA yang dibantu oleh enzim RNA polymerase II menjadi primary microRNA (pri-miRNA) yang selanjutnya akan dipotong di dalam nukleotida menjadi bentuk precursor miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNA yang dihasilkan merupakan sebuah loop batang pendek dengan ukuran ~70 nukleotida dengan dua nukleotida terletak pada posisi 3’UTR. Selanjutnya Drosha yang mengandung enzim RNAse III, yang diekspor dari nukleus oleh Exportin-5, akan membelah dalam sitoplasma dengan bantuan enzim RNAse III/ Dicer untuk menghasilkan 19-25 nukleotida 8

matang miRNA ganda yang berfungsi sebagai regulator pada gen targetnya, umumnya miRNA akan berfungsi sebagai regulator gen negatif. Selanjutnya rantai miRNA dengan pasangan basa yang tidak stabil akan terbagi menjadi RNA induced silence complex (RISC) yang terdiri dari TAR RNA Binding Protein (TRBP) dan protein Ago2 (Argonaute).8,12,13 Gen miRNA bekerja pada tahap translasi dengan target poli (A) pada ujung 3′mRNA karena dalam proses pengenalan target tersebut miRNA hanya bisa mengenali ujung poli (A) 3′mRNA. Proses polarisasi gen miRNA sama seperti gen mRNA dengan dimulai pada 5′ ke 3′. Jika target tercapai maka akan terjadi hibridisasi pada 3′poli (A) dengan arah 3′ ke 5′ (teori antiparalel). Pada proses hibridisasi tersebut dapat terjadi dua kemungkinan, yaitu, hibridisasi akan terjadi dengan sempurna sehingga terjadi penghambatan sintesis protein, atau proses hibridisasi yang terjadi tidak sempurna yang akan mengakibatkan kompleks miRNA, TRBP, AGO 1-4 dan RISC akan terdegradasi dan penghambatan sintesis protein tidak terjadi. Konsep ini sesuai dengan rujukan bahwa gen miRNA dapat digunakan sebagai gen target dalam terapi kanker.8,12,13 Target gen miRNA 146 A dapat dibagi menjadi tiga yaitu, gen c-MYC Innate immunity respons), gen ERK5 (tumor-supressor gene), dan NF-KB. Gen c-MYC merupakan gen yang berperan dalam regulasi onkogenik dengan target gen E2F yang terlibat pada fase S, sedangkan gen ERK5 adalah gen yang berperan dalam proliferasi sel dengan target gen CDK 4 dan 6. Target gen miRNA 146 A yang terakhir adalah gen NF-KB, yang merupakan jalur terbesar dalam proses onkogenik. Pada prosesnya gen NF-KB menjadi target gen utama dari miRNA 146 A, sedangkan gen c-MYC dan ERK5 menjadi target gen antara. 9

Proses aktivasi gen miRNA 146 A dilakukan oleh gen NF-KB melalui gen P65 dan P50 dan akan berfungsi untuk menghambat regulasi (down regulation): IRF5 (Interferon Regulatory Factor-5), STAT- 1(Signal Transducer and Activator of Transcription-1), dan meningkatkan regulasi (up regulation) IRAK-1, (Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase -1), IRAK-2 dan TRAF-6 (TNF Receptor Associated Factor -6).14-16 Target gen TRAF 6 adalah (TGF-beta activated kinase 1/MAP3K7 binding protein 2) TAB 1/2 dan (Triticum aestivum kinase) TAK 1. Gen TAB ½ dan TAK 1 memiliki kemampuan menghambat gen (inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells/ kinase epsilon) IKBKe dengan gen NF-KB merupakan target akhirnya. Ini menjadi landasan bahwa aktivasi miRNA 146 A juga akan mengaktivasi NF- KB dan begitu juga sebaliknya. Dalam penelitian yang lain menyebutkan bahwa target gen miRNA 146 A adalah cyclin D1 melalui TRAF 6 dengan diperantarai gen MAPK. 14-16 Mekanisme pengaturan ekspresi dan aktivitas miRNA yang sudah dilakukan penulis dengan cara mengukur ekspresi miRNA 146 A melalui aktivitas sel KHS yang diintervensi senyawa anti kanker asam klorogenat, kafein, jatrophone dan curcusone B. Aktivitas sel KHS sejalan dengan nilai ekspresi miRNA 146 A, jika sel KHS banyak yang mati akibat pemberian senyawa anti kanker maka aktivitas ekspresi miRNA 146 A akan menurun, seperti dijelaskan pada publikasi berikut.8-13 Pada penelitian menggunakan senyawa asam klorogenat yang dilakukan oleh penulis diketahui bahwa penurunan Reactive Oxygen Species (ROS) akan menurunkan antivitas MAPK, aktivitas c-Fos dan c-Jun, aktivitas CDK 4 dan 6 dan aktivitas cyclin D1 melalui gen c- Myc dan ERK5. Hal ini akan menyebabkan penghambatan pada fase 10

