พันธุวิศวกรรม

พนั ธวุ ศิ วกรรม



คำนำ หนงั สือเล่มน้ีเป็นส่วนหน่ึงของวชิ า ชีววทิ ยา เรื่องพนั ธุวศิ วกรรม เราไดจ้ ดั ทาข้ึนตาม โครงสร้างของหลกั สูตรรายวชิ าชีววยิ าเพิม่ เติมเพอื่ ใหน้ กั เรียนไดศ้ กึ ษาเทียบเคียงกบั หลกั สูตรของสถานศกึ ษาและพิจารณา ใชห้ นงั สือน้ีประกอบการเรียนการสอน ให้ สอดคลอ้ งตามหลกั สูตรของสถานศกึ ษาตามความเหมาะสมหนงั สือเล่มน้ีไดร้ ับความ ร่วมมือจากอาจารย์ ผเู้ ช่ียวชาญ เป็ นอยา่ งดี พวกเราหวงั เป็ นอยา่ งยง่ิ วา่ หนงั สือเล่มน้ีจะเป็นประโยชนต์ ่อการจดั การเรียนการ สอน เพอ่ื ประยกุ ตใ์ ชพ้ ฒั นาการเรียนรู้ไดอ้ ยา่ งเหมาะสม ขอขอบคุณบคุ คลที่มีส่วน เก่ียวขอ้ งในการจดั ทาไว้ ณ โอกาสน้ี คณะผจู้ ดั ทา

สำรบัญ 1 พนั ธุวิศวกรรม 2 เอนไซม์ตดั จำเพำะ 3 กำรเชื่อมต่อสำย DNA ด้วยเอนไซม์ DNA ไลเกส 5 กำรโคลนยีน

พนั ธุวศิ วกรรม

17.1.1เอนไซม์ตัดจำเพำะหรือ restriction enzyme เป็ นเอนไซม์ตดั ดเี อน็ เอในตำแหน่งที่มลี ำดับเบสจำเพำะ ทำให้ได้ปลำยดเี อน็ เอ 2 แบบ คือ ปลำยเหนยี ว (sticky end) ซ่ึงเป็ นปลำยทมี่ สี ำยดเี อน็ เอสำยหน่งึ ย่ืนออกมำ และปลำยเรียบ (blunt end) ซึ่งเป็ นปลำยทไี่ ม่มี กำรยื่นออกมำของสำยดเี อน็ เอ เม่อื ตดั ดีเอน็ เอ 2 ตวั อย่ำงด้วยเอนไซม์ชนดิ เดยี วกนั ทำให้ดเี อน็ เอท้งั สองน้ัน เช่ือมต่อกนั ได้พอดี ซ่ึงมปี ระโยชน์อย่ำงมำกในงำนด้ำนพนั ธุวศิ วกรรม จำกตำรำงจะเห็นว่ำแต่ละชนดิ จะมบี ริเวณลำดบั เบสจำเพำะและจุดตดั จำเพำะทต่ี ่ำงกนั เช่น เอนไซม์ EcoRI จะ มลี ำดบั เบสจำเพำะในกำรตดั จำนวน 6 คู่เบส ขณะที่ Haell ใช้เพยี ง 4 ค่เู บส จดุ ตดั จำเพำะทเ่ี กดิ ขึน้ จะได้สำย DNA หลงั จำกถูกตดั แล้วใน 2 รูปแบบ เช่น ในกรณขี องกำรตดั ด้วยเอนไซม์ EcoRI จดุ ตดั จำเพำะอยู่ระหว่ำงเบส G และ A ซึ่งหลงั จำกกำรตดุ จะทำให้ปลำยสำยเด่ยี วท้งั 2 ปลำย ท่ีรอยตดั ของสำย DNA ซึ่งมนี วิ คลโี อไทด์สำย เดี่ยวย่ืนออกมำ เรียกปลำยสำย DNA ที่เกดิ ขึน้ เช่นนวี้ ่ำ ปลำยเหนยี ว แต่ในกรณขี อง HeaIII จดุ ตดั จำเพำะอยู่ ระหว่ำงเบส G และ C ดังตำรำง เม่ือตดั แล้วจะไม่เกดิ ปลำยสำย DNA เป็ นนวิ คลโี อไทด์สำยเดีย่ ว เน่ืองจำกจุดตดั ของสำย DNA ท้ังสองเส้นอย่ตู รงกนั พอดี ปลำยรอยตดั DNA เช่นนีเ้ รียกว่ำปลำยทู่

