บทที่ 11 Amino acid and Protein

บทที่ 11 กรดอะมิโนและโปรตีน (Amino Acid and Protein) แผนการสอนประจำบท เนอ้ื หาประจำบท 11.1 โครงรา( งของกรดอะมิโน 11.2 จดุ ไอโซอเิ ลก็ ตริกและอิเล็กโตรโฟรีซีส 11.3 การสังเคราะหBกรดอะมิโน 11.4 เพปไทดBและโปรตีน 11.5 การสังเคราะหBโพลเี พปไทดB 11.6 โครงสร(างของโปรตนี 11.7 แบบฝกL หัดเสรมิ ความเข(าใจ วตั ถุประสงคก8 ารเรียนรป=ู ระจำบท เพอ่ื ให(เข(าใจลกั ษณะทวั่ ไปของกรดอะมโิ นและโปรตีน เพื่อให(เขา( ใจโครงสรา( งพืน้ ฐานของกรดอะมโิ นและโปรตีน วธิ ีการสอนและกิจกรรมการเรียนการสอนประจำบท บรรยายผาW นระบบออนไลนB google meet, google classroom, Microsoft team และ BUU LMS ตอบข(อซักถามของผู(เรยี น การถาม-ตอบระหวาW งผ(สู อนและผูเ( รยี น ใหผ( ูเ( รยี นทำแบบฝกL หัด ส่ือการเรียนการสอน เอกสารประกอบคำสอนรายวิชา 30322463 เคมอี ินทรียB 2 (สำหรับนิสิตเภสชั ศาสตรB) คอมพวิ เตอรB ไอแพด และ Power Point การวดั ผลและประเมนิ ผล แบบฝLกหัด และข(อสอบ สงั เกตความสนใจของผูเ( รยี น และการแสดงความคิดเห็นของผเ(ู รยี น

บทท่ี 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน บทนำ (Introduction) โปรตีน (protein) เปนx สารชีวโมเลกลุ ขนาดใหญW พบมากทีส่ ุดในสง่ิ มีชวี ติ เชนW เอนไซมB (enzyme) ฮอรโB มน (hormone) แอนต้ไี บโอติก (antibiotic) รวมถงึ เส(นผมและกลา( มเน้อื เปxนต(น โปรตนี มีมากมายหลายชนดิ โดยแตWละชนิดมคี วามแตกตาW งกนั และมีหน(าที่ทางชวี ภาพตWางกันไป เชนW ทำ หนา( ทเ่ี ปxนตัวเรWงปฏิกริ ิยาในราW งกาย ทำหนา( ทข่ี นสWงและเก็บสะสมสารตาW งๆ ถWายทอดกระแสประสาท ควบคมุ การ เจริญเตบิ โต และเปxนภมู คิ (ุมกันใหแ( กรW าW งกาย เปxนต(น โปรตนี เปxนพอลเิ มอรBขนาดใหญW ประกอบด(วยหนWวยยWอย คอื “กรดอะมิโน (amino acid)” ตWอกนั ด(วย พนั ธะเอไมดB หรือเรียกวWา “พนั ธะเปปไทดB (peptide bond)” 11.1 โครงสร8างของกรดอะมิโน (Structure of Amino Acid) กรดอะมโิ น (amino acid) มีโครงสร(างเปxนแบบ a-amino acid ที่หมอูW ะมโิ น (aminogroup, -NH2) และหมWคู ารBบอกซลิ (carboxyl, -COOH) ตอW อยกูW บั คารBบอนในตำแหนWงแอลฟา (a-carbon) โดยกรดอะมิโนทพี่ บ เปxนองคBประกอบของโปรตนี ประกอบดว( ย 20 ชนดิ และทง้ั 20 ชนิด มีความแตกตาW งกนั ตรงชนดิ ของหมูW R ที่ตWอกบั คารบB อนอะตอมในตำแหนงW a-carbon ดังรปู ท่ี 11-1 รูปที่ 11-1 โครงสร(างของ a-amino acid ถงึ แมว( Wาโครงสร(างของ a-amino acid จะนิยมเขียนอยใูW นรปู ทไ่ี มWมีประจุ (unionized form) แตเW น่อื งจาก a-amino acid มีหมูW amino (NH2) และหมWู carboxyl (-COOH) ทีส่ ามารถเกิดปฏิกริ ยิ ากรดเบสกนั ได( ทำให( โครงสรา( งของ a-amino acid สามารถแสดงอยใWู นรปู ของ zwitterion (internal salt) ดังรูปที่ 11-2 รูปท่ี 11-2 โครงสร(าง zwitterion ของ a-amino acid โดยในสภาวะที่เปนx กรด (pH ต่ำ) amino acid จะอยูใW นรูปของประจุบวก (cation) โดย zwitterion ของ amino acid จะรับโปรตอน ( H ) ได(เปนx cation สWวนในสภาวะท่ีเปxนเบส (pH สงู ) amino acid จะอยใูW นรปู ของ ประจลุ บ (anion) โดย zwitterion ของ amino acid จะสญู เสียโปรตอน ( H ) ได(เปxน anion ดงั รปู ท่ี 11-3 ผศ.ดร. อุทัยวรรณ ศริ อิ /อน ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 324

