Standard_method_in_urine(full)

44 วธิ มี าตรฐานสําหรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพติดในปส สาวะ เลม ที่ 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 7. วิธดี �าเนนิ การ (Procedure) 7.1 นําสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวั อยา่ งวเิ คราะห์ด้วยเคร�ือง GC-MS ตามสภาวะดังน้ี Column : HP-5ms 30Mx0.25mm ID DF = 0.25 หรือเทียบเท่า Flow rate : 1.0 ml/minute He; Injection: 1 µl, split mode 1:10 MS mode : EI scan 50-300 amu. Library : NIST, Wiley, MPW2007 Oven Temperature : เร�ิมต้นไมส่ งู กวา่ 90 °C จนถงึ ไมต่ �ํากวา่ 280 °C Run time : 12 นาที ดูคา่ RT และ mass fragment ของสารมาตรฐานแตล่ ะชนิด ดังน้ี ตารางแสดงคา retention Time ( RT ) และ mass spectrum ของสารมาตรฐาน 3 ชนดิ Compound RT Mass spectrum ( m/z ) ( min ) PFPA-derivatives Q Q1 Q2 Amphetamine 4.55 190 118 91 Phentermine ( IS ) 4.67 204 132 91 Methamphetamine 5.71 204 160 118 Q = quantitation ion Q1 และ Q2 = qualifier ion-1 และ 2 7.2 ลําดบั การฉีดตวั อยา่ ง 7.2.1 ตวั ทา� ละลาย 3 เขม็ เพ่อื ตรวจสอบ baseline และ noise 7.2.2 สารละลายมาตรฐานทค่ี วามเขม้ ขน้ เท่ากับ CS4 จา� นวน 5 เข็มส�าหรับ system suitability test

วิธมี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 45 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 7.2.3 Calibration solutions ประกอบด้วย Certified drugs free urine sample, zero sample และ CS1-7 7.2.4 ตวั อย่างและ QC samples ( QCL1-2, QCM1-2, QCH1-2 ) แทรก สลบั กันไป อยา่ งสม�า่ เสมอจนครบชดุ การตรวจวิเคราะห์ 7.2.5 จ�านวนตัวอยา่ งในแตล่ ะชุดการตรวจวิเคราะหไ์ มค่ วรเกนิ 70ตัวอยา่ ง ( กา� หนดตาม autosampler stability ท ่ี 18 ช่วั โมง ) 7.2.6 กรณมี ีตวั อยา่ งเกนิ 70ตัวอย่างจะต้องเตรยี ม calibration solution และ QC sample พรอ้ มฉดี ตวั อย่างเปน็ ชดุ การฉดี ใหม่ 8. การคา� นวณและการรายงานผล ( Calculation and Report ) 8.1 Back-calculated value, %RD %RD = ( ความเข้มข้นที่ค�านวณได้จาก Curve – ความเข้มขน้ จริง ) x 100 ความเขม้ ข้นจริง 8.2 %CV; %CV = SD x 100 x 8.3 ค�านวณคา่ ความเข้มขน้ ของ Amphetamineและ Methamphetamine ดว้ ยคา่ response เทียบกบั calibration curve 8.4 การรายงานผล 8.4.1 ตวั อย่างทรี่ ายงาน “ ตรวจพบเมทแอมเฟตามนี ” ในกรณดี ังตอ่ ไปน้ี 8.4.1.1 ม ี RT และ ม ี mass spectrum ตรงกบั CS4 และสารมาตรฐาน Methamphetamine 8.4.1.2 มีพืน้ ท่ใี ต้พคี ( peak area ) ของ Methamphetamine ต้อง เทา่ กบั หรือมากกว่า CS4 ทคี่ วามเข้มขน้ 1000 ng/ml 8.4.1.3 คา� นวณผลจาก calibration curve ในหน่วย ng/ml มีคา่ เทา่ กบั หรือมากกวา่ 1000 ng/ml

46 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสูจนส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ที่ 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 8.4.2 ตวั อย่างทรี่ ายงาน “ ตรวจไมพ่ บเมทแอมเฟตามนี ” ในกรณดี ังต่อไปน้ี 8.4.2.1 ตัวอย่างท่มี ีผลการวเิ คราะหไ์ ม่เปน็ ไปตามขอ้ 8.4.1.1 8.4.2.2 ตวั อยา่ งทมี่ ผี ลการวิเคราะหเ์ ปน็ ไปตามข้อ 8.4.1.1 แตไ่ ม่เป็นไป ตามข้อ 8.4.1.2 และ 8.4.1.3 8.4.3 กรณตี รวจพบ Amphetamine ไมต่ ้องรายงานผลในใบสรุปผลการวิเคราะห์ แตค่ �านวณผลการตรวจวิเคราะห์ปริมาณ Amphetamine จาก calibration curve ในหนว่ ย ng/ml 9. การควบคุมคุณภาพและผลการทดสอบ ( Assuring the quality of test results ) 9.1 กรณีของ system suitability test พิจารณาคา่ retention time และ คา่ %CV ของ response ไม่เกนิ 10.0 % 9.2 75 % ของระดบั ความเข้มข้นท้ังหมด ( หรืออย่างน้อย 6 ระดบั ความเข้มขน้ ) บน calibration curve ตอ้ งมคี า่ back - calculated value ไมเ่ กนิ 15 % ยกเว้นที่ ระดบั ความเข้มขน้ ต�่าสดุ ให้ไม่เกนิ 20% ส�าหรบั ระดบั ความเขม้ ข้นทไี่ ม่ผ่านน้ันตอ้ ง ไมใ่ ชร่ ะดับความเข้มข้นสูงสุดหรอื ต�่าสดุ ของ calibration curve จึงจะสามารถ ตัดทิ้ง และไม่น�าไปใชใ้ นการคา� นวณค่า correlation coefficient ( r ) และสมการ เชงิ เสน้ ได้ 9.3 คา่ correlation coefficient (r) ของ calibration curve ไม่นอ้ ยกว่า 0.95 9.4 คา่ %RD ของ 4 ใน 6 ( 67 % ) QC samples ทัง้ หมด ควรมคี ่าไม่เกิน 15 % และ 2 ใน 6 ( 33 % ) QC samples ทไี่ ม่ผา่ นตอ้ งไม่ใช่ QC ample ทรี่ ะดับความ เขม้ ขน้ เดยี วกนั 9.5 กรณีที่การวเิ คราะหช์ ุดนั้นๆไมผ่ า่ นเกณฑ์การควบคุมคุณภาพ นักวเิ คราะห์จะต้อง ทา� การวิเคราะหซ์ �้าทงั้ ชุด 9.6 กรณีตัวอย่างมคี วามเขม้ ขน้ ของ Amphetamine และ Methamphetamine เกิน 4,000 ng/ml นักวิเคราะห์จะตอ้ งทา� การวเิ คราะห์ซ�้า ดว้ ยการเจอื จางตวั อยา่ งกบั Drug free urine ที่ระดับ 1 : 1 หรอื 1 : 9 หรือ 1 : 39 ตามเหมาะสม เพ่อื ใหค้ วาม เข้มข้นของสารอยใู่ นช่วงของ calibration curve คอื 100 – 4,000 ng/ml

วธิ มี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลม ท่ี 1 47 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 10. รายละเอียดอน่ื ๆ 10.1 วธิ ีนใ้ี ชส้ �าหรับตรวจหา Amphetamine และ Methamphetamine ในตวั อยา่ ง ปสั สาวะเทา่ นั้น หากน�าไปประยุกต์สา� หรับตรวจในตัวอย่างอนื่ ๆ ทีไ่ ม่ใช่ปัสสาวะ จะต้องทา� การทวนสอบ ( verify ) กอ่ น 10.2 การตรวจยืนยันดว้ ยเทคนิค GC-MS ตัวอย่างปสั สาวะควรท�าการตรวจเบอ้ื งต้น โดยใช้หลกั การภูมคิ ุ้มกนั วิทยา โดยพจิ ารณา ดงั นี้ - กรณใี ห้ผลบวกหรอื ให้ผลบวกไม่ชัดเจน ตอ้ งท�าการตรวจยนื ยนั ผลทกุ ตวั อย่าง - กรณใี ห้ผลลบ ไม่ท�าการตรวจยืนยนั ผล ยกเวน้ กรณีรอ้ งขอพเิ ศษ หรอื ต้องการทา� เพ่ือยืนยนั ผลลบ เป็นต้น 10.3 คา่ ความไวของวิธี : 100 ng/ml เมอ่ื ใช้ปสั สาวะ 3 ml 10.4 การเตรียม reagent สามารถเตรียมตามปริมาตรท่ตี อ้ งการได ้ แตค่ วามเขม้ ข้นต้อง เปน็ ไปตามทีก่ า� หนด 10.5 การเตรียมตวั อยา่ งทุกขัน้ ตอน ตลอดจนถึงการทา� derivatize ควรทา� ในวันเดยี วกัน หากจา� เป็นตอ้ งหยุดกระบวนการต้องเกบ็ ตัวอยา่ งในรูป dry extract ก่อนการทา� derivatize ในต้เู ยน็ ที่อณุ หภูมิ 2 - 8 ºC ไดไ้ มเ่ กนิ 1 วนั 10.6 ตัวอยา่ งเก็บในตเู้ ยน็ ท่ีอณุ หภูมิ 2 - 8 ºC และต้องทา� การวิเคราะห์ใหเ้ สรจ็ ส้นิ ภายใน 3 เดอื น 10.7 ควรเตรียมตวั อยา่ งให้เสร็จสน้ิ ภายใน 8 ชว่ั โมง หลังการน�าตัวอยา่ งออกจาก ต้เู ยน็ 10.8 โครมาโทแกรม การตรวจปริมาณแอมเฟตามีนและเมทแอมเฟตามีนในปัสสาวะ ด้วยเครื่องแกส๊ โครมาโทกราฟ ี - แมสสเปกโทรเมทรี

48 วธิ มี าตรฐานสําหรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย Amphetamine 190.0, 118.0, 91.0 Phentermine 204.0, 132.0, 91.0 Methamphetamine 204.0, 160.0, 118.0

วธิ ีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสจู นส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลมที่ 1 49 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 2.4 การตรวจปรมิ าณยาบ้าและยาอใี นปสสาวะดว้ ยเทคนิค Gas Chromatography - Mass Spectrometry ( GC-MS ) 1. ขอบขา ย ( Scope ) เปน็ วธิ มี าตรฐานในการปฏบิ ตั งิ านตรวจพสิ จู นย์ นื ยนั ผลหายาบา้ /ไอซ ์ (Amphetamine และ Methamphetamine) และยาอี (MDA, MDMA และ MDE) ในปัสสาวะ 2. เอกสารอ้างอิง ( Reference ) 2.1 รวมกฎหมายยาเสพตดิ พร้อมดว้ ย กฎกระทรวง ระเบยี บ ข้อบังคบั ท่ีเก่ียวขอ้ ง, สา� นกั งานปอ้ งกันและปราบปรามยาเสพติด กระทรวงยุตธิ รรม พ.ศ. ๒๕๕๒, หมายเลขเอกสารเผยแพร ่ ๑-๐๙-๒๕๕๒, ๒๖-๒๗. 2.2 ความผิดและโทษเกย่ี วกบั กฎหมายยาเสพติด, กองนติ กิ าร สา� นักงานป้องกนั และ ปราบปรามยาเสพตดิ ส�านกั นายกรฐั มนตรี, หมายเลขเอกสารเผยแพร ่ 02-07-2543; 12-16. 2.3 Anthony C Moffat, M David Osselton and Brian Widdop, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons.Third edition, Volume 2, Pharmaceuticals Press London, 2004; 1228 - 1229, 1254 - 1258. 2.4 Recommended Method for the Detection and Assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine, Amphetamine, Methamphetamine and Ring - Substituted Amphetamine Derivative in Biological Specimens, UNITED NATIONS New York, 1995; 59 - 70. 2.5 Varian. Toxicology Manual Confirmation of Drugs of Abuse in Urine with Ion - Trap GC - MS, Varian, Inc, 2001; 5 - 18.

