amicro71259scr

่คาความเ ็ปนกดร ่ดาง 6 G. hansenii 5.5 N3 5 1234 N4 4.5 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) S16 4 B19 3.5 L10 3 K6 2.5 2 5 0 ภาพ 4.7 คา่ ความเป็นกรดด่าง ระหวา่ งการหมกั แบบไม่เติมเอทานอล โดย G. hansenii, แบคทีเรีย ไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 4.6.1.1.3 ปริมาณกรดอะซิติกท้งั หมด ในการติดตามการเปลี่ยนแปลงของปริมาณกรดอะซิติกพบวา่ เมื่อเริ่มตน้ กระบวนการหมกั G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ให้ปริมาณกรดเท่ากบั 0.24, 0.33, 0.25, 0.27, 0.21, 0.35 และ 0.12 g/l ตามลาดับ โดยในวนั ที่ 5 ของการหมักมีปริมาณกรดอะซิติก เท่ากบั 0.27, 0.01, 2.52, 0.25, 0.18, 0.33 และ 0.13 g/l ตามลาดบั ดงั แสดงในภาพ 4.8 4.6.1.1.4 ปริมาณแบคทเี รียท้งั หมด ปริมาณแบคทีเรียท้งั หมดจากการทดลองพบวา่ ในวนั เริ่มตน้ ของการหมกั แบบไม่เติมเอทา- นอล โดย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 มีปริมาณแบคทีเรีย เท่ากบั 5.11, 3.48, 3.48, 3.53, 3.48, 3.10, 3.69 และ 4.48 logCFU/ml ตามลาดบั โดยในวนั ท่ี 5 ของ การห มักมี ปริ มาณ แบ คที เรี ยเท่ ากับ 7.46, 7.51, 6.28, 6.96, 6.60, 5.88 และ 6.79 logCFU/ml ตามลาดบั ดงั แสดงในภาพ 4.9 36

ป ิรมาณกรดอะ ิซติก (g/l) 3 G. hansenii 2.5 N3 2 1234 N4 1.5 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) S16 1 B19 0.5 L10 0 K6 0 5 ป ิรมาณแบคทีเ ีรย ้ทังหมด (logCFU/ml)ภาพ 4.8 ปริมาณกรดอะซิติกระหว่างการหมกั แบบไม่เติมเอทานอล โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 8 G. hansenii 7 6 N3 5 N4 4 S16 3 2 B19 1 L10 0 K6 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) ภาพ 4.9 ปริมาณแบคทีเรียระหวา่ งการหมกั แบบไมเ่ ติมเอทานอล โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 37

4.6.1.1.5 การทดสอบฤทธ์ิต้านอนุมูลอสิ ระด้วยวธิ ี DPPH radical scavenging จากการทดสอบฤทธ์ิตา้ นอนุมูลอิสระดว้ ยวิธี DPPH radical scavenging ของชาหมกั แบบไม่ เติมเอทานอล โดย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในวนั เร่ิมตน้ ของการหมักมีปริมาณสารต้านอนุมูลอิสระเท่ากับ 386, 457, 877, 908, 436, 886 และ 908 mg Gallic/L tea broth ตามลาดบั เม่ือทาการศึกษาฤทธ์ิการตา้ นอนุมูลอิสระของแต่ละไอโซเลท พบว่า ในวนั ท่ี 5 ของการหมกั ดว้ ยไอโซเลท N3, S16 และ L10 ให้ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระที่เพ่ิมข้ึน เป็ น 667, 943 และ 915 mg Gallic/L tea broth ซ่ึงการหมกั ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N4, B19 และK6 ให้ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระท่ีลดลงเป็น 464, 749, 423.71 และ 880 mg Gallic/L tea broth ตามลาดบั ดงั แสดงในตาราง 4.5 ตาราง 4.5 ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระ (mg Gallic/L tea broth) ระหวา่ งการหมกั แบบไม่เติมเอทา- นอล ดว้ ยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา ปริมาณสารต้านอนุมูลอสิ ระ (mg Gallic/L tea broth) K6 (วนั ) G. hansenii N3 N4 S16 B19 L10 0 386.19±38.27 457.69±31.33 877.68±7.78 908.27±3.91 436.00±7.77 886.61±1.53 908.59±7.94 3 556.27±81.82 603.41±62.16 824.63±50.56 905.88±17.86 426.99±10.45 829.19±66.31 899.73±8.72 5 464.74±47.56 667.15±12.53 749.92±59.72 943.08±5.95 423.71±7.13 915.56±15.45 880.00±30.00 38

4.6.1.2 ระดับความเข้มข้นของเอทานอลท่ี 1 เปอร์เซ็นต์ 4.6.1.2.1 ปริมาณแอลกอฮอล์ เม่ือเติมเอทานอลระดบั ความเขม้ ขน้ ที่ 1% ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในการหมกั พบวา่ ในวนั เร่ิมตน้ ของการหมกั ตรวจพบปริมาณแอลกอฮอล์ เท่ากบั 0.77, 0.60, 0.73, 0.60, 0.80, 0.50 และ 0.60 ตามลาดบั เม่ือระยะเวลาการหมกั ในวนั ท่ี 1 ดว้ ย แบคทีเรียไอโซเลท N4 ในวนั ที่ 3 ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4 และ B19 ในวนั ที่ 5 วนั หมกั ด้วยแบคทีเรียไอโซเลท S16 และ L10 และในวนั ที่ 7 ด้วยแบคทีเรียไอโซเลท K6 จะไม่ ตรวจพบแอลกอฮอลใ์ นชาหมกั ตามลาดบั ดงั แสดงในตาราง 4.6 ตาราง 4.6 ปริมาณแอลกอฮอล์ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 1% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ปริมาณแอลกอฮอล์ (%) (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 L10 L6 0 0.70±0.06 0.60±0.00 0.73±0.06 0.60±0.00 0.80±0.09 0.50±0.00 0.60±0.00 1 0.60±0.00 0.53±0.09 0.00±0.00 0.47±0.12 0.67±0.09 0.50±0.00 0.50±0.00 3 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.20±0.00 0.00±0.00 0.50±0.00 0.20±0.00 5 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.10±0.00 7 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 9 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 11 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 13 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 15 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 39

4.6.1.2.2 ค่าความเป็ นกรดด่าง ค่าความเป็ นกรดด่างของการหมกั แบบเติมเอทานอลความเขม้ ขน้ ที่ 1% พบว่า เม่ือเริ่มตน้ กระบวนการหมกั ค่าความเป็ นกรดด่างของแต่ละไอโซเลทอยรู่ ะหวา่ ง 4.17-5.31 โดยในวนั ท่ี 3 ของ การหมกั ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ให้ค่าความเป็ นกรด ด่างท่ีลดลงจาก 4.61, 4.17, 5.13, 4.40, 4.86, 4.63 และ 4.49 เป็ น 3.35, 3.26, 4.05, 3.77, 4.30, 3.57 และ 3.85 ตามลาดบั เม่ือสิ้นสุดกระบวนการหมกั ค่าความเป็ นกรดด่างของการหมกั ดว้ ยแบคทีเรียแต่ ละไอโซเลทให้ค่าเท่ากับ 2.79, 2.71, 2.56, 2.66, 2.70, 2.58 และ 2.91 ซ่ึงไม่แตกต่างกันอย่างมี นยั สาคญั ทางสถิติท่ีระดบั ความเชื่อมนั่ ท่ี 95% ดงั แสดงในภาพ 4.10 และ ตาราง 4.7 ่คาความเ ็ปนกรด ่ดาง 5.5 G. hansenii 5 N3 4.5 3 6 9 12 N4 4 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) S16 3.5 B19 3 L10 2.5 K6 2 15 0 ภาพ 4.10 ค่าความเป็ นกรดด่าง ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 1% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 40

ตาราง 4.7 ค่าความเป็นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 1% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ค่าความเป็ นกรด-ด่าง L10 K6 (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 0 4.61±0.05d 4.17±0.01b 5.13±0.15f 4.40±0.01c 4.86±0.10e 4.63±0.05d 4.49±0.04a 1 4.69±0.10c,d 4.18±0.01a 4.83±0.04d 4.39±0.02b 4.66±0.09c 4.69±0.03c,d 4.39±0.03b 3 3.35±0.03a,b 3.26±0.10a 4.05±0.10e 3.77±0.06c,d 4.30±0.01f 3.57±0.03b,c 3.85±0.14d,e 5 3.11±0.01a,b 3.07±0.02a 3.26±0.14b 3.19±0.01a,b 3.26±0.01b 3.22±0.03a,b 3.23±0.10a,b 7 3.02±0.03b,c 2.94±0.01b 2.77±0.13a 3.10±0.02c 3.19±0.01d 3.15±0.04c 3.05±0.03b,c 9 2.91±0.02a 2.89±0.03a 3.01±0.26a 3.00±0.05a 3.05±0.04a 2.99±0.06a 3.01±0.01a 11 2.87±0.01b,c,d 2.71±0.01a,b 2.54±0.10a 2.85±0.10b,c 2.96±0.08c,d 2.83±0.05b,c 3.05±0.07d 13 2.90±0.02c,d 2.77±0.02b,c 2.56±0.12a 2.79±0.02a,b 2.84±0.07c,d 2.82±0.03c,d 2.95±0.03d 15 2.79±0.11b,c 2.71±0.06a,b 2.56±0.04a 2.66±0.06a,b 2.70±0.01a,b 2.58±0.06a 2.91±0.03c หมายเหตุ:อกั ษรที่ต่างกนั ในแถวเดียวกนั มีความแตกต่างกนั อย่างมีนยั สาคญั ท่ีระดบั ความเชื่อมนั่ 95% (P < 0.05) 4.6.1.2.3 ปริมาณกรดอะซิติกท้งั หมด ปริมาณกรดอะซิติกที่เปล่ียนแปลงของการหมกั แบบเติมเอทานอลความเขม้ ขน้ ที่ 1% เม่ือ เร่ิมต้นกระบวนการหมัก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ให้ ปริมาณกรดอะซิติกท้ังหมดเท่ากับ 0.24, 0.31, 0.28, 0.31, 0.22, 0.37 และ 0.09 g/l ตามลาดบั ใน วนั ที่ 3 ของการหมกั แบคทีเรีย G. hansenii มีปริมาณกรดอะซิติกที่สูงเท่ากบั 5.03 g/l ในวนั ท่ี 5 ของ การหมกั แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, และ L10 มีปริมาณกรดอะซิติกท่ีสูงเท่ากบั 5.66, 3.97, 5.37 และ 5.53 g/l ตามลาดบั ในวนั ที่ 7 ของการหมกั แบคทีเรียไอโซเลท B19 และ K6 มีปริมาณ กรดอะซิติกท่ีสูงเท่ากบั 5.39 และ 2.22 g/l ตามลาดบั เมื่อเปรียบเทียบปริมาณกรดอะซิติกที่สูงสุด ของแต่ละไอโซเลท พบว่า G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, S16, B19 และ L10 มีปริมาณ กรดอะซิติกที่เพิ่มข้ึนมีปริมาณใกลเ้ คียงกนั จึงไม่มีความแตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติท่ีระดบั 41

ป ิรมาณกรดอะ ิซติก (g/l)ความเชื่อมนั่ ท่ี 95% แต่แบคทีเรียไอโซเลท N4 และ K6 มีปริมาณกรดที่นอ้ ยกวา่ จึงมีความแตกต่าง กนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติท่ีระดบั ความเช่ือมนั่ ท่ี 95% ดงั แสดงในภาพ 4.11 และ ตาราง 4.8 6 5 G. hansenii N3 4 N4 3 S16 2 B19 1 L10 0 K6 0 3 6 9 12 15 ระยะเวลาการหมกั (วนั ) ภาพ 4.11 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 1% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 4.6.1.2.4 ปริมาณแบคทเี รียท้งั หมด ปริมาณแบคทีเรียท้งั หมดจากการทดลองแบบเติมเอทานอล 1% พบวา่ ในวนั เร่ิมตน้ ของการ หมกั ด้วย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 มีปริมาณแบคทีเรีย เท่ากบั 5.30, 3.30, 5.43, 3.53, 4.62, 3.48, 4.44 และ 4.48 logCFU/ml ตามลาดบั โดยในวนั ที่ 3 ของ การหมักแบคทีเรียไอโซเลท N4 และ S16 มีปริมาณเพ่ิมข้ึนเท่ากับ 7.02 และ 7.25 logCFU/ml ตามลาดบั เม่ือระยะการหมกั ในวนั ที่ 5 แบคทีเรียไอโซเลท B19 และ K6 มีปริมาณเพิ่มข้ึนเท่ากบั 6.94 และ 7.29 logCFU/ml ตามลาดบั ในวนั ที่ 7 ของการหมกั แบคทีเรียไอโซเลท L10 มีปริมาณ เพิ่มข้ึนเป็น 7.06 logCFU/ml และในวนั ท่ี 9 ของการหมกั G. hansenii และแบคทีเรียไอโซเลท N3 มี ปริมาณเพ่ิมข้ึนเป็ น 9.62 และ 8.90 logCFU/ml ตามลาดบั เมื่อเปรียบเทียบปริมาณแบคทีเรียที่เพ่ิม สูงสุดของแต่ละไอโซเลท พบว่า G. hansenii และแบคทีเรียไอโซเลท N3 มีปริมาณเพ่ิมสูงข้ึนท่ี ใกล้เคียงกันจึงไม่มีความแตกต่างกนั อย่างมีนัยสาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเชื่อมนั่ ท่ี 95% แต่มี ปริมาณท่ีมากกว่าแบคทีเรียไอโซเลท N4, S16, B19, L10 และ K6 จึงมีความแตกต่างกัน อย่างมี นยั สาคญั ทางสถิติท่ีระดบั ความเช่ือมน่ั ท่ี 95% ดงั แสดงในภาพ 4.12 42