บทท่ี 11 กรดอะมโิ นและโปรตนี รูปที่ 11-3 โครงสรา( งทอ่ี ยูใW นรปู ของ cation และ anion ของ a-amino acid โดยสามารถแบWงกรดอะมโิ นท้งั 20 ชนิด ออกเปนx 3 กลWุม ตามชนิดของหมWู R ดังนี้ 1. หมWู R เปนx กลมWุ ทีไ่ มWมีขว้ั (amino acid with nonpolar side chain) ไดแ( กW ไกลซีน (glycine) อะลานีน (alanine) แวรีน (valine) ลวิ ซีน (leucine) ไอโซลิวซนี (isoleucine) เมไทโอนนี (methionine) โพรลีน (proline) ฟŽนลิ อะลานนี (phenylalanine) และ ทริปโตเฟน (trypyophene) แสดงดังรปู ท่ี 11-4 รปู ท่ี 11-4 โครงสรา( งของ a-amino acid ที่ไมมW ีขัว้ 2. หมWู R เปนx กลมWุ ทม่ี ขี ้ัวแตไW มมW ีประจุ (amino acid with uncharged polar side chain) ได(แกW เซรีน (serine) ทรีโอนีน (threonine) แอสพาราจีน (Asparagine) กลตู ามนี (glutamine) ไทโรซีน (tyrosine) และ ซิส เทอีน (cysteine) แสดงดงั รปู ท่ี 11-5 รูปที่ 11-5 โครงสร(างของ a-amino acid ที่มีขั้วแตWไมมW ีประจุ 325 ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศริ ิอ/อน ภาควชิ าเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตีน 3. หมWู R เปxนกลมWุ ทมี่ ขี ้วั แบบมปี ระจุ (amino acid with charged polar side chain) ไดแ( กW ไลซีน (lysine) อารจB ีนนี (arginine) ฮีสตดิ นี (histidine) กรดแอสพารBตกิ (aspartic acid) และ กรดกลูตามกิ (glutamic acid) แสดงดงั รูปที่ 11-6 รปู ที่ 11-6 โครงสรา( งของ a-amino acid ที่มีขว้ั และมปี ระจุ สเตอริโอเคมีของกรดอะมิโน กรดอะมิโนมไี ครัลคารบB อน 1 ตำแหนงW (ยกเวน( ไกลซนี ) และมีสเตอรโิ อไอโซเมอรไB ด( 2 แบบ คือ D-form และ L-form เชWนเดยี วกบั สเตอริโอไอโซเมอรขB องโมโนแซคคาไรดB การพิจารณาชนดิ ไอโซเมอรBของกรดอะมโิ นให( เทยี บกบั โครงสรา( งแบบฟ‘ชเชอรB (Fischer projection) ของกลีเซอรลั ดีไฮดB (glyceraldehyde) โดยให(หมอูW ะมโิ น (amino, -NH2) วางตวั ในแนวเดยี วกับหมไWู ฮดรอกซลิ (-OH) ของโมโนแซคคาไรดB และพจิ ารณาดงั นี้ • ถ(าหมWูอะมโิ น (-NH2) อยทWู างดา( นขวาจะเปนx แบบ D-form • ถ(าหมWอู ะมิโน (-NH2) อยWูทางดา( นซ(ายจะเปนx แบบ L-form โดยที่ D-form และ L-form เปนx ไอโซเมอรแB บบ “อีแนนทโิ อเมอรB (enantiomer)” ท่ีเปนx ภาพสะท(อนใน กระจกเงา (mirror image) ซงึ่ กนั และกนั และในธรรมชาตพิ บกรดอะมิโนที่มีสเตอริโอไอโซเอรBแบบ L- form แสดง ดังรปู ที่ 11-7 รปู ท่ี 11-7 สเตอรโิ อไอโซเมอรBของกรดอะมิโน โครงสรา( งของ a-amino acid สามารถแตกตัวให(โปรตอนได(มากกวWา 1 ตำแหนWง ได(แกW ตำหนWง a-COOH, α-NH3 และ side chain สำหรบั amino acid บางตวั โดยแสดงคWา pKa ของ amino acid แตลW ะชนดิ ดงั ตาราง ที่ 11.1 ถงึ 11.3 ผศ.ดร. อทุ ยั วรรณ ศิรอิ อ/ น ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บูรพา 326

