ANEXOS Anexo 1. Preparación de soluciones a) Solución de Tris-HCl 1 M Preparación de 1 L de solución Tris-HCl 1 M. Cálculos. 1 M = 1 mol/L Tris-HCl PM=157.6 g/mol 1 L 1 mol 157.6 g = 157.6 g 1L 1 mol Pesar 157.6 g de Tris-HCl y disolver en 1 L de ddH2O. Esterilizar en autoclave la solución. b) Solución de NaCl 5 M Preparación de 1 L de solución NaCl 5 M. Cálculos. 5 M = 5 mol/L NaCl PM= 58.44 g/mol 1 L 5 mol 58.44 g = 292.2 g 1L 1 mol Pesar 292.2 g de NaCl y disolver en 1 L de ddH2O. Esterilizar en autoclave la solución. 41
c) Solución de EDTA 0.5 M, pH= 8.0 Preparación de 1 L de solución EDTA 0.5 M, pH= 8.0. Cálculos. 0.5 M = 0.5 mol/L EDTA PM= 292.24 g/mol 1L 0.5 mol 292.24 g = 146.12 g 1L 1 mol Pesar 146.12 g de EDTA y disolver en 1 L de ddH2O. Ajustar pH a 8.0 con solución de NaOH 1 M. Esterilizar en autoclave la solución. d) Solución de lavado (Etanol 76%, acetato de amonio 10 mM) Preparación de 1 L de solución de lavado Cálculos. Acetato de amonio C1= 1 M = 1,000 mM V1= ? C2= 10 mM V2= 1,000 mL V1= C2*V2 = (10 mM)(1,000 mL) = 10 mL C1 1,000 mM Componente Volumen (mL) Acetato de amonio 1 M 10 Etanol 76 % 990 Volumen total 1,000 42
e) Solución de acetato de amonio 1 M Preparación de 1 L de solución de acetato de amonio 1 M Cálculos. 1 M= 1 mol/L CH3COONH4 PM= 77.08 g/mol 1 L 1 mol 77.08 g = 77.08 g 1L 1 mol Pesar 77.08 g de acetato de amonio y disolver en 1 L de ddH2O. Esterilizar la solución en autoclave. f) Solución de etanol al 76 % Preparación de 1 L de etanol al 76% Agregar 240 mL de ddH20 más 760 mL de etanol absoluto. g) Solución buffer TE Preparación de 1 L de solución buffer TE que contiene Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM Tris-HCl 10 mM, PM= 157.60 g/mol 1 L 0.01 mol 157.6 g = 1.576 g 1L 1 mol EDTA1mM, 292.24 g = 0.292 g PM= 292.24 g/mol 1 mol 1 L 0.001 mol 1L Pesar 1.576 g de Tris-HCl, disolver en ddH2O, después agregar 0.292 g de EDTA y aforar a 1 L. Esterilizar en autoclave la solución. 43
h) Solución buffer TEB 10 X y dilución a TEB 1 X Preparación de 1 L de solución TEB 10 X que contiene Tris-HCl 0.89 M, EDTA 0.025 M y ácido bórico 0.89 M. Tris-HCl 0.89 M, PM= 157.60 g/mol 1 L 0.89 mol 157.6 g = 140.3 g 1L 1 mol EDTA 0.025 M, 292.24 g = 7.3 g PM= 292.24 g/mol 1 mol 1 L 0.025 mol 1L Ácido bórico 0.89 M, PM= 61.84 g/mol 1 L 0.89 mol 61.84 g = 55.0 g 1 L 1 mol Pesar 140.3 g de Tris-HCl, disolver en ddH2O, después agregar 7.3 g de EDTA y disolver, después agregar 55.0 g de ácido bórico y aforar a 1 L. Esterilizar en autoclave la solución. 44
Bibliografía Doyle J. J. and Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12:13–15. Levin, R. A.; Wagner, W. L.; Hoch, P. C.; Nepokroeff, M.; Pires, J. C.; Zimmer, E. A. and Sytsma, K. J. 2003. Family-level relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcL and ndhF data. Am J Bot. 90(1):107–115. López-Mora, P. A.; López Gutiérrez, A. M. and Marulanda-Ángel, M. L. 2011. Standardizing genomic DNA extraction in Tabebuia rosea (Bertol.) DC. and Cordia alliodora (Ruiz and Pav.) Okén. Temas Agrarios. 