ตาราง 4.8 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 1% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ปริมาณกรดอะซิติก (g/l) L10 K6 (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 0 0.24±0.00b,c 0.31±0.00c,d 0.28±0.04b,c 0.31±0.06c,d 0.22±0.03b 0.37±0.03d 0.09±0.03a 1 0.36±0.12b 0.35±0.04b 0.34±0.04a,b 0.31±0.06a,b 0.24±0.00a,b 0.37±0.15b 0.12±0.02a 3 5.03±0.21d 3.58±0.25c 0.55±0.07a 1.04±0.16a 0.47±0.10a 2.15±0.09b 0.30±0.10a 5 5.01±0.35c,b 5.66±0.13c 3.97±0.23b 5.37±0.19c 4.86±0.07c,b 5.53±0.29c 2.03±0.22a 7 3.50±0.25a,b 4.97±0.12b,c 3.47±0.15a,b 5.55±0.15c 5.39±0.19c 4.69±0.15b,c 2.22±0.15a 9 2.48±0.27a 4.53±0.07b 2.52±0.23a 4.99±0.25b 4.82±0.21b 4.80±0.44b 2.04±0.08a 11 1.18±0.13a 4.35±0.13d 2.84±0.20b,c 3.89±0.19c,d 4.71±0.10d 4.94±0.30d 1.70±0.12a,b 13 1.02±0.16a 4.62±0.18b,c 4.16±0.12b,c 3.47±0.10b 4.33±0.14b,c 4.96±0.16c 1.58±0.06a 15 1.28±0.12a 4.45±0.19c,d 4.03±0.00b,c 3.00±0.15b 5.04±0.13c,d 5.67±0.10d 1.40±0.15a หมายเหตุ:อกั ษรท่ีต่างกนั ในแถวเดียวกนั มีความแตกตา่ งกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ที่ระดบั ความเช่ือมน่ั 95% (P < 0.05) 4.6.1.2.5 การทดสอบฤทธ์ิการต้านอนุมูลอสิ ระด้วยวธิ ี DPPH radical scavenging จากการทดสอบฤทธ์ิตา้ นอนุมูลอิสระดว้ ยวิธี DPPH radical scavenging ของชาหมกั แบบ เติมความเขม้ ขน้ ของเอทานอลท่ี 1% ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในวนั เริ่มตน้ ของการหมกั ใหป้ ริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระเท่ากบั 630, 431, 882, 869, 426, 887 และ 898 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั เม่ือวนั สุดทา้ ยของการหมกั ด้วยไอโซเลท N3, N4, B19 และ L10 พบว่า มีปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระท่ีเพิ่มข้ึนเท่ากบั 649, 1506, 470 และ 934 mg gallic/L tea broth ตามลาดับ โดยการหมกั ด้วย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท S16 และ K6 ให้ ปริมาณสารต้านอนุมูลอิสระที่ลดลงเป็ น 453, 575 และ 687 mg gallic/L tea broth ตามลาดับ ดัง แสดงในตาราง 4.9 43

11 ป ิรมาณแบคทีเ ีรย ้ัทงหมด (logCFU/ml) 10 G. hansenii 9 8 N3 7 N4 6 5 S16 4 B19 3 2 L10 1 K6 0 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) ภาพ 4.12 ปริมาณแบคทีเรียระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 1% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.9 ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระ (mg gallic/L tea broth) ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอล 1% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา ปริมาณสารต้านอนุมูลอสิ ระ (mg gallic/L tea broth) K6 (วนั ) G. hansenii N3 N4 S16 B19 L10 0 630.90±0.02 431.79±0.02 882.19±0.10 869.55±0.01 426.92±0.01 887.84±0.01 898.33±0.00 3 617.36±0.02 498.98±0.04 821.54±0.04 908.67±0.02 391.88±0.01 928.80±0.00 862.66±0.02 5 466.82±0.02 660.53±0.02 997.34±0.06 886.81±0.02 425.46±0.00 926.18±0.01 889.32±0.02 7 476.30±0.01 514.81±0.01 869.81±0.02 942.30±0.02 452.10±0.01 930.80±0.01 900.09±0.01 9 540.26±0.02 595.22±0.02 934.20±0.03 933.25±0.02 455.69±0.01 645.33±0.48 865.07±0.03 11 530.68±0.03 624.82±0.03 941.40±0.01 922.15±0.03 449.88±0.01 933.22±0.01 896.18±0.02 13 544.51±0.05 505.81±0.02 845.74±0.01 762.20±0.09 502.30±0.04 938.71±0.01 916.04±0.01 15 453.08±0.01 649.17±0.01 1506.59±0.0 575.67±0.01 470.41±0.01 934.98±0.00 687.87±0.03 44

4.6.1.3. ระดบั ความเข้มข้นของเอทานอลท่ี 3 เปอร์เซ็นต์ 4.6.1.3.1 ปริมาณแอลกอฮอล์ เมื่อเติมเอทานอลระดบั ความเขม้ ขน้ ท่ี 3% ด้วย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในการหมกั พบว่า ในวนั เริ่มตน้ ของการหมกั ตรวจพบปริมาณแอลกอฮอล์ เท่ากบั 2.43, 2.40, 2.57, 2.60, 2.60, 2.00 และ 2.67 ตามลาดบั เมื่อระยะเวลาการหมกั ในวนั ท่ี 5 ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท B19 และ L10 ในวนั ที่ 7 ดว้ ยแบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16 และ K6 จะไม่ตรวจพบปริมาณแอลกอฮอลใ์ นชาหมกั ดงั แสดงในตาราง 4.10 ตาราง 4.10 ปริมาณแอลกอฮอล์ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 3% โดยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ปริมาณแอลกอฮอล์ (%) (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 L10 L6 0 2.43±0.06 2.40±0.00 2.57±0.06 2.60±0.00 2.60±0.09 2.00±0.00 2.67±0.12 1 2.57±0.06 2.27±0.09 1.93±0.05 2.67±0.12 2.20±0.00 2.00±0.00 2.47±0.12 3 0.47±0.06 1.33±0.09 1.20±0.00 1.20±0.00 1.20±0.09 2.00±0.00 1.67±0.12 5 0.00±0.00 0.47±0.09 0.17±0.01 0.40±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 1.07±0.12 7 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 9 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 11 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 13 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 15 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 45

่คาความเ ็ปนกรด ่ดาง4.6.1.3.2 ค่าความเป็ นกรดด่าง ค่าความเป็ นกรดด่างของการหมกั แบบเติมเอทานอลความเขม้ ขน้ ท่ี 3% พบว่า เม่ือเริ่มตน้ กระบวนการหมกั ค่าความเป็ นกรดด่างของแต่ละไอโซเลทอยูร่ ะหวา่ ง 4.21-5.07 โดยในวนั ท่ี 3 ของ การหมกั ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 มีค่าความเป็ นกรด ด่างที่ลดลงจาก 4.55, 4.21, 5.07, 4.50, 4.77, 4.72 และ 4.47 ตามลาดบั เป็ น 3.20, 3.77, 4.32, 3.59, 4.34, 4.36 และ 4.15 เม่ือสิ้นสุดกระบวนการหมกั คา่ ความเป็ นกรดด่างของแบคทีเรียแต่ละไอโซเลท เท่ากบั 2.29, 2.59, 2.82, 2.51, 2.68, 2.57 และ 2.68 เมื่อทาการเปรียบเทียบค่าความเป็ นกรดด่างของ แต่ละไอโซเลท พบว่า G. hansenii ให้ค่าความเป็ นกรดด่างที่ต่ากว่าแบคทีเรียไอโซเลทอ่ืนๆ และ แบคทีเรียไอโซเลท N4 ใหค้ ่าความเป็ นกรดด่างท่ีมากกวา่ G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, S16, B19, L10 และ K6 จึงมีความแตกต่างกนั อย่างมีนัยสาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเชื่อมนั่ ท่ี 95% ดงั แสดงในภาพ 4.13 และ ตาราง 4.11 6 5.5 G. hansenii 5 N3 4.5 N4 4 S16 3.5 B19 3 L10 2.5 K6 2 0 3 6 9 12 15 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) ภาพ 4.13 ค่าความเป็ นกรดด่าง ระหว่างการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 3% โดยแบคทีเรียกรดอะซิ- ติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 46

ตาราง 4.11 ค่าความเป็ นกรดด่าง ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 3% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิ- ติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท, N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ค่าความเป็ นกรด-ด่าง L10 L6 (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 0 4.55±0.06a,b 4.21±0.01a 5.07±0.33c 4.50±0.03a,b 4.77±0.03b,c 4.72±0.03b,c 4.47±0.04a,b 1 4.69±0.05a,b 4.19±0.02a 4.76±0.20b 4.43±0.02a,b 4.64±0.04a,b 4.69±0.04a,b 4.41±0.05a,b 3 3.20±0.05a 3.77±0.11b 4.32±0.28c 3.59±0.07b 4.34±0.16c 4.36±0.04c 4.15±0.09c 5 2.86±0.01a 3.03±0.04a,b 3.16±0.25b,c 3.12±0.01a,b,c 3.34±0.05c 3.22±0.03b,c 3.24±0.01b,c 7 2.74±0.02a 2.77±0.04a 2.99±0.04c 2.89±0.01b 2.99±0.02c 2.97±0.01c 2.84±0.03b 9 2.67±0.01a 2.70±0.03a,b 2.81±0.03b 2.78±0.01c 2.92±0.02c 2.84±0.06b 2.75±0.03a,b 11 2.61±0.01a,b 2.59±0.02a 2.69±0.15a,b,c 2.66±0.01a,b,c 2.81±0.04c 2.75±0.02c 2.80±0.02b,c 13 2.51±0.02a 2.66±0.03b,c 2.78±0.11c 2.61±0.06a,b,c 2.73±0.01b,c 2.78±0.03c 2.71±0.02b,c 15 2.29±0.03a 2.59±0.01b,c 2.82±0.09d 2.51±0.05b 2.68±0.01b,c 2.57±0.03b,c 2.68±0.01c หมายเหตุ:อกั ษรท่ีต่างกนั ในแถวเดียวกนั มีความแตกตา่ งกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ที่ระดบั ความเชื่อมนั่ 95% (P < 0.05) 4.6.1.3.3 ปริมาณกรดอะซิติกท้งั หมด ปริมาณกรดอะซิติกท่ีเปล่ียนแปลงระหว่างการหมกั แบบเติมเอทานอลความเขม้ ขน้ ที่ 3% เมื่อเริ่มตน้ กระบวนการหมกั ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ให้ปริมาณกรดเท่ากบั 0.26, 0.85, 0.38, 0.31, 0.18, 0.28 และ 0.14 g/l ตามลาดบั ในวนั ท่ี 7 ของการ หมักแบคทีเรีย G. hansenii มีปริมาณกรดอะซิติกท่ีสูงเท่ากับ 14.78 g/l ในวนั ท่ี 9 ของการหมัก แบคทีเรียไอโซเลท L10 มีปริมาณกรดอะซิติกที่สูงสุดเท่ากบั 11.81 g/l ในวนั ท่ี 11 ของการหมกั แบคทีเรียไอโซเลท K6 มีปริมาณกรดอะซิติกท่ีสูงเท่ากบั 5.82 g/l ในวนั ที่ 13 ของการหมกั แบคทีเรีย ไอโซเลท N4 และ B19 มีปริมาณกรดอะซิติกที่สูงเท่ากบั 11.41 และ 12.70 g/l และในวนั ท่ี 15 ของ การหมกั แบคทีเรียไอโซเลท N4 และ S16 มีปริมาณกรดอะซิติกที่สูงเท่ากบั 18.12 และ 16.31 g/l ตามลาดับ เมื่อเปรียบเทียบปริมาณกรดอะซิติกที่สูงสุดของแต่ละไอโซเลท พบว่า G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19 และ L10 มีปริมาณกรดอะซิติกท่ีเพิ่มข้ึนมีปริมาณใกลเ้ คียง 47