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตนี ตารางท่ี 11.1 แสดงคWา pKa ของกรดอะมโิ นที่เปนx nonpolar และ polar side chain ชนดิ ของกรดอะมโิ น pKa ของ a-COOH pKa ของ α-NH3 alanine 2.35 9.87 asparagine 2.02 8.80 glutamine 2.17 9.13 glycine 2.35 9.78 isoleucine 2.32 9.76 leucine 2.33 9.74 methionine 2.28 9.21 phenylalanine 2.58 9.24 proline 2.00 10.60 serine 2.21 9.15 threonine 2.09 9.10 tryptophan 2.38 9.39 valine 2.29 9.72 ตารางท่ี 11.2 แสดงคาW pKa ของกรดอะมโิ นท่ีเปxน acidic side chain ชนิดของกรดอะมโิ น pKa ของ a-COOH pKa ของα-NH3 pKa ของ side chain side chain group aspartic acid 2.10 9.82 3.86 carboxyl glutamic acid 2.10 9.47 4.07 carboxyl cysteine 2.05 10.25 8.00 sulfhydryl tyrosine 2.20 9.11 10.07 phenolic ตารางที่ 11.3 แสดงคWา pKa ของกรดอะมโิ นทเี่ ปxน basic side chain ชนดิ ของกรดอะมิโน pKa ของ a-COOH pKa ของ α-NH3 pKa ของ side chain side chain group arginine 2.01 9.04 12.48 guanidino histidine 1.77 9.18 6.10 imidazole lysine 2.18 8.95 10.53 1o amino จากตาราง ที่ 11.1 ถึง 11.3 จะเหน็ วาW ความเปxนกรด (acidity) ของ a-carboxyl มคี Wาเฉลยี่ ประมาณ 2.19 ซึง่ มีความเปนx กรดมากวาW acetic acid (CH3COOH, pKa เทาW กับ 4.76) เน่ืองจากผลของ α-NH3 ทเี่ ปนx หมWดู งึ อิเล็กตรอน (electron-withdrawing inductive effect) ซงึ่ อยWูตดิ กับ a-carboxyl ดงั รปู ที่ 11-8 ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศริ อิ อ/ น ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บูรพา 327

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตนี รปู ที่ 11-8 แสดงคาW pKa ของ a-COOH เทียบกับหมWู COOH ของ acetic acid นอกจาก a-COOH ที่มีความเปxนกรดมากกวาW acetic acid (pKa 4.76) เน่อื งจากผลของหมูW α-NH3 ซ่ึง เปนx หมดูW ึงอเิ ลก็ ตรอนแล(ว หมWู α-NH3 ยงั ทำใหห( มWู carboxyl ที่เปนx side chain ของ a-amino acid มคี วามเปxน กรดมากวWา acetic acid ดว( ย ได(แกW aspartic acid มี b-COOH ซ่ึงมคี Wา pKa เทาW กบั 3.86 และ glutamic acid มี g-COOH มคี Wา pKa เทWากับ 4.07 โดยความเปนx กรดของ COOH จะลดลงเมื่อระยะของหมูW α-NH3 หWางออกไป ดงั รูปที่ 11-9 รูปท่ี 11-9 แสดงคWา pKa ของ a-COOH, b-COOH และ g-COOH ของ amino acid ความเปนx กรด (acidity) ของหมWู a-ammonium ( α-NH3 ) มคี Wาเฉลีย่ ประมาณ 9.47 ซง่ึ มีความเปxนกรด มากวWา 1o aliphatic ammonium ion ( RNH3 , pKa เทาW กับ 10.60) เนื่องจากผลของ a-COOH ทีเ่ ปxนหมูดW ึง อิเลก็ ตรอน (electron-withdrawing inductive effect) ซ่งึ อยตูW ิดกับ α-NH3 ดังรูปท่ี 11-10 รปู ท่ี 11-10 แสดงคWา pKa ของ α-NH3 เทยี บกับหมWู 1o aliphatic ammonium ion ในกรณขี อง amino acid ท่ี side chain มคี วามเปนx เบส ไดแ( กW arginine, histidine และ lysine โดยแสดง ความเปนx เบสมากกวWา aliphatic amine รายละเอยี ดดงั นี้ โมเลกุลของกรดอะมโิ นชนดิ arginine มี side chain เปนx หมูW guanidine ซ่งึ มีความเปนx เบสสูง โดยมีคาW pKa ของ conjugate acid เทาW กบั 12.48 เนื่องจากเม่ือหมูW guanidine มีการรับโปรตอนจะเกิดเปนx โครงสร(าง protonated form ที่สามารถเกิดการ resonance stabilization ได(มากถึงสามโครงสร(าง ดังรปู ที่ 11-11 ผศ.ดร. อุทัยวรรณ ศิริอ/อน ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 328

