วิธีมาตรฐานสำหรับการวิเคราะห์อาหาร เล่มที่ 1_2 มี.ค. 58

วธิ มี าตรฐานกสำ�รหมวริทบั ยกาาศรวาิเสคตรรา์กะาหรอ์ แาพหทายร์ 5. 0.1 % Peptone water 1 กรัม Peptone น้ำ� กลนั่ หรอื นำ�้ กรอง 1,000 มิลลิลติ ร ละลาย peptone ในน�ำ้ กลัน่ หรือนำ้� กรอง ฆ่าเชื้อท่ี 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 6. Thioglycollate Medium (Fluid) (FTG) 0.5 กรมั L-Cystine Agar (granulated) 0.75 กรัม NaCl 2.5 กรัม Dextrose 5 กรัม Yeast extract 5 กรมั Tryptone 15 กรัม Sodium thioglycollate or thioglycollic acid 0.5 กรัม Resazurin, sodium solution (1:1000), fresh 1 มลิ ลลิ ิตร น้�ำกลนั่ หรือน�้ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร ละลายส่วนประกอบในน�้ำกลั่นหรือน้�ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร จนละลาย ฆ่าเชื้อท่ี 121°C 20 นาที pH 7.1 ± 0.2 7. Tryptose-sulfite-cycloserine (TSC) agar 7.1 Base medium Tryptose 15 กรมั Yeast extract 5 กรมั Soytone 5 กรมั Ferric ammonium citrate (NF Brown Pearls) 1 กรัม Sodium metabisulfite 1 กรมั Agar 20 กรมั นำ้� กลนั่ หรอื น้ำ� กรอง 900 มิลลิลิตร ละลายสว่ นประกอบในนำ้� กลน่ั หรอื นำ้� กรอง900มลิ ลลิ ติ รใหค้ วามรอ้ นจนagarละลายฆา่ เชอื้ ที่ 121°C 15 นาที pH 7.6 ± 0.2 7.2 D-cycloserine solution ละลาย D-cycloserine (white crystalline powder) 1 กรัม ในน�้ำกลั่นหรือน�้ำกรอง 200 มลิ ลิลิตร ท�ำให้ปราศจากโดยการกรอง เก็บทีอ่ ณุ หภูมิ 4°C การใชง้ าน ปิเปต D-cycloserine solution (ข้อ 6.2) 20 มิลลิลิตร ลงใน base medium (ขอ้ 6.1) 250 มิลลลิ ิตร ที่หลอมละลายและมีอุณหภูมิ 50°C ผสมให้เขา้ กนั เทลงจานเพาะเชื้อตาม ปรมิ าตรที่ต้องการ 141

กวิธรมีมาวตทิ รยฐาาศนาสสำ�ตหรร์กับากรแารพวทิเคยร์ าะห์อาหาร 8. Tryptose-sulfite-cycloserine agar containing egg yolk (TSC-EY) 8.1 base medium (ขอ้ 7.1) 8.2 D-cycloserine solution (ข้อ 7.2) 8.3 50% Egg yolk emulsion ล้างเปลอื กไขส่ ดใหส้ ะอาด แช่ใน 70% ethanol 1 ช่วั โมง ตอกไข่ดว้ ยวธิ ี aseptic technique น�ำส่วนของไขแ่ ดงใส่ในภาชนะปราศจากเชอ้ื ผสม sterile 0.85% saline ในปริมาตรท่เี ทา่ กัน การใชง้ าน เติม D-cycloserine solution (ข้อ 8.2) 20 มิลลิลิตร และ 50% Egg yolk emulsion (ข้อ 8.3) 20 มิลลิลิตร ลงใน base medium (ขอ้ 8.1) 250 มลิ ลลิ ิตร ผสมให้เข้ากนั เทลงจาน เพาะเช้ือตามปริมาตรทตี่ อ้ งการ สารเคมี กรณีใช้สารเคมีส�ำเรจ็ รูป เตรยี มตามสูตรและวธิ ที ี่ผผู้ ลติ ระบุ 1. 0.04% Bromthymol Blue Indicator Bromthymol blue 0.2 กรัม 0.01 N NaOH 32 มิลลิลิตร ละลาย bromthymol blue ใน NaOH ปรบั ปริมาตรเปน็ 500 มลิ ลลิ ติ ร ด้วยน้ำ� กล่ัน 2. Gram stain reagents ใช้ชนดิ สำ� เร็จรปู 3. Nitrite detection reagents A. Sulfanilic acid reagent Sulfanilic acid 1 กรัม 5 N acetic acid 125 มลิ ลลิ ติ ร ละลาย sulfanilic acid ใน 5 N acetic acid B. N-(l-naphthyl) ethylenediamine reagent N-(l-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride 0.25 กรมั 5 N acetic acid 200 มิลลิลิตร ละลาย N-(l-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride ใน 5 N acetic acid เตรียม 5 N acetic acid โดยเติม glacial acetic acid 28.75 มิลลิลิตร ในน้�ำกล่ันหรือ น้�ำกรอง 71.25 มลิ ลิลิตร 4. Zinc dust 142

วิธมี าตรฐานกส�ำรหมวรทิบั ยกาาศรวาิเสคตรราก์ ะาหรอ์ แาพหทายร์ ภาคผนวก 2 ตวั อยา่ งเริม่ ตน้ หรอื ตัวอยา่ งทีเ่ จอื จางตามความเหมาะสม (1:10 หรือ 1:100, ...) 1 มลิ ลลิ ิตร 10 มลิ ลลิ ติ ร CMM (modified) ระดับความเจอื จางละ 2 หลอด 35°C 24-48 ชวั่ โมง TSC-EY agar AnO2 35°C 24 ชั่วโมง โคโลนีท่ีมลี กั ษณะเฉพาะ 3-5 โคโลนี ตรวจยืนยนั ทางชีวเคมี (ภาคผนวก 5) รายงานผล แผนภูมิท่ี 1 การตรวจหา (detection) C. perfringens ในอาหาร 143

กวธิรีมมาวตทิ รยฐาาศนาสสำ�ตหรรก์ ับากรแารพวทเิ คยร์ าะห์อาหาร ภาคผนวก 3 ตวั อย่างเร่ิมตน้ หรือตวั อย่างทเี่ จือจางตามความเหมาะสม (1:10 หรือ 1:100, ...) 1 มิลลลิ ติ ร 2 มิลลลิ ิตร จานเพาะเชื้อ TSC agar (6-7 มิลลิลิตร) CMM (modified) (ระดบั ความเจือจางละ 2 จานเพาะเช้อื ) เท TSC agar และผสมให้เข้ากนั 35°C 24-48 ชั่วโมง AnO2 35°C 20-24 ชัว่ โมง TSC-EY agar นับโคโลนที ม่ี ีลักษณะเฉพาะ (20-200 โคโลนี) กรณไี ม่มีโคโลนีที่มลี ักษณะเฉพาะ (กรณีไม่พบ C. perfringens จากวิธี pour plate) เขีย่ เชอ้ื ท่ีมลี ักษณะเฉพาะ 10 โคโลนี AnO2 35°C 24 ชว่ั โมง เข่ียเชอื้ ทมี่ ลี ักษณะเฉพาะอยา่ งน้อย 1 โคโลนี ตรวจยนื ยันทางชีวเคมี (ภาคผนวก 5) ตรวจยนื ยนั ทางชวี เคมี (ภาคผนวก 5) ค�ำนวณ รายงานผล รายงานผล แผนภูมทิ ี่ 2 การตรวจปริมาณ (enumeration) C. perfringens ในอาหารโดยวิธี pour plate 144

วธิ ีมาตรฐานกส�ำรหมวริทบั ยกาาศรวาเิสคตรรา์กะาหรอ์ แาพหทายร์ ภาคผนวก 4 ตวั อยา่ งเร่มิ ตน้ หรอื ตวั อยา่ งท่เี จือจางตามความเหมาะสม (1:10 หรอื 1:100, ...) 0.3, 0.3 และ 0.4 มิลลลิ ติ ร 2 มลิ ลิลติ ร หรือ 0.1, 0.1 มิลลลิ ิตร CMM (modified) TSC-EY agar เท TSC agar ทบั หนา้ AnO2 35°C 20-24 ชัว่ โมง 35°C 24-48 ช่ัวโมง นับโคโลนที ีม่ ีลกั ษณะเฉพาะ (20-200 โคโลน)ี กรณีไม่มีโคโลนที ่มี ีลักษณะเฉพาะ TSC-EY agar (กรณีไม่พบ C. perfringens จากวิธี spread plate) เข่ียเชอื้ ทีม่ ีลักษณะเฉพาะ 10 โคโลนี AnO2 35°C 24 ชว่ั โมง เข่ยี เชื้อที่มลี ักษณะเฉพาะอยา่ งนอ้ ย 1 โคโลนี ตรวจยืนยนั ทางชวี เคมี (ภาคผนวก 5) ตรวจยืนยันทางชีวเคมี (ภาคผนวก 5) ค�ำนวณ รายงานผล รายงานผล แผนภมู ทิ ี่ 3 การตรวจปรมิ าณ (enumeration) C. perfringens ในอาหารโดยวธิ ี spread plate 145

กวิธรมีมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรรก์ บั ากรแารพวทเิ คยร์ าะห์อาหาร ภาคผนวก 5 โคโลนลี ักษณะเฉพาะ ย้อมสีแกรม แกรมบวก รูปท่อน แกรมลบ ไมใ่ ช่ C. perfringens lactose-gelatin medium Motility-nitrate medium lactose ผลบวก motile ผลลบ gelatin ผลบวก nitrate ผลบวก ทดสอบเพมิ่ (กรณีผลทางชวี เคมไี มต่ รง) 1% raffinose 1% salicin ผลบวก สว่ นใหญ่ผลลบ (90%) C.perfringens รายงานผล แผนภูมิท่ี 4 การตรวจยนื ยนั ทางชวี เคมขี อง C. perfringens 146

วิธีมาตรฐานกส�ำรหมวริทบั ยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหร์อแาพหทายร์ DMSc F 2003: วิธีตรวจวิเคราะห์ Listeria spp. และ Listeria monocytogenes ในอาหาร Analytical Method of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in Food 1. ขอบขา่ ย (Scope) วิธีนใี้ ชใ้ นการตรวจวิเคราะห์ Listeria spp. และ Listeria monocytogenes ในอาหาร ครอบคลมุ การตรวจหา (detection) 2. เอกสารอา้ งองิ (Normative reference) 2.1 ISO 11290-1: 1996 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes-Part 1: Detection method. 2.2 ISO 11290-1: 1996/Amd. 1: 2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes- Part 1: Detection method/Amendment 1: Modification of the isolation media and the haemolysis test, and inclusion of precision data. 2.3 U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2011; updated 2013, Chapter 10 “Listeria monocytogenes”. [ออนไลน์]. 2011; [สืบค้น 22 เมษายน 2556]. เข้าถึงได้ท่ี http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/ LaboratoryMethods/ ucm071400.htm. 3. นยิ ามศัพท์และค�ำย่อ (Terms and abbreviation) 3.1 CAMP = Christie, Atkins, Munch-Peterson 3.2 L. innocua = Listeria innocua 3.3 L. grayi subsp. grayi = Listeria grayi subspecies grayi 3.4 L. grayi subsp. murrayi = Listeria grayi subspecies murrayi 3.5 L. ivanovii = Listeria ivanovii 3.6 L. monocytogenes = Listeria monocytogenes 3.7 L. seeligeri = Listeria seeligeri 3.8 L. welshimeri = Listeria welshimeri 3.9 R. equi = Rhodococcus equi 3.10 S. aureus = Staphylococcus aureus 147

กวิธรมีมาวตทิ รยฐาาศนาสสำ�ตหรรก์ ับากรแารพวทเิ คยร์ าะหอ์ าหาร 4. หลกั การ (Principle) Listeria spp. เปน็ แบคทเี รยี แกรมบวก รปู ทอ่ นส้ัน ไมส่ รา้ งสปอร์ เจรญิ ได้ในท่ีมีออกซเิ จนและไมม่ ี ออกซิเจน (facultative anaerobe) สามารถยอ่ ย lecithin ในพชื ได้ การตรวจหา (detection) แบ่งเป็น 4 ข้นั ตอน ดงั น้ี 4.1 การเพมิ่ ปรมิ าณเชอ้ื ขน้ั ตน้ (primary enrichment) เปน็ ขนั้ ตอนทใี่ ชอ้ าหารเลย้ี งเชอื้ ชนดิ ทเี่ ตมิ สาร ยบั ยง้ั เพียงเลก็ นอ้ ยแล้วบม่ ข้ามคนื เพ่ือให้ Listeria spp. ทีม่ จี ำ� นวนน้อยหรอื ท่บี าดเจบ็ ฟน้ื 4.2 การเพิ่มปริมาณเช้ือ (secondary enrichment) เป็นขั้นตอนท่ีใช้อาหารเลี้ยงเชื้อจ�ำเพาะ ชนิดเหลว (selective broth) ซ่ึงเติมสารยับยั้งเชื้ออ่ืนในปริมาณสูงขึ้นเพื่อให้ Listeria spp. ทีฟ่ น้ื ตวั สามารถเพม่ิ จ�ำนวนและเชอ้ื อ่นื ถกู ยับยงั้ 4.3 การแยกเชือ้ (isolation) บนอาหารเล้ียงเชอื้ จำ� เพาะชนิดแข็ง (selective agar) 2 ชนิด 4.4 การตรวจยืนยัน (confirmation) นำ� โคโลนที มี่ ีลกั ษณะเฉพาะ ตรวจยนื ยนั ทางชีวเคมี 5. อาหารเลย้ี งเชอ้ื และสารเคมี (Culture media and reagents): ภาคผนวก 1 5.1 อาหารเลย้ี งเช้อื 5.1.1 Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) และอาหารเลี้ยงเชือ้ จ�ำเพาะชนดิ แขง็ อีกหนง่ึ ชนิด 5.1.2 Carbohydrate utilization broth (rhamnose, xylose and mannitol) 5.1.3 Fraser broth 5.1.4 Half Fraser broth 5.1.5 Motility agar 5.1.6 Sheep blood agar 5.1.7 Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) 5.2 สารเคมี 5.2.1 Gram stain reagents 5.2.2 3% Hydrogen peroxide (H2O2) solution 148