กนั จึงไม่มีความแตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเชื่อมน่ั ที่ 95% แต่แบคทีเรียไอโซ เลท K6 มีปริมาณกรดที่นอ้ ยจึงมีความแตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเช่ือมนั่ ที่ 95% ดงั แสดงในภาพ 4.14 และ ตาราง 4.12 20 G. hanseniiป ิรมาณกรดอะ ิซติก (g/l) 15 N3 N4 10 S16 B19 5 L10 K6 0 0 3 6 9 12 15 ระยะเวลาการหมกั (วนั ) ภาพ 4.14 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 3% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.12 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 3% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ปริมาณกรดอะซิติก (g/l) L10 K6 (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 0 0.26±0.00a,b 0.85±0.16c 0.38±0.00b 0.31±0.06a,b 0.18±0.00a,b 0.28±0.03a,b 0.14±0.01a 1 0.26±0.12b 0.69±0.00d 0.38±0.00c 0.35±0.04b,c 0.26±0.03b 0.31±0.03b,c 0.12±0.01a 3 7.33±0.50c 0.92±0.31a 0.80±0.26a 2.27±0.47b 0.31±0.03a 0.33±0.03a 0.22±0.07a 5 13.74±0.60c 8.13±0.44b 8.86±0.40b 7.59±0.16b 4.41±0.23a 6.48±0.22b 1.67±0.15a 7 14.78±0.45c 14.62±0.45c 10.94±0.48b 13.94±0.32c 11.12±0.14b 10.73±0.34b 5.18±0.38a 48

ตาราง 4.12 (ต่อ) เวลา N3 ปริมาณกรดอะซิตกิ (g/l) L10 K6 (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 9 13.66±0.30b,c 15.89±0.11c 11.17±0.42b 13.94±0.29c 11.14±0.13b 11.81±0.20b 5.34±0.49a 11 12.84±0.30c 16.56±0.35d 10.92±0.43b 15.52±0.22d 12.09±0.01b,c 10.97±0.18b 5.82±0.34a 13 12.40±0.30b 16.89±0.39c 11.42±0.25b 15.50±0.14c 12.70±0.15b 11.73±0.45b 5.67±0.22a 15 12.09±0.50b 18.12±0.40c 11.30±0.21b 16.31±0.21c 12.56±0.22b 11.71±0.29b 5.36±0.36a หมายเหตุ:อกั ษรท่ีตา่ งกนั ในแถวเดียวกนั มีความแตกตา่ งกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ที่ระดบั ความเช่ือมนั่ 95% (P < 0.05) 4.6.1.3.4 ปริมาณแบคทเี รียท้งั หมด ปริมาณแบคทีเรียท้งั หมดจากการทดลองแบบเติมเอทานอล 3% พบวา่ ในวนั เริ่มตน้ ของการ หมกั ด้วย G. hansenii แบคทีเรียไอโซเลท, N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 มีปริมาณแบคทีเรีย เท่ากับ 5.53, 3.54, 4.08, 2.39, 3.70, 3.61 และ 4.50 logCFU/ml ตามลาดับ โดยในวนั ท่ี 5 ของการ หมกั แบคทีเรียไอโซเลท S16, B19 และ K6 มีปริมาณเพิ่มข้ึนเป็ น 6.48, 7.50 และ 7.10 logCFU/ml ตามลาดบั เม่ือระยะการหมกั ในวนั ท่ี 7 แบคทีเรียไอโซเลท N4 และ L10 มีปริมาณเพ่ิมข้ึนเท่ากบั 6.59 และ 6.86 logCFU/ml ในวนั ท่ี 9 ของการหมกั แบคทีเรียไอโซเลท N3 มีปริมาณแบคทีเรีย เพ่ิมข้ึนเป็ น 8.39 logCFU/ml และในวนั ที่ 11 ของการหมกั G. hansenii มีปริมาณแบคทีเรียเพ่ิมข้ึน เป็ น 10.26 logCFU/ml เมื่อเปรียบเทียบปริมาณแบคทีเรียท่ีเพิ่มสูงสุดของแต่ละไอโซเลท พบวา่ G. hansenii มีปริมาณแบคทีเรียที่สูงท่ีสุด จึงมีความแตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติท่ีระดบั ความ เช่ือมน่ั ท่ี 95% และ N3 มีปริมาณแบคทีเรียท่ีสูงกวา่ แบคทีเรียไอโซเลท N4, S16, B19, L10 และ K6 จึงมีความแตกตา่ งกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติท่ีระดบั ความเชื่อมนั่ ที่ 95% ดงั แสดงในภาพ 4.14 49

ป ิรมาณแบคทีเ ีรย (logCFU/ml)11 10 9 8 7 G. hansenii 6 N3 5 N4 4 S16 3 B19 2 L10 1 K6 0 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) ภาพ 4.15 ปริมาณแบคทีเรียระหว่างการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 3% ดว้ ยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 4.6.1.3.5 การทดสอบฤทธ์ิการต้านอนุมูลอสิ ระด้วยวธิ ี DPPH radical scavenging จากการทดสอบฤทธ์ิตา้ นอนุมูลอิสระดว้ ยวิธี DPPH radical scavenging ของชาหมกั แบบ เติมความเขม้ ขน้ ของเอทานอลท่ี 3% ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในวนั เร่ิมตน้ ของการหมกั ให้ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระเท่ากบั 385, 425, 928, 908, 425, 750 และ 904 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั เม่ือวนั สุดทา้ ยของการหมกั ด้วยไอโซเลท N3, N4, B19, L10 และ K6 พบว่า มีปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระที่เพ่ิมข้ึนเท่ากบั 657, 1480, 512, 937 และ 952 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั โดยการหมกั ดว้ ย G. hansenii และแบคทีเรียไอโซเลท S16 ให้ ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระที่ลดลงเป็ น 356 และ 595 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั ดงั แสดงใน ตาราง 4.13 50

ตาราง 4.13 ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระ (mg gallic/L tea broth) ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทา- นอล 3% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา ปริมาณสารต้านอนุมูลอสิ ระ (mg gallic/L tea broth) K6 (วนั ) G. hansenii N3 N4 S16 B19 L10 0 385.58±0.14 425.71±0.02 928.97±0.02 908.95±0.02 425.80±0.01 750.62±0.03 904.75±0.00 3 506.53±0.01 641.33±0.01 911.25±0.01 936.89±0.01 491.52±0.01 773.53±0.01 918.17±0.02 5 381.09±0.01 586.27±0.03 744.69±0.01 953.93±0.01 412.41±0.01 896.08±0.04 908.95±0.01 7 557.14±0.02 552.58±0.03 838.13±0.00 962.91±0.01 497.06±0.00 916.93±0.02 928.76±0.00 9 520.00±0.01 685.60±0.06 761.49±0.02 930.19±0.01 450.73±0.01 930.35±0.01 888.14±0.03 11 498.73±0.02 629.52±0.00 818.17±0.01 951.99±0.01 512.70±0.00 923.07±0.03 929.90±0.01 13 489.71±0.00 395.06±0.02 765.36±0.00 919.45±0.01 510.22±0.00 935.91±0.01 946.36±0.01 15 356.58±0.11 657.34±0.00 1480.34±0.0 595.51±0.04 512.40±0.01 937.95±0.01 952.22±0.00 4.6.1.4. ระดับความเข้มข้นของเอทานอลที่ 5 เปอร์เซ็นต์ 4.6.1.4.1 ปริมาณแอลกอฮอล์ เมื่อเติมเอทานอลระดบั ความเขม้ ขน้ ท่ี 5% ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในการหมกั พบว่า ในวนั เร่ิมตน้ ของการหมกั ตรวจพบปริมาณแอลกอฮอล์ เท่ากบั 4.17, 4.27, 4.20, 4.13, 4.33, 4.50 และ 4.33 ตามลาดบั เม่ือระยะเวลาการหมกั ในวนั ที่ 7 ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N4 และ L10 ในวนั ท่ี 9 ดว้ ยแบคทีเรียไอโซเลท N3, S16 และ B19 ในวนั ท่ี 11 ของการหมกั ดว้ ยแบคทีเรียไอโซเลท S16 ไม่ตรวจพบแอลกอฮอล์ในชาหมกั ตามลาดบั ดงั แสดงในตาราง 4.14 51

ตาราง 4.14 ปริมาณแอลกอฮอล์ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 5% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ปริมาณแอลกอฮอล์ (%) (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 L10 L6 0 4.17±0.20 4.27±0.09 4.20±0.15 4.13±0.12 4.33±0.09 4.50±0.00 4.33±0.12 1 4.13±0.10 4.07±0.09 3.77±0.15 4.07±0.12 4.27±0.08 3.83±0.29 4.27±0.23 3 2.03±0.15 3.27±0.09 2.43±0.02 2.87±0.12 2.53±0.10 3.83±0.29 3.27±0.12 5 0.97±0.15 1.90±0.09 1.43±0.34 1.60±0.00 1.40±0.09 1.00±0.00 2.80±0.35 7 0.00±0.00 0.67±0.09 0.00±0.00 0.87±0.12 0.50±0.00 0.00±0.00 2.00±0.00 9 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.87±0.12 11 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 13 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 15 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 4.6.1.4.2 ค่าความเป็ นกรดด่าง ค่าความเป็ นกรดด่างของการหมกั แบบเติมเอทานอลความเขม้ ขน้ ท่ี 5% พบว่า เมื่อเริ่มตน้ กระบวนการหมกั ค่าความเป็ นกรดด่างของแต่ละไอโซเลทอยูร่ ะหวา่ ง 4.23-5.56 โดยในวนั ท่ี 5 ของ การหมกั ด้วย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 จะมีค่าความเป็ น กรดด่างที่ลดลงจาก 4.61, 4.23, 5.56, 4.43, 4.76, 4.64 และ 4.52 ตามลาดับ เป็ น 3.03, 3.27, 4.05, 3.38, 3.57, 3.40 และ 4.13 ตามลาดบั เม่ือสิ้นสุดกระบวนการหมกั พบว่าค่าความเป็ นกรดด่างของ แบคทีเรียแต่ละไอโซเลทมีความแตกต่างกัน โดย G. hansenii มีค่าความเป็ นกรดด่างท่ี 2.28 แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 มีค่าความเป็ นกรดด่างที่ 2.57, 2.76, 2.50, 2.68, 2.57และ 2.69 ตามลาดบั ซ่ึงมีความแตกตา่ งกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเชื่อมน่ั ท่ี 95% ดงั แสดงในภาพ 4.16 และตาราง 4.15 52

6่คาความเ ็ปนกรด ่ดาง 5.5 G. hansenii 5 N3 4.5 N4 4 S16 3.5 B19 3 L10 2.5 K6 2 0 3 6 9 12 15 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) ภาพ 4.16 คา่ ความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 5% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.15 ค่าความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 5% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิ- ติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ค่าความเป็ นกรดด่าง L10 K6 (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 0 4.61±0.07c 4.23±0.01a 5.56±0.06e 4.43±0.02b 4.76±0.07d 4.64±0.03c,d 4.52±0.05b,c 1 4.82±0.13c 4.23±0.01a 5.42±0.06d 4.38±0.06a,b 4.69±0.09c 4.66±0.06c 4.46±0.02b 3 3.83±0.10a 3.91±0.05a 4.62±0.08c 4.18±0.02a,b 4.57±0.05c 4.60±0.03c 4.32±0.01b,c 5 3.03±0.08a 3.27±0.06a,b 4.05±0.18c 3.38±0.10a,b 3.57±0.17b 3.40±0.03a,b 4.13±0.08c 7 2.70±0.02a 2.82±0.10a,b 3.12±0.19c 2.98±0.03b,c 3.09±0.01c 3.03±0.00b,c 3.10±0.03c 9 2.62±0.01a 2.66±0.05a 2.92±0.13b 2.84±0.02b 2.87±0.02b 2.84±0.04b 2.91±0.08b 11 2.54±0.02a 2.55±0.03a 2.81±0.06c,d 2.67±0.02b 2.80±0.01c,d 2.74±0.01b,c 2.83±0.03d 13 2.48±0.03a 2.61±0.01c 2.78±0.02e 2.56±0.01b 2.72±0.01d 2.77±0.01e 2.69±0.01d 15 2.28±0.06a 2.57±0.01bc 2.76±0.08d 2.50±0.01b 2.68±0.01cd 2.57±0.03b 2.69±0.00d หมายเหตุ:อกั ษรที่ตา่ งกนั ในแถวเดียวกนั มีความแตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ท่ีระดบั ความเชื่อมนั่ 95 เปอร์เซ็นต์ (P < 0.05) 53

ป ิรมาณกรดอะ ิซติก (g/l)4.6.1.4.3 ปริมาณกรดอะซิติกท้งั หมด ปริมาณกรดอะซิติกที่เปลี่ยนแปลงของการหมกั แบบเติมเอทานอลความเขม้ ขน้ ท่ี 5% เม่ือ เร่ิมต้นกระบวนการหมัก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ให้ ปริมาณกรดเท่ากับ 0.26, 0.87, 0.32, 0.25, 0.24, 0.31 และ 0.11 g/l ตามลาดับ ในวนั ที่ 9 ของการ หมกั G. hansenii และแบคทีเรียไอโซเลท N4 มีปริมาณกรดอะซิติกที่สูงเท่ากบั 22.51 และ 13.17 g/l ในวนั ที่ 11 ของการหมกั แบคทีเรียไอโซเลท N3 มีปริมาณกรดอะซิติกท่ีสูงเท่ากบั 23.07 g/l ในวนั ที่ 13 ของการหมกั แบคทีเรียไอโซเลท K6 มีปริมาณกรดอะซิติกท่ีสูงเท่ากบั 7.82 g/l ในวนั ที่ 15 ของ การหมกั แบคทีเรียไอโซเลท S16, B19 และ L10 มีปริมาณกรดอะซิติกเท่ากับ 20.40, 16.93 และ 16.24 g/l ตามลาดับ เม่ือเปรียบเทียบปริมาณกรดอะซิติกท่ีสูงสุดของแต่ละไอโซเลท พบว่า G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3 และ S16 มีปริมาณกรดอะซิติกท่ีเพ่ิมสูงข้ึนในท่ีปริมาณใกลเ้ คียง กนั จึงไม่มีความแตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเช่ือมนั่ ที่ 95% ส่วนแบคทีเรียไอ โซเลท N4, B19 และ L10 มีปริมาณกรดท่ีใกลเ้ คียงกนั แต่แบคทีเรียไอโซเลท K6 มีปริมาณกรดที่ นอ้ ยที่สุดจึงมีความแตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเชื่อมนั่ ที่ 95% ดงั แสดงในภาพ 4.17 และ ตาราง 4.16 25 G. hansenii 20 N3 15 N4 S16 10 B19 5 L10 0 K6 0 3 6 9 12 15 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) ภาพ 4.17 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 5% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 54