50 วิธมี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ จู นสารเสพติดในปส สาวะ เลมที่ 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 3. หลักการ ( Principle ) ยาบ้า (Methamphetamine และ Amphetamine) และยาอี (MDA MDMA และ MDE) จดั อยใู่ นกลมุ่ Phenethylamines ซง่ึ มสี ตู รโครงสรา้ งคลา้ ยกนั การตรวจแยกดว้ ย หลกั การ TLC ใน บาง system ไมส่ ามารถแยกออกจากกนั ไดอ้ ยา่ งชดั เจน นอกจากนเ้ี ทคนคิ นจ้ี ะใหผ้ ลไมช่ ดั เจนกรณที ี่ มสี ารในปรมิ าณตา�่ ๆ หรอื ใกลค้ า่ cut off การตรวจดว้ ย GC-MS จะมลี กั ษณะการแยกสารในรปู แบบ เดยี วกัน ดังนัน้ การท�าปฏกิ ริ ยิ ากับสารอนพุ ันธุ ์ TFA หรอื PFPA จะเข้าไปแทนทไ่ี ฮโดรเจนของเอมนี (Amine) เพ่มิ ความจา� เพาะเจาะจงและเพ่มิ ความไว (selectivity และ sensitivity) และการตรวจ ดว้ ย GC-MS ยงั สามารถตรวจวัดสารในปรมิ าณต�า่ ๆ ได ้ ดงั น้ันจงึ สามารถตรวจพบ Amphetamine และ MDA ซึ่งเปน็ metabolite ของ Methamphetamine และ MDMA ตามล�าดับ ได้ ซ่งึ ไม่ สามารถตรวจพบได้ด้วยเทคนคิ TLC เพอ่ื เพ่มิ ความมัน่ ใจในการรายงานผล การแยกสารดังกลา่ วโดยอาศัยหลักการ GC-MS ซึ่งอาศยั หลกั การแยกสารผสมออกจากกัน โดยอาศัยคุณสมบัติความสามารถในการกลายเป็นไอ การละลาย และการดูดซับท่ีแตกต่างกันของ สารแตล่ ะชนิดในคอลัมน ์ ในอณุ หภมู ิและเวลาทต่ี า่ งกนั โดยใช้เคร่ือง gas chromatography แล้วใช้ mass spectrometry ในการท�าให้สารทแ่ี ยกไดแ้ ตกตัวเป็นไอออน ( ion fragment ) แล้วศกึ ษา รปู แบบการแตกตวั ของสารนนั้ ๆ เทยี บกบั สารมาตรฐานทเ่ี ตรยี มขนึ้ เอง หรอื ฐานขอ้ มลู ใน software ของเคร่อื ง MS database เชน่ Wiley07 หรือ NIST05 การหาปรมิ าณสารจะขน้ึ กบั ความสงู ของพีค (peak abundance) และพน้ื ทใี่ ตพ้ คี ( peak area ) เปรยี บเทยี บกบั ความสงู พคี หรอื พน้ื ทใ่ี ตพ้ คี ของ สารมาตรฐาน

วธิ ีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ จู นสารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 51 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 4. เคร่ืองมือ และอุปกรณ์ ( Apparatus ) 4.1 เครื่องมือ 4.1.1 เครอ่ื งช่ังละเอยี ด ( analytical balance ) ชนดิ ทศนิยมไม่นอ้ ยกว่า 4 ต�าแหนง่ 4.1.2 เครือ่ งผสมนา�้ ยาแบบหมนุ วน ( vortex mixer ) หรือ เครอ่ื งเขย่า ( shaker ) 4.1.3 เครื่องปนั หมนุ เหวีย่ งความเรว็ ไมน่ ้อยกวา่ 2,000 รอบตอ่ นาที 4.1.4 เครอ่ื ง evaporator with nitrogen พรอ้ ม needle 4.1.5 เครอ่ื ง heating block พรอ้ ม เทอรโ์ มมเิ ตอร์ 4.1.6 เครอ่ื ง vacuum manifold 4.1.7 เครอ่ื ง vacuum pump 4.2 เครอื่ งแก้วและอุปกรณ ์ 4.2.1 micropipette และ micropipette tips ขนาด 50-200 µl และ 1-5 ml 4.2.2 positive auto - pipetteและpipette tips ขนาด 10, 50, 100, 250, 1000 µl 4.2.3 solid phase extraction ( SPE ) ชนิด OASIS HLP cartridge 3 ml / 60 mg หรอื เทยี บเท่า 4.2.4 pH paper rang 0 - 14

52 วิธมี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปส สาวะ เลมที่ 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 5. สารเคมี ( Reagent ) 5.1 ชนิด AR grade 5.1.1 Ammonium hydroxide 5.1.2 Ethyl acetate 5.1.3 Methanol 5.1.4 Pentafluoropropionic anhydride ( PFPA ) 5.1.5 Phosphoric acid 5.1.6 Trifluoroacetic acid anhydrous ( TFA ) 5.1.7 Distilled Water type II 5.2 ชนิด HPLC grade 5.2.1 Ethyl acetate 5.2.2 Methanol 5.3 สารมาตรฐาน ( Standard ) มใี บรับรองผลการตรวจวเิ คราะห ์ ( certificate of analysis; COA ) มีความบริสุทธม์ิ ากวา่ 98% as is หรือเทียบเท่า 5.3.1 Amphetamine Sulfate หรอื Amphetamine hydrochloride ( A ) 5.3.2 Methamphetamine hydrochloride ( M ) 5.3.3 MDA hydrochloride 5.3.4 MDMA hydrochloride 5.3.5 MDE hydrochloride 5.3.6 Phentermine hydrochloride 5.3.7 Ephedrine hydrochloride ( EP ) ( กรณีทจี่ �าเป็น ) 5.3.8 Pseudoephedrine hydrochloride ( PE ) ( กรณที จี่ า� เป็น )

วธิ ีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพิสูจนส ารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 53 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 6. การเตรยี มตัวอยาง ( Preparation of test sample ) 6.1 การเตรียมสารเคมี 6.1.1 2 % Ammonium hydroxide  ตวง 40 ml 25 % Ammonium hydroxide ใสล่ งในขวดปรับปริมาตร ขนาด 500 ml ทีม่ นี ้�ากรองอยู่ประมาณ 2 ใน 3 ของขวด  เขยา่ ขวดเบาๆ ปรับปริมาตรเป็นดว้ ยนา้� กรอง  เกบ็ ไวใ้ นขวดแกว้ ทอี่ ุณหภมู หิ อ้ ง 6.1.2 4 % Phosphoric acid  ดดู 4.7 ml 85 % Phosphoric acid ใสล่ งในขวดปรับปรมิ าตรขนาด 100 ml ที่มนี า้� กรองอย่ปู ระมาณ 2 ใน 3 ของขวด  เขยา่ ขวดเบาๆ ปรบั ปรมิ าตรเป็นดว้ ยนา�้ กรอง  เก็บไว้ในขวดแกว้ ที่อณุ หภูมิหอ้ ง 6.1.3 5 % Methanol in 2 % Ammonia  ดดู 5 ml 100% Methanol ใส่ลงในขวดปรับปรมิ าตรขนาด 100 ml ปรับปรมิ าตรด้วย 2 % Ammonium hydroxide  เก็บไวใ้ นขวดแกว้ ทีอ่ ณุ หภมู หิ อ้ ง 6.1.4 20% Methanol in 2% Ammonia  ดูด 20 ml 100% Methanol ปรับปรมิ าตรดว้ ย 2% Ammonium hydroxide ปรบั ปริมาตรเป็น 500 ml ด้วยนา�้ กรอง  เก็บไว้ในขวดแกว้ ที่อณุ หภมู หิ ้อง หมายเหตุ สารละลายทเ่ี ตรียมข้นึ เอง มีอายกุ ารใชง าน ไมเ กิน 2 ป หรอื เมือ่ พบ วา มลี กั ษณะทางกายภาพและทางเคมีเปลย่ี นแปลง

54 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ จู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลมที่ 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 6.2 การเตรียมสารมาตรฐาน 6.2.1 Stock standard: เตรียมสารละลายมาตรฐานความเขม้ ขน้ ชนดิ ละ 1 mg/ml ใน Methanol HLPC grade ดังนี้ 1) กลมุ่ ยาบ้า ได้แก ่ Amphetamine Methamphetamine 2) กลมุ่ ยาอ ี ไดแ้ ก ่ MDA, MDMA, MDE 3) Internal standard ได้แก่ Phentermine 4) กลุม่ สารรบกวน ( interferences ) ( ในกรณีที่จ�าเป็น ) เช่น Ephedrine Pseudoephedrine 6.2.2 Working standard Mix - 1 ( WS1 - 100 ) : เตรียมสารละลายมาตรฐาน เจอื จาง จากขอ้ 6.2.1 ความเข้มข้นชนิดละ 100 µg/ml ใน Methanol ( HLPC grade )  ดูดสารละลายมาตรฐาน 1 mg/ml ( โดยเตรยี มตามกล่มุ ที่ตอ้ งตรวจ วเิ คราะห ์ ) ชนดิ ละ 1 ml ใส ่ volumetric flask ขนาด 10 ml ปรบั ปริมาตรดว้ ย Methanol จะไดส้ ารละลายมาตรฐาน 100 µg/ml 6.2.3 Working standard Mix - 2 ( WS2 - 10 ) : เตรยี มสารละลายมาตรฐาน เจอื จางจากข้อ 6.2.1 ความเขม้ ขน้ ชนิดละ 10 µg/ml ใน Methanol ( HLPC grade )  ดูดสารละลายมาตรฐาน 100 µg/ml ( โดยเตรียมตามกลมุ่ ท่ีต้องตรวจ วิเคราะห์ ) ชนดิ ละ 1 ml ใส ่ volumetric flask ขนาด 10 ml ปรับ ปริมาตรดว้ ย Methanol จะไดส้ ารละลายมาตรฐาน 10 µg/ml 6.3 เตรยี ม QC sample และ positive control 6.3.1 เตรยี ม reference standard no urine ( S ) : สา� หรบั ฉดี หาตา� แหน่ง retention time และ reference spectra  ดดู สารละลายมาตรฐาน working standard mix - 1 ( high ) 100 µg/ml 15 µl เปา แห้งด้วย N2 นา� ไปทา� derivatize ตามข้อ 6.6.7 6.3.2 Negative control ( NC ) a. Certified drugs free urine b. ปสั สาวะของผทู้ ี่ไมไ่ ดร้ บั ประทานยาใดๆ ต่อเนอื่ งกันอย่างนอ้ ย 5 วัน ในวนั ทีเ่ กบ็ ปัสสาวะ

วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสจู นส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลมท่ี 1 55 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 6.3.3 Positive control (PC) เตรยี ม spiked urine ทีค่ วามเข้มข้นในช่วง 0 ถงึ 5000 ng/ml โดย ให้ครอบคลุมคา่ สงู กลาง ต�่า ของคา่ cut off เช่น 0, 100, 250, 500, 1000, 2000, 3000 ng/ml level ละ 1 ml โดยมี Phentermine เปน็ internal standard ดงั ตารางตอ่ ไปนี้ วิธีเตรียม QC sample spikueridne1 ml volWumS(µe2l-)t1a0ken voWluSm(1µe-l1)ta0k0en vo(lPu1hm0ee0ntItueSagrkm/eminnle(µ) l) Ac(mongnpc/hmfeeinnltaautrlmraintiineoe)ns S 100 0 10 - NC 0 0 10 0 PC 1 10 0 10 100 PC 2 25 0 10 250 PC 3 50 0 10 500 PC 4 100 0 10 1000 PC 5 0 20 10 2000 PC 6 0 25 10 2500 PC 7 0 30 10 3000 Sample (s) 0 0 10 X หมายเหตุ 1. reference standard no urine ( S ) มคี ่าความเข้มข้นของสารเทยี บเทา่ สาร เปา้ หมายท ่ี cut off เมื่อใชป้ สั สาวะ 3 ml 2. PC 1 – PC 7 ความเข้มขน้ อยู่ในช่วง -10 ถงึ 500 % ของค่า cut off, และต้อง ม ี level ทีค่ า่ cut off เสมอ