วธิ ีมาตรฐานกส�ำรหมวรทิับยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหร์อแาพหทายร์ 6. เครอ่ื งมอื และเครือ่ งใช้ (Equipment and materials) 6.1 เครอ่ื งมอื 6.1.1 เครือ่ งนง่ึ ท�ำลายเช้อื (autoclave) 121 ± 3°C 6.1.2 ตอู้ บเพาะเชื้อ (incubator) 25 ± 1°C, 30 ± 1°C, 35 ± 1°C และ 37 ± 1°C 6.1.3 กลอ้ งจุลทรรศน์ (microscope) 6.1.4 เครือ่ งวดั ความเปน็ กรด-เบส (pH-meter) 6.1.5 เครอ่ื งผสม (vortex mixer) 6.1.6 อ่างนำ้� แบบควบคุมอุณหภูมิ (water bath) 44 - 50°C 6.2 เครื่องใช้ 6.2.1 ขวดรปู ชมพู่ (flask) หรอื ขวดแก้วฝาเกลยี ว 6.2.2 แผ่นกระจก (glass slide) 6.2.3 หว่ งและเขม็ เข่ียเชอื้ (loop and needle) 6.2.4 จานเพาะเชือ้ (petri dish) 6.2.5 ปิเปต (pipette) 6.2.6 หลอดทดลอง (test tube) 6.2.7 ตะแกรงหลอดทดลอง (test tube rack) 7. ข้ันตอนการทดสอบ (Procedure) 7.1 การสุ่มตวั อยา่ ง (Sampling) 7.1.1 ในกรณีที่ตัวอย่างเป็นของแข็งหรือของเหลวข้นหนืด ตัดตัวอย่างหรือเขย่าให้ทั่วจาก หลายๆ ต�ำแหน่งให้เป็นชิ้นเล็กๆ ผสมให้เข้ากัน สุ่มตัวอย่าง 25 กรัม ใส่ในภาชนะ ปราศจากเชื้อ 7.1.2 ในกรณที ต่ี วั อย่างเปน็ ของเหลว เขย่าตวั อย่างในแตล่ ะภาชนะบรรจุให้เข้ากัน เทหรอื ปเิ ปต ตวั อยา่ งจากแตล่ ะภาชนะปรมิ าตรเทา่ ๆกนั ใสใ่ นภาชนะปราศจากเชอ้ื ไมน่ อ้ ยกวา่ 100มลิ ลลิ ติ ร และเขยา่ ให้เขา้ กนั สมุ่ ตวั อยา่ ง 25 มิลลิลิตร ใสใ่ นภาชนะปราศจากเชอ้ื 7.2 การเตรียมตวั อย่าง (Preparation of test sample) นำ� ตัวอยา่ งท่ไี ดจ้ ากการสมุ่ ตวั อย่างผสมให้เข้ากัน แลว้ นำ� ไปตรวจวิเคราะห์ 7.3 การตรวจหา (detection): ภาคผนวก 2 แผนภมู ิที่ 1 7.3.1 ขนั้ ตอนการเพิ่มปรมิ าณเช้อื ข้ันต้น (primary enrichment) เติม half Fraser broth 225 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน บ่มท่ี 30°C 24 ± 3 ช่ัวโมง (กรณีสุ่มตัวอย่างนอกเหนือจาก 25 กรัม หรือมิลลิลิตร ให้เติม half Fraser broth เพือ่ ใหส้ ัดสว่ นของตัวอยา่ ง : half Fraser broth = 1 : 10) 149

วกิธรีมมาวตทิ รยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กบั ากรแารพวทเิ คยร์ าะหอ์ าหาร 7.3.2 ขนั้ ตอนการเพ่ิมปรมิ าณเชอื้ (secondary enrichment) ปิเปต 0.1 มิลลิลิตร จากข้อ 7.3.1 ใส่ใน Fraser broth 10 มิลลิลิตร บ่มที่ 35°C หรอื 37°C 48 ± 3 ชั่วโมง 7.3.3 ขน้ั ตอนการแยกเชือ้ (isolation) 7.3.3.1 น�ำเช้ือ (จากข้อ 7.3.1 และ 7.3.2) ขีดบนอาหารเล้ียงเช้ือ ALOA และ อาหารเลี้ยงเชอ้ื จ�ำเพาะชนดิ แขง็ อืน่ อีกหน่งึ ชนดิ ชนิดละ 1 จานเพาะเชื้อ 7.3.3.2 บ่มที่ 37°C 24 ± 3 ชั่วโมง กรณีท่ีไม่มีโคโลนีลักษณะเฉพาะ หรือโคโลนี มีขนาดเล็กให้บ่มต่อ 24 ± 3 ช่ัวโมง (อาหารเลี้ยงเชื้ออ่ืนบ่มตามค�ำแนะน�ำ ของผผู้ ลติ ) ลกั ษณะโคโลนเี ฉพาะของ Listeria spp. ♦ ALOA โคโลนสี ีเขียวอมฟ้า ♦ อาหารเลี้ยงเช้ือจ�ำเพาะชนิดแข็งอื่น เป็นไปตามค�ำแนะน�ำของผู้ผลิตลักษณะ โคโลนเี ฉพาะของ L. monocytogenes ♦ ALOA โคโลนสี เี ขยี วอมฟา้ มี zone ขนุ่ ทบึ แสง แตบ่ างสายพนั ธอ์ุ าจไมใ่ ห้ zone ♦ อาหารเลยี้ งเช้ือจ�ำเพาะชนิดแขง็ อน่ื เป็นไปตามคำ� แนะน�ำของผ้ผู ลติ 7.4 ข้ันตอนการตรวจยนื ยนั (confirmation) 7.4.1 การตรวจยืนยนั Listeria spp. เลอื กโคโลนที ม่ี ลี กั ษณะเฉพาะ หรอื โคโลนที สี่ งสยั วา่ เปน็ Listeria spp. 5 โคโลนี ขดี บนจาน เพาะเชื้อ TSYEA บ่มที่ 35°C หรือ 37°C 18-24 ชั่วโมง เลือกโคโลนี กลม นูน ขุ่น ไม่มสี ี เพอ่ื ทดสอบดงั น้ี ♦ Catalase reaction น�ำเชือ้ ที่แตะบนแผน่ กระจก หยด 3% H2O2 สงั เกตฟองกา๊ ซทีเ่ กดิ ข้นึ ผลบวก: มีฟองก๊าซเกดิ ข้ึนทันที ผลลบ: ไมม่ ีฟองกา๊ ซ Listeria spp. ให้ผลบวก เน่อื งจากสรา้ งเอนไซม์ catalase ได้ ♦ Gram staining Listeria spp. เป็นแบคทีเรียแกรมบวก (สีมว่ ง) รูปท่อนส้นั ไมส่ ร้างสปอร์ ♦ Motility test stab ลงใน motility agar บ่มที่ 25°C 48 ชั่วโมง ในกรณีที่ไม่พบการเจริญ แบบร่มกาง ให้บ่มและสังเกตต่อจนครบ 5 วัน ผลบวก: เชอื้ เจรญิ แผ่ออกจากแนว stab เปน็ แบบรม่ กาง (umbrella-like) ผลลบ: เช้ือเจริญเฉพาะแนว stab Listeria spp. ใหผ้ ลบวก 150

วธิ มี าตรฐานกสำ�รหมวรทิับยกาาศรวาิเสคตรรา์กะาหรอ์ แาพหทายร์ 7.4.2 การตรวจยืนยนั Listeria monocytogenes: ภาคผนวก 3 (ตารางท่ี 1) กรณเี ชอ้ื ทสี่ งสัยใหผ้ ลการทดสอบเป็น Listeria spp. ตามข้อ 7.4.1 ใหน้ �ำเช้อื เพื่อทดสอบ ดงั น้ี ♦ Haemolysis test แตะเชอ้ื ทส่ี งสยั และเชอื้ control (L. monocytogenes, L. ivanovii และ L. innocua) บนผิวหนา้ จานเพาะเชือ้ sheep blood agar บม่ ที่ 35°C หรือ 37°C 24 ± 2 ชัว่ โมง ผลบวก: เกดิ โซนใสรอบโคโลนี ผลลบ: ไมเ่ กดิ โซนใสรอบโคโลนี การอา่ นผล: เปรียบเทยี บเชื้อท่ที ดสอบกับเชือ้ control L. monocytogenes เกิดโซนใสแคบรอบโคโลนี L. ivanovii เกดิ โซนใสกว้างรอบโคโลนี L. innocua ไม่เกดิ โซนใสรอบโคโลนี ♦ Carbohydrate utilization ทดสอบการใช้น้�ำตาล rhamnose, xylose และ mannitol โดยเขี่ยเช้ือลงใน น�้ำตาลดงั กลา่ ว บม่ ที่ 35°C หรอื 37°C 24-48 ชัว่ โมง ถา้ ไมม่ กี ารเปล่ียนแปลงใหบ้ ม่ ตอ่ จนครบ 5 วัน ผลบวก: อาหารเล้ียงเชือ้ ขุ่นและเปล่ยี นจากสมี ่วงเปน็ สีเหลอื ง ผลลบ: อาหารเล้ยี งเชอื้ ไมเ่ ปล่ียนสี L. monocytogenes ให้ผล rhamnose บวก แต่ให้ผลการทดสอบ xylose และ mannitol ลบ ♦ CAMP test: ภาคผนวก 4 รปู ที่ 1 น�ำ S. aureus และ R. equi ขีดเปน็ แนวขนานกนั บน sheep blood agar และนำ� เช้อื ที่ตอ้ งการทดสอบขีดตัง้ ฉากกับ S. aureus และ R. equi อยา่ ใหช้ นแนวของเชอ้ื ทั้งสอง ควรห่างประมาณ 1-2 มิลลเิ มตร บม่ ที่ 35°C หรอื 37°C 18-24 ช่ัวโมง อ่านผลโดย ดูการเสริมฤทธิ์การย่อยเม็ดเลือดแดง (β-haemolysis) ในกรณีเสริมฤทธ์ิกับเช้ือใด (S. aureus และ R. equi) จะปรากฏโซนใสกวา้ งขึน้ L. monocytogenes: ส่วนใหญ่จะเสริมฤทธิ์การย่อยเม็ดเลือดแดงกับ S. aureus (ส่วนน้อยอาจเสริมฤทธิ์กับ R. equi) คือจะเห็นส่วนใสกว้างขึน้ ดา้ น S. aureus L. ivanovii: จะเสริมฤทธิ์การยอ่ ยเมด็ เลือดแดงกบั R. equi คอื จะเหน็ ส่วนใสคลา้ ยหัวลูกศร (arrow-head) ขนาด กว้าง (5-10 มลิ ลิเมตร) ดา้ น R. equi L. innocua: ไม่เกิดการย่อยเมด็ เลอื ดแดง 151

วกธิรีมมาวตทิ รยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กบั ากรแารพวทิเคยร์ าะห์อาหาร 8. รายงานผลการทดสอบ (Test report) Listeria spp./น้ำ� หนกั หรือปริมาตร (เช่น กรมั หรอื มลิ ลลิ ติ ร) พบหรือไม่พบ L. monocytogenes/น�ำ้ หนกั หรอื ปริมาตร (เช่น กรมั หรือมิลลลิ ิตร) พบหรอื ไมพ่ บ 9. รายละเอียดอ่นื (Supplementary notes) 9.1 ภาคผนวก 1: อาหารเลีย้ งเชอื้ และสารเคมี (Culture Media and reagents) 9.2 ภาคผนวก 2: แผนภูมทิ ่ี 1 การตรวจหา (detection) Listeria spp. และ L. monocytogenes ในอาหาร 9.3 ภาคผนวก 3: ตารางท่ี 1 ปฏกิ ริ ยิ าตา่ งๆ ทใ่ี ชย้ นื ยนั เชอื้ Listeria spp. และ L. monocytogenes 9.4 ภาคผนวก 4: รูปที่ 1 ปฏกิ ิรยิ า CAMP test ของเชือ้ Listeria spp. 152

วธิ มี าตรฐานกส�ำรหมวริทบั ยกาาศรวาิเสคตรรา์กะาหร์อแาพหทายร์ ภาคผนวก 1 อาหารเล้ียงเช้ือและสารเคมี (Culture media and reagents) อาหารเลยี้ งเช้ือ กรณใี ช้อาหารเลย้ี งเช้ือส�ำเร็จรูป เตรียมตามสูตรและวธิ ีการท่ีผู้ผลิตระบุ 1. Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) 1.1 Base medium Enzymatic digest of animal tissues 18 กรัม Enzymatic digest of casein 6 กรัม Yeast extract 10 กรัม Sodium pyruvate 2 กรัม Glucose 2 กรัม Magnesium glycerophosphate 1 กรัม Magnesium sulfate (anhydrous) 0.5 กรมั Sodium chloride 5 กรมั Lithium chloride 10 กรัม Disodium hydrogen phosphate (anhydrous) 2.5 กรมั 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucopyranoside 0.05 กรมั Agar 12-18* กรมั น�้ำกล่ันหรอื น้ำ� กรอง 930 มิลลิลิตร ละลายสว่ นประกอบในนำ้� กลนั่ 930 มลิ ลิลติ ร ฆ่าเช้อื ท่ี 121°C 15 นาที pH 7.2 ± 0.2 1.2 Nalidixic acid solution Nalidixic acid sodium salt 0.02 กรมั Sodium hydroxide (0.05 mol/l) 5 มลิ ลิลติ ร 1.3 Ceftazidime solution Ceftazidime 0.02 กรัม น�ำ้ กลน่ั หรอื นำ้� กรอง 5 มิลลิลติ ร 1.4 Polymyxin B solution Polymyxin B sulfate 76700 IU น้�ำกลน่ั หรือน�้ำกรอง 5 มลิ ลิลิตร *ขึ้นอยกู่ บั ความแข็งของวุ้น (gel strength of the agar) 153

กวธิรมีมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรรก์ ับากรแารพวทิเคยร์ าะห์อาหาร 1.5 Antibiotic supplement 1.5.1 Cycloheximide solution Cycloheximide 0.05 กรัม Ethanol 2.5 มลิ ลิลิตร น้�ำกล่ันหรอื น้�ำกรอง 2.5 มิลลิลิตร 1.5.2 Amphotericin B solution Amphotericin B 0.01 กรมั HCl (1 mol/l) 2.5 มลิ ลิลิตร Dimethylformamide (DMF) 7.5 มลิ ลลิ ติ ร 1.6 Supplement ละลาย L-α-phosphatidylinositol (Sigma P6636®) 2 กรัม ในน�้ำกลั่น 50 มิลลิลิตร คนให้เปน็ เน้อื เดยี วกัน ฆา่ เช้ือท่ี 121°C 15 นาที การใชง้ าน Base medium (ข้อ 1.1) 930 มิลลลิ ิตร Nalidixic acid solution (ขอ้ 1.2) 5 มลิ ลลิ ิตร Ceftazidime solution (ข้อ 1.3) 5 มลิ ลิลิตร Polymyxin B solution (ขอ้ 1.4) 5 มิลลลิ ิตร Cycloheximide solution (ข้อ 1.5.1) 5 มิลลิลติ ร หรอื Amphotericin B solution (ขอ้ 1.5.2) 10 มลิ ลลิ ติ ร Supplement (ข้อ 1.6) 50 มิลลลิ ิตร เตมิ ขอ้ 1.2-1.6 ตามปรมิ าตรขา้ งตน้ ใน base medium (ขอ้ 1.1) 930 มลิ ลลิ ติ ร (หรอื 925 มลิ ลลิ ติ ร กรณีที่ใช้ Amphotericin B solution) ผสมให้เข้ากัน pH 7.2 ± 0.2 เทใส่จานเพาะเชื้อ ตามปริมาตรทตี่ อ้ งการ 2. Fraser broth 5 กรมั 2.1 Base medium 5 กรมั Meat peptone (peptic digest of animal tissue) 5 กรมั Tryptone (peptic digest of casein) 5 กรัม Meat extract 20 กรัม Yeast extract 12 กรมั Sodium chloride Disodium hydrogen phosphate dihydrate 154

วิธมี าตรฐานกส�ำรหมวริทบั ยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหร์อแาพหทายร์ Potassium dihydrogen phosphate 1.35 กรมั Aesculin 1 กรมั Lithium chloride 3 กรัม Sodium salt of nalidixic acid 0.02 กรัม น้�ำกลัน่ หรือนำ�้ กรอง 1,000 มลิ ลิลิตร ละลายส่วนประกอบในน�้ำกลน่ั 1,000 มิลลลิ ติ ร ฆา่ เชอื้ ที่ 121°C 15 นาที pH 7.2 ± 0.2 2.2 Acriflavine hydrochloride solution Acriflavine hydrochloride 0.25 กรัม น้ำ� กลัน่ หรอื น้�ำกรอง 100 มิลลลิ ติ ร 2.3 Ammonium iron (III) citrate solution Ammonium iron (III) citrate 5 กรัม น้�ำกลน่ั หรอื น้�ำกรอง 100 มิลลิลติ ร การใชง้ าน เติม Acriflavine hydrochloride solution (ข้อ 2.2) และ Ammonium iron (III) citrate solution (ขอ้ 2.3) อยา่ งละ 0.1 มลิ ลลิ ติ ร ลงใน base medium (ขอ้ 2.1) 10 มลิ ลลิ ติ ร ใชง้ านทันที 3. Half Fraser broth 3.1 Base medium Meat peptone (peptic digest of animal tissue) 5 กรมั Tryptone (peptic digest of casein) 5 กรมั Beef extract 5 กรมั Yeast extract 5 กรัม Sodium chloride 20 กรมั Disodium hydrogen phosphate dihydrate 12 กรมั Potassium dihydrogen phosphate 1.35 กรมั Aesculin 1 กรัม นำ�้ กลนั่ หรอื น้ำ� กรอง 1,000 มิลลิลติ ร ละลายส่วนประกอบในนำ�้ กล่ัน 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ฆ่าเช้ือที่ 121°C 15 นาที pH 7.2 ± 0.2 3.2 Lithium chloride solution Lithium chloride 3 กรัม น้�ำกลัน่ หรอื นำ้� กรอง 10 มิลลลิ ติ ร 155

วกธิรีมมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กับากรแารพวทเิ คยร์ าะห์อาหาร 3.3 Solution of sodium salt of nalidixic 0.1 กรมั sodium salt of nalidixic acid 10 มิลลิลิตร sodium hydroxide, 0.05 mol/l solution การใช้งาน 100 มิลลิลติ ร Base medium (ขอ้ 3.1) Lithium chloride solution (ข้อ 3.2) 1 มลิ ลลิ ิตร Solution of sodium salt of nalidixic (ขอ้ 3.3) 0.1 มลิ ลิลิตร Acriflavine hydrochloride solution (ขอ้ 2.2) 0.5 มิลลิลิตร Ammonium iron (III) citrate solution (ข้อ 2.3) 1 มิลลลิ ติ ร เตมิ ข้อ 3.2-3.3 และ 2.2-2.3 ตามปริมาตรข้างตน้ ใน base medium (ข้อ 3.1) 100 มิลลิลติ ร ใชง้ านทนั ที 4. Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) Trypticase soy broth1) 30 กรัม 1)Tryptone 17 กรมั Soya peptone 3 กรมั Sodium chloride 5 กรัม Dipotassium phosphate 2.5 กรมั Glucose 2.5 กรัม Yeast extract 6 กรัม Agar 9-18* กรัม น้�ำกลัน่ หรอื น�้ำกรอง 1,000 มิลลิลติ ร ละลายส่วนประกอบในน�้ำกล่ัน 1,000 มลิ ลิลิตร ฆา่ เช้อื ท่ี 121°C 15 นาที pH 7.3 ± 0.2 5. Sheep blood agar (SBA) 5.1 Base medium Meat peptone 15 กรมั Liver digest 2.5 กรัม Yeast extract 5 กรัม Sodium chloride 5 กรมั Agar 9-18* กรมั นำ้� กลน่ั หรอื น�้ำกรอง 1,000 มลิ ลิลิตร ละลายสว่ นประกอบในน�้ำกลนั่ 1,000 มิลลิลติ ร ฆ่าเชื้อท่ี 121°C 15 นาที pH 7.2 ± 0.2 *ขน้ึ อย่กู บั ความแขง็ ของว้นุ (gel strength of the agar) 156

วิธีมาตรฐานกส�ำรหมวริทบั ยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหร์อแาพหทายร์ 5.2 Defibrinated sheep blood การใชง้ าน เตมิ defibrinated sheep blood (ขอ้ 5.2) 5-7 มลิ ลลิ ติ ร ลงใน base medium (ขอ้ 5.1) 100 มิลลลิ ติ ร ผสมให้เขา้ กัน 6. Carbohydrate utilization broth (rhamnose, xylose และ mannitol) base 6.1 Base Proteose peptone 10 กรัม Meat extract 1 กรมั Sodium chloride (NaCl) 5 กรมั Bromocresol purple 0.02 กรัม น้�ำกล่ันหรือน�้ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร ละลายสว่ นประกอบในน้ำ� กลน่ั ฆ่าเชือ้ ท่ี 121°C 15 นาที pH 6.8 ± 0.2 6.2 Carbohydrate solutions (rhamnose, xylose and mannitol) Carbohydrate (rhamnose, xylose หรือ mannitol) 5 กรมั น้�ำกล่นั หรอื นำ้� กรอง 100 มิลลลิ ติ ร ละลายนำ้� ตาลแตล่ ะชนิดในน้�ำกลั่น ฆา่ เช้ือโดยการกรอง การใชง้ าน น�ำน้�ำตาลแต่ละชนิด (rhamnose, xylose หรือ mannitol) ผสมลงใน base ใน อัตราสว่ น 1:9 7. Motility agar 20 กรมั Casein peptone 6.1 กรมั Meat peptone 3.5 กรมั Agar 1,000 มิลลลิ ติ ร น้ำ� กลนั่ หรือน้ำ� กรอง ละลายสว่ นประกอบในนำ�้ กลน่ั ฆ่าเชอ้ื ท่ี 121°C 15 นาที pH 7.3 ± 0.2 สารเคมี 1. Gram stain reagents ใชช้ นดิ สำ� เรจ็ รปู 2. 3% hydrogen peroxide solution ใชช้ นิดส�ำเร็จรูป 157

วกิธรีมมาวติทรยฐาาศนาสสำ�ตหรรก์ ับากรแารพวทิเคยร์ าะห์อาหาร ภาคผนวก 2 ตวั อยา่ ง 25 กรมั /มิลลิลิตร + half Fraser broth 225 มิลลิลิตร 30°C 24 ± 3 ช่วั โมง 0.1 มิลลิลติ ร Fraser broth 10 มิลลลิ ิตร 35°C หรอื 37°C 4 8 ± 3 ช่ัวโมง ALOA และอาหารเลีย้ งเชอ้ื จำ� เพาะชนิดแข็งอื่นอีกหนงึ่ ชนิด 37°C 24 ± 3 ชวั่ โมง บม่ เพ่ิม 24 ± 3 ชว่ั โมง (หากจำ� เปน็ ) และตามค�ำแนะน�ำของผู้ผลิต โคโลนที ม่ี ีลักษณะเฉพาะ หรือท่ีสงสัย 5 โคโลนี ลงบนจานเพาะเชอ้ื TSYEA 35°C หรือ 37°C, 18-24 ชั่วโมง ตรวจสอบยืนยัน Listeria spp (Catalase reaction, Gram staining, Motility test) รายงานผล Listeria spp. ตรวจสอบยืนยนั L. monocytogenes (Haemolysis test, Carbohydrate utilization, CAMP test) รายงานผล L. monocytogenes แผนภูมทิ ่ี 1 การตรวจหา (detection) Listeria spp. และ L. monocytogenes ในอาหาร 158

วธิ มี าตรฐานกสำ�รหมวริทบั ยกาาศรวาิเสคตรราก์ ะาหรอ์ แาพหทายร์ ภาคผนวก 3 Species เกมาด็ รเยลอ่ อื ยดสแลดางย สร้างกรดจาก Mannitol S. CAMP test Rhamnose Xylose aureus R. equi L. monocytogenes + + - - + - L. innocua - V - - - - L. ivanovii + - + - - + L. seeligeri (+) - + - (+) - L. welshimeri - V + - - - L. grayi subsp. grayi - - - + - - L. grayi subsp. murrayi - V - + - - V : ไมแ่ นน่ อน (Variable reaction) (+) : ปฏิกิรยิ าบวกอยา่ งออ่ น (Weak reaction) + : ปฏิกิรยิ าบวกมากกวา่ 90% - : ไมเ่ กิดปฏกิ ิริยา ตารางที่ 1 : ปฏิกริ ิยาตา่ งๆ ที่ใชย้ ืนยนั เชอ้ื Listeria spp. และ L. monocytogenes 159

กวิธรมีมาวตทิ รยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กับากรแารพวทเิ คยร์ าะหอ์ าหาร ภาคผนวก 4 รูปที่ 1 : ปฏิกิริยา CAMP test ของเชื้อ Listeria spp. หมายเหตุ 1. รูปภาพแสดงการเพาะเชือ้ ลงใน sheep blood agar ♦ แนวตั้ง แสดงรอยขีดของเชอ้ื S. aureus (S) และ R. equi (R) ♦ แนวขวาง แสดงรอยขีดของเชือ้ ทต่ี อ้ งการทดสอบ ♦ พืน้ ทแ่ี รเงา แสดงการยอ่ ยสลายของเมด็ เลอื ดแดง 2. พื้นท่ีเส้นประเป็นบริเวณอิทธิพล (influence) S. aureus ในการเสริมฤทธ์ิการย่อย สลายเม็ดเลอื ดแดง 160

วิธีมาตรฐานกส�ำรหมวรทิบั ยกาาศรวาิเสคตรรา์กะาหร์อแาพหทายร์ DMSc F 2004: วธิ ีตรวจวิเคราะห์ Salmonella spp. ในอาหาร Analytical Method of Salmonella spp. in Food 1. ขอบข่าย (Scope) วิธนี ้ใี ชใ้ นการตรวจวิเคราะห์ Salmonella spp. ในอาหาร ครอบคลุมการตรวจหา (detection) 2. เอกสารอา้ งอิง (Normative reference) ISO 6579:2002/Cor.1:2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of Salmonella spp. 3. นิยามศัพท์และค�ำย่อ (Terms and abbreviation) 3.1 E. coli = Escherichia coli 3.2 H2S = Hydrogen sulphide 3.3 S. Abortus-equi = Salmonella serovar Abortus-equi 3.4 S. Berta = Salmonella serovar Berta 3.5 S. Cholerae-suis = Salmonella serovar Cholerae-suis 3.6 S. Gallinarum = Salmonella serovar Gallinarum 3.7 S. Paratyphi A = Salmonella serovar Paratyphi A 3.8 S. Sendai = Salmonella serovar Sendai 3.9 S. Typhi = Salmonella serovar Typhi 4. หลกั การ (Principle) Salmonella spp. เป็นแบคทเี รยี แกรมลบ รูปทอ่ น ไมส่ ร้างสปอร์ ส่วนใหญส่ ามารถเคลอื่ นที่ไดด้ ว้ ย แฟลกเจลลาทอี่ ยรู่ อบตวั เจรญิ ไดใ้ นทม่ี อี อกซเิ จนและไมม่ อี อกซเิ จน (facultative anaerobe) สามารถ ใชน้ ำ้� ตาล glucose ได้ การตรวจหา (detection) แบง่ เปน็ 4 ขน้ั ตอน ดังน้ี 4.1 การเพิ่มปริมาณเชื้อขั้นต้น (pre-enrichment) เป็นขั้นตอนที่ใช้อาหารเล้ียงเช้ือชนิดไม่เติม สารยบั ยั้ง แล้วบ่มขา้ มคนื เพื่อให้ Salmonella spp. ที่มจี ำ� นวนน้อยหรือทบ่ี าดเจบ็ ฟืน้ ตัว 161

กวธิรีมมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรรก์ บั ากรแารพวทิเคยร์ าะหอ์ าหาร 4.2 การเพม่ิ ปรมิ าณเชอ้ื (selective enrichment) เปน็ ขน้ั ตอนทใ่ี ชอ้ าหารเลยี้ งเชอื้ จำ� เพาะชนดิ เหลว (selective broth) 2 ชนดิ ซงึ่ เตมิ สารยบั ยง้ั เชอ้ื อน่ื ในปรมิ าณทตี่ า่ งกนั เพอื่ ให้ Salmonella spp. ที่ฟื้นตัวสามารถเพ่ิมจ�ำนวนและยับยั้งเช้ืออื่น โดยอาหารเล้ียงเชื้อท่ีใช้ทั้ง 2 ชนิด จะสนับสนุน หรอื ยบั ยั้งเชื้อตา่ งกนั 4.3 การแยกเชื้อ (isolation) บนอาหารเล้ยี งเชือ้ จ�ำเพาะชนดิ แขง็ (selective agar) 2 ชนิด 4.4 การตรวจยืนยัน (confirmation) น�ำโคโลนีที่มีลักษณะเฉพาะ ตรวจยืนยันทางชีวเคมีและ น้ำ� เหลืองวทิ ยา 5. อาหารเล้ียงเชอื้ และสารเคมี (Culture media and reagents): ภาคผนวก 1 5.1 อาหารเล้ียงเชอ้ื 5.1.1 Buffered peptone water (BPW) 5.1.2 L-Lysine decarboxylation medium 5.1.3 Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin (MKTTn) broth 5.1.4 Nutrient agar (NA) 5.1.5 Rappaport-Vassiliadis medium with soya (RVS) broth 5.1.6 Triple sugar iron (TSI) agar 5.1.7 Tryptone/tryptophan medium 5.1.8 Urea agar 5.1.9 VP medium 5.1.10 Xylose lysine deoxycholate (XLD) agar และอาหารเล้ียงเชื้อจ�ำเพาะชนิดแข็ง อีกหนึ่งชนดิ 5.2 สารเคมี 5.2.1 β-galactosidase reagent 5.2.2 Kovacs reagent 5.2.3 Reagents for Voges-Proskauer (VP) reaction 5.2.4 Salmonella polyvalent anti-O-sera 5.2.5 Salmonella monovalent anti-O-sera 5.2.6 Salmonella anti-Vi-sera 5.2.7 Toluene 5.2.8 นำ้� เกลือ 0.85% 162

วธิ มี าตรฐานกส�ำรหมวริทับยกาาศรวาิเสคตรราก์ ะาหรอ์ แาพหทายร์ 6. เครอื่ งมอื และเคร่อื งใช้ (Equipment and materials) 6.1 เครื่องมอื 6.1.1 ตอู้ บเพาะเช้อื (incubator) 37 ± 1°C 6.1.2 เคร่อื งน่งึ ท�ำลายเชือ้ (autoclave) 115 ± 3°C และ 121 ± 3°C 6.1.3 เครอื่ งวัดความเปน็ กรด-เบส (pH-meter) 6.1.4 เครื่องผสม (vortex mixer) 6.1.5 อ่างน�้ำแบบควบคุมอณุ หภูมิ (water bath) 41.5 ± 1°C และ 44 ± 50°C 6.2 เครือ่ งใช้ 6.2.1 ขวดรูปชมพู่ (flask) หรอื ขวดแก้วฝาเกลียว 6.2.2 แผ่นกระจก (glass slide) 6.2.3 ห่วงและเข็มเข่ยี เชื้อ (loop and needle) 6.2.4 จานเพาะเช้อื (petri dish) ขนาดเล็ก (90 - 100 มม.) และหรอื ขนาดใหญ่ (140 มม.) 6.2.5 ปิเปต (pipette) 6.2.6 หลอดทดลอง (test tube) 6.2.7 ตะแกรงหลอดทดลอง (test tube rack) 7. ขนั้ ตอนการทดสอบ (Procedure) 7.1 การสุ่มตัวอยา่ ง (Sampling) 7.1.1 ในกรณที ต่ี วั อยา่ งเปน็ ของแขง็ ตดั ตวั อยา่ งจากหลายๆ ตำ� แหนง่ ใหเ้ ปน็ ชนิ้ เลก็ ๆ ผสมใหเ้ ขา้ กนั กรณที ่ตี วั อย่างของเหลวข้นหนดื เขย่าให้ทว่ั สุ่มตัวอย่าง 25 กรมั ใสใ่ นภาชนะปราศจากเช้ือ 7.1.2 ในกรณีท่ีตัวอย่างเป็นของเหลว เขย่าตัวอย่างในแต่ละภาชนะบรรจุให้เข้ากันเทหรือปิเปต ตัวอย่างจากแต่ละภาชนะปริมาตรเท่าๆ กัน ใส่ในภาชนะปราศจากเช้ือไม่น้อยกว่า 100 มิลลิลติ ร และเขยา่ ให้เข้ากนั สมุ่ ตัวอย่าง 25 มิลลิลิตร ใส่ในภาชนะปราศจากเชอ้ื 7.2 การเตรียมตัวอย่าง (Preparation of test sample) ในกรณีท่ีต้องการลดปริมาณงานส�ำหรับตัวอย่างรุ่นเดียวกัน (specified lot of food) สามารถ น�ำตัวอยา่ งทดสอบรวมกันได้ (pooling the test portions) เชน่ การตรวจวเิ คราะห์ 10 ตัวอยา่ ง ให้สุ่มตัวอย่างละ 25 กรัม หรือมิลลิลิตร รวมเป็น 250 กรัม หรือมิลลิลิตรและตรวจวิเคราะห์ ในคราวเดยี วกันได้ 163

วกิธรมีมาวตทิ รยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กับากรแารพวทเิ คยร์ าะหอ์ าหาร 7.3 ขนั้ ตอนการเพม่ิ ปรมิ าณเช้อื ขน้ั ตน้ (pre-enrichment) 7.3.1 เตมิ BPW 225 มิลลลิ ิตร ลงในขวดตัวอยา่ ง ข้อ 7.1 เขย่าใหเ้ ขา้ กนั บ่มที่ 37°C 18 ± 2 ช่ัวโมง (กรณีเตรียมตัวอย่างนอกเหนือจาก 25 กรัม หรือ 25 มิลลิลิตร เติม BPW ให้ไดส้ ดั สว่ นของตวั อยา่ ง : BPW = 1 : 10) 7.3.2 กรณีอาหารเฉพาะ แบ่งออกเปน็ ♦ โกโกแ้ ละผลติ ภัณฑท์ ีม่ ีโกโกเ้ ปน็ องคป์ ระกอบมากกวา่ 20% : เติม BPW (ที่มี casein ชนิดท่ีไมใ่ ช่ acid casein 50 กรมั ต่อลติ ร หรือ sterile skim milk powder 100 กรมั ตอ่ ลติ ร) 225 มลิ ลลิ ติ ร ลงในขวดตวั อยา่ ง เขยา่ ใหเ้ ขา้ กนั บม่ ท่ี 37°C 18 ± 2 ชว่ั โมง ถ้าคาดว่าตัวอย่างมีการปนเปื้อนของแบคทีเรียแกรมบวกในปริมาณสูง ให้บ่มที่ 37°C 2 ชั่วโมง แล้วเติม brilliant green 0.018 กรัมต่อลิตร บ่มต่อท่ี 37°C จนครบ 18 ± 2 ชว่ั โมง ♦ อาหารทม่ี คี วามเปน็ กรดหรอื อาหารท่ปี รบั สภาพใหเ้ ป็นกรด : เติม BPW (ท่ีมีความเข้มข้น 2 เท่า) 225 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน บ่มท่ี 37°C 18 ± 2 ชัว่ โมง อยา่ ใหค้ า่ pH ต่ำ� กวา่ 4.5 ในขน้ั ตอน pre-enrichment 7.4 ขั้นตอนการเพิ่มปรมิ าณเชอื้ (selective enrichment) 7.4.1 ปิเปต 0.1 มิลลิลิตร จากข้อ 7.3.1 หรือ ข้อ 7.3.2 ใส่ใน RVS broth 10 มิลลิลิตร และ 1 มลิ ลลิ ิตร ใส่ใน MKTTn broth 10 มิลลลิ ิตร 7.4.2 บ่ม RVS broth ที่ 41.5°C 24 ± 3 ชว่ั โมง และ MKTTn broth ที่ 37°C 24 ± 3 ชัว่ โมง 7.5 ข้ันตอนการแยกเช้อื (isolation) 7.5.1 นำ� เช้ือ (จากขอ้ 7.4.2) ขดี บนอาหารเลย้ี งเชื้อ XLD agar และอาหารเลย้ี งเชื้อจำ� เพาะ ชนิดแข็งอ่ืนอีกหน่ึงชนิด ชนิดละ 1 จานเพาะเชื้อขนาดใหญ่ (140 มม.) หรือ 2 จาน เพาะเชอ้ื ขนาดเล็ก (90-100 มม.) 7.5.2 บม่ ที่ 37°C 24 ± 3 ช่วั โมง (อาหารเล้ียงเชอื้ อืน่ บ่มตามคำ� แนะน�ำของผผู้ ลติ ) โคโลนีทมี่ ลี ักษณะเฉพาะคอื ♦ XLD agar โคโลนีใสสแี ดง มหี รอื ไม่มจี ุดดำ� ตรงกลางโคโลนี หมายเหต:ุ Salmonella บางสายพนั ธไ์ุ มส่ รา้ ง H2S เชน่ S. Paratyphi A บน XLD โคโลนมี ีสีชมพแู ละจุดตรงกลางมีสชี มพูเข้ม สว่ นโคโลนขี อง Salmonella ที่เป็น lactose-positive บน XLD มีสีเหลืองและมีหรือไม่มีจุดด�ำ ตรงกลาง กรณที ีไ่ ม่มีโคโลนลี กั ษณะเฉพาะ ให้เลือกโคโลนบี น XLD ทม่ี สี เี หลอื งมีหรอื ไมม่ ีจุดด�ำ หรือโคโลนสี ชี มพูที่มีจดุ สชี มพูตรงกลางโคโลนี ♦ อาหารเลย้ี งเชอ้ื จ�ำเพาะชนิดแข็งอนื่ เป็นไปตามคำ� แนะน�ำของผูผ้ ลติ 164

วิธมี าตรฐานกสำ�รหมวรทิบั ยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหร์อแาพหทายร์ 7.5.3 เลือกโคโลนีท่ีมีลักษณะเฉพาะหรือโคโลนีที่สงสัยอย่างน้อย 5 โคโลนี กรณีน้อยกว่า 5 โคโลนใี หเ้ ลือกท้งั หมด ขีดบนจานเพาะเชื้อ NA บม่ ที่ 37°C 24 ± 3 ชั่วโมง 7.6 ขัน้ ตอนการตรวจยืนยัน (confirmation) 7.6.1 การยนื ยันทางชวี เคมี เขี่ยเชอ้ื จากขอ้ 7.5.3 ทดสอบทางชีวเคมีกับอาหารเล้ียงเช้อื ต่อไปนี้ ♦ TSI agar น�ำเชือ้ ขดี บนผวิ หนา้ (slant) และ stab ในสว่ น butt บ่มท่ี 37°C 24 ± 3 ชัว่ โมง butt : สีเหลอื ง (ใชน้ ้�ำตาล glucose) : สแี ดงหรือไมเ่ ปลีย่ นสี (ไม่ใช้น้�ำตาล glucose) : สดี ำ� (สรา้ ง H2S) : มีฟองอากาศหรอื รอยแตกของวุ้น (สรา้ ง gas จากน้�ำตาล glucose) slant : สีเหลอื ง (ใชน้ ำ�้ ตาล lactose และ-หรอื sucrose) : สแี ดงหรือไมเ่ ปลยี่ นสี (ไมใ่ ช้ท้ังนำ�้ ตาล lactose และ sucrose) Salmonella spp. ท่ีมีลักษณะเฉพาะให้ผล slant สีแดง และ butt สีเหลือง สร้าง gas และประมาณ 90% สร้าง H2S (ว้นุ เปล่ยี นเป็นสดี ำ� ) ♦ Urea agar น�ำเชื้อขีดบนผิวหน้า (slant) บ่มที่ 37°C 24 ± 3 ช่ัวโมง ปฏิกิริยามักเกิดภายใน 2-4 ชัว่ โมง ผลบวก : อาหารเลี้ยงเช้ือเปล่ียนเป็นสีชมพูแดง ผลลบ: อาหารเลีย้ งเชอื้ ไมเ่ ปลยี่ นสี Salmonella spp. ใหผ้ ลลบ ♦ L-Lysine decarboxylation medium บ่มที่ 37°C 24 ± 3 ชั่วโมง ใชอ้ ่านผลปฏกิ ิริยา lysine decarboxylation ผลบวก : อาหารเลย้ี งเช้ือขุน่ สีมว่ ง ผลลบ: อาหารเล้ยี งเชื้อเปลย่ี นเป็นสเี หลอื ง Salmonella spp. ให้ผลบวก ♦ β-galactosidase เขย่ี เชอ้ื ลงในนำ้� เกลอื 0.85% ปรมิ าตร 0.25 มลิ ลลิ ติ ร หยด toluene 1 หยด เขยา่ หลอด เตมิ β-galactosidase reagent 0.25 มลิ ลลิ ติ ร เขยา่ หลอด บม่ ที่ 37°C 24 ± 3 ชวั่ โมง ผลบวก : น้�ำเกลือ 0.85% เปลีย่ นเปน็ สีเหลอื ง ผลลบ: น�ำ้ เกลอื 0.85% ไม่เปลี่ยนสี Salmonella spp. ให้ผลลบ กรณใี ช้แผ่น ONPG disc สำ� เรจ็ รูป ให้ทำ� ตามคำ� แนะน�ำของผูผ้ ลติ 165