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตีน รปู ที่ 11-11 แสดงความเปนx เบสของหมWู guanidine ของ arginine สWวนโมเลกลุ ของ histidine ซึง่ มีหมูW imidazole เปนx side chain แสดงความเปนx เบสเนื่องจากอเิ ลก็ ตรอน คอูW ิสระบนไนโตรเจนอะตอม (lone pair electron) ที่ไมWได(เปxนสWวนของความเปxนอะโรมาติกของวง imidazole จะ แสดงความเปxนเบส และสามารถรับโปรตอนได( โดยมคี าW pKa ของ conjugate acid เทาW กับ 6.10 และเม่อื รับ โปรตอนและเกิดเปนx โครงสรา( ง protonated form ท่สี ามารถเกิดการ resonance stabilization ดงั รูปที่ 11-12 และแสดงโครงสร(างของ histidine ดงั รูปท่ี 11-13 รูปที่ 11-12 แสดงความเปนx เบสของหมูW imidazole ของ histidine รปู ที่ 11-13 โครงสร(างของ histidine 11.2 จุดไอโซอเิ ลก็ ตริกและอเิ ลก็ โตรโฟรซี ิส (Isoelectric Point and Electrophoresis) กรดอะมิโน (amino acid) เปนx โมเลกลุ ทแ่ี สดงประจุได(ทัง้ บวกและลบขนึ้ กับคWา pH ของสารละลายท่ี amino acid ละลายอยWู โดยในสารละลายกรด (pH ต่ำ) amino acid จะอยWใู นรปู ประจุบวก (cation) เนอ่ื งจากมี การรับโปรตอนจากสารละลายกรด สWวนในสารละลายเบส amino acid จะอยูใW นรปู ประจลุ บ (anion) เนื่องจาก สญู เสียโปรตอนให(กับสารละลายเบส แสดงดงั รปู ท่ี 11-14 ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศิริออ/ น ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 329

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน รูปที่ 11-14 การแตกตัวของ amino acid ในสารละลายที่ pH ตWางๆ โดยเมือ่ นำ amino acid มาทำการไตเตรตกบั เบส (HO ) จะไดก( ราฟการไตเตรต (titration curve) ดงั รปู ท่ี 11-15 จากกราฟเมอื่ คWา pH ของสารละลายเพมิ่ ขน้ึ จนถึงจดุ ท่ีประจบุ วกเทาW กับประจุลบ โมเลกุลของ amino acid จะอยใWู นรูปที่ zwitterion คือมีประจสุ ุทธเิ ปนx ศนู ยB และเรยี ก pH ทที่ ำให( amino acid มปี ระจุเปxนศูนยวB าW pI หรอื isoelectric point โดยในกรณีของ glycine มีคWา pI เทาW กบั 6.00 รปู ท่ี 11-15 กราฟการไตเตรตของ glycine ดดั แปลงจาก: Wade, L. G. (2016). Organic Chemistry. UK: Pearson. (9th ed.) isoelectric point (pI) คอื pH ที่ amino acid, polypeptide หรือ protein มีประจสุ ุทธิ (net charge) เปนx ศนู ยB การหาจดุ pI จะหาจากโครงสรา( งของ amino acid, polypeptide หรือ protein ท่มี ี net charge เปนx 0 โดยการนำคWา pKa ของการแตกตัวใหโ( ประตอนระหวาW งโครงสรา( งท่มี ี net charge เปxนศนู ยมB าคำนวณ ซ่งึ ในกรณี ท่ี amino acid เปxนชนดิ nonpolar และ polar side chain ท่ไี มมW ี side chain ทแี่ ตกตวั ใหโ( ปรตอนได( การหาคWา pI จะนำคาW pKa ของ a-COOH และ pKa ของ α-NH3 มาคำนวณโดยตรง แสดงตัวอยาW งการคำนวณคWา pI ของ glycine ดงั รูปท่ี 11-16 ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศิริออ/ น ภาควชิ าเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 330