17.1.2 กำรเช่ือมต่อสำย DNA ด้วยเอนไซม์ DNA ไสเกส 1. เฮลเิ คส (helicase) - สลายพนั ธะไฮโดรเจน แยกเกลียวคู่ออกจากกนั โดยอาศยั พลงั งานจากการสลาย ATP 2. โปรตีนที่ไปจบั กบั DNAสายเด่ียว (single strand DNA binding protein, SSB หรือ DBP) - จบั กบั DNAสายเด่ียวป้องกนั ไม่ใหก้ ลบั มาพนั กนั เป็นเกลยี วคู่อกี - ป้องกนั DNAสายเดี่ยวดงั กล่าวไม่ใหถ้ ูกยอ่ ยโดยเอนไซมน์ ิวคลเี อส (nuclease) 3. DNAไจเรส (DNA gyrase) หรือโทโปไอโซเมอเรส (topoisomerase) - คลายปมเหนือจุดที่DNAสายเด่ียวแยกตวั ออกจากกนั (replication fork)โดยตดั DNAสายใดสายหน่ึงหรือท้งั สองสายแลว้ จึงต่อกลบั ใหม่ 4. ไพรเมส (primase) - สงั เคราะห์RNAเพือ่ ใชเ้ ป็นไพรเมอร์เน่ืองจากเอนไซมท์ ี่ใชส้ งั เคราะห์DNA ไม่สามารถ เร่ิมสงั เคราะหโ์ ดยตวั เอง 5. DNAพอลิเมอเรส (DNA polymerase) - สงั เคราะห์DNAโดยนานิวคลโี อไทดใ์ หม่เขา้ มาต่อท่ีปลาย 3' ของ ไพรเมอร์หรือสายDNA ในทิศทาง 5' ไปยงั 3' โดยมเี บสเป็นคู่สมกบั ตน้ แบบ Pol ? - ต่อสายไพรเมอร์ใหย้ าวมากข้ึน (polymerization) คือเป็น 5' → 3' polymerase - ยอ่ ยนิวคลีโอไทดท์ ่ีอยทู่ ่ีปลายออกไดท้ ้งั 2 ทิศทางเรียก 3' → 5' หรือ 5' → 3' exonuclease - ตรวจสอบความถกู ตอ้ ง (proofreading) และ ซ่อมแซมโมเลกุลของDNA - ตดั ไพรเมอร์ท่ีเป็นRNAออกทางปลาย 5' เพอื่ เปลย่ี นใหเ้ ป็นDNAที่สมบูรณ์ต่อไป Pol ? - ยงั ไม่ทราบหนา้ ที่ แต่ 5' → 3' polymerase และ 3' → 5' exonuclease Pol ? - เอนไซมห์ ลกั ในการสงั เคราะห์DNAต่อจากไพรเมอร์ และตดั DNAไดท้ าง ปลาย 3' (3' → 5' exonuclease) Pol ? - นอ้ ยกว่า Pol ? ถึง 20 เท่า แต่สงั เคราะห์DNAไดเ้ ร็วกวา่ ประมาณ 60 เท่า 6. DNAไลเกส (DNA ligase) - เชื่อมโมเลกุลของDNAในระหว่างการจาลองโมเลกุล การซ่อมแซมและการ จดั เรียงตวั ใหม่ของDNA โดยสร้างพนั ธะฟอสโฟไดเอสเทอร์



17.1.3 กำรโคลนยีน กำรโคลนยนี โดยอำศัยพลำสมดิ ของแบคทเี รีย โดยทว่ั ไปการทาพนั ธุวศิ วกรรมมกั จะใชก้ ารนา DNA ทสี่ นใจมาตดั ต่อใส่ในส่วนของพ ลาสมิด (Plasmid) จากเซลลแ์ บคทีเรีย จากน้นั เมอ่ื ได้ DNA ลกู ผสมแลว้ ก็จะตอ้ งมกี ารนากลบั เขา้ ไปใส่ในเซลล์ แบคทีเรียใหม่อีกคร้ังเรียนการนา DNAลกู ผสมเขา้ เซลลแ์ บคทีเรียน้ีวา่ การ Transformation จะมโี อกาสสาเร็จ นอ้ ย นกั วทิ ยาศาสตร์จาเป็นตอ้ งมีเทคนิคในการคดั เลือกแบคทีเรียโคโลนีใดบา้ งท่ีไดร้ ับพลาสมดิ ที่มีDNA ลูกผสมท่ีเขา้ ไปภายใน ซ่ึงโดยทว่ั ไปพลาสมดิ ของแบคทีเรียจะมียนี ทตี่ า้ นทานยา ปฏชิ ีวนะ (antibiotic resistance) อยภู่ ายใน ดงั น้นั ถา้ เซลลแ์ บคทีเรียไดร้ ับพลาสมิดเขา้ ไปภายในเซลล์ เม่ือ นาไปเล้ยี งอาหารเล้ียงเช้ือท่ีใส่ยาปฏิชีวนะจะตอ้ งสามารถเกิดการเจริญเติบโตและสร้างโคโลนีได้ (เน่ืองจากยนี ที่ตา้ นยาปฏชิ ีวนะบนพลาสมดิ สามารถทางานได้ แสดงวา่ เซลลแ์ บคทีเรียเซลลน์ ้นั ไดร้ ับพลาสมดิ เขา้ ไปภายใน เซลลแ์ ลว้ )