ตาราง 4.16 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 5% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา N3 ปริมาณกรดอะซิตกิ (g/l) (วนั ) G. hansenii N4 S16 B19 L10 K6 0 0.26±0.03b 0.87±0.06c 0.32±0.06b 0.25±0.00b 0.24±0.00b 0.31±0.03b 0.11±0.02a 1 0.32±0.03b 0.69±0.06c 0.23±0.10a,b 0.33±0.04b 0.24±0.00a,b 0.30±0.06b 0.12±0.02a 3 2.88±0.00e 0.62±0.06d 0.29±0.07b 0.46±0.04c 0.35±0.00b,c 0.30±0.00b 0.14±0.04a 5 9.79±0.00c 4.06±0.54b 0.74±0.25a 3.68±0.43b 2.97±0.09b 4.08±0.27b 0.19±0.02a 7 17.92±0.30c 12.96±0.30b,c 8.90±0.39b 11.00±0.34b 9.13±0.02b 10.10±0.41b 2.65±0.71a 9 22.51±0.41c 20.68±0.21c 13.17±0.33b 14.64±0.42b 14.47±0.09b 14.63±0.15b 3.73±0.76a 11 21.61±0.35d 23.07±0.15d 11.42±0.27b 19.36±0.31d 15.51±0.07c 15.43±0.45c 6.13±0.67a 13 22.57±0.20c 22.28±0.24c 14.15±0.11b 20.30±0.35c 16.52±0.17b 15.34±0.29b 7.82±0.36a 15 19.02±0.60b 23.98±0.11c,b 11.49±0.33a 20.40±0.29c,b 16.93±0.05b 16.24±0.26b 7.60±0.03a หมายเหตุ:อกั ษรที่ต่างกนั ในแถวเดียวกนั มีความแตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ที่ระดบั ความเช่ือมน่ั 95% (P < 0.05) 4.6.1.4.4 ปริมาณแบคทเี รียท้งั หมด ปริมาณแบคทีเรียท้งั หมดจากการทดลองแบบเติมเอทานอล 5% พบวา่ ในวนั เริ่มตน้ ของการ หมกั ด้วย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 มีปริมาณแบคทีเรีย เท่ากับ 5.41, 3.30, 4.64, 3.72, 4.08, 4.51 และ 4.35 logCFU/ml ตามลาดบั โดยในวนั ที่ 3 ของการ หมกั แบคทีเรียไอโซเลท S16 มีปริมาณเพ่มิ ข้ึนเทา่ กบั 7.05 logCFU/ml ตามลาดบั เมื่อระยะการหมกั ในวนั ที่ 5 แบคทีเรียไอโซเลท N4, B19 และ K6 มีปริมาณเพิ่มข้ึนเท่ากับ 7.07, 7.26 และ 7.72 logCFU/ml ตามลาดบั ในวนั ที่ 7 ของการหมกั แบคทีเรียไอโซเลท N3 และ L10 มีปริมาณเพ่ิมข้ึน เป็ น 9.09 และ 6.68 logCFU/ml และในวนั ที่ 9 ของการหมกั G. hansenii มีปริมาณเพิ่มข้ึนเป็ น 9.20 logCFU/ml เมื่อเปรียบเทียบปริมาณแบคทีเรียที่เพิ่มสูงสุดของแต่ละไอโซเลท พบว่า G. hansenii และแบคทีเรียไอโซเลท N3 มีปริมาณเพิ่มสูงข้ึนที่ใกลเ้ คียงกนั จึงไม่แตกต่างกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทาง 55

ป ิรมาณแบคทีเ ีรย (logCFU/ml)สถิติที่ระดบั ความเชื่อมน่ั ท่ี 95% แต่มีปริมาณที่มากกวา่ แบคทีเรียไอโซเลท N4, S16, B19, L10 และ K6 จึงมีความแตกตา่ งกนั อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเช่ือมนั่ ท่ี 95% ดงั แสดงในภาพ 4.18 10 9 G. hansenii 8 N3 7 6 N4 5 S16 4 3 B19 2 L10 1 0 K6 ระยะเวลาการหมกั (วนั ) ภาพ4.18 ปริมาณแบคทีเรียในระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 5% ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 4.6.1.4.5 การทดสอบฤทธ์ิการต้านอนุมูลอสิ ระด้วยวธิ ี DPPH radical scavenging จากการทดสอบฤทธ์ิตา้ นอนุมูลอิสระดว้ ยวิธี DPPH radical scavenging ของชาหมกั แบบ เติมความเขม้ ขน้ ของเอทานอลท่ี 5% ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในวนั เร่ิมตน้ ของการหมกั ให้ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระเท่ากบั 545, 511, 770, 890, 395, 692 และ 889 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั เมื่อวนั สุดทา้ ยของการหมกั ด้วยไอโซเลท N3, N4, B19, L10 และ K6 พบว่า มีปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระท่ีเพ่ิมข้ึนเท่ากบั 611, 1306, 508, 728 และ 928 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั โดยการหมกั ดว้ ย G. hansenii และแบคทีเรียไอโซเลท S16 ให้ ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระที่ลดลงเป็ น 442 และ 560 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั ดงั แสดงใน ตาราง 4.17 56

ตาราง 4.17 ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระ (mg gallic/L tea broth) ระหว่างการหมกั แบบเติมเอทา- นอล 5% โดย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 เวลา ปริมาณสารต้านอนุมูลอสิ ระ (mg gallic/L tea broth) K6 (วนั ) G. hansenii N3 N4 S16 B19 L10 0 545.03±0.01 511.00±0.03 770.03±0.04 890.07±0.04 395.55±0.01 692.92±0.02 889.41±0.01 3 569.52±0.01 720.03±0.00 724.36±0.01 918.35±0.02 481.33±0.00 739.76±0.02 898.44±0.04 5 469.92±0.01 543.98±0.06 706.60±0.06 877.21±0.02 513.35±0.01 930.80±0.01 758.80±0.24 7 540.97±0.04 483.77±0.02 726.35±0.02 933.46±0.01 472.87±0.02 928.47±0.01 924.38±0.01 9 586.21±0.06 627.52±0.02 812.43±0.02 929.24±0.00 486.44±0.00 926.18±0.01 887.17±0.01 11 465.21±0.05 408.66±0.03 674.91±0.16 869.91±0.00 517.57±0.00 929.40±0.01 903.36±0.01 13 482.70±0.01 439.72±0.01 744.97±0.04 736.85±0.01 508.78±0.01 930.71±0.00 928.96±0.01 15 442.13±0.03 611.40±0.01 1306.86±0.2 560.62±0.02 508.32±0.02 728.77±0.00 928.92±0.00 4.6.2 ศึกษาการหมัก โดยใช้หัวเชื้อจุลินทรีย์บริสุทธ์ิและหัวเชื้อจุลนิ ทรีย์คอมบูชาแบบผสม ในอตั ราส่วน 1:1 4.6.2.1 ค่าความเป็ นกรดด่าง ค่าความเป็ นกรดด่างของการหมกั โดยใชห้ ัวเช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิและหวั เช้ือจุลินทรียแ์ บบ ผสมในอตั ราส่วน 1:1 เปอร์เซ็นต์ พบวา่ เม่ือเร่ิมตน้ กระบวนการหมกั ค่าความเป็ นกรดด่างของแต่ละ ไอโซเลทอยู่ระหว่าง 3.32-4.13 โดยในวนั ท่ี 5 ของการหมกั แบบเติม G. hansenii, แบคทีเรียไอโซ เลท N3, N4, S16, B19, G42,G45, L10, K6 และแบบด้ังเดิม (control) จะมีค่าความเป็ นกรดด่างที่ ลดลงจาก 3.32, 4.11, 4.09, 3.67, 4.08, 3.70, 3.75, 4.13, 3.74และ 3.50 ตามลาดับ เป็ น 2.62, 3.29, 2.81, 3.10, 3.00, 3.14, 3.18, 3.00, 3.19 และ 2.89 ตามลาดบั เม่ือสิ้นสุดกระบวนการหมกั พบว่าค่า ความเป็ นกรดด่างของแบคทีเรียแต่ละไอโซเลทไม่แตกต่างกนั โดย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซ N4, S16, B19, G42, G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม มีค่าความเป็ นกรดด่างที่ 2.33, 2.34, 2.40, 2.33, 2.38, 2.40, 2.28, 2.44 และ 2.38 ตามลาดบั ยกเวน้ ไอโซเลท N3 มีค่าความเป็ นกรดด่างท่ี 2.70 ซ่ึงมี ความแตกต่างกบั ไอโซเลทอื่นอยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเช่ือมน่ั ที่ 95% ดงั แสดงในภาพ 4.19 57

4.5 G. hansenii N3 4 N4 ่คาความเ ็ปนกรด ่ดาง 3.5 S16 B19 3 G42 G45 2.5 L10 2 K6 ระยะเวลาการหมกั (วนั ) control ภาพ 4.19 ค่าความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบผสมดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42,G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม 4.6.2.2 ปริมาณกรดอะซิตกิ ท้งั หมด ปริมาณกรดอะซิติกที่เปล่ียนแปลงของการหมกั โดยใช้หัวเช้ือจุลินทรีย์บริสุทธ์ิและหัว เช้ือจุลินทรีย์แบบผสมในอัตราส่วน 1:1 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเริ่มต้นกระบวนการหมัก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42,G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม ให้ปริมาณกรดอะซิติก เท่ากบั 0.89, 0.60, 0.45, 0.80, 0.43, 0.74, 0.74, 0.65, 0.78 และ 0.88 g/l ตามลาดบั ในวนั ที่ 13 ของ การหมกั แบคทีเรียไอโซเลท B19 มีปริมาณกรดอะซิติกท่ีสูงเท่ากบั 22.87 g/l ในวนั ท่ี 15 ของการ หมกั ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42,G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม มี ปริมาณกรดอะซิติกที่สูงเท่ากบั 16.85, 15.94, 28.34, 14.26, 14.91, 12.36, 19.56, 12.13 และ 17.44 g/l ตามลาดบั เมื่อเปรียบเทียบปริมาณกรดอะซิติกที่สูงสุดของแต่ละไอโซเลท พบว่า การหมกั ดว้ ย แบคทีเรียไอโซเลท N4 มีปริมาณกรดอะซิติกสูงที่สุด มีความแตกต่างกบั G. hansenii, แบคทีเรียไอ โซเลท N3, S16, B19, G42,G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม อย่างมีนยั สาคญั ทางสถิติท่ีระดบั ความ เช่ือม่ันที่ 95% สาหรับ G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, S16, B19, G42, G45, L10 และแบบ ด้งั เดิม มีปริมาณกรดอะซิติกในปริมาณใกลเ้ คียงกนั สาหรับแบคทีเรียไอโซเลท K6 มีปริมาณกรดอะ ซิติกน้อยท่ีสุด จึงมีความแตกต่างกบั G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, S16, B19, G42, G45, L10 และแบบด้งั เดิม อยา่ งมีนยั สาคญั ทางสถิติที่ระดบั ความเช่ือมนั่ ที่ 95% ดงั แสดงในภาพ 4.20 58

30 ป ิรมาณกรดอะ ิซ ิตก ้ทังหมด (g/l) 25 G. hansenii 20 N3 15 N4 10 S16 5 B19 0 G42 G45 0 L10 K6 control 3 6 9 12 15 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) ภาพ 4.20 ปริมาณกรดอะซิติกระหว่างการหมกั แบบผสมดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42,G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม 4.6.2.3 ปริมาณแบคทเี รียท้งั หมด ปริมาณแบคทีเรียท้งั หมดจากการหมกั โดยใช้หวั เช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิและหัวเช้ือจุลินทรีย์ แบบผสมในอตั ราส่วน 1:1 เม่ือเร่ิมตน้ กระบวนการหมกั G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42,G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม พบว่า ในวนั เร่ิมตน้ ของการหมกั มีปริมาณแบคทีเรีย เท่ากบั 4.81, 5.40, 4.44, 3.91, 4.23, 3.71, 5.72 และ 5.07 logCFU/ml ตามลาดบั โดยในวนั ท่ี 3 ของ การหมกั แบคทีเรียทุกไอโซเลทมีปริมาณแบคทีเรียเพ่ิมข้ึนเป็ น 7.48, 7.90, 7.64, 7.13, 7.72, 7.08, 7.15, 7.30, 6.93 และ 7.39 logCFU/ml ตามลาดบั เมื่อสิ้นสุดกระบวนการหมกั ปริมาณแบคทีเรียทุก ไอโซเลทมีปริมาณแบคทีเรียท่ีลดลงเท่ากบั 6.27, 7.72, 6.00, 6.16, 6.91, 6.10, 6.41, 6.34, 6.40 และ 6.43 logCFU/ml ตามลาดบั ดงั แสดงในภาพ 4.21 59

