ບົດນິພົນ ປະລິນຍາໂທ

vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi [pK7GW-CPi (SMV-BYMV). Kết quả phân tích các cây thuốc lá chuyển gen bằng Real-time RT-PCR đã chứng minh sự điều khiển phiên mã của CaMV35S đối với cấu trúc RNAi [25]. Kế thừa kết quả của các nghiên cứu trước, vector chuyển gen pBI121- CoOMT chứa promoter CaMV35S được thiết kế nhằm biểu hiện mạnh gen CoOMT trong các thí nghiệm chuyển gen ở cây thuốc lá và cây Bình vôi, làm sáng tỏ chức năng của gen này trong quá trình sinh tổng hợp rotundin và alkaloid. Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Hà và cộng sự (2018), sau 3 lần biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào các mảnh thuốc lá giống K326, 235/ 249 mảnh lá sống sót sau 4 tuần, phát sinh 205 chồi và thu được 186 cây con in vitro sống sót trên môi trường MS có bổ sung kháng sinh. Số cây ra bầu đất là 113 cây và có 65 cây trồng tại nhà lưới có biểu hiện xanh tốt, mập mạp (hiệu suất chuyển gen giai đoạn này là 26,1%). Kết quả phân tích PCR, Southern blot và Western blot các dòng cây thuốc lá chuyển gen CrDAT ở thế hệ T0 đã chứng minh gen chuyển CrDAT đã hợp nhất vào hệ gen của cây thuốc lá được chuyển gen và gen chuyển CrDAT hoạt động phiên mã và dịch mã cho kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp CrDAT [1]. Như vậy, trong nghiên cứu của đề tài này, hiệu suất chuyển gen giai đoạn chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen bằng kháng sinh chọn lọc là 27,3%. Kết quả này phù hợp với các công trình đã công bố trước đây. Kết quả bước đầu về phân tích cây chuyển gen như xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT bằng phản ứng RT-PCR, xác định định tính mức độ phiên mã của gen chuyển CoOMT bằng phản ứng qPCR đã có tín hiệu khả quan để khẳng định cấu trúc chuyển gen pBI121-1113 - CoOMT hoạt động tốt trên cây mô hình, có thể tiếp tục chuyển vào cây đích. 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1.1. Cấu trúc mang gen chuyển CoOMT đã được biến nạp thành công vào cây thuốc lá. Từ 150 mẫu cây biến nạp thu được 69 mẫu tạo cụm chồi và có 152 mẫu chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc MS chứa cefotaxime 500 mg/ml, kanamycin 50 mg/ml, trong đó có 84 mẫu ra rễ, 41 cây sống trên giá thể (hiệu suất chuyển gen là 27,3%). 1.2. Bằng phản ứng RT-PCR đã xác định được sự có mặt của gen chuyển CoOMT ở 6 dòng cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20). Cấu trúc vector pBI121-1113 - CoOMT mang gen chuyển đã hoạt động tốt ở mức độ phiên mã. 2. ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT mức độ dịch mã bằng kỹ thuật Western blot, ELISA, định lượng alkaloid tổng số để đánh giá chức năng của gen trong cây thuốc lá biến đổi gen ở thế hệ sau. Nghiên cứu biến nạp cấu trúc biểu hiện mang gen CoOMT vào cây Bình vôi (cây đích), phân tích sự biểu hiện của gen chuyển nhằm đánh giá chức năng của gen trong sinh tổng hợp alkaloid và L-tetrahydropalmatin (rotundin). 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Minh Chính (2001), Nghiên cứu chiết tách Rotundin từ củ một số loài Bình vôi (thuộc chi Stephania Lour.), điều chế Rotundin Sulfat để bào chế thuốc tiêm, Luận án Tiến sĩ dược học, Hà Nội, tr. 20-24. 2. Ngô Quang Đại (1999), “Sản xuất thuốc giảm đau từ củ Bình vôi”, Tạp chí công nghiệp hóa chất, số 12. 3. Bùi Thị Hà (2018), Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học sư phạm, Đại Học Thái Nguyên, tr. 4-5, 20-31. 4. Trương Thu Hằng (2013), “Chọn tạo các dòng ngô được chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3: tr. 17-29. 5. Phạm Thu Hằng, Đàm Quang Hiếu, Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Xuân Hội (2016), “Thiết kế vector và chuyển gen OsNAC1 liên quan đén tính chịu hạn vào giống lúa J02 (Oryzasativa L. japonica)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): tr. 271-277. 6. Võ Thị Thúy Huệ, Mã Yến Thanh (2011), “Thiết lập quy trình tái sinh in vitro và đánh giá bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp, số 1, tr. 6 - 10. 7. Đỗ Thanh Kim Hường (2019), Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương, Trung tâm học liệu và công nghệ thông tin, Đại Học Thái Nguyên, tr. 37-40. 8. Nguyễn Thị Ngọc Lan, Từ Quang Tân, Chu Hoàng Mậu (2020), Sinh học hiện đại, một số vấn đề nguyên lý và ưng dụng, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội (2020), tr.32-32, 90-118, 261. 41

9. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, phần III Các cây vị thuốc có chất độc, Nxb Y Học, Hà Nội, tr 185-205. 10. Phạm Duy Mai, Phan Đức Thuận (1986), Tác dụng Dược lý của Bình vôi, Công trình NCKH Viện Dược liệu 1972 -1986, NXB Y học, Hà nội, 55-57 11. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Hữu Quân, Lê Thị Hồng Trang (2019), “Chuyển gen Glycine max Chalcone Iomerase1A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Một mô hình cho tăng cường biểu hiện gen GmCHI1A ở cây đạu tương”, TNU Journal of Science and Technology 207(14), tr. 195-200. 12. Chu Hoàng Mậu, Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Hữu Quân (2019), Giáo trình tin sinh học (Bioinformatics), NXB Đại học Thái Nguyên, tr.95-100. 13. Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012), “Nghiên Cứu Quy Trình Chuyển Gen Vào Cây Dưa Hấu (Citrullus lanatus Thumb.)”, Tạp chí sinh học, 34(3): tr. 389-396. 14. Lê Thu Ngọc, Nguyễn Khắc Hưng, Nguyễn Thị Thơm, Phạm Bích Ngọc (2017), “Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen ssiv tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 33, tr. 224-230. 15. Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Chu Hoàng Mậu (2013), “Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gene GmEXP1 vào cây thuốc lá (Nicotinana tabacum L.)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4, tr. 44-52. 16. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005). Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tra. 97-115. 17. Vì Thị Xuân Thủy, Bùi Thị Minh Thúy, Hoàng Thị Huệ Khang, Chu Hoàng Mậu (2017), “Chuyển gen ZmDEF1 nhờ Agrobacterium tumefaciens vào giống thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) C9-1”, Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, tr. 39-41. 42

18. Nguyễn Văn Vân, Hoàng Minh Tấn (2013), “Kìm hãm sự ra hoa của giống thuốc lá k326 bằng chiếu sáng bổ sung, quang gián đoạn và cắt thân“, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 11, số 5: tr. 629-634. 19. Nguyễn Văn Vinh (2010), “Khảo sát một số hợp chất alkaloid có hoạt tính sinh học ở cây dưa cạn (Catharanthus roceus L.) trong điều kiện nuôi cây in vitro”, Tạp chí khoa học và công nghệ, Tập 48, số 1, tr. 87-95. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 20. Chen P.Y., Wang C.K., Soong S.C., To K.Y. (2003), “Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants”, Mol. Breed., 11, 287-293. 21. Demura T., Ye Z.H. (2010), ‘‘Regulation of Plant Biomass Production’’, Curen Opin Plant Biology, pp 299-304. 22. Edwards K.D. (2017), “A reference genome for Nicotiana tabacum enables map-based cloning of homeologous loci implicated in nitrogen utilization efficiency”, https://www. ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5474855/, ngày 19/06/2017. 23. Hongyuan Chu , Guozhang Jin, Eitan Friedman và Xuechu Zhen (2008), “Recent Development in Studies of Tetrahydroprotoberberines: Mechanism in Antinociception and Drug Addiction”. Cell Mol Neurobiol, 28, 491–499. 24. Hotta T., Tanimura H. (1997), “Modulation of multidrug resistance by cepharanthin in fresh human gastrointestinal tumor cells”, Oncology, 54, pp. 153-157. 25. Lo Thi Mai Thu, Vi Thi Xuan Thuy, Le Hoang Duc, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2016), “RNAi-mediated resistance to SMV and BYMV in transgenic tobacco”, Crop Breeding and Applied Biotechnology, 6, pp. 213 - 218. 43