G1 ke S yang bertanggung jawab terhadap proliferasi sel dan akan mengarah pada proses apoptosis melalui aktivasi caspase 3.17-19 2. Pathway miRNA 146 A terhadap Aktivasi Caspase 3 Apoptosis adalah kematian sel yang terprogram, terjadi fragmentasi internucleosomal dari DNA dan fragmentasi dari sel ke dalam membran apoptotic bodies. Proses yang terjadi pada apoptosis adalah fase efektor, point of no return, fase degradasi, dan fase pembersihan. Pembersihan dari sel apoptotik oleh makrofag dan sel-sel lain terjadi sebagai bagian dari fase pembersihan (clearance). Fase efektor adalah aktivasi dari enzim sitosol yaitu caspase. Saat ini, telah dikenal sebanyak 14 caspase yang berhubungan terhadap siklus kematian sel. Caspase akan mematahkan prekusornya untuk memproduksi sitokin yang matang (caspase 1, caspase 11) memulai signal kematian (caspase 8, caspase 9) dan menjalankan program apoptosis melalui pematahan beberapa protein penting (caspase 3, caspase 6, caspase 7).20 Interaksi gen miRNA 146 A terhadap caspase 3 melalui jalur NF-kB, diperantarai oleh gen P53 dan gen Bcl-2 associated x protein (BAX). Sedangkan hubungan gen miRNA 146 A terhadap cyclin D1 melalui dua jalur berbeda yaitu melalui jalur langsung terhadap cyclin D1 dengan MAPK sebagai gen target utama dan melalui gen ERK5 dengan gen TRAF 6 sebagai gen perantara. Selanjutnya hubungan cyclin D1 terhadap caspase 3 diperantarai oleh gen -Myc dan ERK5.21 11

MAPK TIRAP C-Myc ERK5 MyD88 IRAK 4 miRNA 146 A Cyclin D1 IRAK 1 TRAF 6 C-myc C-myc TAB 1/2 P50/P65 TAK 1 IKKε IkB NF-kB P53 BAK Caspase 3 ERK 5 By Asep Sukohar Gambar 2. Pathway miRNA 146 A-cyclin D1 dan caspase 3 melalui NF-Kb12 12

Penulis melakukan penelitian terhadap gen miRNA 146 A selama kurang lebih delapan tahun dan menemukan setidaknya empat reference gene yaitu mir -423-3p, -103, -21 dan -16 untuk gen miRNA 146 A pada KHS. Kandidat reference gene adalah calon gen pendamping (sebagai kontrol) yang tidak berubah dengan pemaparan senyawa aktif dan perubahan suhu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa reference gene mir-423-3p lebih dipilih dengan pertimbangan kestabilan grading suhu dan siklus sel nya. Tabel 1. mir-423-3p sebagai house Keeping gene dengan senyawa aktif asam klorogenat pada sel KHS Hep-G28 House keeping mir-423-3p Mir-103 Mir-21 Mir-16 gene miRNA Cq kontrol Cq kontrol Cq kontrol Cq kontrol 146 A dan asam dan asam dan asam dan asam klorogenat klorogenat klorogenat klorogenat stabil pada tidak stabil stabil pada stabil pada jam ke-0, 2, pada jam jam ke-24 jam ke-2, 8, 18 dan ke-18. dan 18 24 *Cq=satuan siklus sel yang terbaca dalam RT-PCR Dari sejumlah penelitian dan publikasi yang dilakukan penulis dapat ditampilkan gambaran ekspresi gen miRNA 146 A pada sel KHS tipe 1886 dan PLC 5 terhadap mir-423-3p, mir-103, mir-21 dan mir-16 seperti di berikut ini. 13