ป ิรมาณแบคทีเ ีรย ้ัทงหมด (logCFU/ml) 12 G. hansenii 11 N3 10 N4 9 S16 8 B19 7 G42 6 G45 5 L10 4 K6 3 control 2 1 0 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) ภาพ 4.21 ปริมาณแบคทีเรียในระหว่างการหมกั แบบผสม ดว้ ยแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42,G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม 4.7 การวเิ คราะห์ชนิดของสารประกอบอนิ ทรีย์ในคอมบูชาเมื่อสิ้นสุดกระบวนการหมกั ด้วยเทคนิค High Performance Liquid Chromatography (HPLC) จากการวเิ คราะห์ชนิดของสารประกอบอินทรียจ์ ากคอมบูชาท่ีผ่านกระบวนการหมกั 2 วิธี คือ การหมกั แบบเติม 3% เอทานอล และการหมกั แบบผสม ซ่ึงหมกั โดยไอโซเลท N3, N4 และแบบ ด้งั เดิมและชาเขียว ทาการตรวจวเิ คราะห์ glucuronic acid, gluconic acid, ascorbic acid, acetic acid, succinic acid และ สาร DSL ดงั แสดงในตาราง 4.18 การตรวจวิเคราะห์ปริมาณ glucuronic acid ไม่สามารถตรวจพบได้จากคอมบูชาท่ีผ่าน กระบวนการหมกั ท้งั 2 วธิ ี สาหรับการตรวจวิเคราะห์ปริมาณ gluconic acid พบว่า ในคอมบูชาแบบด้งั เดิมให้ปริมาณ gluconic acid เท่ากบั 20.98 mg/ml สาหรับการหมกั แบบผสมดว้ ยไอโซเลท N3 และ N4 ให้ปริมาณ กรดเท่ากบั 7.50 และ 18.85 mg/ml ตามลาดบั โดยการหมกั แบบเติม 3% เอทานอลของไอโซเลท N3 และ N4 ให้ปริมาณกรดเท่ากบั 11.58 และ 5.16 mg/ml ตามลาดบั ซ่ึงในชาเขียวสามารถตรวจพบ กรดไดเ้ ท่ากบั 0.45 mg/ml 60

การตรวจวิเคราะห์ปริมาณสาร DSL พบวา่ ในคอมบูชาแบบด้งั เดิมให้ปริมาณสารเท่ากบั 3.08 mg/ml สาหรับการหมกั แบบผสมของไอโซเลท N3 และ N4 ให้ปริมาณสาร DSL เท่ากบั 1.22 และ 2.27 mg/ml ซ่ึงการหมกั แบบเติม 3% เอทานอลของไอโซเลท N3 และ N4 ให้ปริมาณสาร DSL เท่ากบั 1.24 และ 0.42 mg/ml ซ่ึงในชาเขียวสามารถตรวจพบปริมาณสาร DSL เทา่ กบั 0.26 mg/ml การตรวจวิเคราะห์ปริมาณ ascorbic acid พบว่า ในคอมบูชาแบบด้ังเดิมให้ปริมาณกรด เท่ากบั 0.12 mg/ml ในการหมกั แบบผสมของไอโซเลท N3 และ N4 ใหป้ ริมาณกรดเท่ากบั 0.01 และ 0.09 mg/ml สาหรับการหมกั แบบเติม 3% เอทานอลของไอโซเลท N4 ให้ปริมาณกรดเท่ากบั 0.05 mg/ml ซ่ึงในชาเขียวสามารถตรวจพบปริมาณกรดเท่ากบั 0.07 mg/ml และการหมกั แบบเติม 3 % เอ ทานอลของไอโซเลท N3 ไมส่ ามารถตรวจพบ ascorbic acid การตรวจวิเคราะห์ปริมาณ acetic acid พบวา่ ในคอมบูชาแบบด้งั เดิมให้ปริมาณกรดเท่ากบั 15.25 mg/ml สาหรับการหมกั แบบผสมของไอโซเลท N3 และ N4 ใหป้ ริมาณกรดเท่ากบั 13.37 และ 17.18 mg/ml การหมกั แบบเติม 3 % เอทานอลของไอโซเลท N3 และ N4 ให้ปริมาณกรดเท่ากับ 18.75 และ 10.65 mg/ml ซ่ึงในชาเขียวสามารถตรวจพบ acetic acid เทา่ กบั 1.13 mg/ml การตรวจวิเคราะห์ปริมาณ succinic acid พบว่า ในคอมบูชาแบบด้ังเดิมให้ปริมาณกรด เท่ากบั 0.50 mg/ml ในการหมกั แบบผสมของไอโซเลท N3 และ N4ใหป้ ริมาณกรดเท่ากบั 0.39 และ 0.30 mg/ml สาหรับการหมกั แบบเติม 3% เอทานอลของไอโซเลท N4 ให้ปริมาณกรดเท่ากบั 0.31 mg/ml ซ่ึงในชาเขียวสามารถตรวจพบปริมาณกรดเท่ากบั 0.17 mg/ml และในการหมกั แบบ 3% เอ ทานอลดว้ ยไอโซเลท N3 ไมส่ ามารถตรวจพบ succinic acid ตาราง 4.18 ปริมาณสารประกอบอินทรียท์ ี่ตรวจวเิ คราะห์ดว้ ยวธิ ี HPLC ปริมาณสารประกอบอนิ ทรีย์ (mg/ml) คอมบูชา Acetic acid Gluconic DSL Ascorbic Succinic Glucuronic acid 1.22±0.02 acid acid acid N3 + ด้งั เดิม 13.37±0.14 nd N3+3% เอทานอล 18.75±0.19 7.5±0.01 0.10±0.00 0.39±0.00 nd N4+ด้งั เดิม 17.18±0.17 N4+3% เอทานอล 10.65±0.11 11.58±0.01 1.24±0.02 0.12±0.00 nd nd 18.85±0.03 2.27±0.04 0.09±0.00 0.30±0.00 nd 5.16±0.01 0.42±0.01 0.05±0.00 0.31±0.00 61

ตาราง 4.18 (ต่อ) ปริมาณสารประกอบอนิ ทรีย์ (mg/ml) คอมบูชา Acetic acid Gluconic DSL Ascorbic Succinic Glucuronic 15.25±0.16 acid 3.08±0.05 acid acid acid แบบด้งั เดิม ชาเขียว 20.98±0.03 0.12±0.00 0.5±0.00 nd 1.13±0.01 0.45±0.01 0.26±0.00 0.07±0.04 0.17±0.00 nd หมายเหตุ nd หมายถึง ตรวจไมพ่ บสารประกอบอินทรียช์ นิดน้นั ในชาหมกั 4.8 การบ่งชี้ชนิดของเชื้อจุลนิ ทรีย์บริสุทธ์ิท่คี ัดแยกได้ด้วยวธิ ีการทางด้านดีเอน็ เอ (Identification of Microbial by DNA analysis) เม่ือทาการสกดั ดีเอ็นเอของไอโซเลท N3 และ N4 นาไปทาการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอด้วย เทคนิค Polymerase chain reaction โดยใช้ไพรเมอร์ Ac1 และ Ac2 ท่ีมีความจาเพาะต่อแบคทีเรีย กรดอะซิติก 16S rRNA พบวา่ ไอโซเลท N3 และ N4 มีขนาดของดีเอน็ เอเท่ากบั 900 bp ดงั แสดงใน ภาพ 22 ภาพ 4.22 PCR product ของไอโซเลท N3 และ N4 ดว้ ยวธิ ี Agarose Gel Electrophoresis 62

เม่ือทาการส่ งวิเคราะห์ข้อมูลเพ่ือหาลาดับของดี เอ็นเ อและนาไปทาการเปรี ยบเทียบใน ฐานข้อมูล พบว่า แบคทีเรียไอโซเลท N3 และ N4 มีความใกล้เคียงกับแบคทีเรียกรดอะซิติก โดยแบคทีเรียไอโซเลท N3 มีความใกล้เคียงและสามารถบ่งช้ีชนิดเป็ น Gluconacetobacter xylinus หรือ Komagataeibacter xylinus และแบคทีเรียไอโซเลท N4 มีความใกล้เคียงและ สามารถบ่งช้ีชนิดของแบคทีเรียเป็ น Gluconacetobacter intermedius ที่เปอร์เซ็นต์ความ เหมือนที่ 100 ดังแสดงในภาพ 4.23 N3 Komagataeibacter xylinus NBCR 13693 GNl4uconacetobacter intermedius IBP-RWV02 GGlluuccoonnaacceettoobbaacctteerr ehuarnospeaneiiuNs BEVRCB914820 Komagataeibacter rhaeticus DSM 16663 Gluconacetobacter kombuchae LMG 23726T Asaia platycodi T-671 GGlluuccoonnoobbaacctteerrktohnadiloannidiiNcuBsRMCG37216-62 Frateuria aurantia IFO13333 0.20 ภาพ 4.23 โครงสร้างวิวฒั นาการของแบคทีเรียกรดอะซิติกไอโซเลท N3 และ N4 63

บทท่ี 5 อภปิ รายผลการทดลอง การคดั แยกแบคทีเรียกรดอะซิติกจากหวั เช้ือคอมบูชาจากโรงงานและน้าสมุนไพร ผลไมห้ มกั ในอาหารเหลวโดยใช้อาหาร Hestrin–Schramm (HS) ที่ผส ม 50 ppm ของ cycloheximide ได้ เช้ือจุลินทรียจ์ านวนมาก ซ่ึง cycloheximide มีผลต่อการยบั ย้งั การเจริญของเช้ือรา ซ่ึงสอดคลอ้ งกบั งานวิจยั ของ Aydın และ Aksoy (2013) ท่ีใชอ้ าหารเหลว HS ที่ผสม 50 mg/l ของ cycloheximide ใน การคดั แยกแบคทีเรียกรดอะซิติกจากตวั อย่างน้าส้มสายชู น้าทิ้งจากกระบวนการหมกั น้าส้มสายชู ผลไมส้ ุกงอม ไดแ้ ก่ แอปเปิ้ ล องุ่น สับปะรด ลูกพลมั การคดั แยกแบคทีเรียกรดอะซิติกบนอาหารแข็ง Glucose Yeast Calcium Carbonate (GYC) และอาหารแข็ง HS ในตวั อย่างของน้าผลไม้ สมุนไพรหมกั และคอมบูชาพบการเจริญของแบคทีเรีย กรดอะซิติกบนอาหารแข็ง HS มากกว่าบนอาหารแข็ง GYC ท้ังน้ีจากรายงานของ Elhanan และ Hestrin (1963) อาหาร HS เป็ นอาหารที่เหมาะสมกบั การเจริญของแบคทีเรียกรดอะซิติกท่ีสามารถ สร้างแผ่นวุน้ และมีการเพิ่มสารอาหารจาพวก peptone, Disodium Hydrogenphosphate และ citric acid ซ่ึงเป็ นการเพ่ิมแหล่งสารอาหาร แหล่งไนโตรเจนและคาร์บอนให้แก่จุลินทรีย์ ซ่ึงการหมกั คอม บูชามีการเกิดแผน่ วนุ้ ดงั น้นั อาหาร HS จึงมีความเหมาะสมกวา่ อาหาร GYC การเตรียมหัวเช้ือคอมบูชาโดยใช้เช้ือบริสุทธ์ิ พบว่า ภายใน 3 วนั ของการหมกั จะพบการ ปนเป้ื อนของเช้ือรา ท้ังน้ีเน่ืองจากแบคทีเรียกรดอะซิติกบริสุทธ์ิท่ีใช้ผลิตหัวเช้ือคอมบูชามีความ อ่อนแอ เช่นจากระบบการหมกั คอมบูชาเป็ นการหมกั แบบพ่ึงพาอาศยั ร่วมกนั ของแบคทีเรียกรดอะ ซิติกและยีสต์ Dufresne และ Farmworth (2000) พบว่าในระยะเร่ิมต้นของการหมกั ยีสต์ทาหน้าท่ี เปล่ียนน้าตาลโมเลกุลคู่ใหเ้ ป็นน้าตาลโมเลกุลเดี่ยว จากน้นั ยีสตก์ จ็ ะเปลี่ยนน้าตาลโมเลกลุ เดี่ยวใหเ้ ป็ น แอลกอฮอล์และกรดอินทรีย์บางชนิด ในสภาวะที่มีท้งั แอลกอฮอล์และน้าตาลโมเลกุลเดี่ยวจึงมีความ เหมาะสมตอ่ การเจริญเติบโตของแบคทีเรียกรดอะซิติก โดยแบคทีเรียกรดอะซิติกสามารถท่ีจะเปล่ียน แอลกอฮอลใ์ หเ้ ป็นกรดอะซิติก กรดอินทรียแ์ ละสารประกอบตา่ งๆ ได้ ผลความเข้มข้นของเอทานอลท่ีระดับ 1, 3 และ 5% ต่อการหมกั คอมบูชาจากแบคทีเรีย บริ สุ ทธ์ิ การหมักด้วยไอโซเลท N4 ให้ปริ มาณกรดอะซิติกเท่ากับ 4.45, 18.12 และ 23.98 g/l ตามลาดบั โดยความเขม้ ขน้ ท่ี 5% มีการผลิตกรดอะซิติกไดส้ ูง ซ่ึงสอดคลอ้ งกบั รายงานของ Lu F S et 64