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตีน รปู ท่ี 11-16 การคำนวณคWา isoelectric point ในขณะท่ี amino acids ในกลมWุ ที่มี side chain ทส่ี ามารถแตกตวั ใหโ( ปรตอนได( ไดแ( กW aspartic acid, glutamic acid, cysteine, tyrosine, arginine, histidine และ lysine จะพจิ ารณาจากโครงสร(างท่ีมี net charge เปxน 0 โดยนำคWา pKa ระหวาW งโครงสร(างทมี่ ี net charge เปxน 0 มาคำนวณ แสดงผลดังตารางท่ี 11.4 ตารางที่ 11.4 แสดงคWา isoelectric point ของ amino acid ชนิดของกรดอะมโิ น pKa ของ a-COOH pKa ของ α-NH3 pKa ของ side chain pI alanine 2.35 9.87 - 6.11 - 5.41 asparagine 2.02 8.80 - 5.65 glutamine 2.17 9.13 - 6.06 - 6.04 glycine 2.35 9.78 - 6.04 isoleucine 2.32 9.76 - 5.74 - 5.91 leucine 2.33 9.74 - 6.30 methionine 2.28 9.21 - 5.68 phenylalanine 2.58 9.24 - 5.60 - 5.88 proline 2.00 10.60 - 6.00 serine 2.21 9.15 3.86 2.98 4.07 3.08 threonine 2.09 9.10 8.00 5.02 tryptophan 2.38 9.39 10.07 5.63 valine 2.29 9.72 12.48 10.76 6.10 7.64 aspartic acid 2.10 9.82 10.53 9.74 glutamic acid 2.10 9.47 cysteine 2.05 10.25 tyrosine 2.20 9.11 arginine 2.01 9.04 histidine 1.77 9.18 lysine 2.18 8.95 อเิ ล็กโตรโฟรซี สิ (electrophoresis) เปxนกระบวนการแยกสารโดยอาศยั ความหนาแนนW ของประจุบน โครงสร(างสาร (electric charge) ทีต่ Wางกัน ซง่ึ กระบวนการ electrophoresis ของกรดอะมิโน จะสามารถแยก ผศ.ดร. อุทัยวรรณ ศริ อิ /อน ภาควชิ าเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 331

บทท่ี 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน กรดอะมโิ นท่ีมีประจตุ าW งกันได( โดย amino acid จะเคลอื่ นท่ีไปยังขัว้ อเิ ลก็ โทรด (electrode) ทมี่ ปี ระจตุ รงข(าม ซึ่ง amino acid ทม่ี ี net charge เปนx บวกจะเคล่ือนทไ่ี ปยงั ข้วั cathod (-) สวW น amino acid ทมี่ ี net charge เปxน ลบจะเคล่อื นท่ไี ปยงั ขัว้ anode (+) โมเลกุลท่มี คี วามหนาแนWนของประจสุ งู จะเคลอ่ื นทไ่ี ดไ( วกวาW โมเลกุลทม่ี คี วาม หนาแนนW ของประจตุ ำ่ สWวนโมเลกลุ ทมี่ ี net charge เปxนศูนยB หรอื อยูWทจ่ี ุด pI จะไมWเคลอื่ นที่ ดังรปู ที่ 11-17 รูปท่ี 11-17 แสดงกระบวนการแยกสารด(วยเทคนคิ electrophoresis ดัดแปลงจาก: Wade, L. G. (2016). Organic Chemistry. UK: Pearson. (9th ed.). การทดสอบ amino acid จะทดสอบดว( ยสารละลายนนิ ไฮดริน เรียกวWา ninhydrin test โดย amino acid จะทำปฏกิ ริ ยิ ากับสาร ninhydrin ไดเ( ปxนสารละลายสีมวW ง ยกเวน( proline จะไดเ( ปxนสารละลายสีสม( แสดงปฏิกริ ยิ า ระหวWาง amino acid กบั ninhydrin ดงั รปู ที่ 11-18 และกลไกดงั รูปที่ 11-19 รูปที่ 11-18 ปฏิกิรยิ าระหวาW ง amino acid กับ ninhydrin ผศ.ดร. อทุ ยั วรรณ ศิริออ/ น ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 332