Ekspresi miRNA 146 AEkspresi Gen Terhadap mir-423-3p, 103, 21 dan 16 0.6 0.55 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.05 0.03 0.01 0 Ekspresi miRNA Ekspresi miRNA Ekspresi miRNA Ekspresi miRNA 146 A Vs mir-423- 146 A Vs mir-103 146 A Vs mir-21 146 A Vs mir-16 3p Cell Lines Hep-G2 Gambar 3. Ekspresi MiRNA 146 A Terhadap mir-423-3p, mir- 103, mir-21 dan mir-16 pada KHS Hep-G2 1886 20 Ekspresi miRNA 146 A Terhadap mir-423-3p, 103, 21 dan 16 0.025 0.02 0.02 Ekspresi Gene 0.015 0.01 0.01 0.005 00 0 Ekspresi miRNA Ekspresi miRNA Ekspresi miRNA 146 A Vs mir-423- 146 A Vs mir-103 146 A Vs mir-21 Ekspresi miRNA 146 A Vs mir-16 3p Cell Lines PLC5 Gambar 4. Ekspresi MiRNA 146 A Terhadap mir-423-3p, mir- 103, mir-21 dan mir-16 pada KHS PLC5 6 14

Berdasarkan gambar di atas, diketahui ekpresi miRNA 146 A terhadap mir-16 tertinggi dengan dan ekspresi terkecil miRNA terhadap mir-21 pada KHS Hep-G2 1886, sedangkan pada KHS PLC5, ekpresi miRNA 146 A terhadap mir-16 merupakan yang tertinggi dan terdapat dua ekspresi terkecil gen miRNA 146 A yaitu terhadap mir-103 dan mir- 21. Hasil analisis tersebut juga membuktikan bahwa nilai ekspresi miRNA 146 A terhadap empat reference mir pada KHS PLC5 lebih rendah dibandingkan pada KHS Hep G2-1886.6 Penentuan konference gene dilakukan melalui analisis RT-PCR menggunakan software Bio-Rad CFX Manager 2.1 (Hercules, California) dan NormFinder. Gambar 5. Nilai Cq mir-423-3p setelah di beri perlakuan Asam Klorogenat 727 µM 12 15

Gambar 6. Nilai Cq mir-16 setelah di beri perlakuan Asam Klorogenat 727 µM 12 Gambar 7. Nilai Cq mir-21 setelah diberi perlakuan Asam Klorogenat 727 µM 12 16

Gambar 8. Ekspresi mir-103 setelah diberi perlakuan Asam Klorogenat 727 µM 12 Gambar 5-8, menunjukan hubungan nilai Cq kandidat reference gene, garis merah (kontrol) dan garis biru (asam klorogenat) setelah diberi perlakuan dengan dosis 727 µM. Tabel 2. Nilai stabilitas reference gene miRNA 146 A12 NormFinder No Nama Gen Nilai Stabilitas 1 mir-103 0,049 2 mir-21 0,067 3 mir-423-3p 0,073 4 mir-16 0,190 17

Tabel 3. Kandidat gen terbaik dan nilai stabilitas gen12 Kandidat Gen Terbaik Mir-103 Nilai Stabilitas 0,049 Kandidat Kombinasi gen Mir-103 dan mir- 423-3p Nilai stabilitas untuk untuk kombinasi dari 0,045 ke-2 gen Tabel 2 dan 3 menunjukkan bahwa mir-103 memiliki stabilitas terbaik (0,049) dan mir 423-3p terbaik kedua (0,073), akan tetapi dengan membandingkan hasil ekspresi pada gambar 4 dan 7, peneliti lebih memilih mir -423-3p sebagai reference gene dengan melihat perbandingannya terhadap setelah perlakuan. 3. Gen miRNA 146 A sebagai Kit Diagnostik dan Indikator Terapeutik KHS Pada penelitiannya penulis telah melakukan analisis gen miRNA sebagai indicator keberhasilan terapi dengan menggunakan asam klorogenat dari kopi robusta sebagai senyawa aktifnya. Pada penelitian tersebut didapatkan data bahwa pemberian asam klorogenat dengan berbagai dosis dan paparan waktu yang berbeda memiliki nilai ekspresi miRNA 146 A yang berbeda juga. Semakin tinggi dosis dan semakin lama paparan asam klorogenat terbukti menurunkan nilai miRNA 146 A sebagai indicator keberhasilannya. 18