กวธิรีมมาวติทรยฐาาศนาสสำ�ตหรรก์ ับากรแารพวทิเคยร์ าะห์อาหาร ♦ VP medium บ่มท่ี 37°C 24 ± 3 ชว่ั โมง หยด creatine solution 2 หยด ethanolic solution of 1-naphthol 3 หยด และ potassium hydroxide solution 2 หยด เขยา่ ให้ เข้ากนั ผลบวก: อาหารเลี้ยงเชอ้ื เปลย่ี นเปน็ สชี มพู-แดง ภายใน 15 นาที ผลลบ: อาหารเลีย้ งเชอื้ ไมเ่ ปลยี่ นสี Salmonella spp. ใหผ้ ลลบ ♦ Tryptone/tryptophan medium บ่มท่ี 37°C 24 ± 3 ชว่ั โมง เติม Kovacs reagent 1 มลิ ลลิ ิตร เพื่ออ่านปฏิกริ ิยา ผลบวก: เกิดวงแหวนสแี ดง ผลลบ: เกดิ วงแหวนสเี หลอื ง Salmonella spp. ใหผ้ ลลบ 7.6.2 การยืนยนั ทางน�ำ้ เหลอื งวิทยา 7.6.2.1 เข่ียเชื้อมาแตะบนแผ่นกระจกท่ีสะอาด หยดน้�ำเกลือ 0.85% 1 หยด ใช้ loop ผสมให้เข้ากัน สังเกตการจับกันเป็นตะกอน (agglutination) ถ้ามีตะกอน แสดงวา่ เปน็ auto-agglutination 7.6.2.2 ทดสอบเช้อื ทไี่ มเ่ กิด auto-agglutination หยด polyvalent anti-O-sera 1 หยด ใช้ loop ผสมให้เข้ากันโดย เอียงหลอดไป-มา 30-60 วินาที สังเกต การจับกนั เปน็ ตะกอน ถ้ามตี ะกอนแสดงว่าให้ผลบวก จากนน้ั ให้ทดสอบตอ่ ด้วย monovalent anti-O-sera ถา้ มตี ะกอนกบั monovalent anti-O-serum ใด แสดงวา่ ให้ผลบวกกับ antiserum นนั้ 7.6.2.3 ถ้าเชื้อไม่ตกตะกอนกับ polyvalent anti-O-sera ให้ทดสอบการตกตะกอน กับ anti-Vi-sera ถ้าผลเป็นบวก แสดงว่าอาจเป็น Salmonella Typhi (group D) หรือ Salmonella Paratyphi C (group C) ♦ การทดสอบanti-Vi-seraโดยเขยี่ เชอื้ ลงในนำ�้ เกลอื 0.85%และตม้ เดอื ดจากนน้ั ทดสอบตอ่ ดว้ ย monovalent anti-O-serum group C และ group D 7.6.3 การแปลผล โคโลนีท่ีเกิด auto-agglutination หรือโคโลนีที่ให้ผลทั้งทางชีวเคมีและหรือ ผลทางน้�ำเหลืองวิทยาว่าเป็นหรือสงสัยว่าเป็น Salmonella spp. ส่งตรวจยืนยัน ที่ WHO National Salmonella and Shigella Center สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์ สาธารณสุข กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข หรือสถาบันอื่น ทเ่ี ชื่อถอื ได้ 166

วธิ ีมาตรฐานกส�ำรหมวริทับยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหรอ์ แาพหทายร์ 8. รายงานผลการทดสอบ (Test report) Salmonella spp./นำ�้ หนกั หรอื ปรมิ าตร (เชน่ กรมั หรือมลิ ลิลิตร) พบหรือไม่พบ 9. รายละเอยี ดอนื่ (Supplementary notes) 9.1 ภาคผนวก 1: อาหารเลีย้ งเชอ้ื และสารเคมี (Culture media and reagents) 9.2 ภาคผนวก 2: แผนภมู กิ ารตรวจหา (detection) Salmonella spp. ในอาหาร 167

วกิธรีมมาวตทิ รยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กบั ากรแารพวทเิ คยร์ าะห์อาหาร ภาคผนวก 1 อาหารเล้ียงเชื้อและสารเคมี (Culture media and reagents) อาหารเล้ียงเชื้อ กรณีใช้อาหารเลีย้ งเชอ้ื ส�ำเรจ็ รปู เตรยี มตามสูตรและวิธีการทผ่ี ู้ผลติ ระบุ 1. Buffered peptone water Enzymatic digest of casein 10 กรัม Sodium chloride 5 กรมั Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O) 9 กรัม Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 1.5 กรัม น�ำ้ กลน่ั หรอื น้�ำกรอง 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ละลายส่วนประกอบในน้ำ� กลนั่ 1,000 มลิ ลิลติ ร ฆ่าเชอ้ื ที่ 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 2. Buffered peptone water ทม่ี ี casein 50 กรมั ตอ่ ลติ ร เตรยี มอาหารเลยี้ งเชอื้ ขอ้ 1 เตมิ casein 40 กรมั ตอ่ ลติ ร ฆา่ เชอื้ ที่ 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 3. Buffered peptone water ที่มี skim milk powder 100 กรมั ตอ่ ลิตร เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อขอ้ 1 เติม skim milk powder 100 กรมั ตอ่ ลติ ร ฆา่ เชือ้ ที่ 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 4. L-Lysine decarboxylation medium L-Lysine monohydrochloride 5 กรัม Yeast extract 3 กรัม Glucose 1 กรมั Bromocresol purple 0.015 กรัม นำ�้ กลน่ั หรือน้ำ� กรอง 1,000 มลิ ลิลติ ร ละลายส่วนประกอบในน�ำ้ กล่นั 1,000 มลิ ลลิ ิตร ฆา่ เชอ้ื ท่ี 121°C 15 นาที pH 6.8 ± 0.2 168

วิธีมาตรฐานกสำ�รหมวรทิับยกาาศรวาิเสคตรราก์ ะาหรอ์ แาพหทายร์ 5. Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin (MKTTn) broth 5.1 Base medium Meat extract 4.3 กรมั Enzymatic digest of casein 8.6 กรมั Sodium chloride (NaCl) 2.6 กรมั Calcium carbonate (pCenaCtaOh3y)d rate 38.7 กรมั Sodium thiosulfate (Na2S2O3.5H2O) 47.8 กรมั Ox bile for bacteriological use 4.78 กรมั Brilliant green 9.6 มิลลิกรมั น�้ำกลัน่ หรอื นำ�้ กรอง 1,000 มลิ ลิลติ ร ละลายสว่ นประกอบในนำ้� กลัน่ หรอื นำ�้ กรอง 1,000 มิลลลิ ติ ร ตม้ เดือด 5 นาที pH 8.0 ± 0.2 5.2 Iodine-iodide solution Iodine 20 กรัม Potassium iodide (KI) 25 กรมั น�ำ้ กลน่ั หรือนำ�้ กรอง 100 มลิ ลลิ ิตร ละลาย KI ในน้�ำกล่ันหรือน�้ำกรอง 10 มิลลิลิตร จากน้ันใส่ iodine และเติมน้�ำให้ครบ 100 มิลลิลิตร เก็บในที่มดื อุณหภมู หิ ้อง 5.3 Novobiocin solution Novobiocin sodium salt 0.04 กรัม น้ำ� กลน่ั หรอื น้ำ� กรอง 5 มิลลิลิตร ละลาย Novobiocin sodium salt ในน้�ำกลั่นหรือน้�ำกรอง 5 มิลลิลิตร ท�ำให้ปราศจากเช้ือ ด้วยการกรองเกบ็ อุณหภมู ติ เู้ ยน็ (3 ± 2°C) นาน 4 สัปดาห์ การใชง้ าน เตมิ Novobiocin solution (ขอ้ 5.3) 5 มิลลิลิตร ใน Base medium (ขอ้ 5.1) 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ผสมใหเ้ ขา้ กนั จากนน้ั เตมิ Iodine-iodide solution (ขอ้ 5.2) 20 มลิ ลลิ ติ ร ผสมให้ เข้ากันอกี ครั้ง complete medium ควรเตรียมเม่ือใช้งาน 6. Nutrient agar (NA) 3 กรัม Meat extract Peptone 5 กรมั Agar 9-18* กรมั นำ�้ กลน่ั หรอื น้�ำกรอง 1,000 มลิ ลิลติ ร ละลายสว่ นประกอบในน�ำ้ กล่ัน 1,000 มลิ ลิลิตร ใหค้ วามรอ้ นจน agar ละลาย ฆา่ เชอ้ื ที่ 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 *ขึ้นกบั ความแข็งของวุ้น (gel strength of the agar) 169

กวธิรมีมาวติทรยฐาาศนาสสำ�ตหรรก์ บั ากรแารพวทิเคยร์ าะห์อาหาร 7. Rappaport-Vassiliadis medium with soya (RVS) broth 7.1 Solution A Enzymatic digest of soya 5 กรมั Sodium chloride 8 กรัม Potassium dihygrogen phosphate (KH2PO4) 1.4 กรมั Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 0.2 กรัม น้ำ� กล่นั หรือน้�ำกรอง 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ละลายส่วนประกอบในน�้ำกลั่น 1,000 มิลลิลิตร ถ้าจ�ำเป็นให้ความร้อนประมาณ 70°ซ เตรียม สารละลายนี้ในวันทเ่ี ตรยี ม complete medium 7.2 Solution B Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) 400 กรมั น�ำ้ กล่ันหรอื น�้ำกรอง 1,000 มิลลิลติ ร ละลาย Magnesium chloride ในน้�ำกลั่นหรือน�้ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร เก็บในขวดแก้วสีชา ฝาปิดสนิท ทอ่ี ุณหภูมหิ อ้ งไดน้ าน 2 ปี 7.3 Solution C Malachite green oxalate 0.4 กรมั น�ำ้ กลั่นหรือน�้ำกรอง 100 มลิ ลิลิตร ละลาย Malachite green oxalate ในน้�ำกลั่นหรือน�้ำกรอง 100 มิลลิลิตร เก็บในที่มืด อณุ หภูมิหอ้ ง ไดน้ าน 8 เดือน การใช้งาน Solution A (ขอ้ 7.1) 1,000 มลิ ลิลิตร Solution B (ขอ้ 7.2) 100 มลิ ลิลิตร Solution C (ข้อ 7.3) 10 มลิ ลลิ ติ ร ผสมสว่ นประกอบทงั้ หมดเข้าด้วยกัน ฆ่าเช้อื ที่ 115°C 15 นาที pH 5.2 ± 0.2 170

วธิ มี าตรฐานกสำ�รหมวริทับยกาาศรวาเิสคตรรา์กะาหร์อแาพหทายร์ 8. Triple sugar iron (TSI) agar 3 กรมั Meat extract Yeast extract 3 กรมั Peptone 20 กรมั Sodium chloride (NaCl) 5 กรมั Lactose 10 กรมั Sucrose 10 กรมั Glucose 1 กรัม Iron (III) citrate 0.3 กรมั Sodium thiosulfate 0.3 กรมั Phenol red 0.024 กรมั Agar 9-18* กรัม น�้ำกล่นั หรอื นำ�้ กรอง 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ละลายส่วนประกอบในน้�ำกลั่นหรือน้�ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร ให้ความร้อนจน agar ละลายฆ่าเช้ือ ท่ี 121°C 15 นาที pH 7.4 ± 0.2 ปล่อยให้ agar แขง็ โดยการเอยี งหลอด 9. Tryptone/tryptophan medium Tryptone 10 กรัม Sodium chloride (NaCl) 5 กรัม DL-Tryptophan 1 กรมั น้�ำกลนั่ หรอื น้ำ� กรอง 1,000 มิลลิลิตร ละลายส่วนประกอบในน้�ำกลั่นหรือน้�ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร แบ่งใส่หลอดตามปริมาตรที่ต้องการ ฆา่ เชื้อที่ 121°C 15 นาที pH 7.5 ± 0.2 10. Urea agar (Christensen) 10.1 Base medium Peptone 1 กรัม Glucose 1 กรัม Sodium chloride (NaCl) 5 กรมั Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 2 กรมั Phenol red 0.012 กรัม Agar 9-18* กรมั นำ้� กลน่ั หรือนำ�้ กรอง 1,000 มิลลลิ ติ ร ละลายส่วนประกอบในน�้ำกลั่นหรือน�้ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร ให้ความร้อนจน agar ละลาย ฆ่าเชื้อที่ 121°C 15 นาที pH 6.8 ± 0.2 *ขึน้ กบั ความแขง็ ของวนุ้ (gel strength of the agar) 171

วกธิรีมมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กบั ากรแารพวทิเคยร์ าะห์อาหาร 10.2 Urea solution Urea 400 กรมั น้ำ� กล่ันหรอื นำ�้ กรอง 1,000 มลิ ลิลติ ร ละลาย Urea ในน�้ำกลั่นหรือนำ้� กรอง ปรับปริมาตรเป็น 1,000 มิลลิลิตร ท�ำให้ปราศจากเชื้อ ด้วยการกรอง การใช้งาน เติม Urea solution (ข้อ 10.2) 50 มิลลลิ ติ ร ใน Base medium (ข้อ 10.1) 950 มลิ ลลิ ิตร ผสมใหเ้ ขา้ กันโดยใช้ aseptic technique แลว้ ปล่อยให้แข็งโดยการเอยี งหลอด 11. VP medium 7 กรัม Peptone Glucose 5 กรัม Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 5 กรมั น้�ำกลน่ั หรอื น้�ำกรอง 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ละลายส่วนประกอบในน้�ำกลั่นหรือน�้ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร แบ่งใส่หลอดตามปริมาตรที่ต้องการ ฆา่ เช้ือท่ี 121°C 15 นาที pH 6.9 ± 0.2 12. Xylose lysine desoxycholate (XLD) Agar 3 กรมั Yeast extract powder Sodium chloride (NaCl) 5 กรัม Xylose 3.75 กรัม Lactose 7.5 กรมั Sucrose 7.5 กรัม L-Lysine hydrochloride 5 กรัม Sodium thiosulfate 6.8 กรัม Iron (III) ammonium citrate 0.8 กรัม Phenol red 0.08 กรมั Sodium deoxycholate 1 กรัม Agar 9-18* กรัม น�้ำกลัน่ หรือน้�ำกรอง 1,000 มลิ ลิลติ ร ละลายส่วนประกอบในนำ้� กลั่นหรอื นำ�้ กรอง 1,000 มิลลลิ ิตร ใหค้ วามร้อนจน agar ละลายไมใ่ ห้รอ้ น เกินไป pH 7.4 ± 0.2 *ข้นึ กับความแข็งของวุ้น (gel strength of the agar) 172

วิธมี าตรฐานกสำ�รหมวรทิับยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหรอ์ แาพหทายร์ สารเคมี กรณใี ชส้ ารเคมีส�ำเร็จรูป เตรียมตามสูตรและวิธที ่ผี ู้ผลิตระบุ 1. β-galactosidase reagent 1.1 Buffer solution Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) 6.9 กรมั Sodium hydroxide, 10 mol/l solution 3 มิลลลิ ิตร น�ำ้ กลน่ั 50 มลิ ลลิ ิตร ละลาย Sodium dihydrogen phosphate ในน้�ำกล่ัน 45 มิลลิลิตร ปรับ pH 7.0 ± 0.2 ด้วย Sodium hydroxide ปรบั ปรมิ าตรเป็น 50 มลิ ลลิ ิตร 1.2 ONPG solution o-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) 0.08 กรัม น�้ำกลั่น 15 มิลลิลติ ร ละลาย ONPG ในน้ำ� กลั่นทีอ่ ณุ หภมู ิประมาณ 50°C การใชง้ าน Buffer solution (ขอ้ 1.1) 5 มลิ ลลิ ติ ร กับ ONPG solution (ขอ้ 1.2) 15 มลิ ลิลิตร ผสมใหเ้ ข้ากนั 2. Kovacs reagent 5 กรัม 4-Dimethylaminobenzaldehyde 25 มิลลิลติ ร Hydrochloric acid 75 มิลลลิ ิตร 2-Methybutan-2-ol ผสมสว่ นประกอบให้เขา้ กัน 3. น้�ำเกลือ 0.85% Sodium chloride (NaCl) 8.5 กรมั น�้ำกลัน่ 1,000 มิลลิลิตร ละลายส่วนประกอบในน้ำ� กล่ัน 1,000 มลิ ลิลิตร ฆา่ เช้อื ที่ 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 4. Reagent for Voges-Proskauer (VP) reaction 0.5 กรมั 4.1 Creatine solution (N-amidinosarcosine) 100 มิลลิลิตร Creatine monohydrate น้�ำกลั่น ละลาย Creatine monohydrate ในน้�ำกลัน่ 173

กวธิรมีมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กับากรแารพวทเิ คยร์ าะหอ์ าหาร 6 กรัม 100 มลิ ลลิ ติ ร 4.2 1-Naphthol, ethanolic solution 1-Naphthol 40 กรัม 100 มิลลลิ ิตร Ethanol, 96% (volume fraction) ละลาย 1-Naphthol ใน Ethanol 4.3 Potassium hydroxide solution Potassium hydroxide นำ�้ กลนั่ ละลาย Potassium hydroxide ในน�ำ้ กล่นั 5. Salmonella anti-sera ใช้ชนดิ สำ� เรจ็ รปู 174

วิธีมาตรฐานกส�ำรหมวรทิับยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหร์อแาพหทายร์ ภาคผนวก 2 ตัวอยา่ ง 25 กรัม/มลิ ลิลติ ร + buffered peptone water 225 มลิ ลิลิตร 37°C 18 ± 2 ชว่ั โมง 0.1 มลิ ลิลติ ร 1 มลิ ลิลิตร RVS broth 10 มลิ ลลิ ิตร MKTTn broth 10 มิลลิลิตร 41.5°C 24 ± 3 ชว่ั โมง 37°C 24 ± 3 ชัว่ โมง XLD agar และอาหารเลี้ยงเชอื้ จ�ำเพาะชนิดแข็งอืน่ อีกหนึง่ ชนิด 37°C 24 ± 3 ชั่วโมงและตามคำ� แนะนำ� ของผู้ผลติ โคโลนที ี่มลี กั ษณะเฉพาะหรอื ที่สงสยั เขยี่ เชอ้ื อยา่ งน้อย 5 โคโลนี ลงบนจานเพาะเช้อื NA 37°C 24 ± 3 ชั่วโมง ทดสอบทางชีวเคมี ปฏกิ ริ ยิ าทางชวี เคมีของ Salmonella spp. TSI agar Urea L-Lysine นำ�้ เกลอื 0.85% VP Tryptone/ Suspected Slant Butt Gas H2S agar decarboxylation (β-galactosidase) medium tryptophan pathogens medium medium สแี ดง สีเหลือง + + * - + - - - Salmonella (สดี ำ� ) (สมี ่วง) (เกดิ วงแหวน in general สเี หลอื ง) สีแดง สีเหลือง - + W - + - - - S. Typhi ( - ) สแี ดง สเี หลอื ง + - ** - (สเี หลอื ง) - - - S. Paratyphi A ตกตะกอนกับ polyvalent anti-O-sera, monovalent anti-O-sera, anti-Vi-sera กรณที ีต่ อ้ งการทราบ serovar ใด ส่งตรวจยนื ยนั ท่ี WHO National Salmonella and Shigella Center สถาบันวิจัยวทิ ยาศาสตรส์ าธารณสุข หรือสถาบนั อืน่ ท่เี ช่อื ถือได้ รายงานผล * = S. Sendai, S. Abortus-equi, S. Gallinarum, S. Berta และบางสายพันธุ์ของ S. Cholerae-suis ให้ผลลบ ** = Rarely positive W = Weakly positive แผนภูมิ การตรวจหา (detection) Salmonella spp. ในอาหาร 175



วิธีมาตรฐานกสำ�รหมวรทิบั ยกาาศรวาิเสคตรรา์กะาหร์อแาพหทายร์ DMSc F 2005: วธิ ตี รวจวเิ คราะห์ Salmonella spp. ในน้�ำและน้ำ� แขง็ (Analytical Method of Salmonella spp. in Water and Ice) 1. ขอบขา่ ย (Scope) วธิ นี ใ้ี ชใ้ นการตรวจวเิ คราะห์ Salmonella spp. ในนำ�้ และนำ้� แขง็ ครอบคลมุ การตรวจหา (detection) 2. เอกสารอ้างองิ (Normative references) 2.1 ISO 19250:2010. Water quality-Detection of Salmonella spp. 2.2 ISO 6579:2002. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of Salmonella spp. 3. นิยามศพั ทแ์ ละคำ� ยอ่ (Terms and abbreviation) 3.1 E. coli = Escherichia coli 3.2 H2S = Hydrogen sulfide 3.3 µ = ไมครอน (micron) หรอื ไมโครเมตร (micrometer) 4. หลกั การ (Principle) Salmonella spp. เป็นแบคทเี รียแกรมลบ รปู ทอ่ น ไม่สรา้ งสปอร์ ส่วนใหญ่สามารถเคลื่อนท่ไี ด้ดว้ ย แฟลกเจลลาที่อยู่รอบตัว เจริญได้ในที่มีออกซิเจนและไม่มีออกซิเจน (facultative anaerobe) สามารถใชน้ ำ�้ ตาล glucose ได้ การตรวจหา (detection) แบ่งเป็น 4 ข้นั ตอน ดงั น้ี 4.1 การเพ่ิมปริมาณเช้ือข้ันต้น (pre-enrichment) เป็นขั้นตอนที่ใช้เทคนิคการกรองตัวอย่าง ผ่านแผ่นกรองเมมเบรน (membrane filter) ท่ีมีรู (pore size) ขนาด 0.45 µ จากน้ัน น�ำแผ่นกรองท่ีมีเชื้อจุลินทรีย์ไปใส่ในอาหารเล้ียงเชื้อชนิดไม่เติมสารยับย้ัง แล้วบ่มเพาะเช้ือ เพ่อื ให้ Salmonella spp. ท่มี จี ำ� นวนน้อยเพมิ่ จำ� นวนหรือที่บาดเจบ็ ฟน้ื ตวั 4.2 การเพิ่มปริมาณเชื้อ (selective enrichment) เป็นขั้นตอนท่ีใช้อาหารเลี้ยงเชื้อจ�ำเพาะ ชนดิ เหลว (selective broth) 2 ชนดิ ซง่ึ เตมิ สารยบั ยงั้ เชอื้ อน่ื ตา่ งชนดิ กนั เพอ่ื ให้ Salmonella spp. ที่ฟื้นตัวสามารถเพ่ิมจ�ำนวนและยับย้ังเชื้ออ่ืน โดยอาหารเล้ียงเช้ือที่ใช้ทั้ง 2 ชนิด จะสนับสนุน หรอื ยับยั้งเช้ือตา่ งกนั 4.3 การแยกเช้ือ (isolation) บนอาหารเลยี้ งเชอ้ื จ�ำเพาะชนิดแข็ง (selective agar) 2 ชนิด 4.4 การตรวจยืนยัน (confirmation) น�ำโคโลนีท่ีมีลักษณะเฉพาะ ตรวจยืนยันทางชีวเคมีและ นำ้� เหลอื งวิทยา 177

วกธิรีมมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กบั ากรแารพวทเิ คยร์ าะหอ์ าหาร 5. อาหารเลย้ี งเชื้อและสารเคมี (Culture media and reagents): ภาคผนวก 1 5.1 อาหารเล้ยี งเชือ้ 5.1.1 Buffered peptone water (BPW) single strength 5.1.2 Buffered peptone water (BPW) double strength 5.1.3 L-Lysine decarboxylation medium 5.1.4 Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin (MKTTn) broth 5.1.5 Nutrient agar (NA) 5.1.6 Rappaport-Vassiliadis broth with soya (RVS) broth 5.1.7 Triple sugar iron (TSI) agar 5.1.8 Urea agar (Christensen) 5.1.9 Xylose lysine deoxycholate (XLD) agar และอาหารเลี้ยงเช้ือจ�ำเพาะชนิดแข็ง อกี หนงึ่ ชนิด เชน่ brilliant green (BGA) agar, bismuth sulfite (BS) agar เป็นต้น 5.2 สารเคมี 5.2.1 น�ำ้ เกลือ 0.85% 5.2.2 Salmonella polyvalent anti-O-sera 5.2.3 Salmonella monovalent anti-O-sera 5.2.4 Salmonella anti-Vi-sera 5.2.5 น้�ำกลั่นปราศจากเชอ้ื หรอื น�้ำกรองทม่ี ีคุณสมบัติเทยี บเทา่ 6. เคร่อื งมือและเคร่อื งใช้ (Equipment and materials) 6.1 เครื่องมือ 6.1.1 ตอู้ บเพาะเชือ้ (incubator) 36 ± 2°C 6.1.2 เคร่อื งนง่ึ ท�ำลายเชอื้ (autoclave) 115 ± 3°C และ 121 ± 3°C 6.1.3 ชุดกรองเมมเบรน (membrane filter unit) 6.1.4 เครื่องวดั ความเป็นกรด-เบส (pH-meter) 6.1.5 อา่ งน�ำ้ แบบควบคมุ อุณหภมู ิ (water bath) 41.5 ± 1°C และ 44 - 50°C 6.1.6 เครอ่ื งดดู สุญญากาศ (vacuum pump) 220 โวลต์ 50 เฮริ ตซ์ 178