al., 1999 ท่ีกล่าววา่ ความเขม้ ขน้ ของเอทานอลที่ระดบั 5% เป็ นความเขม้ ขน้ ที่เหมาะสมต่อแบคทีเรีย กรดอะซิติก ซ่ึงแบคทีเรียกรดอะซิติกสามารถเปล่ียนแอลกอฮอล์ให้เป็ นกรดอะซิติก โดยอาศยั เอนไซม์ Alcohol dehydrogenase และ aldehyde dehydrogenase (Kersters et al.,2006) การหมกั ดว้ ยไอโซเลท N4 ให้ปริมาณสารต้านอนุมูลอิสระสูงสุดท่ี 1,506 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั ในรายงานของ Jayabalan et al., 2008 กล่าวว่า สารตา้ นอนุมูลอิสระในระหวา่ งการ หมกั คอมบูชาเกิดจากแบคทีเรียกรดอะซิติกและยีสต์สามารถผลิตเอนไซม์และเข้าไปย่อยขนาด โมเลกุลของ tea polyphenol ให้มีขนาดและโครงสร้างใหม่ และเม่ือสิ้นสุดการหมกั คอมบูชาให้ สารประกอบอินทรียท์ ี่จดั เป็ นกลุ่มสารตา้ นอนุมูลอิสระจาพวก ascorbic acid, DSL และ gallic acid จึง ทาใหเ้ คร่ืองดื่มคอมบูชามีสารตา้ นอนุมูลอิสระท่ีเพิ่มข้ึน การตรวจวิเคราะห์สารประกอบอินทรียจ์ ากคอมบูชาท่ีสามารถเป็ นสารตา้ นอนุมูลอิสระดว้ ย เทคนิคทาง HPLC ไดแ้ ก่ ascorbic acid และ DSL พบวา่ การหมกั แบบเติม 3% เอทานอลและการหมกั แบบผสมดว้ ยไอโซเลท N3 ใหป้ ริมาณ ascorbic acid เท่ากบั 0.12 และ 0.10 mg/ml ตามลาดบั ปริมาณ สาร DSL เท่ากบั 1.24 และ 1.22 mg/ml ตามลาดบั สาหรับการหมักด้วยไอโซเลท N4 แบบเติม 3% เอทานอลและแบบผสม สามารถตรวจ วิเคราะห์ปริมาณ ascorbic acid เท่ากบั 0.05 และ 0.09 mg/ml ตามลาดบั ปริมาณ DSL เท่ากบั 0.42 และ 2.27 mg/ml ตามลาดับ และในรายงานของ Jayabalan et al., 2007 กล่าวว่า การใช้ชาเขียวเป็ น วตั ถุดิบสาหรับการหมกั จดั เป็ นวตั ถุดิบท่ีให้สารตา้ นอนุมูลอิสระดีท่ีสุดกวา่ ชาชนิดอ่ืน ซ่ึงปริมาณสาร ตา้ นอนุมูลอิสระจะข้ึนอยู่กบั ปริมาณสารประกอบโพลีฟี นอลและสารคาเทชิน โดยสารประกอบ polyphenol จะสามารถให้หมู่ไฮดรอกซิลได้อย่างง่าย จึงส่งผลให้สารตา้ นอนุมูลอิสระมีปริมาณท่ี แตกต่างกนั การหมกั คอมบูชาแบบผสม โดยใชห้ วั เช้ือจุลินทรียจ์ ากโรงงานเติมผสมไอโซเลทที่คดั แยกได้ คือ ไอโซเลท N3 และ N4 พบวา่ ไดป้ ริมาณกรดอะซิติกสูงกวา่ การใชห้ วั เช้ือจุลินทรียแ์ บบด้งั เดิม หรือ ท้ังการใช้ไอโซเลทเดียวที่ได้มีค่ากรดอะซิติกเท่ากับ 13.37 และ 17.18 g/l ตามลาดับ ซ่ึงมากกว่า ผลการวิจยั ของ Chakravorty S et al., 2016 ที่ไดก้ รดอะซิติกไดเ้ พียง 12.53 g/l ในขณะท่ี Jayabalan et al., 2007 ไดก้ รดอะซิติก 9.51 g/l ซ่ึงกรดอะซิติกเป็นกรดอินทรียท์ ี่พบไดม้ ากท่ีสุดในเครื่องดื่มชาหมกั คอมบูชา (Chen and Liu, 2000) นอกจากปริมาณกรดอะซิติกแลว้ สามารถตรวจวิเคราะห์ปริมาณ gluconic acid พบว่าการ หมกั แบบผสมให้ปริมาณ gluconic acid เท่ากบั 7.5 และ 18.85 g/l ตามลาดบั ซ่ึงมากกวา่ ในรายงาน ของ Chakravorty S et al., 2016 สามารถตรวจวิเคราะห์ปริมาณ gluconic acid เท่ากับ 6.38 g/l ซ่ึง 65

gluconic acid เป็ นกรดที่พบได้เป็ นหลักรองจาก acetic acid โดยแบคทีเรียกรดอะซิติกจะเปลี่ยน น้าตาลกลูโคสและผลิตเป็น gluconic acid ไดใ้ นสภาวะที่ไมม่ ีเอทานอล (Chen and Liu, 2000) ในส่วนของปริมาณสาร D-saccharic acid-1,4-lactone (DSL) จากวนั ที่ 15 ของการหมัก สามารถตรวจวิเคราะห์ DSL เท่ากับ 1.22 และ 2.27 g/l ซ่ึงมีความสอดคล้องในรายงานของของ Chakravorty S et al.,2016 ตรวจพบสาร DSL เท่ากบั 1.32 g/l ในปี 2013 Wang, Y et al ตรวจพบสาร DSL ได้สูงเท่ากบั 3.20 g/l และในปี 2010 Wang, K et al ตรวจพบสาร DSL เท่ากับ 0.132 g/l โดย ปริมาณสาร DSL ในเคร่ืองดื่มชาหมกั คอมบูชาจะลดลงตามระยะเวลาการหมกั ที่เพ่ิมข้ึน ในรายงาน ของ Yang et al., 2010 กล่าวว่า ปริมาณสาร DSL ในคอมบูชาให้ปริมาณสูงสุดจนวนั ท่ี 8 ของการ หมกั และหลงั จากน้นั จะลดปริมาณลงจนสิ้นสุดการหมกั การบ่งช้ีชนิดของเช้ือจุลินทรีย์ พบวา่ ไอโซเลท N3 และ N4 ท่ีไดจ้ ากการคดั แยกจากตวั อยา่ ง น้ าหมักลูกจาก (Nipa palm) เป็ นแบคทีเรี ย Gluconacetobacter xylinus และ Gluconacetobacter intermedius ซ่ึงสอดคล้องกับรายงานของ Lin et al., 2016 ที่สามารถแยกเช้ือ Gluconacetobacter intermedius จากน้าหมกั ผลไม้ สับปะรด แอปเปิ้ ลและฝร่ัง ซ่ึงเป็ นแบคทีเรียที่สามารถทนทานต่อ ความเขม้ ขน้ ของเอทานอล และกรดอะซิติกในระดบั ท่ีสูงและยงั สามารถผลิตแผน่ วุน้ และ glucuronic acid ได้ และในลกั ษณะเดียวกนั Neera et al., 2015 ได้ทาการคดั แยกแบคทีเรียกรดอะซิติกในจีนัส Gluconacetobacter sp.ที่สามารถผลิตแผน่ วุน้ จากตวั อยา่ งผลไม้ อาทิเช่น แอปเปิ้ ล มะม่วง กลว้ ย ส้ม แตงโม และคอมบูชา พบแบคทีเรียกรดอะซิติก Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter intermedius และ Gluconobacter oxydans ซ่ึ งสามารถนาไปใช้ในอุตสาหกรรมอาหารได้ และ เช่นเดียวกนั Nguyen T. V et al., 2008 สามารถคดั แยก G. xylinus จากเคร่ืองดื่มชาหมกั คอมบูชา ซ่ึง G. xylinus ท่ีคดั แยกไดส้ ามารถผลิตแผน่ วนุ้ หรือแผน่ เซลลูโลสที่มีโครงสร้างแตกต่างไปจากไอโซเลท ที่คดั แยกไดจ้ ากผลไม้ 66

บทที่ 6 สรุปผลการวจิ ยั การคดั แยกแบคทีเรียกรดอะซิติกจากน้าผลไม้ สมุนไพรหมกั และหัวเช้ือคอมบูชาจำนวน 21 ตวั อยำ่ ง พบจุลินทรียท์ ้งั หมด 425 ไอโซเลท เม่ือนำไปทดสอบชีวเคมีและกำรหมกั เบ้ืองตน้ โดยใช้ G.hansenii เป็ นจุลินทรียม์ าตรฐานให้ปริมาณกรดเท่ากบั 8.13 g/l พบแบคทีเรียจานวน 8 ไอโซเลท คือ N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10 และ K6 สามารถผลิตกรดได้เท่ากับ 8.46, 9.31, 8.42, 8.44, 8.77, 8.43, 8.46 และ 8.41 g/l ตามลาดบั สำหรับวธิ ีกำรเตรียมหวั เช้ือคอมบูชำจำกเช้ือบริสุทธ์ิ มีระยะเวลำกำรหมกั ที่เหมำะสมท่ี 6 วนั ซ่ึงไอโซเลท คือ N3, S16, G42, G45, L10 และ K6 เจริญไดด้ ีในชำเขียวผสม 0.2% เอทำนอล ส่วนไอ- โซเลท N4 และ B19 เจริญไดด้ ีท่ี 0.2% เอทำนอล ผสม 0.05% แอมโมเนียมซลั เฟต จำกกำรหมกั ในเบ้ืองตน้ พบว่ำ กำรหมกั คอมบูชำแบบไม่มีส่วนผสมของเอทำนอล มีกำร เจริญของเช้ือรำ ส่งผลให้ระบบกำรหมกั หยุดชะงกั เม่ือเติมเอทำนอลควำมเขม้ ขน้ 1, 3 และ 5% ของ เช้ือจุลินทรียแ์ ต่ละไอโซเลท พบว่ำ ระดบั ควำมเขม้ ขน้ ของเอทำนอลท่ีสูงจะส่งผลให้ปริมำณกรด สูงข้ึนตำมไปดว้ ย กำรหมกั แบบเติมเอทำนอลที่ 1, 3 และ 5% หมกั ด้วยไอโซเลท N3 มีควำมเป็ นกรดด่ำงที่ 2.71, 2.59 และ 2.57 ตำมลำดับ ให้ปริมำณกรดเท่ำกับ 4.45, 18.12 และ 23.98 g/l ตำมลำดับ ให้ ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระเท่ากบั 649, 657 และ 611 mg gallic/L tea broth ตามลาดบั เมื่อทำกำร ตรวจวเิ ครำะห์สำรประกอบอินทรียด์ ว้ ยเทคนิค HPLC แบบเติม 3% เอทำนอล ให้ปริมำณ acetic acid เท่ำกบั 18.75 mg/ml, gluconic 11.58 mg/ml, สำร DSL 1.24 mg/ml และไม่สำมำรถตรวจพบ ascorbic acid และ succinic acid สำหรับกำรแบบเติมเอทำนอลท่ี 1, 3 และ 5% ดว้ ยไอโซเลท N4 มีควำมเป็ นกรดด่ำงท่ี 2.55, 2.82 และ 2.76 ตำมลำดบั ใหป้ ริมำณกรดเท่ำกบั 4.03, 11.30 และ 11.49 g/l ตำมลำดบั ให้ปริมาณสาร ต้านอนุมูลอิสระเท่ากับ 1506, 1480 และ 1306 mg gallic/L tea broth ตามลาดับ เมื่อทำกำรตรวจ วเิ ครำะห์สำรปะกอบอินทรียด์ ว้ ยเทคนิค HPLC แบบเติม 3% เอทำนอล ใหป้ ริมำณ acetic acid เท่ำกบั 67