16(2):28–41. Nardini, E. 2012. Event-specific Method for the Quantification of Cotton T304-40 Using Real-time PCR -Validation Report and Protocol- Sampling and DNA Extraction from Cotton Seeds Online Publication. Pérez-Urquiza, M.; Rivera-Mellado J. and Matus-Cundapi, E. D. 2013. Métodos de extracción de ácidos nucleicos. En: Manual de Protocolos de Medición de Organismos Genéticamente Modificados. Pérez-Urquiza, M.; Rivera-Mellado J. and Matus-Cundapi, E. D. (comp.) 1. Centro Nacional de Metrología. El Marqués, Querétaro, México. 24-55 pp. Yang L; Zhang H; Guo J; Pan L and Zhang D. 2008. International collaborative study of the endogenous reference gene LAT52 used for qualitative and quantitative analyses of genetically modified tomato. J. Agric. Food Chem. 56(10):3438-3443. Youssef M., Valdez-Ojeda R., Ku-Cauich A. R. and Escobedo-Gracia M. R. M. 2015. Enhanced Protocol for Isolation of Plant Genomic DNA. Journal of Agriculture and Environmental Sciences. Volume 4, No. 2, pp: 12-180. 45
COORDINADORES DE LA INFORMACIÓN Dr. Ramón Ignacio Arteaga Garibay REVISIÓN TÉCNICA Dr. José Luis Pons Hernández Dr. Carlos Iván Cruz Cárdenas EDICIÓN Dra. Aremi Rebeca Contreras Toledo FOTOGRAFIAS Y DISEÑO Dr. Luis Felipe Guzmán Rodríguez Ing. Blanca Amalia Amaro González AGRADECIMIENTOS Agradecemos a Andrea Marlene García Muro, Oscar Joary Plancarte Valadez, Jesús Muñoz Hernández, Evelyn González Tapia, Valeria Salazar y Juan Luis De León Rodríguez por el apoyo en el laboratorio. Este instructivo fue realizado con apoyo del proyecto “Monitorización de presencia adventicia de eventos transgénicos en accesiones de maíz, soya, frijol, trigo, tomate y algodón a resguardar en el Centro Nacional de Recursos Genéticos” con número INIFAP 15571832982. 46
Centro Nacional de Recursos Genéticos Dr. Ramón Ignacio Arteaga Garibay Director Lic. Alejandro Alcántar Palomera Jefe Administrativo Personal Investigador del Centro Nacional de Recursos Genéticos Laboratorio de ADN y Genómicas Dr. Luis Felipe Guzmán Rodríguez Dra. Aremi Rebeca Contreras Toledo Laboratorio Agrícola Forestal sección semillas ortodoxas Dr. Juan Manuel Pichardo González Dr. Martín Quintana Camargo Dr. Carlos Iván Cruz Cárdenas Laboratorio Agrícola Forestal sección cultivo In vitro Dra. Esmeralda Judith Cruz Gutiérrez Dra. Gabriela Sandoval Cancino Laboratorio Acuático Pecuario M.C. David Urbán Duarte M.C. Horacio Álvarez Gallardo Laboratorio de Recursos Genéticos Microbianos Dra. Lilly Xochilt Zelaya Molina Dra. Edith Rojas Anaya Dr. Fernando Ismael Chávez Díaz Bioinformática Dra. Lorena Jacqueline Gómez Godínez 47
Centros Nacionales de investigación Disciplinaria, Centros de Investigación Regional y Campos Experimentales 48
La presente publicación se terminó de editar en octubre de 2019 en la Imprenta Prometeo Editores. Domicilio: Libertad No. 1457, Col Americana, CP. 44160 Guadalajara, Jalisco, México. 49
Los cultivos genéticamente modificados impactan a la diversidad genética de su especie y especies silvestres relacionadas. Actualmente, se desconoce la presencia adventicia de eventos transgénicos en accesiones en resguardo en bancos de germoplasma, de tal manera que, actividades de monitorización resultan de gran importancia. En la presente publicación se presentan protocolos de aislamiento de ácidos nucleicos a partir de semilla y tejido foliar y detección de organismos genéticamente modificados en algodón, jitomate, maíz y soya. 50
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