วิธมี าตรฐานกสำ�รหมวรทิบั ยกาาศรวาิเสคตรราก์ ะาหร์อแาพหทายร์ 6.2 เครื่องใช้ 6.2.1 ขวดรปู ชมพู่ (flask) หรือขวดแก้วฝาเกลยี วขนาด 250 และ 500 มลิ ลลิ ิตร 6.2.2 แผน่ กรองเมมเบรนปราศจากเชอื้ ขนาดเสน้ ผา่ นศนู ยก์ ลาง 47 มลิ ลเิ มตร, pore size 0.45 µ 6.2.3 แผ่นกระจก (glass slide) 6.2.4 หว่ งและเขม็ เข่ยี เชือ้ (loop and needle) 6.2.5 จานเพาะเช้อื (petri dish) 6.2.6 ปเิ ปต (pipette) 6.2.7 หลอดทดลอง (test tube) 6.2.8 ตะแกรงหลอดทดลอง (test tube rack) 6.2.9 forceps ปากแบนและผวิ เรยี บ 7. ขั้นตอนการทดสอบ (Procedure) 7.1 การสมุ่ ตวั อย่าง (Sampling) 7.1.1 ในกรณีที่ตัวอย่างเป็นน�้ำ เขย่าตัวอย่างในแต่ละภาชนะบรรจุให้เข้ากัน เทตัวอย่าง จากแต่ละภาชนะปริมาตรเท่าๆ กัน ใส่ในภาชนะปราศจากเชือ้ ไมน่ ้อยกวา่ 100 มิลลิลติ ร หรอื ปริมาตรอน่ื ท่ตี ้องการทดสอบ 7.1.2 ในกรณีทต่ี ัวอย่างเป็นนำ้� แข็ง เทตัวอยา่ งจากแต่ละหน่วยภาชนะบรรจุใสร่ วมกัน ในภาชนะ ปราศจากเชื้อ ท�ำให้ตัวอย่างละลายจนหมด สุ่มให้ได้ตัวอย่างไม่น้อยกว่า 100 มิลลิลิตร หรอื ปรมิ าตรอนื่ ท่ีต้องการทดสอบ 7.2 การเตรยี มชดุ กรอง (Preparation of membrane filter unit) 7.2.1 เตรยี มชดุ กรองเมมเบรน 1 ชดุ 7.2.2 ใช้ forceps ที่ฆ่าเช้ือแล้วคีบแผ่นกรองเมมเบรนปราศจากเช้ือ 1 แผ่น มาวางบนส่วนที่ เปน็ ฐานรองรับกระดาษ วางกรวยกรองรบั น�้ำครอบบนฐานรองรับกระดาษใหส้ นิท 7.3 ขั้นตอนการเพมิ่ ปรมิ าณเชอ้ื ขัน้ ตน้ (pre-enrichment) 7.3.1 เขยา่ ตวั อยา่ งให้เข้ากนั อย่างน้อย 25 คร้ัง แล้วเทตวั อยา่ ง 100 มิลลิลิตร หรอื ปรมิ าตรอืน่ ท่ตี อ้ งการทดสอบลงในกรวยกรองโดยวธิ ีปราศจากเช้ือแลว้ ปดิ ฝาครอบ 7.3.2 เปิดเครื่องดดู สญุ ญากาศเพือ่ ให้น�้ำไหลผ่านจนหมดแล้วปิดเคร่ือง 7.3.3 ลา้ งรอบๆ กรวยกรองดว้ ยนำ�้ กลนั่ ปราศจากเชอื้ หรอื นำ้� กรองทมี่ คี ณุ สมบตั เิ ทยี บเทา่ ประมาณ 150 มิลลิลิตร ปิดฝาครอบ และเปิดเคร่ืองดูดสุญญากาศเพ่ือให้น�้ำไหลผ่านจนหมดแล้ว ปดิ เคร่อื ง 179

วกธิรีมมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กับากรแารพวทิเคยร์ าะหอ์ าหาร 7.3.4 ใช้ forceps ปราศจากเชื้อคีบแผ่นกรองใส่ใน BPW, single strength 50 มิลลลิ ิตร แลว้ น�ำไปบม่ ท่ี 36 ± 2°C 18 ± 2 ชว่ั โมง 7.3.5 หากไม่ใช้ชุดกรองเมมเบรน และมีตัวอย่างมากกว่า 10 มิลลิลิตร ให้เทตัวอย่างปริมาตร เท่ากับ BPW ความเข้มข้น 2 เท่า (double strength) ลงในขวดแก้วปราศจากเชื้อ เขย่าใหเ้ ขา้ กัน แลว้ นำ� ไปบม่ ท่ี 36 ± 2°C 18 ± 2 ชัว่ โมง ถ้าปริมาตรตัวอย่างน้อยกว่า 10 มิลลิลิตร ให้ผสมตัวอย่างกับ BPW ความเข้มข้น 1 เทา่ 50 มลิ ลลิ ติ ร ในขวดแก้วปราศจากเชื้อ เขยา่ ใหเ้ ขา้ กัน แล้วน�ำไปบม่ ท่ี 36 ± 2°C 18 ± 2 ชว่ั โมง 7.4 ขัน้ ตอนการเพมิ่ ปริมาณเชือ้ (selective enrichment) 7.4.1 ปเิ ปต 0.1 มิลลลิ ติ ร จากขอ้ 7.3.4 หรอื ข้อ 7.3.5 ใสใ่ น RVS broth 10 มิลลิลติ ร และ ปเิ ปต 1 มิลลิลติ ร ใส่ใน MKTTn broth 10 มลิ ลลิ ติ ร 7.4.2 บ่ม RVS broth ท่ี 41.5 ± 1°C 24 ± 3 ชวั่ โมง และ MKTTn broth ที่ 36 ± 2°C 24 ± 3 ชวั่ โมง ถา้ ตอ้ งการตรวจหา Salmonella spp. ทเี่ จรญิ เตบิ โตชา้ (slow-growing) ให้บ่ม RVS broth ต่อท่ี 41.5 ± 1°C จนครบ 48 ± 4 ชวั่ โมง 7.5 ขนั้ ตอนการแยกเชอ้ื (isolation) 7.5.1 น�ำเชื้อ (จากข้อ 7.4.2) ขีดบนอาหารเลย้ี งเชอ้ื XLD agar และอาหารเล้ียงเชอื้ จ�ำเพาะชนดิ แข็งอ่นื อกี หนึง่ ชนดิ ชนดิ ละ 1 จานเพาะเชือ้ 7.5.2 XLD agar บ่มท่ี 36 ± 2°C 24 ± 3 ชั่วโมง ส�ำหรับอาหารเลี้ยงเชื้ออื่น บ่มตาม คำ� แนะนำ� ของผู้ผลติ โคโลนที ี่มีลักษณะเฉพาะคือ ♦ XLD agar โคโลนีใสสแี ดง มหี รือไมม่ จี ดุ ด�ำตรงกลางโคโลนี หมายเหตุ: Salmonella บางสายพนั ธไุ์ ม่สร้าง H2S เช่น S. Paratyphi A บน XLD โคโลนมี สี ีชมพแู ละจุดตรงกลางมสี ีชมพเู ขม้ ส่วนโคโลนีของ Salmonella ทส่ี ามารถใชน้ �ำ้ ตาลแลคโตส (lactose-positive) บน XLD มสี ีเหลอื ง และมหี รอื ไมม่ จี ดุ ด�ำตรงกลาง ในกรณที พ่ี บโคโลนลี กั ษณะเหลา่ น้ี ใหน้ �ำไป ตรวจสอบยืนยนั ดว้ ย 7.5.3 ส�ำหรับงานท่ีวิเคราะห์เป็นประจ�ำ (routine monitoring purpose) เลือกโคโลนี ที่มีลักษณะเฉพาะหรือโคโลนีที่สงสัยอย่างน้อย 1 โคโลนี จากแต่ละจานอาหารเล้ียงเชื้อ จำ� เพาะชนิดแขง็ นำ� ไปตรวจวิเคราะห์ยนื ยนั ถา้ โคโลนีแรกไม่ใช่ Salmonella ใหท้ ดสอบ เพิ่มอีก 4 โคโลนี 7.5.4 กรณกี ารศกึ ษาดา้ นระบาดวทิ ยา (epidemilogical studies) เลอื กโคโลนที มี่ ลี กั ษณะเฉพาะ หรือโคโลนีที่สงสัยอย่างน้อย 5 โคโลนี จากแต่ละจานอาหารเลี้ยงเช้ือจ�ำเพาะชนิดแข็ง ถ้ามนี อ้ ยกวา่ 5 โคโลนี ให้เลอื กท้ังหมดแล้วน�ำไปตรวจวเิ คราะห์ยนื ยนั 180

วิธีมาตรฐานกสำ�รหมวรทิับยกาาศรวาเิสคตรราก์ ะาหรอ์ แาพหทายร์ 7.6 ข้นั ตอนการตรวจยนื ยนั (confirmation) เขี่ยเชือ้ ท่ีสงสยั จากขอ้ 7.5.3 หรือ 7.5.4 ขดี บนจานเพาะเชอ้ื NA บ่มท่ี 36 ± 2°C 24 ± 3 ชว่ั โมง แลว้ น�ำไปตรวจยนื ยันทางชีวเคมีและทางน�้ำเหลอื งวิทยา 7.6.1 การตรวจยนื ยันทางชวี เคมี ทดสอบดว้ ยอาหารเล้ยี งเชอื้ ต่อไปนี้ ♦ TSI agar น�ำเชอื้ ขีดบนผวิ หน้า (slant) และ stab ในส่วน butt บ่มท่ี 36 ± 2°C 24 ± 3 ชั่วโมง butt : สีเหลือง (ใช้นำ�้ ตาล glucose) : สีแดงหรอื ไมเ่ ปลีย่ นสี (ไมใ่ ชน้ ้ำ� ตาล glucose) : สดี �ำ (สร้าง H2S) : มฟี องอากาศหรอื รอยแตกของวนุ้ (สรา้ ง gas จากนำ้� ตาล glucose) slant : สเี หลือง (ใช้น�้ำตาล lactose และ-หรือ sucrose) : สแี ดงหรือไมเ่ ปล่ยี นสี (ไมใ่ ช้ทง้ั น้�ำตาล lactose และ sucrose) Typical Salmonella ให้ผล slant สีแดง (ไม่ใช้น�้ำตาล lactose และ sucrose) และ butt สีเหลอื ง (ใชน้ ำ�้ ตาล glucose) สร้าง gas และประมาณ 90% สรา้ ง H2S (ว้นุ เปล่ยี นเปน็ สีด�ำ) ♦ Urea agar น�ำเชื้อขีดบนผิวหน้า (slant) บ่มท่ี 36 ± 2°C 24 ช่ัวโมง ปฏิกิริยามักเกิดภายใน 2-4 ช่วั โมง ผลบวก: อาหารเล้ยี งเชอื้ เปลีย่ นเป็นสชี มพูแดง ผลลบ: อาหารเลยี้ งเช้ือไม่เปลีย่ นสี Typical Salmonella ให้ผลลบ ♦ L-Lysine decarboxylation medium บ่มที่ 36 ± 2°C 24 ± 3 ช่ัวโมง ใชอ้ า่ นผลปฏกิ ริ ิยา lysine decarboxylation ผลบวก: อาหารเลี้ยงเชือ้ ขนุ่ สมี ่วง ผลลบ: อาหารเลย้ี งเชอื้ เปลีย่ นเปน็ สเี หลือง Typical Salmonella ให้ผลบวก 181

กวิธรีมมาวตทิ รยฐาาศนาสสำ�ตหรรก์ ับากรแารพวทเิ คยร์ าะห์อาหาร โคโลนีที่ให้ผลทดสอบตาม typical reactions ในตารางท่ี 1 จัดเป็น presumptive Salmonella spp.ให้ทดสอบยืนยันต่อทางน�้ำเหลืองวิทยา และหากผลไม่เป็นไปตาม typical reactions (ตารางที่ 1) 1-2 ปฏกิ ริ ยิ า ใหท้ ดสอบยนื ยนั ตอ่ ทางนำ�้ เหลอื งวทิ ยาดว้ ย ตารางที่ 1 Typical reactions ทางชวี เคมี ของ Salmonella spp. การทดสอบ ผล TSI lactose - TSI glucose + TSI sucrose - TSI hydrogen sulfide + Urea splitting - L-Lysine decarboxylase + 7.6.2 การยนื ยนั ทางนำ�้ เหลืองวทิ ยา 7.6.2.1 เข่ียเชื้อมาแตะบนแผ่นกระจกท่ีสะอาด หยดน้�ำเกลือ 0.85% 1 หยด ใช้ loop ผสมให้เข้ากัน สังเกตการจับกันเป็นตะกอน (agglutination) ถ้ามีตะกอน แสดงว่าเป็น auto-agglutination 7.6.2.2 ทดสอบเชอื้ ทไี่ มเ่ กดิ auto-agglutination โดยหยด polyvalent anti-O-sera 1 หยด ใช้ loop ผสมให้เข้ากันโดย เอียงหลอดไป-มา 30-60 วินาที สังเกต การจับกันเป็นตะกอน ถ้ามตี ะกอนแสดงวา่ ให้ผลบวก จากนนั้ ให้ทดสอบต่อด้วย monovalent anti-O-sera ถา้ มตี ะกอนกบั monovalent anti-O-serum ใด แสดงวา่ ให้ผลบวกกับ antiserum นั้น 7.6.2.3 ถา้ เชอื้ ไมต่ กตะกอนกบั polyvalent anti-O-sera ใหท้ ดสอบการตกตะกอนกบั anti-Vi-sera ถา้ ผลเปน็ บวก แสดงวา่ อาจเปน็ Salmonella Typhi (group D) หรือ Salmonella Paratyphi C (group C) ทดสอบต่อโดยเข่ียเชื้อปรมิ าณ มากลงในหลอดบรรจนุ ำ�้ เกลอื 0.85%และตม้ เดอื ด แลว้ ตรวจสอบดว้ ย monovalent anti-O-serum group C และ group D 7.6.3 โคโลนีท่ีให้ผลตาม typical reactions ของการทดสอบทางชีวเคมี และให้ผลบวกทาง น�้ำเหลอื งวทิ ยาแสดงว่าเปน็ Salmonella spp. 7.6.4 โคโลนีที่เกิด auto-agglutination หรือกรณีสงสัย และ/หรือต้องการทราบว่าเป็น serovar ใด ใหส้ ง่ ตรวจยนื ยันที่ WHO National Salmonella and Shigella Center สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุข กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข หรือสถาบนั อนื่ ที่เชือ่ ถือได้ 182

วิธมี าตรฐานกส�ำรหมวริทบั ยกาาศรวาเิสคตรรา์กะาหร์อแาพหทายร์ 8. รายงานผลการทดสอบ (Test report) Salmonella spp./100 มลิ ลิลติ ร หรอื ปริมาตรท่ที ดสอบ พบหรอื ไมพ่ บ 9. รายละเอียดอื่น (Supplementary notes) 9.1 ภาคผนวก 1: อาหารเลีย้ งเชอื้ และสารเคมี (Culture media and reagents) 9.2 ภาคผนวก 2: แผนภมู กิ ารตรวจหา (detection) Salmonella spp. ในนำ้� และน�้ำแข็ง 183