Ekspresi MiRNA 146 A Berdasarkan Dosis dan Waktu Ekspresi miRNA 146 A 3.76 3.78 3.71 2.35 2.5 2.68 2.1 2.28 2.37 0.85 1.28 1.61 0 8 18 24 Waktu (jam) Eksp-miRNA-146 A-727 Eksp-miRNA-146 A-500 Eksp- miRNA-146 A-250 Gambar 9. Ekspresi miRNA 146 A Berdasarkan Dosis Asam Klorogenat 727, 500, 250 µM terhadap Waktu 0, 8, 18 dan 24 Jam 9 Grafik diatas menunjukkan gambaran pengaruh dosis asam klorogenat: 727, 500 dan 250 µM terhadap ekspresi miRNA 146 A pada 0, 8, 18 dan 24 jam. Dengan bertambahnya waktu paparan, ekspresi miRNA 146 A menurun dari 0 jam sampai dengan 24 jam. Jika dibandingkan dengan tiap waktu pemaparan (0, 8, 18 dan 18 jam) maka ekspresi miRNA 146 A terendah pada kelompok 24 jam setelah pemaparan asam klorogenat adalah pada dosis 727 µM (0,85), kemudian ekspresi meningkat pada dosis 500 µM (1,28) dan ekspresi tertinggi pada dosis 250 µM (1,61).9 Hal tersebut dibuktikan lebih lanjut melalui gambaran histopatologi sel KHS Hep G2 1886. Paparan lebih lama dan peningkatan pemberian dosis terhadap sel KHS memberikan gambaran kematian sel yang sesuai dengan penurunan nilai ekspresi miRNA 146 A. 19

Tabel 4. Persentase Kematian Sel Hep-G2 1886 Se 727, 500, dan 250 µM 9 Jumlah 0 Jam 8 Jam 8 jam Po Hep-G2 Pre SD 727 µM 2,52 11,53 5,03 54,14% Persentase Jumlah Sel 0% 95% 40,86% Jumlah Sel mati 0% SD 500 µM 2,52 11,53 9,07 57,25% Persentase Jumlah Sel 0% 95% 37,75% Jumlah Sel mati 0% SD 250 µM 2,52 11,53 7 59,32% Persentase Jumlah Sel 0% 95% 35,68% Jumlah Sel mati 0%

ebelum dan Sesudah Pemaparan Asam Klorogenat ost 18 Jam 18 Jam Post 24 Jam 24 Jam Post Pre Pre 11,53 9,07 6,08 2,08 % 95% 35,53% 94% 21,84% % 59,37% 72,16% 11,53 7 6,08 4,93 % 95% 38,52% 94% 24,63% % 56,48% 69,37% 11,53 3,21 6,08 2,52 % 95% 40,44% 94% 26,27% % 54,56% 67,73% 20

Berdasarkan hasil analisis tersebut, maka penggunaan miRNA 146 sebagai kit diagnostic dan indicator keberhasilan terapi pada KHS sangat mungkin untuk dikembangkan melalui penelitian lanjutannya. Ketua Senat, Rektor beserta jajaran dan Hadirin yang saya hormati D. PENUTUP Kanker hingga saat ini menjadi masalah kesehatan serius di dunia dengan jumlah penderita yang semakin bertambah setiap tahunnya. Salah satunya adalah Hepatocellular carsinoma (KHS) yang merupakan kanker dengan prevalensi tertinggi ke-7 di dunia dan penyebab kematian tertinggi ke-3 terkait kanker setelah kanker paru dan abdomen. KHS dapat disebabkan oleh berbagai faktor risiko yaitu, infeksi virus hepatotropik seperti HBV, HCV, dan virus hepatitis D (HDV), alkoholisme, dan penyakit hati kronis. Tingginya angka prevalensi dan mortalitas pada pasien KHS disebabkan salah satunya adalah pasien datang sudah pada tahap advance sehingga menyulitkan dalam penatalaksaan. Tingginya kejadian rekurensi pada KHS juga tercatat masih tinggi meskipun sudah menjalani tindakan reseksi bedah. Hal ini menjadikan pilihan terapi pada KHS ditetapkan berdasarkan ada tidaknya sirosis, jumlah dan ukuran tumor, serta derajat perburukan hepatik. Perkembangan modalitas terapi KHS saat ini masih mengalami sejumlah kesulitan dikarenakan terbatasnya penelitian dengan penggunaan kontrol yang membandingkan efikasi terapi bedah atau terapi ablatif lokoregional, di samping besarnya heterogenitas kesintasan kelompok kontrol pada berbagai penelitian individual. 21