56 วิธีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสูจนสารเสพตดิ ในปสสาวะ เลมที่ 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 3. PC ส�าหรับท�า calibration curve ตอ้ งมที ค่ี วามเขม้ ข้นที่ค่า cut off เสมอ และ มีความเข้มข้นอื่นๆ ครอบคลมุ ค่าสูง กลาง ต�่า ของคา่ cut off 4. PC ส�าหรบั เปน็ QC sample ต้องมคี ่าทีแ่ ตกต่างจากตวั อยา่ งทท่ี า� calibration curve 6.4 เตรยี มวสั ด/ุ อุปกรณ์ 6.4.1 น�าตวั อย่างปสั สาวะออกจากตูเ้ ยน็ วางไว้ใหเ้ ยน็ ทอี่ ณุ หภูมิหอ้ งก่อนท�าการ วิเคราะห์ 6.4.2 เขยี นรหสั ตัวอยา่ งปสั สาวะหรอื เลขที่ตัวอยา่ งและ QC sample บนวัสด ุ อุปกรณท์ ตี่ อ้ งใช ้ เช่น test tube, SPE cartridge, vial ขนาด 2 ml เป็นตน้ 6.4.3 เปดเคร่ือง heating block ตั้งอณุ หภมู ปิ ระมาณ 65 ºC โดยใสเ่ ทอร์โมมเิ ตอร์ ไวช้ ่องสา� หรับใสเ่ ทอรโ์ มมเิ ตอร์ 6.5 การเตรียมตัวอย่าง (pretreatment) 6.5.1 ดดู ตัวอยา่ งปัสสาวะ/negative control/positive control/QC sample 1 ml ใสใ่ น test tube 6.5.2 เติม internal standard Phentermine 100 µg/ml 10 µl 6.5.3 เตมิ 1 ml 4 % H3PO4 เขยา่ บน vortex mixer ประมาณ 1 นาที 6.6 การสกัดตัวอย่าง (extraction) ใช้สารเคมชี นิด AR gradeมีขนั้ ตอนดังนี้ 6.6.1 condition column - เติม 2 ml 100% Methanol - เตมิ 2 ml นา�้ กรอง 6.6.2 load sample เทตวั อย่าง / QC Sample / positive control และ negative control ปลอ่ ยให้ไหลจนหมด หรือถ้าไม่ไหลใหเ้ ปด vacuum pump โดยให้ไหล ประมาณ 1 - 2 ml / 1 นาท ี 6.6.3 wash column - เตมิ 2 ml 5 % Methanol - เตมิ 2 ml 20 % Methanol in 2 % Ammonium hydroxide - เตมิ 3 ml 100 % Methanol

วิธีมาตรฐานสําหรับการตรวจพิสจู นสารเสพติดในปสสาวะ เลม ท่ี 1 57 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 6.6.4 dry column - เปา column ใหแ้ หง้ ดว้ ย N2 ประมาณ 5 นาที 6.6.5 elute sample - เตมิ 1.5 ml 100% Methanol ปลอ่ ยใหไ้ หลจนหมด - Elute ซ�้าดว้ ย 0.5 ml 100% Methanol 6.6.6 dry column และ concentrate sample - น�าตัวอย่างท ่ี elute ไประเหยใหแ้ ห้งดว้ ย N2 6.6.7 derivatization (เลือก 1 วธิ )ี น�าตัวอยา่ งจากขอ้ 6.6.6 1) TFA-Derivative  เตมิ Ethyl acetate ( HPLC grade ) 50 µl และ TFA 50 µl ปดจกุ tube แล้วพันทบั ดว้ ย paraffin เพื่อปอ้ งกนั การขยายตัวของสารจาก ความรอ้ น นา� ไป heat บน heating block ท ่ี 65 ºC เปน็ เวลา 25 นาท ี แลว้ นา� ออกจาก heating block ตั้งไว้ให้เยน็ ถา่ ยใส ่ vial ขนาด 2 ml ที่มขี นาด 200 µl อย่ภู ายใน 2) PFPA-Derivative  เติม Ethyl acetate (HPLC grade) 50 µl และ PFPA 50 µl ปด จกุ Tube แล้วพนั ทบั ดว้ ย paraffin เพ่ือป้องกันการขยายตัวของสารจาก ความรอ้ น นา� ไป heat บน heating block ที ่ 65 ºC เป็นเวลา 25 นาที แล้วนา� ออกจาก heating block ตั้งไวใ้ ห้เยน็ ถา่ ยใส่ vial ขนาด 2 ml ท่มี ี insert ขนาด 200 µl อย่ภู ายใน

58 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปส สาวะ เลม ท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 7. วิธดี า� เนนิ การ ( Procedure ) 7.1 นา� ตวั อย่างทส่ี กัดไดไ้ ปวเิ คราะห์ด้วยเคร่อื ง GC-MS โดยสภาวะของเครื่อง ดงั นี้ Column : HP-5 ms 30 M x 0.25 mm ID DF = 0.25 หรอื เทียบเทา่ Flow rate : 1.0 ml / minute He; Injection: 1 µl, split mode MS mode : EI scan 50-300 amu หรือกว้างกวา่ Library : NIST, Wiley, MPW2007 Oven temperature : เรม่ิ ต้นไม่สงู กว่า 90 °C จนถงึ ไมต่ �่ากวา่ 280 °C program oven temperature สามารถปรับเปลีย่ นได ้ เพอื่ ความเหมาะสมใน การแยก แต่ต้องให้ครอบคลมุ อณุ หภูมิท่สี ารออกจากคอลัมน์ 7.2 Detection & identification 7.2.1 ดูค่า RT และ mass spectrum ของสารมาตรฐานแต่ละชนดิ ดังนี้ ตารางแสดงคา retention time (RT) และ mass spectrum ของสารมาตรฐาน 8 ชนิด mass spectrum (m/z) RT* compound RT* mass spectrum (m/z) TFA-derivatives Order Order PFPA-derivatives Q Q1 Q2 Amphetamine Q Q1 Q2 140 118 91 1 1 190 118 91 154 132 91 2 Phentermine (IS) 2 204 132 91 154 110 69 3 Ephedrine 3 204 160 119 154 118 110 4 Methamphetamine 4 204 118 110 154 110 69 5 Pseudoephedrine 5 204 160 119 135 162 77 6 MDA 6 135 162 119 154 162 135 7 MDMA 7 204 162 160 168 162 140 8 MDE 8 218 190 162

วธิ ีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพิสจู นสารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 59 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย Q = quantitation ionQ1 และ Q2 = qualifier ion-1 และ 2 * ค่า RT อาจมกี ารเปลี่ยนแปลง ข้นึ อยู่กบั ความยาวของคอลัมนแ์ ละ qven temperature ท่ีใช้ แต่ใหถ้ อื ล�าดบั RT ตามตารางดงั แสดงในตารางน้ี 7.2.2 ดคู ่า RT และ mass spectrum ของตัวอยา่ งเทียบกบั positive control และสารมาตรฐาน ตามตารางในข้อ 7.2.1 8. การค�านวณและการรายงานผล (Calculation and report) 8.1 การรายงานผล 8.1.1 กรณยี าบ้า 8.1.1.1 ตวั อยา่ งทรี่ ายงาน “ ตรวจพบเมทแอมเฟตามีน ” ตอ้ งมลี กั ษณะดงั น้ี 8.1.1.1.1 ม ี RT และ มี mass spectrum ตรงกับ positive control และสารมาตรฐาน Methamphetamine 8.1.1.1.2 มีพน้ื ทใ่ี ต้พคี (peak area) Methamphetamine ตอ้ งเทา่ กับหรอื มากกวา่ positive control ทค่ี วาม เข้มข้น 1000 ng/ml 8.1.1.1.3 คา� นวณผลจาก calibration curve มีคา่ เทา่ กบั หรือ มากกวา่ 1000 ng/ml 8.1.1.2 ตัวอยา่ งที่รายงาน “ ตรวจไม่พบเมทแอมเฟตามนี ” ตอ้ งมลี กั ษณะดังนี้ 8.1.1.2.1 ตัวอยา่ งท่มี ีลักษณะไมเ่ ป็นไปตามข้อ 8.1.1.1.1 8.1.1.2.2 ตัวอยา่ งท่ีมีลกั ษณะเป็นไปตามข้อ8.1.1.1.1 แต่ไม่เป็น ไปตามขอ้ 8.1.1.1.2 และ 8.1.1.1.3

60 วธิ มี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ ูจนส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 8.1.2 กรณียาอี 8.1.2.1 ตวั อย่างทร่ี ายงาน “ ตรวจพบยาอ ี ” ใหร้ ายงานตามชนิดของสาร ออกฤทธ์สิ า� คัญทพ่ี บ ไดแ้ ก่ “ ตรวจพบ3,4-เมทลิ ลีนไดออกซีเมทแอมเฟตามีน ( เอ็มดีเอ็มเอ, MDMA ) ” “ ตรวจพบ เมทิลลีนไดออกซีแอมเฟตามีน ( เอ็มดีเอม, MDA ) ” “ ตรวจพบ เอ็น เอทิล เอ็มดีเอ หรอื เอม็ ดอี ี ( เอ็มดีอ,ี MDE ) ” ตอ้ งมีลักษณะ ดงั น้ี 8.1.2.1.1 มี RT และ ม ี mass spectrum ตรงกบั positive control และสารมาตรฐาน ยาอี 8.1.2.1.2 มีพน้ื ทีใ่ ตพ้ ีค ( peak area ) ของยาอ ี ต้องเท่ากบั หรือ มากกว่า positive control ทีค่ วามเข้มข้น 1000 ng/ml 8.1.2.1.3 ค�านวณผลจาก calibration curve มีคา่ เท่ากับหรอื มากกวา่ 1000 ng/ml 8.1.2.2 ตวั อย่างทร่ี ายงาน “ ตรวจไม่พบยาอ ี ” 3, 4-Methylenedioxymethampheta-mine, 3, 4-Methylenedioxeneamphetamine และ 3, 4-Methylenedioxe-neethamphe ต้องมีลักษณะ ดังนี้ 8.1.2.2.1 ตวั อยา่ งทม่ี ลี กั ษณะไม่เป็นไปตามข้อ 8.1.2.1.1 8.1.2.2.2 ตัวอย่างทมี่ ีลักษณะเปน็ ไปตามขอ้ 8.1.2.1.1 แตไ่ ม่เปน็ ไปตามข้อ 8.1.2.1.2 และ 8.1.2.1.3

วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ ูจนสารเสพตดิ ในปสสาวะ เลมท่ี 1 61 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 9. การควบคมุ คณุ ภาพและผลการทดสอบ ( Assuring the quality of test results ) 9.1 ต้องทา� การตรวจวเิ คราะห ์ negative control และ positive control ด้วยทกุ ครัง้ 10. รายละเอยี ดอ่นื ๆ 10.1 การตรวจยืนยนั ดว้ ยเทคนิค GC-MS ตัวอย่างปสั สาวะควรทา� การตรวจเบอื้ งต้น โดยใช้ชดุ ทดสอบหลักการภมู คิ ้มุ กันวทิ ยา (rapid test kit) โดยพิจารณา ดงั นี้ - กรณใี หผ้ ลบวกหรอื ให้ผลบวกไมช่ ัดเจน ต้องทา� การตรวจยืนยันผลทุกตวั อยา่ ง - กรณใี หผ้ ลลบ จะท�าการตรวจยืนยนั ผลหรือไมก่ ็ได ้ ข้นึ อยกู่ บั ดุลพนิ ิจของหัวหนา้ ห้องปฏิบตั กิ าร เชน่ กรณรี ้องขอพเิ ศษ หรือ ตอ้ งการทา� เพือ่ ยนื ยันผลลบ เป็นต้น 10.2 ปจั จบุ นั ยาบ้า / ไอซท์ ี่แพรร่ ะบาดในประเทศไทย คอื Methamphetamine ส่วนยาอี คอื MDMA, MDA, MDE ดังน้นั การรายงานผลการวเิ คราะหใ์ นกรณีที่ เป็นยาบา้ / ไอซ์ ใหเ้ ป็นไปตามขอ้ 8.2.1 และ 8.2.2 สา� หรบั ยาอ ี ให้เปน็ ไปตาม ขอ้ 8.2.3 และ 8.2.4 10.3 ความไวของวิธี 250 µg/ml เม่อื ใชป้ ัสสาวะ 1 ml 10.4 โครมาโตแกรมการตรวจปริมาณยาบ้าและยาอใี นปสั สาวะดว้ ยวธิ ี Chromatography - Mass Spectrometry ( GC - MS )