26. Manske R.H.F. (1973), The alkaloid- chemistry and Physiology, volume XIV, Academic Press- New York- London. 27. Mantsch J.R., Li S.J., Risinger R., Awad S., Katz E., Baker D.A., Yang Z. (2007), “Levo-tetrahydropalmatine attenuates cocaine selfadministration and cocaine-induced reinstatement in rats”, Psychopharmacology (Berl), 192, pp. 581-591. 28. Ramachandra Rao S., Ravishakar G. A. (2002), “Plannt cell culture: chemical factory of secondary metabolite”, Biotechnology Advance, 20, 101-153. 29. Saghhai Maroof M.A.,Solima K.M., Jorgenson R.A , Allard R.W (1984), “Ribosome DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, choromosomal location and population dynamics”, Natl. Aca. Sci.USA, 81: 8014 – 8018. 30. Sandra Knapp, Details for species Nicotiana tabacum, https://solgenomics. net/organism/941/view. 31. Sandro Jube (2007), Expression of bacterial genes in transgenic tobacco: methods, applications and future prospects, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC2742426/, ngày 15/07/2007. 32. Thanh Son LO., Hoang Duc LE., Vu Thanh Thanh NGUYEN., Hoang Ha CHU., Van Son LE., Hoang Mau CHU. (2015), “Overexpression of a soybean expansin gen, GmEXP1, improves drought tolerance in transgenic tobacco”, Turkish Journal of Botany, 39, pp. 988 - 995. 33. Takashi Morishige, Emilyn Dubouzet, Kum-Boo Choi, Kazufumi Yazaki, Fumihiko Sato (2002), “Molecular cloning of columbamine O- methyltransferase from cultured Coptis japonica cells”, Eur J Biochem., 269(22): pp 5659-67. 34. Topping J.E. (1998), \"Tobacco transformation\", Methods Mol. Biol., 81, pp. 365-372. 44

35. Tzfira T., Citovsky V. (2006), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology”, Curr Opin Biotechnol, 17:147–154. 36. Xuan Tan DAO, Thi Thanh Nhan PHAM, Thi Kim Lien VU, Huu Quan NGUYEN, Thi Ngoc Lan NGUYEN, Danh Thuong SY, Thi Thu Thuy VU, Van Son LE, Hoang Mau CHU (2019), “Overexpression of the GmDREB2 gene increases proline accumulation and tolerance to drought stress in soybean plants”, Australian Journal of Crop Science, Ref No: AJCSPNE2173, ISSN 1835-2707 (Online), ISSN: 1835-2693 (Print) INTERNET 37. Kỹ thuật PCR (2016) https://biomedia.vn/review/ky-thuat-pcr-phan-1.html, 19/01/2016. 38. Kỹ thuật điện di ngang trên gel agarose (2019) https://genesmart.vn/ky- thuat-dien-di-ngang-tren-gel-agarose. 39. Giới thiệu chung về cây thuốc lá (2014) http://www.thuvientailieu.vn/tai- lieu/de-tai-gioi-thieu-chung-ve-cay-thuoc-la-27708, 17/04/2014. 40. Sản xuất thuốc giảm đau từ củ bình vôi (1999), 30/12/1999 http://www.vinachem.com.vn/xuat-ban-pham/239-so-vnc/c3239.html. 41. Thuốc Rotunda 30mg (2021) https://baomuctim.com/rotunda-30mg, 27/04/2021. 42. Vi khuẩn Agrobacterium (2021) https://en.wikipedia.org/wiki/ Agrobacterium, 11/4/2021. 43. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (2021) https://en.wikipedia.org/wiki/ Agrobacterium_tumefaciens, 24/4/2021. 44. Gene chuyển hoặc Ti-plasmid (2021) https://en.wikipedia.org/wiki /Ti_plasmid , 142021. 45

45. Ứng dụng và nguyên lý của kỹ thuật Southern blot (2018) https://khonggiansinhhoc.com/ung-dung-va-nguyen-ly-cua-ky-thuat- southern-blot, 21/7/2018. 46. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15596026#/15596026) 47. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K1621#/K1621 48. Vector chuyển gen ở thực vật (2018) https://khonggiansinhhoc.com/cac- vector-chuyen-gen-o-thuc-vat/, 4/7/2018 46