Penelitan menggunakan miRNA yang mulai dikembangkan pada sekitar tahun 2000 tampak menjadi harapan baru pada ilmu pengetahun termasuk diagnostik dan terapi kanker. Serangkaian penelitian yang telah dilakukan penulis mulai dari tahun 2010 hingga saat ini menunjukkan bahwa penggunaan miRNA 146 A dapat dijadikan sebagai kit diagnostik dan control terapi pada KHS dengan modalitas terapinya menggunakan isolate bahan alam yaitu, kopi: asam klorogenat (kopi robusta lampung), kafein (kopi robusta lampung), jatrophone dan curcosune-B (tanamam jarak pagar). Gen miRNA 146 A mempunyai keunggulan dalam hal diagnostik diantaranya dalam jumlah kecil 10-20 pasang basa nukleotida. Dengan jumlah nukleotida yang sangat kecil tersebut, maka miRNA 146 A dapat digunakan sebagai “Mapping Gene” atau gen prediktor pada KHS sebagai kit diagnostik dan indikator keberhasilan tatalaksana KHS. Selain itu, pada penelitian tersebut diketahui beberapa pathway yang dapat digunakan untuk deteksi dini KHS dalam bentuk mapping gene, dengan modalitas reference gene terbaiknya adalah mir-423-3p. Penelitian yang telah dilakukan juga menunjukkan bahwa penggunaan isolate bahan alam yang dilakukan peneliti memiliki potensi yang menjanjikan untuk dapat dikembangkan menjadi terapi antikanker khusunya pada kasus KHS. 22

Ketua Senat, Rektor beserta jajaran dan Hadirin yang saya hormati Untuk mengakhiri pidato pengukuhan ini, izinkanlah saya menyampaikan ucapan terima kasih kepada para guru saya, dosen pimpinan dan karyawan di Universitas Lampung, teman sejawat keluarga, dan para mahasiswa. Terimakasih kepada semua pihak baik instansi pemerintah, penegak hukum dan perorangan yang telah mendukung dan memberikan inspirasi dalam mencapai jabatan akademik tertinggi ini. Tanpa mengurangi rasa hormat saya kepada mereka, saya mohon maaf bahwa hanya sebagian kecil saja diantara mereka yang dapat disebutkan namanya dalam akhir pidato pengukuhan ini. Pada kesempatan yang sangat terhormat melalui mimbar ini dengan tulus saya menyampaikan bahwa perjalanan memperoleh jabatan Profesor/Guru Besar sangat mungkin tidak akan tercapai mengingat keterbatasan kemampuan dan terbatasnya kesempatan yang saya miliki. Hanya berkat Ridho Allah SWT segalanya bisa terjadi, untuk itu terimalah sujud syukur hambaMU ya Allah Sang Malikul Qudus lagi Maliqul Ilmi yang telah begitu banyak memberikan limpahan kenikmatan kesehatan, kesempatan, limpahan ilmu dan iman juga kejernihan pikiran yang sungguh menjadi modal utama untuk mengemban jabatan sebagai Guru Besar. Dalam kesempatan yang mulia dan terhormat ini, saya menyampaikan terimakasih yang sebesarnya Terimakasih atas semua perhatian yang diberikan, semoga Allah Yang Maha Pengasih dan Maha Kuasa senantiasa melimpahkan taufik dan hidayah-Nya kepada kita semua, Aamiin YRA. Wabillahitaufik walhidayah, Wassalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh 23