กวิธรมีมาวตทิ รยฐาาศนาสส�ำ ตหรร์กับากรแารพวทิเคยร์ าะหอ์ าหาร ภาคผนวก 1 อาหารเลย้ี งเชอื้ และสารเคมี (Culture media and reagents) อาหารเลย้ี งเชอ้ื กรณใี ช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ส�ำเรจ็ รปู เตรยี มตามสูตรและวธิ ีการทีผ่ ผู้ ลิตระบุ 1. Buffered peptone water (single strength) Enzymatic digest of casein 10 กรมั Sodium chloride (NaCl) 5 กรมั Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 9 กรัม (Na2HPO4.12H2O) Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 1.5 กรมั น�ำ้ กล่ันหรือน�้ำกรอง 1,000 มิลลลิ ติ ร ละลายสว่ นประกอบในน้�ำกล่นั 1,000 มลิ ลิลิตร ฆ่าเชอ้ื ที่ 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 เก็บที่อุณหภูมิ 5 ± 3°C ไดน้ าน 3 เดือน 2. Buffered peptone water (double strength) 20 กรมั Enzymatic digest of casein Sodium chloride (NaCl) 10 กรมั Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 18 กรัม (Na2HPO4.12H2O) Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 3 กรัม น�ำ้ กลั่นหรอื น�้ำกรอง 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ละลายส่วนประกอบในนำ้� กลนั่ 1,000 มิลลิลติ ร ฆ่าเชื้อที่ 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 เก็บท่อี ณุ หภมู ิ 5 ± 3°C ได้นาน 3 เดือน 3. L-Lysine decarboxylation medium 5 กรมั L-lysine monohydrochloride Yeast extract 3 กรัม Glucose 1 กรมั Bromocresol purple 0.015 กรมั น�้ำกลนั่ หรอื น้�ำกรอง 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ละลายสว่ นประกอบในนำ�้ กลั่น 1,000 มิลลิลติ ร ฆ่าเช้ือที่ 121°C 15 นาที pH 6.8 ± 0.2 184

วิธมี าตรฐานกส�ำรหมวริทบั ยกาาศรวาิเสคตรราก์ ะาหรอ์ แาพหทายร์ 4. Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin (MKTTn) broth 4.1 Base medium Enzymatic digest of meat extract 4.3 กรมั Enzymatic digest of casein 8.6 กรัม Sodium chloride (NaCl) 2.6 กรัม Calcium carbonate (CaCO3) 38.7 กรัม Sodium thiosulfate pentahydrate 47.8 กรัม (Na2S2O3.5H2O) Ox bile for bacteriological use 4.78 กรัม Brilliant green 9.6 มลิ ลิกรมั น�ำ้ กลน่ั หรอื น้�ำกรอง 1,000 มลิ ลิลติ ร ละลายสว่ นประกอบในน�ำ้ กลนั่ หรอื น�้ำกรอง 1,000 มลิ ลิลิตร ตม้ เดอื ด 5 นาที pH 8.0 ± 0.2 4.2 Iodine-iodide solution Iodine 20 กรัม Potassium iodide (KI) 25 กรัม น�้ำกลั่นหรือน�ำ้ กรอง 100 มิลลลิ ติ ร ละลาย KI ในนำ้� กลน่ั หรอื นำ้� กรอง 10 มลิ ลลิ ติ ร จากนนั้ ใส่ iodine และเตมิ นำ้� ใหค้ รบ 100 มลิ ลลิ ติ ร เก็บในที่มืดอุณหภูมหิ ้อง 4.3 Novobiocin solution Novobiocin sodium salt 0.04 กรมั น้ำ� กล่นั หรอื น�้ำกรอง 5 มลิ ลิลิตร ละลาย Novobiocin sodium salt ในน�้ำกล่ันหรือน�้ำกรอง 5 มิลลิลิตร ท�ำให้ปราศจากเช้ือ ด้วยการกรอง เกบ็ อุณหภูมิตู้เย็น (3 ± 2°C) นาน 4 สปั ดาห์ 4.4 Complete medium เตมิ Novobiocin solution (ขอ้ 4.3) 5 มิลลลิ ติ ร ใน Base medium (ขอ้ 4.1) 1,000 มิลลลิ ติ ร ผสมใหเ้ ขา้ กนั จากนนั้ เตมิ Iodine-iodide solution (ขอ้ 4.2) 20 มลิ ลลิ ติ ร ผสมใหเ้ ขา้ กนั อกี ครง้ั เตรยี ม complete medium เมื่อใช้งาน 185

วกธิรีมมาวติทรยฐาาศนาสสำ�ตหรรก์ บั ากรแารพวทเิ คยร์ าะหอ์ าหาร 5. Nutrient agar (NA) Enzymatic digest of meat extract 3 กรัม Peptone 5 กรัม Agar 9-18* กรมั นำ�้ กล่ันหรอื น้ำ� กรอง 1,000 มิลลิลิตร ละลายสว่ นประกอบในน�ำ้ กลน่ั 1,000 มลิ ลิลิตร ใหค้ วามร้อนจน agar ละลาย ฆ่าเชอ้ื ท่ี 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 6. Rappaport-Vassiliadis broth with soya (RVS) broth 6.1 Basic medium, Solution A Enzymatic digest of soya 5 กรมั Sodium chloride 8 กรัม Potassium dihygrogen phosphate (KH2PO4) 1.4 กรัม Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 0.2 กรัม นำ�้ กลน่ั หรอื นำ้� กรอง 1,000 มลิ ลลิ ิตร ละลายส่วนประกอบในน้�ำกลั่น 1,000 มิลลิลิตร ถ้าจ�ำเป็นให้ความร้อนประมาณ 70°C เตรียม สารละลายนีใ้ นวันทเ่ี ตรียม complete medium 6.2 Solution B Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) 400 กรมั นำ้� กลนั่ หรือน�้ำกรอง 1,000 มลิ ลิลิตร ละลาย Magnesium chloride ในน�้ำกล่ันหรือน�้ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร เก็บในขวดแก้วสีชา ฝาปิดสนทิ ทอ่ี ณุ หภูมหิ ้องไดน้ าน 2 ปี 6.3 Solution C Malachite green oxalate 0.4 กรมั น้ำ� กลนั่ หรอื นำ้� กรอง 100 มลิ ลลิ ิตร ละลาย Malachite green oxalate ในน้�ำกลั่นหรือน้�ำกรอง 100 มิลลิลิตร เก็บในที่มืด อณุ หภูมิหอ้ ง ไดน้ าน 8 เดือน 6.4 Complete medium Solution A (ขอ้ 6.1) 1,000 มลิ ลิลิตร Solution B (ขอ้ 6.2) 100 มิลลลิ ิตร Solution C (ข้อ 6.3) 10 มลิ ลลิ ิตร ผสมสว่ นประกอบทั้งหมดเข้าด้วยกัน ฆ่าเช้ือที่ 115°C 15 นาที pH 5.2 ± 0.2 * ปริมาณ agar ข้ึนอยกู่ บั ความแขง็ ของว้นุ (gel strength of the agar) 186

วิธีมาตรฐานกสำ�รหมวรทิับยกาาศรวาเิสคตรรา์กะาหร์อแาพหทายร์ 7. Triple sugar iron (TSI) agar Meat extract 3 กรมั Yeast extract 3 กรมั Enzymatic digest of peptone 20 กรมั Sodium chloride (NaCl) 5 กรมั Lactose 10 กรมั Sucrose 10 กรัม Glucose 1 กรมั Iron (III) citrate 0.3 กรัม Sodium thiosulfate (Na2S2PO4) 0.3 กรัม Phenol red 0.024 กรมั Agar 9-18* กรมั น้�ำกลั่นหรือน�ำ้ กรอง 1,000 มลิ ลิลิตร ละลายส่วนประกอบในน�้ำกล่ันหรือน้�ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร ให้ความร้อนจน agar ละลายฆ่าเช้ือ ท่ี 121°C 15 นาที pH 7.4 ± 0.2 ถา่ ยใสห่ ลอดทดลอง แลว้ ปล่อยให้ agar แข็ง โดยการเอียงหลอด 8. Urea agar (Christensen) 8.1 Base medium Peptone 1 กรัม Glucose 1 กรมั Sodium chloride (NaCl) 5 กรัม Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 2 กรมั Phenol red 0.012 กรมั Agar 9-18* กรัม น้ำ� กลน่ั หรอื น�ำ้ กรอง 1,000 มลิ ลลิ ติ ร ละลายสว่ นประกอบในน�ำ้ กล่ันหรือน้�ำกรอง 1,000 มิลลลิ ิตร ให้ความรอ้ นจน agar ละลายนึง่ ฆา่ เช้ือ ท่ี 121°C 15 นาที pH 6.8 ± 0.2 * ปรมิ าณ agar ขน้ึ อยกู่ ับความแข็งของวนุ้ (gel strength of the agar) 187

วกธิรีมมาวตทิ รยฐาาศนาสสำ�ตหรรก์ บั ากรแารพวทเิ คยร์ าะห์อาหาร 8.2 Urea solution Urea 400 กรมั น�ำ้ กลน่ั หรอื นำ้� กรอง ปรบั ปริมาตรจนครบ 1,000 มลิ ลิลติ ร ละลาย Urea ในน้�ำกล่ันหรือน�้ำกรอง ปรับปริมาตรเป็น 1,000 มิลลิลิตร ท�ำให้ปราศจาก เชอื้ ดว้ ยการกรอง เก็บทอี่ ณุ หภูมิ 5 ± 3°C ไดน้ าน 1 เดือน การใช้งาน เตมิ Urea solution (ขอ้ 8.2) 50 มิลลลิ ติ ร ใน Base medium (ข้อ 8.1) 950 มิลลลิ ิตร ผสมใหเ้ ขา้ กนั โดยใช้ aseptic technique 9. Xylose lysine desoxycholate (XLD) Agar Yeast extract 3 กรมั Sodium chloride (NaCl) 5 กรมั D(+)- Xylose 3.75 กรมั Lactose 7.5 กรมั Sucrose 7.5 กรมั L(+)-Lysine hydrochloride 5 กรมั Sodium thiosulfate 6.8 กรมั Iron (III) ammonium citrate 0.8 กรมั Phenol red 0.08 กรัม Sodium deoxycholate 1 กรัม Agar 9-18* กรมั น�ำ้ กล่ันหรือน้ำ� กรอง 1,000 มิลลลิ ิตร ละลายส่วนประกอบในน้�ำกล่ันหรือน�้ำกรอง 1,000 มิลลิลิตร ให้ความร้อนจน agar ละลาย pH 7.4 ± 0.2 * ปรมิ าณของ agar ข้นึ อยู่กบั ความแขง็ ของวุ้น (gel strength of the agar) 188

วิธีมาตรฐานกสำ�รหมวริทบั ยกาาศรวาิเสคตรรา์กะาหรอ์ แาพหทายร์ สารเคมี 1. น�ำ้ เกลอื 0.85% Sodium chloride (NaCl) 8.5 กรมั นำ้� กลน่ั 1,000 มิลลลิ ิตร ละลาย Sodium chloride (NaCl) ในน้�ำกล่ัน 1,000 มิลลิลิตร ฆ่าเช้ือท่ี 121°C 15 นาที pH 7.0 ± 0.2 2. Salmonella anti-sera ใช้ชนิดสำ� เรจ็ รูป 189

กวธิรมีมาวติทรยฐาาศนาสส�ำ ตหรรก์ บั ากรแารพวทเิ คยร์ าะห์อาหาร ภาคผนวก 2 กรองตวั อยา่ ง 100 มลิ ลลิ ติ ร หรอื ปรมิ าตรทตี่ อ้ งการทดสอบ + buffered peptone water (single strength) หรอื ตวั อย่าง 100 มิลลลิ ติ ร หรือปริมาตรที่ต้องการทดสอบ + buffered peptone water (ตัวอย่างนอ้ ยกวา่ 10 มิลลลิ ติ ร ใช้ single strength ถ้ามากกว่า 10 มิลลลิ ติ ร ใช้ double strength) 36 ± 2°C 18 ± 2 ชวั่ โมง 0.1 มิลลิลติ ร 1 มิลลิลติ ร RVS broth 10 มลิ ลิลติ ร MKTTn broth 10 มลิ ลลิ ิตร 41.5 ± 1°C 24 ± 3 ชว่ั โมง 36 ± 2°C 24 ± 3 ช่วั โมง XLD agar และอาหารเลีย้ งเช้ือจำ� เพาะชนดิ แขง็ อ่นื อกี หน่งึ ชนิด 36 ± 2°C 24 ± 3 ชั่วโมง และตามคำ� แนะน�ำของผผู้ ลติ โคโลนีทมี่ ลี ักษณะเฉพาะหรือที่สงสยั เขี่ยเชอื้ จากแตล่ ะจานอาหารเลีย้ งเช้อื จำ� เพาะ ลงบนจานเพาะเชื้อ NA 36 ± 2°C 24 ± 3 ชั่วโมง ทดสอบทางชีวเคมี เกิดปฏกิ ิริยาเฉพาะ (typical reactions) ไม่เกิดปฏิกริ ยิ าเฉพาะ (typical reactions) ของ Salmonella spp. หรอื ของ Salmonella spp. ไมเ่ กดิ ปฏิกริ ยิ าเฉพาะ 1-2 ปฏิกริ ิยา presumptive Salmonella spp. ทดสอบทางนำ�้ เหลืองวิทยา รายงานผล แผนภมู ิ การตรวจหา (detection) Salmonella spp. ในน�้ำและนำ้� แขง็ 190