62 วธิ มี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 2.5 การตรวจปริมาณสารกลุม แอมเฟตามีนส์และเอค ซต์ าซีในปสสาวะ ดว้ ยเทคนคิ Liquid Chromatography – Massspectrometry ( LC-MS ) 1. ขอบขาย ( Scope ) เป็นวธิ ีมาตรฐาน ในการปฏิบตั งิ านตรวจพิสจู น์ยืนยนั ผลหา Amphetamine, Metham- phetamine, 3,4-Methylenedioxymethamphetamine 3,4- Methylenedioxeneamphe -tamine และ 3,4-Methylenedioxeneethamphe ในปัสสาวะด้วยเทคนิคการสกดั ด้วยวฎั ภาค ของแข็งแบบออนไลน์และลิควิดโครมาโทกราฟี -แมสสเปกโทรเมทรี ที�ระดบั ความเข้มข้น 200 ng/ml ขนึ � ไป 2. เอกสารอา้ งองิ ( Reference ) 2.1 รวมกฎหมายยาเสพตดิ พร้อมด้วย กฎกระทรวง ระเบยี บ ข้อบงั คบั ทีเ่ ก่ยี วขอ้ ง ส�านักงาน ป.ป.ส กระทรวงยตุ ธิ รรม พ.ศ. 2552 หมายเลขเอกสารเผยแพร ่ 1-09-2552, 26-27 2.2 Anthony C Moffat, M David Osselton and Brian Widdop, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons.Third edition, Volume 1, Pharmaceuticals Press London, 2004. 2.3 Recommended Method for Testing Amphetamine in Urine, Recommended Method for Testing for Phenethylamine: Manual for identification of Abuse Drugs 2nd Edition, March, 1998 Narcotics Divition, pharmaceutical and Medical Safety Bureau, Ministry of Health and Welfare, Japan. 3. หลกั การ ( Principle ) สารเสพติดท่ีมีโครงสร้างโมเลกุลพ้ืนฐานเป็น Phenethylamine คือกลุ่มแอมเฟตามีน (Amphetamine type-stimulant: ATS) หมายรวมถงึ Amphetamine Methamphetamine และ กลุ่ม Ectacy ประกอบด้วย 3,4Methylenedioxymeth amphetamine 3,4- Methylenedioxeneamphetamine และ 3,4-Methylenedioxeneethamphe สารกลุ่มน้อี อก ฤทธติ์ อ่ รา่ งกายโดยกระตนุ้ ระบบประสาทสว่ นกลางใหม้ กี ารหลงั่ หรอื การดงึ กลบั ของสารสอ่ื ประสาท 3 ชนิดคือ serotonin dopamine และ norephedrine เป็นผลให้ผู้ใชเ้ กิดความรู้สกึ เปน็ สุข ความ พอใจ อาจมากจนท�าใหเ้ คล้มิ ฝนั และมอี าการประสาทหลอน หวาดระแวงได ้ ผู้เสพสามารถเปลยี่ น

วธิ มี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ ูจนสารเสพติดในปสสาวะ เลม ท่ี 1 63 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย ตวั ยาเสพไดใ้ นกรณที ไี่ มส่ ามารถเขา้ ถงึ ตวั ยาเสพประจา� หรอื เสพสารเสพตดิ รวมกนั หลายชนดิ ทา� ให้ ยาเสพตดิ แพรก่ ระจายอยา่ งรวดเรว็ และยงั เปน็ สาเหตขุ องปญั หาทางสงั คมอยา่ งตอ่ เนอ่ื งในระดบั โลก ตารางแสดงโครงสรา้ งโมเลกลุ ชอ่ื ทวั่ ไป และสารทส่ี ามารถตรวจพบได้ในปสสาวะ Amphetamine Methamphetamine 3,4-Methylenedioxymethamphetamine 3,4- Methylenedioxene- amphetamine และ 3,4- Methylenedioxeneethamphetamine ชนดิ ของยา โครงสรา้ งโมเลกุล ช่อื ท่วั ไป สารเป้าหมายท่ตี รวจใน ปัสสาวะ Amphetamine Speed, whiz, goey, Amphetamine Methamphetamine uppers, louee, (20-30% of the dose) dexies, pep pills 3,4- Methylenedioxy Meth, speed, whiz, Unchanged drug methamphet- fast, uppers, goey, ( MA 44 % ) amine 3,4- louee Its major metabolites Methylenedioxen- Amphetamine(6-20%) eamphetamine 3,4- XTC, X, ecstasy, Unchanged drug Methylenediox- Adam, M & M, ( MDMA ) eneethamphet- eccy, E, go, Scooby amine Love bug, crystal, Unchanged drug P, ( MDA ) window pane Eve Unchanged drug ( MDEA ) การตรวจพิสูจน์หาปริมาณ Amphetamine, Methamphetamine,3,4 Methylene- dioxymeth amphetamine, 3,4-Methylenedioxeneamphetamine และ 3,4-Methylenedioxeneethamphe tamineในปัสสาวะด้วยระบบ การสกดั ดว้ ยวัฎภาคของแขง็ แบบออนไลนแ์ ละลคิ วดิ โครมาโทกราฟ-ี แมสสเปกโทรเมทร ี ตวั อยา่ งจะถกู ทา� ใหแ้ ยกออกจากกนั ดว้ ย คอลัมน์ โดยใชข้ องเหลวเป็นตวั พาจากนน้ั สารจะถูกตรวจวัดด้วยเครื่องแมสสเปกโทรมเิ ตอร์ เทียบ กบั สารมาตรฐานท่ีเตรยี มขึ้น

64 วธิ ีมาตรฐานสําหรับการตรวจพิสูจนสารเสพติดในปส สาวะ เลมที่ 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 4. เครอื่ งมือ และอุปกรณ์ ( Apparatus ) 4.1 เคร่อื งมือ 4.1.1 เครื่องชัง่ ละเอียด (analytical balance) ชนดิ ทศนยิ มไม่นอ้ ยกวา่ 4 ต�าแหนง่ 4.1.2 เครือ่ งปัน หมนุ เหวยี่ งความเร็วไมต่ ่�ากว่า 2,000 รอบตอ่ นาที 4.1.3 เครอ่ื งลคิ วิดโครมาโทกราฟ-แมสสเปกโทรมิเตอร์ 4.1.4 LC column - acclaim Trinity P1 3 µm 3.0 x 100 mm 4.1.5 SPE Dionex SolEX HRP Cartridge 2.1 x 20 mm 4.2 เครื่องแก้วและอุปกรณ์ 4.2.1 micropipette และ micropipette tips ขนาด 100-1000 µl 4.2.2 positive auto-pipette และ pipette tips ขนาด 50, 1000 µl 4.2.3 ขวดวัดปรมิ าตร (volumetric flask) ขนาด 2, 1000 ml 4.2.4 กระดาษกรองชนดิ nylon ขนาดรูพรนุ 0.2 µl 4.2.5 micro centrifuge tube ขนาด 1.5 ml 5. สารเคมี ( Reagent ) 5.1 สารเคมีทั่วไป 5.1.1 Acetonitrile ( HPLC grade) 5.1.2 Ammonium formate 5.1.3 Formic acid 99 % 5.1.3 Methanol 5.1.4 Distilled water (type I) 5.2 สารมาตรฐาน มใี บรบั รองผลการตรวจวเิ คราะห ์ ( Certificate of analysis; COA ) มคี วามบริสทุ ธ์ิ มากกว่า 98% as is หรือเทยี บเท่า

วิธีมาตรฐานสําหรับการตรวจพสิ ูจนส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ท่ี 1 65 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 5.2.1 Amphetamine sulfate 5.2.2 Methamphetamine hydrochloride 5.2.3 3,4-methylenedioxy Amphetamine hydrochloride 5.2.4 3,4-methylenedioxy Methamphetamine hydrochloride 5.2.5 3,4-methylenedioxy Ethylamphetamine hydrochloride 5.2.6 Phentermine hydrochloride 6. การเตรยี มตวั อยา ง ( Preparation of test sample ) 6.1 การเตรียมวฏั ภาคเคลอ่ื นท ่ี ( mobile phase ) 6.1.1 Stock 1.0M Ammonium formate ระยะเวลาการเก็บรกั ษา 3 เดือน เกบ็ ไว้ในตู้เย็น 2 - 8 ºC - ชั่ง Ammonium formate 12.612 g ใสบ่ ีกเกอร์ขนาด 100 ml - ละลาย Ammonium formate ดว้ ยน้�าปรมิ าณ 30 ml เทใสข่ วดวัดปริมาตร ขนาด 200 ml ท�าซ�า้ 3 รอบ - ปรบั ปริมาตรดว้ ยนา�้ กรองจนได้ 200 ml 6.1.2 50mM Ammonium formate pH 4.0 ระยะเวลาการเก็บรกั ษา 1 เดอื น - ปเ ปต 1.0M Ammonium formate ปริมาตร 10 ml ใส่ขวดวดั ปริมาตร ขนาด 200 ml ปรับปรมิ าตรดว้ ยน�้ากรอง - ปรับ pH เปน็ 4.0 ดว้ ย Formic acid - กรองผ่านกระดาษกรองชนดิ nylon ขนาดรูพรนุ 0.2 um 6.1.3 0.15% Hetafluorobutyric acid in water ระยะเวลาการเกบ็ รักษา 1 เดือน - ตวงน้า� กรองปรมิ าตร 1000 ดว้ ยกระบอกตวง เทใส่บีกเกอร์ขนาด 1000 ml ประมาณ 500 ml - ปเ ปต Hetafluorobutyric acid 1.5 ml ลงในบกี เกอรท์ ่ีบรรจุน้�ากรอง - เทนา้� ท่ีเหลอื ทัง้ หมดลงไปผสม คนดว้ ยแทง่ แก้ว - กรองผ่านกระดาษกรองชนิด nylon ขนาดรพู รุน 0.2 µm 6.1.4 Distilled water (type I) กรองผา่ นกระดาษกรองชนดิ nylon ขนาดรพู รนุ 0.2 µm 6.1.5 Acetonitrile กรองผา่ นกระดาษกรองชนดิ nylon ขนาดรพู รนุ 0.2 µm

66 วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพิสูจนส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 6.2 การเตรยี มสารมาตรฐาน ( standard preparation ) 6.2.1 Stock standard solution  Methamphetamine (M) standard solution Stock solution ( M_S2000 ) : ชั่งสารมาตรฐาน Methamphetamine hydrochloride ใหม้ นี า�้ หนกั 12.432 ± 0.050 mg (12.432 – 12.382 mg) ลงในขวดวดั ปริมาตรขนาด 5 ml ปรับปรมิ าตรด้วย Methanol ( HPLC grade )  Amphetamine (Am) standard solution Stock solution ( A_S2000 ) : ชงั่ สารมาตรฐาน Amphetamine sulfate ให้มนี �า้ หนกั 13.656 ± 0.050 mg ( 13.706 – 13.606 mg ) ลงในขวดวัด ปริมาตรขนาด 5 ml ปรบั ปรมิ าตรดว้ ย Methanol ( HPLC grade )  Methylenedioxy-methamphetamine ( MDMA ) standard solution Stock solution ( MDMA_S2000 ) : ชงั่ สารมาตรฐาน 3,4-methylenedioxy Methamphetamine hydrochloride ใหม้ ีน้า� หนัก 12.010 ± 0.050 mg ( 12.060 - 11.960 mg ) ลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 5 ml ปรับปริมาตร ดว้ ย Methanol ( HPLC grade )  Methylenedioxy-amphetamine (MDA) standard solution Stock solution (MDA_S1000): ช่งั สารมาตรฐาน 3,4-methylenedioxy amphetamine hydrochloride ใหม้ ีน�้าหนกั 12.012 ± 0.050 mg ( 12.062 - 11.962 mg ) ลงในขวดวดั ปริมาตรขนาด 5 ml ปรบั ปรมิ าตร ด้วย Methanol ( HPLC grade )  Methylenedioxy-ethylamphetamine (MDEA) standard solution Stock solution (MDEA_S1000): ชงั่ สารมาตรฐาน 3,4-methylenedioxy ethylamphetamine hydrochloride ให้มนี �้าหนกั 11.756 ± 0.050 mg ( 11.806 – 11.706 mg ) ลงในขวดวดั ปริมาตรขนาด 5 ml ปรบั ปริมาตร ด้วย Methanol ( HPLC grade )  Mixed Std-200 stock solution : ปเปต 2 ml ของ A_S2000 M_S2000 MDMA_S2000 MDA_S2000 MDEA_S2000 ใสใ่ นขวดวดั ปรมิ าตรขนาด 20 ml. ปรับปริมาตรดว้ ย Methanol ( HPLC grade )

วธิ มี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ ูจนสารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ที่ 1 67 กรมวิทยาศาสตรการแพทย  Mixed Std-50 stock solution : ปเ ปต 2.50 ml ของ Mixed Std-200 stock solution ใส่ในขวดวดั ปริมาตรขนาด 10 ml ปรบั ปรมิ าตรดว้ ย Methanol ( HPLC grade )  Internal standard solution (IS) Stock solution : ชัง่ สารมาตรฐาน Phentermine hydrochloride ให้มี นา้� หนกั 10 mg ลงในขวดวดั ปรมิ าตรขนาด 10 ml ปรบั ปรมิ าตรดว้ ย Methanol (HPLC grade) 6.2.2 Working standard (WS) solution for linearity range 1 เตรียม WS ใน Methanol สา� หรับ spiked urine calibration curve และ QC sample ดงั ตาราง WS WS Conc. Mixed Std - 50 final volume (ml) (ng/ml) taken (ml) 1WS1 3,000 120 2 1WS2 7,000 280 2 1WS3 10,000 400 2 1WS4 13,000 520 2 1WS5 17,000 680 2 1WS6 20,000 800 2 1WSQCL 8,000 320 2 1WSQCM 10,000 400 2 1WSQCH 15,000 600 2