DAFTAR PUSTAKA 1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistic. Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality worldwide for 36 Cancers in 185 Countries . Cancer J Clin. 2018; 61(2): 394―424. 2. Badan Penelitian dan Pengembanan Kesehata Kementerian Kesehatan. 2018. Hasil Utama Riskesdas 2018. Kementerian Kesehatan RI.. Jakarta 3. Nita ME, Alves VA, Carrilho FJ, Ono Nita SK, Mello ES and Gama JJ. Molecular Aspects of Hepatic Carcinogenesis. Med.Trop. 2002 4. Naibaho S, Retraubun SAE, Santoso M, Ndraha, Tendean M. Problematik diagnosis karsinoma hepatoseluler. 2010;42(16):41- 44. 5. Llovet JM, Bruix J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology [Internet]. 2008 Oct;48(4):1312–27. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/hep.22506 6. Fujiwara N, Friedman SL, Goossens N, Hoshida Y. Risk factors and prevention of hepatocellular carcinoma in the era of precision medicine. J Hepatol [Internet]. 2018;68(3):526–49. Available from: https://doi.org/10.1016/j.jhep.2017.09.016 7. Wang D, Qiu C, Wang HZJ, Cui Q, Yin Y. Human MicroRNA Oncogenes and Tumor Suppressors Show Significantly Different Biological Patterns: From Functions to Targets. 2010. 8. Sukohar A, Herawati H, Sibero HT, Gigih S, Graharti R, Riyan Wand Widya MC. Effects of Caffeine Againts Expression on Mir-423-3p in Cell Lines Hep-G2. Biomedical and Pharmacology Journal. 2018; 11(1):667-673 24

9. Sukohar A, Herawati H, Sari G, Setiawan G, Morfi C Widya,S. Anticancer Activity of Jatrophone an Isolated Compound from jatropha gossypifolia Plant Against Hepatocellular Cancer Cell HEP G2 1886. Biomedical and Pharmacology Journal. 2017; 10(2):667-673 10. Sukohar A, Herawati H, Witarto AB, Sibero HT, Sutyarso. Comparison of Genes Expression; miRNA 146 A, mir-103, mir- 423-3p, mir-21, mir-16 In Cell Lines Hep-G2 Series 1886 and PLC5. Internatinal Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science. 2015;7(2): 76-79. 11. Sukohar A, Muhartono. Comparative effects of chlorogenic acid and doxorubic in against expression of caspase3 in cell lines Hep- G2. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 2015;7(1):187-192 12. Sukohar A, Herawati H, Witarto AB, Sibero HT, Setiawan, Firman F. Wirakusuma, Herry S. Sastramihardja. MIR-423-3P Used As Reference Gene for MiRNA 146 Ain Cell Lines HEP- G2. Internatinal Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science. 2014;6(8): 553-57 13. Labbaye C, and Testa U. The emerging role of MIR-146A in the control of hematopoiesis, immune function and cancer. Journal of Hematology & Oncology. 2012 5(13): 2―10. 14. Esau C, Kang X, Peralta E, Hanson E, Marcusson EG, Ravichandran LV, et al. MicroRNA-143 Regulates adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 2004. 279(5): 52361―5. 15. Wang X, Liu Y. Regulation of innate immune response by MAP kinase phosphatase-1. 2007. 16. Albert B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts k, Walter P. The Cell Cycle and programmed Cell Death, Molecular Bilogy of The Cell, 4th ed, chapter 17.2002.985Wang et al., 2008; 25

17. Wang J, Wang H, Li Z, Wu Q, Lathia JD, McLendon RE, et al. c-Myc Is Required for Maintenance of Glioma Cancer Stem Cells. 2008; 3(11): 1―11. 18. Fernandez SA, Ruiz MJ, Lawhon T, Zaknoen S, Ocio EM, et al. .Potent antimyeloma activity of a novel ERK5/CDK inhibitor. 2009. 19. Rakshit S, Mandal L, Pal BC, Bagchi J, Biswas N, Chaudhuri J , et al. Involvement of ROS in chlorogenic acid-induced apoptosis of Bcr-Abl+ CML cells. 2010 20. Liang Y, Ridzon D, Wong L, and Chen C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. Biomed Central. 2007 June; 8(166): 1―20. 8. buku referensi 21. Sukohar A, Sastramihardja HS. Antioksidan ekstrak air biji kopi Robusta Lampung dalam menghambat degenerasi sel hati tikus model hepatitis yang diinduksi CCL4. MKB. 2012;44(3):127―32.DISERTASI 22. Sukohar A. Peran Asam Klorogenat Terhadap Ekspresi Gen; MiRNA 146 A, Caspase 3 Dan Cyclin D1 Serta Gambaran Histopatologi Pada Sel Kanker Hepatoseluler. 2013. 26