10.65 mg/ml, gluconic acid 5.16 mg/ml, DSL 0.42 mg/ml, succinic acid 0.31mg/ml แล ะ ascorbic acid 0.05 mg/ml กำรหมกั คอมบูชำแบบใชห้ วั เช้ือจุลินทรียผ์ สม พบวำ่ กำรหมกั ดว้ ยไอโซเลท N3 ผสมด้งั เดิม มีค่ำควำมเป็ นกรดด่ำงที่ 2.70 ให้ปริมำณกรดเท่ำกับ 15.94 g/l เมื่อทำกำรวิเครำะห์สำรประกอบ อินทรีย์ด้วยเทคนิค HPLC ให้ปริมำณ acetic acid เท่ำกับ 13.37 mg/ml, gluconic acid 7.50 mg/ml, DSL 1.22 mg/ml, succinic acid 0.39 mg/ml และ ascorbic acid 0.10 mg/ml ส่วนกำรหมกั คอมบูชำแบบผสมของไอโซเลท N4 มีค่ำควำมเป็ นกรดด่ำงที่ 2.34 และให้ ปริมำณกรดเท่ำกบั 28.34 g/l เมื่อทำกำรตรวจวิเครำะห์สำรประกอบอินทรียด์ ้วยเทคนิค HPLC ให้ ปริมำณ acetic acid เท่ำกบั 17.18 mg/ml, gluconic acid 18.85 mg/ml, DSL 2.27mg/ml, succinic acid 0.30 mg/ml และ ascorbic acid 0.09 mg/ml เมื่อทาการระบุชนิดของไอโซเลท N3 และ N4 สามารถระบุชนิดของแบคทีเรียไอโซเลท N3 เป็น Gluconacetobacter xylinus และไอโซเลท N4 เป็น Gluconacetobacter intermedius 68

เอกสารอ้างองิ ธีรพงษ์ เทพกรณ์. 2555. ชา: กระบวนการผลิต และองค์ประกอบทางเคมีจากการหมกั . วารสาร วทิ ยาศาสตร์บูรพา 17: 189-196. ธีรพงษ์ เทพกรณ์. 2556. คาเทชินในชาเขียวและความคงตวั ระหว่างเก็บรักษา. วารสารวิทยาศาสตร์ มหาวทิ ยาลยั ขอนแก่น 41(1): 46-55. นงลักษณ์ สุ วรรณพินิจ และปรีชา สุ วรรณพินิจ. 2548. จุลชีววิทยาทั่วไป. กรุงเทพมหานคร: สานกั พมิ พแ์ ห่งจุฬาลงกรณ์มหาวทิ ยาลยั . เรื องลักขณา จามิกรณ์. 2541. ชีวเคมีเบ้ืองต้น Basic Biochemistry CH 351. กรุ งเทพมหานคร: สานกั พมิ พม์ หาวทิ ยาลยั รามคาแหง. Aydin A. Y and Aksoy D. N . 2013. Isolation and characterization of an efficient bacterial cellulose producer strain in agitated culture: Gluconacetobacter hansenii P2A. Applied Microbiology and Biotechnology. Chakravorty S., Bhattacharya S., Chatzinotas A., Chakraborty W., Bhattacharya D and Gachhui R. 2016. Kombucha tea fermentation: Microbial and biochemical dynamics. Food Microbiology 220 : 63-72. Chen C and Liu Y. B. 2000. Changes in major components of tea fungus metabolites during prolonged fermentation. Applied Microbiology 89 : 834-839. Chu S. C and Chen C. 2006. Effects of origins and fermentation time on the antioxidant activities of Kombucha. Food Chemistry 98: 502-507. Dufresne, C and Farnworth, E. 2 0 0 0 . Tea, Kombucha, and health: a review. Food Research International 33: 409-421. Goh W. N., Rosma A., Kaur B., Fazilah A., Karim A A. and Rajeev B. 2012. Fermentation of black tea broth (Kombucha): I. Effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose. International Food Research Journal 19(1): 109-117. 69

Gullo, M and Giudici, P. 2008. Acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar: Phenotypic traits relevant for starter cultures selection. Food Microbiology 125: 46-53. Gunther W. F. 1995. Kombucha healthy beverage and natural remedy from the far east. Printed in Austria. Jayabalan, R., Marimuthu, S and Swaminathan, K. 2007. Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation. Food Chemistry 102 : 392-398. Jayabalan, R., Marimuthu, S., Thangaraj, P., Sathishkumar, M., Binupriya, R. A., Swaminathan, K and Yun, E. S. 2008. Preservation of Kombucha Tea – Effect of Temperature on Tea Components and Free Radical Scavenging Properties. Food Chemistry 56: 9064-9071. Jayabalan R., Subathradevi P., Marimuthu S., Sathishkumar M and Swaminathan K. 2008. Changes in free-radical scavenging ability of kombucha tea during fermentation. Food Chemistry 109 : 227-237. Jayabalan R., Malbasa V. R., Loncar S. E., Vitas S. J and Sathishkumar. 2014. A review on Kombucha tea-Microbiology composition, Fermentation, Beneficial effects, Toxicity, and tea fungus. Food Science and Food Safety 13: 538-550. Kersters K., Lisdiyanti P., Komagata K and Swings J.2006. The family Acetobacteraceae: The Genera Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconabacter and Kozakia; in Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer H, K and Stackebrandt., eds., The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria, Springer Science and Business Media, Singapore: 163-200. Lin P. S., Huang H. Y., Hsu D. K., Lai J. Y., Chen K. Y and Cheng C. K. 2016. Isolation and identification of cellulose-producing strain Komagataeibacter intermedius from fermented fruit juice. Carbohydrate Polymers 151 : 827-833. Lu F. S., Lee L. F and Chen K. H. 1999. A thermotolerant and high acetic acid-producing bacterium Acetobacter sp. I14–2. Applied Microbiology 86 : 55-62. Malbasa R., Loncar E., Djuric M and Dosenovic D. I. 2008. Effect of sucrose concentration on the products of Kombucha fermentation on molasses. Food Chemistry 108: 926-932. Malbasa V. R., Loncar S. E., Vitas S. J., Canadanovic C. J. 2011. Influence of starter cultures on the antioxidant activity of kombucha beverage. Food Chemistry 127: 1727-1731. 70

Neera, Ramana V. K and Batra V. H. 2015. Occurrence of Cellulose-Producing Gluconacetobacter spp. in Fruit Samples and Kombucha Tea, and Production of the Biopolymer. Biochem Biotechnol 176: 1162-1173. Nguyen T. V., Flanagan B., Gidley J M and Dykes A. G. 2008. Characterization of Cellulose Production by a Gluconacetobacter xylinus Strain from Kombucha. Microbiology 57 : 449-453. Park K. J., Jung Y. J and Park H. Y. 2003. Cellulose production by Gluconacetobacter hansenii in a medium containing ethanol. Biotechnology 25: 2055-2059. Roche, J. (1998). The history and spread of Kombucha. (Online). Available: http://users.bestweb.net/com/kombu/roche.html. (3 December 2013) Sajilata M. G., Bajai R. P and Singhal R. S. 2008. Tea polyphenols as nutraceuticals. Food Science and Food Safety 7: 229-254. Sambrook J and Russell DW. 2001. Molecular cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Sreeramulu G., Zhu Y., Knol W. 2000. Kombucha fermentation and its antimicrobial activity. Agriculture Food Chemistry 48 : 89-94. Suwanposri A., Yukphan P., Yamada Y and Ochaikul D. 2013. Identification and biocellulose production of Gluconacetobacter strains isolated from tropical fruits in Thailand. Science Technology 7(01) : 70-82. Teoh A. L., Heard, G. and Cox, J. 2004 . Yeast ecology of Kombucha fermentation. International Journal of Food Microbiology 95: 119-126. Wang, K., Gan, X., Tang, X., Wang, S and Tan, H. 2010. Determination of d-saccharic acid-1,4- lactone from brewed kombucha broth by high-performance capillary electrophoresis. Chromatography B 878: 371–374. Wang Y., Ji B., Wu W., Wang R., Yang Z., Zhang D and Tian W. 2013. Hepatoprotective effects of kombucha tea: identification of functional strains and quantification of functional components. Science of food and agriculture. Yang, Z. W., Ji, P. B., Zhou, F., Li, B., Luo, Y., Yang, L and Li, T. 2009. Hypocholesterolaemic and antioxidant effects of Kombucha tea in high-cholesterol fed mice. Science of Food and Agriculture 89: 150-156. 71

Yang, Y., Jia, J., Xing, J., Chen, J and Lu, S. 2013. Isolation and characteristics analysis of a novel high bacterial cellulose producing strain Gluconacetobacter intermedius CIs26. Carbohydrate Polymers 92: 2012-2017. 72

ภาคผนวก

ภาคผนวก ก วธิ เี ตรียมอาหารเลยี้ งเชื้อ 1. อาหาร Histrin and Scharmm (Kersters et al., 2006) Glucose 20.0 g Peptone 5.0 g Yeast extract 5.0 g Disodium hydrogen phosphate 2.70 g Citric acid 1.15 g Distilled water 1000 ml ผสมสารท้งั หมดดว้ ยน้ากลนั่ ให้ละลายเขา้ กนั นาไปน่ึงฆ่าเช้ือที่อุณหภูมิ 121ºC ความดนั 15 ปอนดต์ อ่ ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที 2. อาหาร Glucose yeast extract calcium carbonate (Kersters et al., 2006) Glucose 100.0 g Yeast extract 10.0 g Calcium carbonate 20.0 g Distilled water 1000 ml ผสมสารท้งั หมดดว้ ยน้ากลน่ั ให้ละลายเขา้ กนั นาไปน่ึงฆ่าเช้ือที่อุณหภูมิ 121 ºC ความดนั 15 ปอนดต์ อ่ ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 นาที 74

ภาคผนวก ข วธิ ีเตรียมนา้ ยาทดสอบ 1. สารละลาย 0.1 N NaOH NaOH 4.00 g Distilled water 1000 ml เตรียม NaOH ในขวดปรับปริมาตร ละลายดว้ ยน้ากลน่ั แลว้ ปรับปริมาตรใหค้ รบ 1000 ml 2. สารละลายฟี นอลฟธาลนี Ethanol 95% 60.0 ml Phenolpthalene 1.0 g Distilled water ละลายฟี นอลฟธาลีนดว้ ย ethanol 95% ปรับปริมาตรดว้ ยน้ากลนั่ เป็น 100 ml 3. สารละลายสาหรับวเิ คราะห์สารต้านอนุมูลอสิ ระโดยวธิ ี DPPH assay 3.1 สารละลาย DPPH 0.5 mg/ml DPPH 5g Methanol 10 ml ละลายสาร DPPH ดว้ ยเมทานอล ปรับปริมาตรดว้ ยเมทานอลเป็ น 10 ml เก็บในขวดสีชา ท่ี 4 ºC (ตอ้ งเตรียมสารใหมท่ ุกคร้ังท่ีใช)้ 3.2 สารละลายมาตรฐาน 0.1 mg/ml Gallic acid Gallic acid 0.1 mg Methanol 10 ml ละลาย Gallic acid ดว้ ยเมทานอลและปรับปริมาตรเป็ น 10 ml เกบ็ ในขวดสีชาท่ี 4 ºC ซ่ึงจะ ไดเ้ ป็น stock solution 75

ภาคผนวก ค วธิ หี าความเข้มข้นทแ่ี น่นอนของสารละลายโซเดยี มไฮดรอกไซด์มาตรฐาน หาความเข้มข้นทแ่ี น่นอนของสารละลายโซเดยี มไฮดรอกไซด์ด้วย Potassium Hydrogen Pathalate หรือ KHP (KHC8H4O6) (อไุ รและคณะ, 2545) 1. ชงั่ KHP ปริมาณ 2.0-2.2 g นาไปอบที่อุณหภูมิ 60 ºC นาน 3 ชว่ั โมง บนั ทึกน้าหนกั โดย ใชเ้ ครื่องชง่ั แบบละเอียด 2. ละลาย KHP ดว้ ยน้ากลนั่ และปรับปริมาตรเป็น 100 ml 3. คานวณหา KHP จาก minimum assay ของ KHP เทา่ กบั 99.9% สาร KHP 100 กรัม มีเน้ือสารจริง เทา่ กบั 99.9 g ถา้ สาร KHP หนกั 2.0191 กรัม มีเน้ือสารจริง = 99.9 2.0191 = 2.0171 g 100 จาก จานวนโมลของสาร = น้าหนกั ของKHP ท่ีใช้ (g) น้าหนกั โมเลกลุ ของ KHP (204.23) = 2.0171 = 0.0098 204.23 สูตรความเขม้ ขน้ ของสารละลาย = จานวนโมลของสาร ปริมาตรของตวั ทาละลาย (l) = 0.0098×103 = 0.0987 mol/l 100 ดงั น้นั ความเขม้ ขน้ ของสารละลาย KHP ในเริ่มตน้ เทา่ กบั 0.0987 mol/l 4. เตรียมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 5. ปิ เปตสารละลาย KHP 25 ml 6. เติมสารฟี นอลฟ์ ทาลีน 2-3 หยด 7. ทาการไตเตรท KHP ดว้ ยโซเดียมไฮดรอกไซด์ 8. วธิ ีการคานวณหาความเขม้ ขน้ ของโซเดียมไฮดรอกไซด์ ตวั อยา่ งเช่น ปริมาตรของสาร KHP ที่ใช้ เท่ากบั 25 ml 76