68 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ จู นสารเสพติดในปส สาวะ เลมท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 6.2.3 Spiked urine calibration curve และ QC sample ปเ ปตสารละลาย มาตรฐานจาก WS แต่ละระดบั ความเขม้ ข้น ปรมิ าตร 100 ml ลงใน microcentrifuge tube ขนาด 1.5 ml. และผสมด้วย certified drugs free urine 900 ml จะได้ความเขม้ ข้นดังตาราง CS and QC Conc. (ng/ml) WS taken (ml) from solution urine taken (ml) 1CS1 300 100 1WS1 900 1CS2 700 100 1WS2 900 1CS3 1,000 100 1WS3 900 1CS4 1,300 100 1WS4 900 1CS5 1,700 100 1WS5 900 1CS6 2,000 100 1WS6 900 1QCL 800 100 1WSQCL 900 1QCM 1,000 100 1WSQCM 900 1QCH 1,500 100 1WSQCH 900

วธิ ีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ที่ 1 69 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 6.2.4 Working standard (WS) solution for linearity range 2 เตรียม WS ใน Methanol ส�าหรับ spiked urine calibration curve และ QC sample ดังตาราง WS WS Conc. Mixed Std-200 taken final volume (ng/ml) (ml) (ml) 2WS1 20,000 200 2 2WS2 40,000 2WS3 55,000 400 2 2WS4 70,000 2WS5 85,000 550 2 2WS6 100,000 2WSQCL 45,000 700 2 2WSQCM 50,000 2WSQCH 80,000 850 2 1000 2 450 2 500 2 800 2

70 วธิ มี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสูจนส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 6.2.5 Spiked urine calibration curve และ QC sample ปเปตสารละลาย มาตรฐานจาก WS แต่ละระดับความเข้มขน้ ปริมาตร 100 ml ลงใน microcentrifuge tube ขนาด 1.5 ml และผสมด้วย Certified drugs free urine 900 ml จะได้ความเขม้ ขน้ ดงั ตาราง CS and QC Conc. WS taken from urine taken (ng/ml) (ml) solution (ml) 2CS1 2,000 100 900 2CS2 4,000 100 2WS1 900 2CS3 5,500 100 2WS2 900 2CS4 7,000 100 2WS3 900 2CS5 8,500 100 2WS4 900 2CS6 10,000 100 2WS5 900 2QCL 3,000 100 2WS6 900 2QCM 5,000 100 2WSQCL 900 2QCH 8,000 100 2WSQCM 900 2WSQCH * หมายเหตุ เตรียม Certified drugs free urine 1 ml, zero sample ( Certified drugs free urine1 ml + IS 10 µl ) และ CS อยา่ งละ 1 ซํา� QstCanL,d QarCdM fo, rQsCyHs tเeตmรีย sมuอitยa่าbงiลliะty 2 t eซs�า้ t (SST) ใช้ตวั อยา่ ง 1 CS3

วธิ ีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ ูจนส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 71 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 6.2.6 เติม internal standard ปรมิ าตร 10 ml ลงใน CS และ QC 6.2.7 สารจากขอ้ 6.2.6 และ zero sample นา� ไปปันดว้ ยเครื่อง centrifuge ท ่ี ความเร็วไมต่ ่�ากว่า 4,500 รอบตอ่ นาท ี เปน็ เวลา 10 นาที 6.2.8 ดดู ส่วนใส 200 ml ใสใ่ น insert vial 6.3 เตรยี มวัสดุ/อุปกรณ์ 6.3.1 น�าตัวอย่างปัสสาวะออกจากตู้เยน็ วางไว้ใหเ้ ย็นทอ่ี ุณหภมู ิหอ้ งกอ่ นท�าการ วิเคราะห์ 6.3.2 เขยี นเลขลา� ดบั ตวั อยา่ งปสั สาวะหรอื เลขทตี่ วั อยา่ งบน micro centrifuge tube ขนาด 1.5 ml 6.4 การเตรยี มตวั อยา่ ง 6.4.1 ปิ เปตตวั อยา่ งปริมาตร 500 µl ใส่ micro centrifuge tube ขนาด 1.5 ml ตวั อยา่ งละ 1 ซํา� 6.4.2 เตมิ IS ปริมาตร 5 µl 6.4.3 น�าไปปนั ดว้ ยเคร่ือง centrifuge ท่คี วามเรว็ ไม่ต่�ากว่า 4,500 รอบตอ่ นาท ี เปน็ เวลา 10 นาที 6.4.4 ดดู สว่ นใส 200 µl ใสใ่ น insert vial 7. วธิ ดี า� เนินการ ( Procedure ) 7.1 น�าสารละลายมาตรฐานและสารละลายตวั อย่างวิเคราะหด์ ้วยเครอื่ ง LC - MS ตามสภาวะดังน้ี Analytical Column : Acclaim Trinity P1 3 µm 3.0 x 100 mm SPE Online : Acclaim Trinity P1 3 µm 3.0 x 10 mm Column Oven : 35 °C Injection : 0.5 µl Flow Rate : 0.40 ml/min for transferring and 0.50 ml/min. for loading

72 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสูจนสารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย Mobile Phase for transfering : pwHa t4e.r0/ A cgeratdoineintrti le/50 mM NH4 Formate Mobile Phase for loading : 0,20% HFBA in water/Acetonitrile ( 90 / 10 ), isocratic MS Mode : positive ESI SIM Probe Temperature : 600.00 ( °C ) Cone ( Volts ) : 45.00 Programme loading อัตราการไหล loading เหตุการณ์ เวลา (flow rate) สัดสวน (%) Inject sample (นาท)ี ส�าหรบั ปม ซ้าย น้า� กรอง Acetonitrile Fo5rm0 amteMpNHH44 .0 0.00 0.40 12 80 8 1.00 0.40 12 80 8 Valve_Switch1_2 1.50 0.40 16 80 4 1.80 0.40 16 80 4 2.30 0.40 12 80 8 3.50 0.40 12 80 8 Valve_Switch6_1 10.00 0.40 12 80 8 end

วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ ูจนสารเสพติดในปส สาวะ เลมท่ี 1 73 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย ตั้งค่ามวลของสารตามตารางดา้ นลา่ ง SIM No. mass spectrum (m/z) compounds 1 136.20±0.3 A 2 150.20±0.3 M, Phe 3 180.22±0.3 MDA 4 194.20±0.3 MDMA 5 208.27±0.3 MDEA 7.2 ล�าดับการฉีดตวั อย่าง 7.2.1 Certified drugs free urine 1 เข็ม เพ่ือตรวจสอบ baseline และ noise 7.2.2 สารละลายมาตรฐานท่ีความเข้มขน้ เท่ากับ CS2 จา� นวน 5 เขม็ ส�าหรบั SST เพ�ือดคู วามพร้อมของเครื�องมือ และระบบก่อนฉีดตวั อยา่ ง เม�ือพืน� ที�ใต้พีค เฉล�ยี ของการฉีด 5 ครัง� ของทกุ สารท�ีสนใจ ≤ 5% ให้ทําข้อ 7.2.3 7.2.3 Calibration solutions ประกอบด้วย blank sample, zero sample และ 1CS1-6 ตวั อยา่ งละ 1 เขม็ 7.2.4 ตัวอย่างและ QC samples แทรกสลบั กันทุกๆ 50 ตัวอยา่ งจนครบชดุ การ ตรวจวิเคราะห์ 7.2.5 จา� นวนตวั อยา่ งในแต่ละชดุ การตรวจวเิ คราะห์ไม่ควรเกิน 104 ตวั อยา่ ง ( ก�าหนดตาม autosampler stability ท ่ี 24 ช่วั โมง ) 7.2.6 กรณีมีตัวอย่างเกนิ 104 ตวั อยา่ ง จะต้องเตรยี ม calibration solution และ QC sample พรอ้ มฉีดตวั อย่างเปน็ ชดุ การฉีดใหม ่

74 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ ูจนส ารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 7.3 Detection and identification 7.3.1 ดคู ่า run time (RT) และ m/z ของสารมาตรฐานแต่ละชนิด ดงั นี้ SIM No. mass spectrum (m/z) RT compounds 1 136.20 6.46 Amphetamine(A) 2 150.20 4.94 Methamphetamine(M) 5.72 Phentermine 3 180.22 6.49 MDA 4 194.20 4.93 MDMA 5 208.27 4.22 MDEA 7.3.2 ดคู า่ RT และ m/z ของตวั อยา่ งเทียบกบั สารมาตรฐาน

วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสูจนส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 75 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 8. การคา� นวณและการรายงานผล ( Calculation and report ) 8.1 การคา� นวณ 8.1.1 ค�านวณสมการเสน้ ตรงเพอื่ สรา้ ง calibration curve จากข้อมลู CS1-CS6 โดยใช ้ Excel Y = aX + b โดย Slope, a: = SLOPE ( known_y’s, known_x’s ) y-intercept, b: = INTERCEPT ( known_y’s, known_x’s ) Correlation Coefficient, r: = CORREL ( known_y’s, known_x’s ) R-squared, r2: = RSQ ( known_y’s, known_x’s ) 8.1.2 คา� นวณส่วนเบีย่ งเบนมาตรฐาน (standard deviation: S.D.) S.D. = ∑ (x − x )2 n −1 โดย x = คา่ ของข้อมูล x = คา่ กลางของขอ้ มลู n = จา� นวนข้อมูล 8.1.3 ค�านวณสมั ประสทิ ธิ์แหง่ ความแปรผนั (coefficient of Variation: C.V.) C.V. = S .D. × 100 x 8.1.4 Back-calculated value, %RD Back-calculated value, %RD = ( ความเข้มข้นที่คา� นวณได้จาก curve – ความเข้มข้นจรงิ ) x 100 ความเข้มขน้ จรงิ 8.1.5 อัตราส่วนพื้นท่ใี ต้พีค อัตราสว่ น = พ้ืนทีใ่ ต้พีคสาร พนื้ ท่ีใตพ้ คี IS

76 วิธีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพิสจู นสารเสพติดในปส สาวะ เลม ที่ 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 8.2 การรายงานผล ตวั อยา่ งท่ีรายงาน “ตรวจพบเมทแอมแฟตามนี ” “ ตรวจพบ 3,4-เมทิลลีนไดออกซเี มทแอมเฟตามนี ( เอม็ ดเี อม็ เอ, MDMA ) ” “ ตรวจพบ เมทิลลีนไดออกซีแอมเฟตามีน ( เอม็ ดเี อม, MDA ) ” “ ตรวจพบ เอ็น เอทิล เอ็มดีเอ หรือ เอม็ ดีอ ี ( เอ็มดีอี, MDE ) ” 8.2.1 ตอ้ งมีลกั ษณะดังนี้ 8.2.1.1 ม ี RT และ m/z ตรงกับสารมาตรฐานชนดิ ทีต่ อ้ งการตรวจวิเคราะห์ 8.2.1.2 รายงานผลการตรวจวเิ คราะห์ Amphetamine, Methampheta mine, 3,4 Methylene dioxymethamphetamine, 3,4-Methylene dioxeneamphetamine และ 3,4-Methylene dioxeneethamphe tamine ในหน่วย ng/ml โดยคา� นวณผลจาก calibration curve 8.2.1.3 ความเข้มขน้ ของ Amphetamine, Methamphetamine, 3,4 Methylene dioxymethamphetamine, 3,4-Methylene dioxene amphetamine และ 3,4-Methylene dioxeneethamphetamine ต้องไม่ต�่ากว่า 1000 ng/ml 8.2.2 ตัวอยา่ งทรี่ ายงานผลตรวจไมพ่ บ Amphetamine, Methamphetamine, 3, 4Methylene dioxymethamphetamine, 3, 4-Methylene dioxeneamphe tamine และ 3, 4-Methylene dioxeneethamphe tamine ตอ้ งมีลกั ษณะดงั น้ี 8.2.2.1 ตัวอยา่ งท่ไี มพ่ บ mass spectrum และ / หรือ RT ไมต่ รงกับ สารมาตรฐานที่ 8.2.2.2 ตวั อยา่ งท่ีมีลักษณะเปน็ ไปตามขอ้ 8.2.1.1 แตไ่ ม่เปน็ ไปตาม ข้อ 8.2.1.2 และ 8.2.1.3

วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ จู นสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ที่ 1 77 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 9. การควบคุมคณุ ภาพและผลการทดสอบ ( Assuring the quality of test results ) 9.1 กรณขี อง system suitability test พจิ ารณาคา่ retention time และ คา่ %CV ของ response ไม่ควรเกิน 10.0 % 9.2 75 % ของระดับความเข้มข้นท้งั หมดบน calibration curve ตอ้ งมคี า่ back - calculated value ไม่เกิน 15 % ยกเวน้ ทรี่ ะดับความเขม้ ข้นตา�่ สดุ ให้ไม่เกนิ 20 % ส�าหรบั ระดบั ความเขม้ ข้นทไ่ี มผ่ ่านนน้ั ตอ้ งไม่ใช่ระดบั ความเขม้ ข้นสูงสดุ หรอื ต่า� สุดของ calibration curve จึงจะสามารถตดั ท้งิ และไม่น�าไปใชใ้ นการคา� นวณค่า correlation coefficient ( r ) และสมการเส้นตรงได้ 9.3 ค่า correlation coefficient ( r ) ของ calibration curve ควรไม่นอ้ ยกว่า 0.95 9.4 คา่ %RD ของ 4 ใน 6 ( 67 % ) QC samples ท้งั หมด ควรมีคา่ ไมเ่ กนิ 15 % และ 2 ใน 6 ( 33 % ) QC samples ทีไ่ มผ่ า่ นตอ้ งไมใ่ ช ่ QC sample ที่ระดบั ความเขม้ ข้น เดยี วกัน 9.5 กรณที ่กี ารวเิ คราะหช์ ดุ นั้นๆ ไมผ่ ่านเกณฑ์การควบคุมคณุ ภาพนกั วิเคราะหจ์ ะต้องทา� การวิเคราะหซ์ า�้ ทง้ั ชุด 9.6 กรณตี วั อย่างมีความเข้มข้นของ Amphetamine, Methamphetamine, 3,4 Methylenedioxymethamphetamine, 3,4-Methylene\\dioxeneamphetamine และ 3,4-Methylenedioxeneethamphetamineเกิน 1,500 ng/ml นกั วิเคราะห์ จะต้องทําการวเิ คราะห์ซํา� ด้วยการเจือจางตวั อยา่ งกบั certified drugs free urine ทร�ี ะดบั 1:1 หรอื 1:4 หรอื 1 : 9 หรอื ลดปรมิ าณการฉดี เป็น 1 หรอื 2.5 µl ตามเหมาะสม เพอ�ื ให้ความเข้มข้นของสารอยใู่ นชว่ งของ calibration curve คอื 300 - 2,500 ng/ml และ 300 - 1,500 ng/ml ตามลาํ ดบั

78 วิธีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ที่ 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 10. รายละเอยี ดอื่นๆ 10.1 วธิ นี ี้ใช้สา� หรับตรวจหา Amphetamine, Methamphetamine, 3,4 Methylene dioxy methamphetamine, 3,4-Methylene\\dioxeneamphetamine และ 3,4-Methylene dioxeneethamphetamine ในปสั สาวะเทา่ นั้น หากนา� ไปประยุกต ์ ส�าหรับตรวจในตวั อยา่ งอนื่ ๆ ไมใ่ ชป่ สั สาวะ จะต้องท�าการ ทวนสอบ ( verify ) ก่อน 10.2 การตรวจยนื ยนั ดว้ ยเทคนิค LC-MS ตวั อย่างปสั สาวะควรทา� การตรวจเบื้องต้น โดย ใชห้ ลกั การภมู คิ ุม้ กันวทิ ยา โดยพจิ ารณา ดงั น้ี - กรณใี หผ้ ลบวกหรอื ใหผ้ ลบวกไมช่ ดั เจน ตอ้ งทา� การตรวจยนื ยนั ผลทกุ ตวั อยา่ ง - กรณีให้ผลลบ จะไม่ท�าการตรวจยนื ยันผล ยกเวน้ กรณรี อ้ งขอพิเศษ หรือ ตอ้ งการทา� เพ่อื ยนื ยันผลลบ เปน็ ต้น 10.3 การเตรียมสารมาตรฐาน และสารเคม ี สามารถเตรยี มตามปริมาตรทตี่ ้องการได ้ แต่ ความเขม้ ข้นต้องเปน็ ไปตามทก่ี า� หนด 10.4 กรณตี อ้ งการตรวจวิเคราะห์เฉพาะ Amphetamine และ Methamphetamine สามารถฉดี สารมาตรฐานแค ่ 2 ตวั ได ้ เช่นเดยี วกนั กรณีต้องการตรวจวเิ คราะห ์ เฉพาะ MDA, MDMA, MDE สามารถฉีดสารมาตรฐานแค่ 3 ตัว 10.5 กรณใี ชว้ ิธีนเี้ พือ่ ตรวจพิสูจน์สาร และพบว่าพืน้ ที่ใตพ้ ีคของสารท่สี นใจมากเกินกวา่ พ้นื ทใี่ ต้พคี ของความเข้มขน้ สูงสดุ ของ calibration curve ไม่จ�าเปน็ ต้องทา� การ เจือจางตวั อยา่ ง 10.6 กรณตี วั อยา่ งวเิ คราะหม์ ีอตั ราสว่ นพนื้ ท่ใี ต้พคี ตอ่ IS ของ Am มากกวา่ 40.4 M มากกว่า 12.7 MDA มากกวา่ 8.3 MDMA มากกว่า 34.1 และ MDE มากกวา่ 41.3 ตวั อย่างทว่ี เิ คราะหถ์ ัดจากตวั อยา่ งวิเคราะห์ดังกล่าวตอ้ งวิเคราะห์ซ้า�

วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ จู นสารเสพติดในปส สาวะ เลม ท่ี 1 79 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 2.6 การตรวจปริมาณกญั ชาในปสสาวะโดย ดว้ ยเทคนิค Gas Chromatography – Massspectrometry (GC-MS) 1. ขอบขาย ( Scope ) เป็นวธิ ีมาตรฐานในการปฏบิ ัติงานตรวจพิสจู น์ยนื ยันผลกัญชาในปสั สาวะ 2. เอกสารอา้ งอิง ( Reference ) 2.1 รวมกฎหมายยาเสพตดิ พรอ้ มดว้ ย กฎกระทรวง ระเบียบ ข้อบังคับ ทีเ่ ก่ยี วข้อง, สา� นกั งานป้องกนั และปราบปรามยาเสพตดิ กระทรวงยตุ ิธรรม พ.ศ. ๒๕๕๒, หมายเลข เอกสารเผยแพร่ ๑-๐๙-๒๕๕๒, ๒๖-๒๗. 2.2 ความผดิ และโทษเกีย่ วกับกฎหมายยาเสพติด, กองนติ กิ าร สา� นกั งานปอ้ งกนั และ ปราบปรามยาเสพตดิ สา� นกั นายกรัฐมนตร,ี หมายเลขเอกสารเผยแพร่ 02-07-2543; 12-16. 2.3 Anthony C Moffat, M David Osselton and Brian Widdop, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons.Third edition, Volume 2, Pharmaceuticals Press London, 2004; 1228-1229, 1254-1258. 2.4 Recommended Method for the Detection and Assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine, Amphetamine, Methamphetamine and Ring-Substituted Amphetamine Derivative in Biological Specimens, UNITED NATIONS New York, 1995; 59-70. 2.5 Varian. Toxicology Manual Confirmation of Drugs of Abuse in Urine with Ion-Trap GC-MS, Varian, Inc, 2001; 5-18. 3. หลักการ ( Principle ) พชื กญั ชา ( Marijuana ) มสี ารออกฤทธท์ิ สี่ า� คญั อยหู่ ลายชนดิ เชน่ Tetrahydrocannabinol ( THC ), Cannabidiol ( CBD ), Cannabinol ( CBN ) แตส่ ารทีพ่ บในปริมาณสูงและมีฤทธต์ิ อ่ สมองคอื THC ซ่งึ พบมากในยางกัญชา ( Hashish ) สารน้ีเม่อื เข้าสู่รา่ งกายจะถกู ท�าลายท่ีตบั และ เปลี่ยนเปน็ สาร 11-Nor-delta 9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid ( 11-Nor-D9-THC -COOH หรือ 9-Carboxy-THC; THCA ) ซ่ึงจะถกู ขับออกทางปสั สาวะจะอย่ใู นรปู conjugate คอื THCA-glucuronide กรณเี สพเป็นประจ�าสามารถตรวจพบในปสั สาวะได้นานถงึ 30 วนั

80 วิธมี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสูจนสารเสพติดในปส สาวะ เลม ที่ 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย การแยกสารดังกลา่ วโดยอาศัยหลักการ GC-MS ซงึ่ อาศัยหลักการแยกสารผสมออกจากกนั โดยอาศัยคุณสมบัติความสามารถในการกลายเป็นไอ การละลาย และการดูดซับท่ีแตกต่างกันของ สารแต่ละชนิดในคอลัมน ์ ในอุณหภมู ิและเวลาท่ีต่างกันโดยใชเ้ ครอื่ ง gas chromatography แล้ว ใช ้ mass spectrometry ในการทา� ใหส้ ารทีแ่ ยกได้แตกตวั เปน็ ไอออน (ion fragment) แล้วศึกษา รปู แบบการแตกตวั ของสารนน้ั ๆ เทยี บกบั สารมาตรฐานทเี่ ตรยี มขน้ึ เอง หรอื ฐานขอ้ มลู ใน software ของเคร่ือง MS database เชน่ Wiley, NIST เปน็ ต้น การหาปรมิ าณสารจะขึ้นกับความสูงของพคี (peak abundance) และพ้ืนทใี่ ต้พีค (peak area) เปรียบเทียบกบั ความสงู พคี หรอื พืน้ ทีใ่ ตพ้ คี ของ สารมาตรฐาน 4. เคร่อื งมือ และอุปกรณ์ ( Apparatus ) 4.1 เครอ่ื งมอื 4.1.1 เครื่อง analytical balance ชนดิ ทศนยิ มไม่นอ้ ยกวา่ 4 ตา� แหนง่ 4.1.2 เครอ่ื ง centrifuge high speed ความเรว็ ไมต่ �า่ กว่า 2,000 รอบตอ่ นาที 4.1.3 เครื่อง evaporator with nitrogen พร้อม needle 4.1.4 เครอ่ื ง heating block พร้อม เทอร์โมมิเตอร์ 4.1.5 เคร่ือง vacuum manifold พรอ้ ม vacuum pump 4.1.6 เคร่ือง vortex mixer 4.2 เครอ่ื งแก้วและอุปกรณ์ 4.2.1 micropipette และ micropipette tips ขนาด 50-200 µl และ 1-5 ml 4.2.2 positive pipette ขนาด 10, 25, 50, 100, 250, 1000 µl 4.2.3 solid phase extraction (SPE) ชนิด OASIS MAX cartridge 3 ml/60 mg หรือเทียบเท่า 4.2.4 vial ขนาด 2 ml พร้อม insert ขนาด 50-200 µl

วิธีมาตรฐานสําหรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลม ท่ี 1 81 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 5. สารเคมี ( Reagent ) 5.1 สารเคมีทั่วไป 5.1.1 Acetic acid glacial ( AR grade ) 5.1.2 Acetonitrile ( AR grade ) 5.1.3 Bis ( trimethylsilyl ) trifluoroacetamide with 1 % trimethylchlorosilane ( AR grade ) 5.1.4 Certified drugs free urine 5.1.5 Ethyl acetate (AR and HPLC grade) 5.1.6 Methanol ( AR and HPLC grade ) 5.1.7 Potassium dihydrrogen phosphate ( AR grade ) 5.1.8 Potassium hydroxide ( AR grade ) 5.1.9 น�า้ กรอง ( Distilled Water type II ) 5.2 สารมาตรฐาน มใี บรับรองผลการตรวจวิเคราะห์ ( certificate of analysis ; COA ) 5.2.1 11-Nor-∆9-THC -COOH หรือ 9-Carboxy-THC; THCA

82 วธิ ีมาตรฐานสําหรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 6. การเตรยี มตวั อยา ง ( Preparation of test sample ) 6.1 การเตรียมสารเคมี 6.1.1 10.0 N KOH  ชั่ง KOH 56.106 g ละลายด้วยนา�้ กรอง ในขวดปรบั ปรมิ าตรขนาด 100 ml ปรับปรมิ าตรด้วยน�้ากรอง  เขยา่ ขวดเบาๆ เพื่อผสมใหเ้ ขา้ กนั  เกบ็ ไวใ้ นขวดพลาสตกิ ทีอ่ ุณหภูมิห้อง อายุการใชง้ าน 1 ปี 6.1.2 50% Acetic acid (V/V)  ตวง Glacial acetic acid 50 ml และน้า� กรอง 250 ml เทผสมรวมกัน  เขยา่ ขวดเบาๆ เพอ่ื ผสมให้เขา้ กัน  เก็บไวใ้ นขวดแกว้ ทอี่ ุณหภูมิหอ้ ง อายกุ ารใช้งาน 1 ปี 6.1.3 50% Methanol (V/V)  ตวง Methanol (AR) 250 ml และน้า� กรอง 250 ml เทผสมรวมกนั  เขยา่ ขวดเบาๆ เพ่อื ผสมให้เขา้ กัน  เก็บไวใ้ นขวดแก้ว ทอ่ี ณุ หภูมหิ อ้ ง อายกุ ารใชง้ าน 1 ปี 6.1.4 0.1M KH2PO4  ชงั่ KH2PO4 1.36 g ละลายด้วยนา�้ กรองในขวดปรมิ าตร 100 ml  เขย่าขวดเบาๆ เพ่ือผสมใหเ้ ข้ากนั  เกบ็ ไวใ้ นขวดแกว้ ทีอ่ ุณหภูมิห้อง อายุการใชง้ าน 1 ปี 6.1.5 Hexane : Ethyl acetate (AR) : Glacial acetic acid (49 : 49 : 2)  ตวง Hexane 49 ml, Ethyl acetate 49 ml และ Glacial acetic acid 2 ml เทผสมรวมกนั  เขย่าขวดเบาๆ เพอ่ื ผสมให้เข้ากัน  เก็บไวใ้ นขวดแกว้ ทอ่ี ณุ หภูมิห้อง อายุการใชง้ าน 1 ปี หมายเหตุ หา้ มใช้สารละลาย เมอ่ื พบวา่ มกี ารเปล่ยี นแปลงลักษณะทางกายภาพและ ทางเคมี

วธิ ีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ ูจนส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลมที่ 1 83 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 6.2 การเตรยี มสารมาตรฐาน 6.2.1 Stock standard-THCA100 : เตรียมมาตรฐานความเข้มข้น 100 µg/ml ใน Methanol ( HLPC )  ละลาย THCA 1 mg/ml in Methanol 1 ml ในขวดปริมาตรขนาด 10 ml ปรบั ปริมาตรด้วย Methanol ( HPLC grade ) 6.2.2 Working standard ( WS ) เตรยี มสารละลายมาตรฐานเจอื จาง จาก ข้อ 6.2.1 ความเข้มข้น 0.75, 1.00, 1.50, 2.00, 2.50, 5.00, 7.50, 10.00, 11.00, 15.00 µg/ml ใน Methanol (HLPC grade) ดงั ตาราง WS Working THCA 1000 THCA 100 ug/ final volume ug/ml ml in methanol final Conc. for standard volume taken volume taken (HPLC) (ug/ml) (ul) (ul) (ml) PC1 WS 0.75 0 75 10 0.75 PC2 WS 1.50 0 150 10 1.50 PC3 WS 2.50 0 250 10 2.50 PC4 WS 5.00 50 0 10 5.00 PC5 WS 7.50 75 0 10 7.50 PC6 WS 10.00 100 0 10 10.00 PC7 WS 15.00 150 0 10 15.00 QCL WS 1.00 0 100 10 1.00 QCM WS 2.00 0 200 10 2.00 QCH WS 11.00 110 0 10 11.00

84 วิธีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ จู นสารเสพติดในปส สาวะ เลม ท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 6.3 เตรียม QC และ PC Sample 6.3.1 เตรียม reference standard (SS): สา� หรบั ฉดี หาตา� แหนง่ retention time reference spectra และ system suitability ดดู สารละลายมาตรฐาน Working standard (WS 2.50) 40 µl เปา แห้ง 6.3 . 2 ดn้วeยg aNti2v eน �าcไoปnทt�าro dl e(rNivCa)tize ตามขอ้ 6.6.7 6.3.3 ใช ้ certified drugs free urine 6.3.4 PC และ QC Sample เตรยี ม spiked urine ทีค่ วามเขมขนในตางๆ ชนิดละ 2 ml ดังตาราง วธิ ีเตรียม SS, NC, PC, QC sample SS/NC/PC/QC/ Working volume taken certified drugs final conc. sample (s) standard (ml) free urine (ml) THC (ng/ml) 40 Reference standard WS 2.50 0 0- ( SS ) 2000 0 NC None PC1: PC 15 WS 0.75 40 1900 15 PC2: PC 30 WS 1.50 40 1900 30 PC3: PC 50 WS 2.50 40 1900 50 PC4: PC 100 WS 5.00 40 1900 100 PC5: PC 150 WS 7.50 40 1900 150 PC6: PC 200 WS 10.00 40 1900 200 PC7: PC 250 WS 15.00 40 1900 300 QCL 20 WS 1.00 40 1900 20 QCM 40 WS 2.00 40 1900 40 QCH 220 WS 11.00 40 1900 220 Sample(s) - - 2000 X

วิธีมาตรฐานสําหรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 85 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย หมายเหตุ 1. reference standard (SS) มีคา่ ความเข้มขน้ ของสารเทียบเท่าสารเปา้ หมาย ที ่ cut off เม่ือใชป้ ัสสาวะ 5 ml 2. PC1 – PC7 ต้องมคี วามเขม้ ขน้ ที่ค่า cut off เสมอ และมคี วามเข้มข้นอื่นๆ ครอบคลุมค่าสูง กลาง ตา่� ของคา่ cut off 3. QC sample มคี า่ ความเขม้ ขน้ ทแี่ ตกตา่ งจากตวั อยา่ งทที่ า� calibration curve 6.4 เตรยี มวัสด/ุ อุปกรณ์ 6.4.1 เบิกตัวอย่างปสั สาวะออกจากตเู้ ย็นวางไวใ้ หม้ ีอณุ หภูมหิ อ้ งเท่าหรือใกล้เคียง อณุ หภูมิห้องกอ่ นทา� การวิเคราะห์ 6.4.2 เขียนเลขล�าดับตัวอยา่ งปสั สาวะหรอื เลขท่ีตวั อยา่ ง, NC, PC, QC sample บนวัสดุอปุ กรณ์ทีต่ ้องใช ้ เชน่ test tube, SPE cartridge, vial เป็นตน้ 6.4.3 เปดเครอ่ื ง heating block ตง้ั อณุ หภมู ปิ ระมาณ 60 ºC โดยใส ่ เทอร์โมมเิ ตอรไ์ วช้ อ่ งสา� หรับใสเ่ ทอรโ์ มมเิ ตอร์ 6.5 การเตรียมตวั อย่าง ( pretreatment ) 6.5.1 ดูดตัวอยา่ งปัสสาวะ/NC/ PC /QC sample 5 ml. ใส่ใน test tube 6.5.2 เตมิ 10.0 N KOH 50 µl เขยา่ ด้วย vortex mixer ประมาณ 1 นาที นําไป incubate ที�อณุ หภมู ิ 60 ºC เป็นเวลา 15 นาที นําออกมาวางที� อณุ หภมู ิห้อง 6.5.3 เตมิ 50% Acetic acid 50 µl เตมิ 0m.1ixMerKปHร2ะPมOา4ณ2010นµาlทแี ละเตมิ Aetonitrile 1 ml เขยา่ ด้วย vortex 6.6 การสกัดตวั อยา่ ง (extraction) ใชส้ ารเคมชี นิด AR grade มีขนั้ ตอนดังน้ี 6.6.1 condition column  เติม Methanol 2 ml  เตมิ นา�้ กรอง 2 ml 6.6.2 load sample เทตัวอยา่ งจากข้อ 10.5 ลงใน SPE column ปลอ่ ยให้ไหลจนหมด โดยให ้ อัตราการไหลประมาณ 1-2 ml/นาที

86 วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 6.6.3 wash column  เตมิ Water : Methanol (50 : 50) 3 ml  เติม Hexane 3 ml. 6.6.4 dry column  เปา column ใหแ้ หง้ ดว้ ย N2 ประมาณ 5 นาที 6.6.5 elute sample  เตมิ Methanol 1.5 ml ปล่อยใหไ้ หลจนหมด  Elute ซา�้ ด้วย Methanol 0.5 ml 6.6.6 dry และ concentrate sample  น�าตัวอย่างที ่ elute ไประเหยให้แห้งดว้ ย N2 6.6.7 derivatization  เตมิ Ethyl acetate (HPLC grade) 50 µl และ BSTFA with 1% TMCS 50 µl ปดจุก tube แล้วพนั ทบั ดว้ ย paraffin เพือ่ ปอ้ งกันแรงดนั จาก การขยายตัวของสารจากความร้อน  นา� ไปใส่ใน heating block ท ี่ 75 ºC เป็นเวลา 25 นาที 6.6.8 น�าออกจาก heating block ตั้งไว้ใหเ้ ย็นเทา่ หรอื ใกล้เคียงอุณหภูมหิ อ้ ง ถา่ ย ใส ่ vial ขนาด 2 ml ที่ม ี insert ขนาด 50-200 µl 7. วธิ ีด�าเนนิ การ (Procedure) 7.1 นา� สารละลายมาตรฐานและสารละลายตวั อยา่ งวิเคราะห์ดว้ ยเครื่อง GC-MS ตาม สภาวะดงั นี้ Column : HP-5ms; 30M, 0.25mm ID, DF 0.25 หรอื เทียบเทา่ Flow rate : He 2.0 ml/minute Injection mode : 1 ml, splitless MS mode : EI SCAN 50-500 amu หรือกวา้ งกว่า, SIM 371, 473, 474,488, 489 Library : NIST, Wiley, MPW2007 หรอื มากกว่า Oven Temperature: เร่มิ ต้นไมส่ งู กว่า 150 °C จนถงึ ไมต่ า่� กวา่ 310 °C

วิธีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมที่ 1 87 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 7.2 ลา� ดับการฉดี ตวั อยา่ ง 7.2.1 ตวั ท�าละลาย 3 เข็ม เพ่อื ตรวจสอบ baseline และ noise 7.2.2 system suitability test โดยฉดี สารละลายมาตรฐานที่ความเขม้ ข้นเท่ากบั PC50 จ�านวน 5 เข็ม 7.2.3 calibration solutions ประกอบดว้ ย blank sample, zero sample และ PC1-7 7.2.4 ตวั อยา่ งและ QC samples ( QCL, QCM, QCH ) แทรกสลบั กนั ไปอย่าง สมา่� เสมอจนครบชดุ การตรวจวิเคราะห์ 7.2.5 จ�านวนตวั อย่างในแต่ละชุดการตรวจวเิ คราะหไ์ มค่ วรเกิน 70 ตัวอย่าง ( ก�าหนดตาม autosampler stability ท ่ี 18 ชวั่ โมง ) 7.2.6 กรณมี ตี ัวอยา่ งเกิน 70 ตวั อยา่ ง จะตอ้ งเตรยี ม calibration solution และ QC sample พรอ้ มฉีดตัวอย่างเป็นชดุ การฉีดใหม ่ 7.3 Detection & Identification 7.3.1 ดูคา่ mass spectrum, RT, peak area ดงั น้ี Mass spectrum (Q, Q1, Q2)* 371, 473, 488 RT** 8.35 Peak area ของ PC 50 >100,000 *Q = Quantitation ion, Q1 = Qualifier ion 1, Q2 = Qualifier ion 2 **คา RT อาจมกี ารเปลี่ยนแปลง ขนึ้ อยกู บั ความยาวของคอลมั นและ oven temperature ทีใ่ ช ทงั้ น้ใี หเ ทยี บกบั RT ของ standard ทีฉ่ ีดหาคา system suitability ในวันทที่ ําการวิเคราะห 7.3.2 ดคู ่า mass spectrum และ RT ของตัวอย่างเทยี บกบั positive control