กำรโคลนยนี โดยอำศัยเทคนิค PCR(Polymerase Chain Reaction) เทคนิค PCR(Polymerase Chain Reaction) –การเลียนแบบกระบวนการ DNA replication ในเซลลส์ ิ่งมชี ีวติ - เทคนิคท่ีใชใ้ นการเพมิ่ ปริมาณDNAในหลอดทดลอง สามารถใชใ้ นการเพม่ิ จานวนของDNA ที่ ไดม้ าจากบริเวณทเ่ี กิดการฆาตกรรมทม่ี ีDNAอยเู่ พยี งเลก็ นอ้ ยเทา่ น้นั ได้ (เชน่ DNA จากคราบอสุจหิ รือคราบเลือด) - เทคนิคน้ีไม่จาเป็นตอ้ งอาศยั เซลลใ์ นการเพ่มิ จานวน แตใ่ ชเ้ คร่ืองทเ่ี รียกวา่ thermocycler ที่ สามารถต้งั เวลาการปรับอุณหภูมภิ ายในไดเ้ องโดยอตั โนมตั ิ - องคป์ ระกอบของการทาPCR จะตอ้ งประกอบดว้ ยส่วนตา่ งๆ ดงั น้ี 1. DNA ทเ่ี ป็นสายตน้ แบบ(template DNA) 2. DNA Primer เป็น DNA สายส้ันๆ ทมี่ ีลาดบั เบสสอดคลอ้ งกบั ยนี ท่ีตอ้ งการ เพอ่ื เริ่มตน้ การสร้าง DNA (ขอ้ สงั เกต Primer ท่ใี ชใ้ นPCR จะเป็นDNA แตกตา่ งจากในธรรมชาติท่ีPrimer จะเป็น RNA) 3. นิวคลีโอไทดอ์ สิ ระท้งั 4ชนิด (dNTPs) 4. เอนไซม์ DNA polymerase ทีม่ ีความสามารถในการทนความร้อนไดด้ ี ทน่ี ิยมใชค้ อื เอนไซม์ Taq polymerase ทส่ี กดั ออกมาจากแบคทเี รียในน้าพรุ ้อนชอ่ื Thermus aqquaticus ข้นั ตอนหลกั กำรทำ PCR ประกอบด้วย 3ข้นั ตอนเกดิ วนซ้ำกนั ไปเรื่อยๆทำให้ได้ DNA สำยใหม่จำนวนมำก ข้นั ตอนมีดงั นี้ 1.ข้นั ตอน denaturation - ข้นั ตอนน้ีจะตอ้ งใชอ้ ณุ หภูมสิ ูงประมาณ 90 องศาเซลเซียส ในการแยกสาย DNA ออก เป็นสายเดย่ี วสองสาย 2. ข้นั ตอน anneal - ข้นั ตอนน้ีจะลดอณุ หภูมลิ งมาอยทู่ ี่ประมาณ 30-60 องศาเซลเซียส เพื่อใหส้ ายขอprimerไปจบั กบั DNAได้ 3. ข้นั ตอนpolymerization - ข้นั ตอนน้ีอณุ หภมู ิจะเพม่ิ ข้ึนมาอย่ทู ีร่ ะดบั ประมาณ 60-70 องศาเซลเซียส เพอื่ ให้ polymerase ทางานต่อไป

ข้อจำกดั ของเทคนิค PCR เทยี บกบั เทคนคิ กำรโคลนยนี โดยใช้แบคทเี รีย คือ 1. เทคนิค PCR น้ีสามารถใชใ้ นการเพ่มิ DNA เพยี งอยา่ งเดียว ไม่สามารถสงั เคราะหโ์ ปรตนี ได้ 2. ความผดิ พลาดของ DNA ทีจ่ าลองข้ึนมาอาจจะมโี อกาสผดิ พลาด เนื่องจากประสิทธิภาพของเอนไซมม์ ี จากดั

บรรณำนุกรม 1.หนงั สือเรียนรายวิชาเพิ่มเติม ชีววิทยา เล่ม 4 2. https://www.nstda.or.th/th/nstda-knowledge/142-knowledges/2227 3. https://www.sites.google.com/site/chiwwithyalem4karreiynru/bth-thi-7-phanthu-sastr-laea- thekhnoloyi-thang-dixenxe/17-1phanthu-wiswkrrm/17-1-2-kar-cheuxm-tx-say-dna-dwy-xensim-dna-si- kes 4. https://sites.google.com/site/biologyroom610/dna-technology/dna-technology2