ปริมาตรโซเดียมไฮดรอกไซดท์ ี่ใช้ = 23.8+23.8+23.8 = 23.8 ml 3 เมื่อ KHP 1 mol ทาปฏิกิริยาพอดีกบั NaOH 1 mol ดงั น้นั จานวน mol ของ KHP ที่ใช้ = 0.0987×25 mol 1000 เม่ือ KHP 1 mol ทาปฏฺกิริยาพอดีกบั NaOH 1 mol KHP 0.0025 mol จะทาปฏิกิริยาพอดีกบั NaOH 0.0025 mol ดงั น้นั ปริมาตรสารละลาย NaOH 23.8 ml มีสาร NaOH 0.0025 mol ถา้ NaOH 1000 ml มีสาร NaOH = 0.0025×1000 = 0.104 mol/l 23.8 ดงั น้นั ความเขม้ ขน้ ของโซเดียมไฮดรอกไซดเ์ ท่ากบั 0.104 mol/l 77

ภาคผนวก ง การคานวณหาปริมาณกรด 1. การคานวณหาปริมาณกรดท้งั หมดทเ่ี ชื้อแบคทเี รียสร้างขนึ้ จากสูตร Total acidity (mol/l) = ความเขม้ ขน้ ของ NaOH ท่ีใช้ (mol/l) × ปริมาณของ NaOH ที่ใชไ้ ตเตรท (ml) ปริมาตรของสารตวั อยา่ งที่ใชไ้ ตเตรท (ml) 2. การคานวณหาปริมาณกรดอะซิตกิ ทเ่ี ชื้อแบคทเี รียสร้างขนึ้ จากสูตร ปริมาณกรดอะซิติก (g/l) = Total acidity (mol/l) × 60 (มวลโมเลกลุ ของกรดอะซิติก) 3. การกรองตัวอย่างชาหมักคอมบูชาให้มสี ีใส เน่ืองจากชาหมกั คอมบูชามีสีน้าตาล จึงทาให้มีความยากต่อการมองเห็นจุดยตุ ิในการไตเต รท ดงั น้นั ตอ้ งมีการกรองสีคอมบูชาด้วย activated carbon โดยใช้น้าชาหมกั คอมบูชาต่อถ่าน ใน อตั ราส่วน 10 ml ต่อ 0.10 g 78

ภาคผนวก จ การทดสอบฤทธ์ติ ้านอนุมูลอสิ ระด้วยวธิ ี (DPPH radical scavenging assay) และกราฟมาตรฐาน 1) ใชต้ วั อยา่ งชาหมกั คอมบูชา 100 µl โดยใชเ้ มทานอลเป็ นตวั ทาละลาย เตรียมใหม้ ีความ เขม้ ขน้ 0.001-0.01 2) เตรียมสารละลาย DPPH 0.5 mg/ml. ในเมทานอล 3) หยดตวั อยา่ งชาในขอ้ 1) ใส่ลงในไมโครไทเทอร์เพลท หลุมละ 100 µl 4) เติมสารละลาย DPPH 50 µl ลงไปผสมใหเ้ ขา้ กนั และนาไปบม่ ในที่มืด เป็นเวลา 30 นาที 5) วดั ค่าการดูดกลืนแสงท่ีความยาวคล่ืน 517 นาโนเมตร ดว้ ยเคร่ืองวดั การดูดกลืนแสงไม โครเพลท และทาการคานวณเปอร์เซ็นตก์ ารกาจดั อนุมูลอิสระ ดงั สมการ เปอร์เซ็นตก์ ารกาจดั อนุมูลอิสระ = [(Acont- A test)/Acont] × 100 เม่ือ Acont = ค่าการดูดกลืนแสงของ Blank (ตวั ทาละลาย + DPPH•) A test = ค่าการดูดกลืนแสงของตวั อยา่ ง (สารสกดั + DPPH•) คานวณค่าการตา้ นอนุมูลอิสระที่ไดเ้ ทียบกบั gallic acid (gallic acid equivalent antioxidant capacity (GAE) ซ่ึงคานวณไดจ้ ากกราฟมาตรฐานของ gallic acid แสดงในหน่วย mg gallic/g tea broth 6). กราฟมาตรฐานเพื่อหาสารตา้ นอนุมูลอิสระโดยวธิ ี DPPH assay 6.1 เตรียมสารละลายมาตรฐาน gallic acid ดว้ ย methanol ใหม้ ีความเขม้ ขน้ 1-10 µg/ml วดั ค่าการดูดกลืนแสงท่ีความยาวคล่ืน 517 นาโนเมตร ดว้ ยเคร่ืองวดั การดูดกลืนแสงไมโคร เพลท และทาการคานวณเปอร์เซ็นตก์ ารกาจดั อนุมูลอิสระ ดงั สมการขา้ งตน้ 79

ตาราง จ.1 ค่าการดูดกลืนแสงและคา่ การยบั ย้งั ของ Gallic acid ที่ความเขม้ ขน้ ต่างๆ Gallic acid Atest เปอร์เซ็นต์การกาจัดอนุมูล ค่าเฉลยี่ (mg/ml) อสิ ระ 13.85 Acont 1.541 1.459 1.465 18.97 31.24 0.001 1.241 1.382 1.219 19.47 5.28 16.79 38.64 49.78 0.002 1.218 1.254 1.144 20.96 14.05 21.91 59.80 69.96 0.003 1.014 1.019 1.035 34.20 30.16 29.35 81.46 87.56 0.004 0.872 0.968 0.896 43.41 33.65 38.84 90.53 0.005 0.744 0.746 0.751 51.72 48.87 48.74 0.006 0.603 0.581 0.610 60.87 60.18 58.36 0.007 0.433 0.437 0.470 71.90 70.05 67.92 0.008 0.208 0.301 0.315 86.50 79.37 78.50 0.009 0.186 0.172 0.197 87.93 88.21 86.55 0.010 0.153 0.134 0.136 90.07 90.82 90.72 100 y = 9245x + 3.3306 80 R2 = 0.9911 60 % Innibition 40 20 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0 ความเขม้ ขน้ gallic acid (mg/ml) ภาพ จ.1 กราฟความสมั พนั ธ์ระหวา่ ง %inhibition และความเขม้ ขน้ ของ Gallic acid 80

ภาคผนวก ฉ การวเิ คราะห์ชนิดของสารประกอบอนิ ทรีย์ในคอมบูชาด้วยเทคนิค High Performance Liquid Chromatography (HPLC) และการเตรียมสารละลายมาตรฐาน 1. การเตรียมสารละลาย mobile phase ทาการเตรียมสาร 20 mM KH2PO4 MW = 136.086 g/mol จาก 1 mM = 1/1000 = 0.001 M 1 mM ของ KH2PO4 = 0.136086 g ถา้ 20 mM = 2.72172 g ชง่ั สาร KH2PO4 2.72172 g ละลายดว้ ยน้าปราศจากไอออน ทาการปรับปริมาตรเป็ น 1000 ml และนาไปปรับค่าความเป็ นกรดด่างดว้ ย HCl ให้ไดค้ ่าความเป็ นกรดด่างท่ี 2.4 และนาไปกรอง ดว้ ย Nylon membrane ขนาด 0.45 µm จึงนาไปใชก้ บั เคร่ือง HPLC 2. การเตรียมนา้ ปราศจากไอออน นาน้ าปราศจากไอออน (DI water) กรองผ่านด้วย Nylon membrane ขนาด 0.45 µm จึง สามารถนาไปใชก้ บั เคร่ือง HPLC 2. วธิ ีการเตรียมสารละลายมาตรฐาน 1.1 สารละลายมาตรฐาน glucuronic acid 10 mg/ml ช่ังสาร glucuronic acid 0.01 g ละลายในน้า DI 1000 µl กรองผ่านด้วยตวั กรองไนลอน ขนาด 0.45 µm และนาไปฉีด HPLC และนาพ้ืนที่ใตก้ ราฟสร้างกราฟมาตรฐาน และนาค่าพ้ืนที่ใต้ กราฟของตวั อยา่ งไปแทนคา่ ในสมการ ตวั อยา่ งเช่น 10% คอมบูชาท่ีทาการวเิ คราะห์ มีค่า RT = 2.218 , Area = 104.987 (mAU) จากสมการ y = 116.44X + 6.1772 นาค่า Area แทนคา่ y ดงั น้นั 104.987 = 166.44X + 6.1772 X = 0.59361 81

แสดงวา่ 10% คอมบูชา มีกรดกลูคูโรนิค 0.53961 mg/ml ถา้ 100% คอมบูชา มีกรดกลูคูโรนิค 5.9366 g/l ตาราง ฉ.1 ความเขม้ ขน้ มาตรฐานของ glucuronic acid เวลาและพ้ืนที่ใตก้ ราฟจากการวเิ คราะห์ดว้ ย วธิ ี HPLC mg/ml Stock glucuronic acid DI water (µl) RetTime (min) Area (mAU) (10 mg/ml) (µl) 0.6 60 940 2.251 78.10642 0.8 80 920 2.281 98.59299 1.0 100 900 2.262 121.15215 1.2 120 880 2.259 142.88162 1.4 140 860 2.256 172.42534 ้ืพน ี่ทใต้กราฟ (mAU) 200 y = 116.44x + 6.1772 R² = 0.9952 150 100 50 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 ความเขม้ ขน้ glucuronic acid (mg/ml) ภาพ ฉ.1 กราฟมาตรฐาน glucuronic acid จากการวเิ คราะห์ดว้ ย HPLC 82

1.2 สารละลายมาตรฐาน gluconic acid 10 mg/ml ชงั่ สาร gluconic acid 0.01 g ละลายในน้า DI 1000 µl กรองผา่ นดว้ ยตวั กรองไนลอน ขนาด 0.45 µm และนาไปฉีด HPLC และนาพ้ืนที่ใตก้ ราฟสร้างกราฟมาตรฐาน และนาค่าพ้ืนท่ีใตก้ ราฟ ของตวั อยา่ งไปแทนคา่ ในสมการ ตาราง ฉ.2 ความเขม้ ขน้ มาตรฐาน gluconic acid เวลาและพ้ืนที่ใตก้ ราฟจากการวิเคราะห์ดว้ ยวิธี HPLC mg/ml Stock gluconic acid DI water (µl) RetTime (min) Area (mAU) (10 mg/ml) (µl) 0.8 60 940 2.429 156.35770 1.0 80 920 2.459 185.59404 1.2 100 900 2.440 218.40970 1.4 120 880 2.436 252.66379 1.6 140 860 2.433 299.77285 ้ืพน ี่ทใต้กราฟ (mAU) 400 y = 176.99x + 10.181 300 R² = 0.9913 200 100 0 0 0.5 1 1.5 2 ความเขม้ ขน้ gluconic acid (mg/ml) ภาพ ฉ.2 กราฟมาตรฐาน gluconic acid จากการวเิ คราะห์ดว้ ย HPLC 83

1.3 สารละลายมาตรฐาน DSL10 mg/ml ชั่งสาร DSL 0.01 g ละลายในน้า DI 1000 µl กรองผ่านด้วยตวั กรองไนลอน ขนาด 0.45 µm และนาไปฉีด HPLC และนาพ้ืนท่ีใตก้ ราฟสร้างกราฟมาตรฐาน และนาค่าพ้ืนที่ใตก้ ราฟของ ตวั อยา่ งไปแทนค่าในสมการ ตาราง ฉ.3 ความเขม้ ขน้ มาตรฐาน DSL เวลาและพ้ืนที่ใตก้ ราฟจากการวเิ คราะห์ดว้ ยวธิ ี HPLC mg Stock DSL (10 mg/ml) DI water (µl) RetTime (min) Area (mAU) (µl) 0.6 60 940 3.614 84.18292 0.8 80 920 3.641 113.59949 1.0 100 900 3.619 140.37915 1.2 120 880 3.608 165.43199 1.4 140 860 3.603 194.67989 ้ืพน ี่ทใต้กราฟ (mAU) 250 y = 136.42x + 3.2384 200 R² = 0.9993 150 100 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 50 ความเขม้ ขน้ DSL (mg/ml) 0 0 ภาพ ฉ.3 กราฟมาตรฐาน DSL จากการวเิ คราะห์ดว้ ย HPLC 84

1.4 สารละลายมาตรฐาน Ascorbic acid 10 mg/ml ชั่งสาร ascorbic acid จานวน 0.01 g ละลายในน้ า DI 1000 µl กรองผ่านด้วยตัวกรอง ไนลอน ขนาด 0.45 µm และนาไปฉีด HPLC และนาพ้ืนท่ีใตก้ ราฟสร้างกราฟมาตรฐาน และนาค่า พ้นื ท่ีใตก้ ราฟของตวั อยา่ งไปแทนคา่ ในสมการ ตาราง ฉ.4 ความเขม้ ขน้ มาตรฐาน ascorbic acid เวลาและพ้ืนท่ีใตก้ ราฟจากการวิเคราะห์ด้วยวิธี HPLC mg/ml Stock ascorbic acid DI water (µl) RetTime (min) Area (mAU) (10 mg/ml) (µl) 0.05 5 995 4.649 128.49490 0.1 10 990 4.661 254.83359 0.2 20 980 4.677 511.56815 0.4 40 960 4.675 1088.581 0.6 60 940 4.699 1578.98267 ้ืพน ี่ทใต้กราฟ (mAU) 4000 y = 2511.4x + 67.801 3000 R² = 0.9974 2000 1000 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 ความเขม้ ขน้ ascorbic acid (mg/ml) 0 0 ภาพ ฉ.4 กราฟมาตรฐาน ascorbic acid จากการวเิ คราะห์ดว้ ย HPLC 85