88 วิธีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นสารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 8. การคา� นวณและการรายงานผล ( Calculation and report ) 8.1 คา� นวณสมการเสน้ ตรงเพ่อื สร้าง calibration curve จากข้อมลู PC 7 ความเข้มขน้ โดยใช้ excel Y = aX + b โดย slope; a: = SLOPE (known_y’s, known_x’s) y-intercept; b: = INTERCEPT (known_y’s, known_x’s) Correlation coefficient; r: = CORREL (known_y’s, known_x’s) R-squared; r2: = RSQ (known_y’s, known_x’s) 8.2 ค�านวณสว่ นเบย่ี งเบนมาตรฐาน (standard deviation: SD) SD = ∑(x − x )2 n −1 โดย x = คา่ ของข้อมูล x = คา่ กลางของข้อมลู n = จํานวนข้อมลู 8.3 คา� นวณสัมประสิทธ์แิ หง่ ความแปรผนั ( coefficient of variation: CV ) %CV = SD x 100 X 8.4 Back-calculated value, %RD %RD = ( ความเขม้ ข้นท่ีคา� นวณไดจ้ าก curve – ความเข้มข้นจรงิ ) x 100 ความเขม้ ข้นจรงิ 8.5 การรายงานผล 8.5.1 ตวั อย่างทร่ี ายงาน “ตรวจพบแคนนาบินอยด์” ต้องมีลักษณะดงั น้ี 8.5.1.1 มี mass spectrum และ มี RT ตรงกบั PC ของ THCA 8.5.1.2 มพี ้ืนที่ใตพ้ คี ของ THCA ต้องเทา่ กบั หรอื มากกว่า PC ทคี่ วาม เข้มข้น 50 ng/ml 8.5.1.3 เมื่อค�านวณผลโดยใช้ calibration curve ได้คา่ เท่ากบั หรอื มากกวา่ 50 ng/ml

วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสูจนสารเสพติดในปสสาวะ เลมที่ 1 89 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 8.5.2 ตัวอย่างทร่ี ายงาน “ตรวจไม่พบแคนนาบนิ อยด”์ ต้องมีลักษณะดังนี้ 8.5.2.1 ตวั อยา่ งท่รี ายงานตรวจไมพ่ บ mass spectrum และ ม ี RT ตรง กบั PC ของ THCA 8.5.2.2 ตวั อยา่ งที�มีลกั ษณะเป็นไปตามข้อ 8.4.1.1 แตไ่ มเ่ ป็นไปตาม ข้อ 8.4.1.2 และ 8.4.1.3 9. การควบคุมคุณภาพและผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results) 9.1 การตรวจตรวจวิเคราะห ์ ตอ้ งทา� NC, PC และ QC ทกุ ครงั้ 9.2 system suitability test พิจารณาค่า %CV ของ response ไม่เกิน 15 และ RT คลาดเคลือ่ นไมเ่ กนิ 2 % 9.3 calibration curve พิจารณาค่า %RD โดย 75 % ของระดบั ความเข้มขน้ ทง้ั หมด ( หรืออย่างน้อย 6 ระดับความเขม้ ข้น ) ต้องมีค่า %RD ไมเ่ กิน 15 ยกเว้นทร่ี ะดบั ความ เขม้ ขน้ ต่�าสุด %RD ไมเ่ กนิ 20 สา� หรับระดับความเข้มข้นท่ีไมผ่ ่านนั้นต้องไมใ่ ช่ระดบั ความเขม้ ขน้ สงู สดุ หรือตา�่ สดุ ของ calibration curve จึงจะสามารถตดั ท้งิ และไม่น�า ไปใช้ในการคา� นวณค่า r และสมการเชงิ เสน้ ได้ 9.4 ค่า r ของ calibration curve ไมน่ อ้ ยกว่า 0.950 9.5 QC sample พิจารณาคา่ %RD โดย 4 ใน 6 ( 67 % ) ของ QC samples ทง้ั หมด ควรมีคา่ ไม่เกิน 15 และ 2 ใน 6 ( 33 % ) ของ QC samples ทไ่ี มผ่ ่านต้องไมใ่ ชร่ ะดับ ความเขม้ ขน้ เดยี วกนั 9.6 คา่ RT ตลอดชุดการวเิ คราะห ์ (batch) ต้องคลาดเคลอ่ื นไมเ่ กนิ 2 % 9.7 ion ratio ของ Q/Q1 และ Q/Q2 ตอ้ งอยู่ในชว่ ง lower และ upper limit 9.8 กรณที ก่ี ารวิเคราะห์ชุดนน้ั ๆ ไม่ผ่านเกณฑก์ ารควบคุมคุณภาพ ตอ้ งทา� การวเิ คราะห์ ซ้�าท้ังชดุ

90 วิธมี าตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ จู นสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 10. รายละเอยี ดอ่นื ๆ 10.1 ความไวของวธิ ี 15 ng/ml เมื่อใช้ปสั สาวะ 2 ml 10.2 วิธที ดสอบนใ้ี ชส้ า� หรบั การตรวจหา THCA ในตวั อยา่ งปสั สาวะเท่าน้ัน หากใชก้ ับ ตวั อย่างชนดิ อนื่ ๆ ต้องทา� การทวนสอบวิธีกอ่ น 10.3 การเตรยี มตวั อย่างหากจ�าเปน็ ตอ้ งหยดุ กระบวนการ ควรหยดุ เมื่อกระบวนการสกัด ตวั อยา่ งสนิ้ สุดแล้ว คอื ช่วงกอ่ นการท�า derivatized 10.4 ตัวอยา่ งที ่ derivatized แล้วสามารถเก็บในตู้เยน็ โดยเกบ็ ได้ไมเ่ กิน 1 สัปดาห์ 10.5 การเตรยี มสารละลายมาตรฐานและสารเคม ี สามารถเตรียมตามปรมิ าตรท่ตี อ้ งการ ได ้ แตค่ วามเข้มขน้ ตอ้ งเปน็ ไปตามทีก่ า� หนด 10.6 ตัวอย่างรปู ภาพแสดง chromatogram และ mass spectrum ของ THCA

วิธมี าตรฐานสําหรบั การตรวจพิสจู นสารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 91 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 10.7 ตัวอยา่ งรปู ภาพแสดงการดคู า่ ion ratio ของ Q/Q1 และ Q/Q2

92 วิธมี าตรฐานสําหรับการตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลมที่ 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 2.7 การตรวจปริมาณมอรฟ์ นในปส สาวะโดย ด้วยเทคนิค Gas Chromatography – Massspectrometry (GC-MS) 1. ขอบขา ย ( Scope ) เปน็ วิธมี าตรฐานในการปฏบิ ัตงิ านตรวจพสิ จู น์ยืนยนั ผลมอรฟ์ นี ในปสั สาวะ 2 เอกสารอา้ งองิ ( Reference ) 2.1 รวมกฎหมายยาเสพตดิ พรอ้ มด้วย กฎกระทรวง ระเบยี บ ขอ้ บังคับ ทเ่ี ก่ียวขอ้ ง, ส�านักงาน ป.ป.ส. กระทรวงยตุ ธิ รรม พ.ศ. ๒๕๕๒, หมายเลขเอกสารเผยแพร ่ ๑-๐๙-๒๕๕๒, ๒๖-๒๗. 2.2 Anthony C Moffat, M David Osselton and Brian Widdop. Clarke’s Analysis of drugs and Poisons, Third edition, Volume 2, London : The Pharmaceuticals Press, 2004, 1302-1305. 2.3 MICHAEL D. COLEMAN, Human Drug Metabolism AN INTRODUCTION, WILLEY, 2007, 225-230. 2.4 United Nation. Recommended Method for the Detection and Assay of Heroin Cannabinoids Cocaine Amphetamine and Ring substituted Amphetamine Derivatives in Biological Specimens, Manual for Use by Nation Laboratories, ST/NAR/27. New York : United Nation, 1995, 15-29. 2.5 Varian. Toxicology Manual Confirmation of Drugs of Abuse in Urine with Ion - Trap GC-MS, Varian, Inc, 2001, 28-40. 3. หลักการ (Principle) มอรฟ์ นี และเฮโรอนี เปน็ สารทอี่ ยใู่ นกลมุ่ Opiates ซงึ่ หมายถงึ กลมุ่ ยาทไี่ ดม้ าจากฝน และอนุ พนั ธ์ุของฝน รวมถึง Alkaloids ท่ีใชก้ นั อย่างแพร่หลาย มอรฟ์ ีนเป็น Alkaloids ที่ส�าคัญที่สดุ ของ ฝน และเป็นตวั ยาหลักของกลุ่ม Opiates มฤี ทธิแ์ รงกว่าฝน 8-10 เทา่ เป็นผลึกสีขาว เป็นเมด็ เป็น ผง หรอื เปน็ กอ้ นหรอื ละลายบรรจหุ ลอดสา� หรบั ฉดี ไมม่ กี ลน่ิ รสขม เสพตดิ ไดง้ า่ ย เฮโรอนี เปน็ ยาเสพ ตดิ ทร่ี า้ ยแรงทสี่ ดุ สังเคราะห์จากฝนหรือจากมอรฟ์ นี เฮโรอนี ออกฤทธิแ์ รงกวา่ มอร์ฟนี ประมาณ 4-8 เทา่ และออกฤทธิ์แรงกวา่ ฝน ประมาณ 30-90 เท่า มีฤทธริ์ ะงับปวดมากกวา่ มอรฟ์ ีนแตร่ ะยะเวลา ในการออกฤทธส์ิ ้ันกวา่

วิธีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสูจนสารเสพติดในปส สาวะ เลม ที่ 1 93 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย เฮโรอนี เมอื่ เขา้ สรู่ า่ งกายแลว้ จะทา� ปฏกิ ริ ยิ ากบั กรดกลโู คโรนคิ (Glucuronic acid) ไดเ้ ปน็ กลู โคโรไนด์ (Glucuronide) ซึ่งจะถูกขับออกทางปสั สาวะ กรณที ่เี สพเฮโรอีนเมอ่ื เขา้ สู่กระแสโลหิตจะ เมตาบอไลตเ์ ปล่ยี นเปน็ 6-O-Monoacetylmorphine (6-O-MAM) อย่างรวดเร็ว ภายใน 3-20 นาที หลงั จากนัน้ จะค่อยๆ เปลีย่ นเปน็ มอรฟ์ ีนภายใน 1–3 ชว่ั โมง และจะถกู ขับออกทางปัสสาวะใน รูปของ Morphine-3-O-Glucuronide 38.2%, Morphine 4.2%, 6-O-MAM 1.3% และ Heroin 0.1% ดังนั้นในทางปฏิบัติการตรวจปัสสาวะผู้เสพเฮโรอีนจะตรวจในรูปมอร์ฟีนเช่นเดียวกับผู้เสพ มอรฟ์ นี กรณีเสพมอรฟ์ ีน จะถูกเมตาบอไลตใ์ ห้อยใู่ นรปู 3- และ 6-Glucuronides เปน็ สว่ นใหญ่ และน้อยกว่า 10% พบในรปู มอร์ฟนี และพบโคเดอีนน้อยกว่า 1% การตรวจหาสารดงั กลา่ วโดยใช ้ GC-MS เปน็ การแยกสารผสมออกจากกนั โดยอาศยั คณุ สมบตั ิ ความสามารถในการกลายเป็นไอ การละลาย และการดูดซับที่แตกต่างกันของสารแต่ละชนิดใน คอลมั น ์ ในเวลาและอณุ หภมู ทิ ต่ี า่ งกนั โดยใชเ้ ครอ่ื ง gas chromatography ใช ้ mass spectrometry ในการทา� ใหส้ ารทแ่ี ยกไดแ้ ตกตวั เป็นไอออน แล้วศึกษารูปแบบการแตกตัว (mass spectrum) ของ สารนน้ั ๆ เทยี บกบั mass spectrum สารมาตรฐานที่เตรียมขึน้ เอง หรอื mass spectrum ของสาร มาตรฐานที่เก็บอย่ใู น MS database เช่น Wiley หรอื NIST ความสงู ของพคี (peak height) และ พืน้ ทใี่ ต้พีค (peak area) ขึน้ อย่กู บั ปรมิ าณสารน้ันๆ ในตัวอยา่ ง 4. เครือ่ งมอื และอุปกรณ์ ( Apparatus ) 4.1 เคร่อื งมือ 4.1.1 เครือ่ งแก๊สโครมาโทกราฟี-แมสสเปกโทรมเิ ตอร ์ (GC-MS) 4.1.2 GC Column HP-5MS 19091S-433 325 °C 30 m x 250 um x 0.25 um 4.1.3 เครื่องเตรยี มตัวอย่างอตั โนมัติ 4.1.4 เครือ่ งผสมสา� หรบั หลอดทดลอง (vortex mixer) 4.1.5 เคร่อื งระเหยแห้ง (evaporator with nitrogen) 4.1.6 เครือ่ งให้ความร้อนแกห่ ลอดทดลอง (heating block) 4.1.7 ตู้อบ ( hot air oven ) 4.2 เครือ่ งแก้วและอุปกรณ์ 4.2.1 solid phase extraction (SPE) ชนดิ DSC-MCAX หรือเทยี บเท่า 4.2.2 micropipette และ micropipette tips ขนาด 50-200 µl และ 1-5 ml