บทที่ 11 กรดอะมิโนและโปรตนี รปู ท่ี 11-19 กลไกการเกิดปฏกิ ริ ิยาระหวWาง amino acid กับ ninhydrin 11.3 การสังเคราะหJกรดอะมิโน (Synthesis of Amino Acid) การสงั เคราะหBกรดอะมิโน (amino acid) โดยท่ัวไปประกอบดว( ย 4 วิธี ดงั น้ี 11.3.1 ปฏิกิริยา reductive amination ปฏิกิรยิ า reductive amination ของแอลดไี ฮดBและคโี ตน เปxนปฏกิ ิรยิ าการสังเคราะหB amine (บทที่ 7) ซ่งึ สามารถนำมาใช(ในการสังเคราะหB amino acid ได( โดยใชส( ารตง้ั ต(นเปนx a-ketoacid ทำปฏิกริ ิยากบั ammonia ท่ีมากเกนิ พอ (excess NH3) ได(เปนx สาร imine จากน้นั imine เกดิ การรดี ิวซBไปเปxน amine ภายใตต( ัวเรงW ปฏกิ ิริยา คอื H2 และ palladium (Pd) ซ่ึงในสภาวะนี้หมูW carboxyl (-COOH) จะไมWถกู รีดิวซB ไดผ( ลติ ภณั ฑBสุดทา( ยเปxน a- amino acid ดังรปู ท่ี 11-20 รูปท่ี 11-20 ปฏิกิริยาการสงั เคราะหB amino acid โดยวิธี reductive amination โดยวธิ นี ้สี ามารถสงั เคราะหB a-amino acid ไดใ( นข้ันเดยี ว โดยนำ a-ketoacid ทำปฏกิ ิริยากบั NH3 และ แกŸส H2 ใช(ตัวเรWงปฏิกิรยิ าเปนx Pd ได(ผลิตภัณฑBเปนx a-amino acid ท่เี ปxนของผสมราซีมิก (racemic a-amino acid) ดงั ตัวอยWางการสังเคราะหB (D,L)-phenylalanine จาก 3-phenyl-2-oxopropanoic acid ดงั รปู ท่ี 11-21 ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศิรอิ /อน ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 333

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตนี รูปท่ี 11-21 ตวั อยาW งปฏกิ ริ ยิ าการสงั เคราะหB amino acid โดยวิธี reductive amination นอกจากน้ี ตัวรดี ิวซB (reducing agent) ท่ใี ชใ( นปฏกิ ริ ิยา reduction ของ imine ไปเปนx amine สำหรบั การสังเคราะหB a-amino acid อาจใชเ( ปxน NaBH4 ไดเ( นื่องจาก NaBH4 ไมWสามารถรดี ิวซBหมWู หมWู carboxyl (-COOH) ได(เชนW เดยี วกบั สภาวะท่ีใช( H2/Pd ดงั รูปที่ 11-22 รูปที่ 11-22 ตวั อยาW งปฏิกิรยิ าการสังเคราะหB amino acid โดยใช( NaBH4 เปนx ตัวรีดิวซB 11.3.2 ปฏิกริ ิยา amination ของ a-halo acid การสังเคราะหB a-amino acid จากสารต้ังตน( ชนิด a-halo acid ทำปฏิกิริยากับแอมโมเนียที่มากเกินพอ (excess ammonia, NH3) จะไดผ( ลติ ภณั ฑเB ปนx ของผสมราซมี ิก (racemic a-amino acid) โดย a-halo acid ทใ่ี ช( เปนx สารต้ังต(นในการสังเคราะหB a-amino acid นีเ้ ตรียมจากปฏกิ ิริยา Hell-Volhard-Zelinsky (HVZ) reaction (บทที่ 4) แสดงดงั รูปท่ี 11-23 รูปท่ี 11-23 การสังเคราะหB a-amino acid จากปฏกิ ิริยา amination ของ a-halo acid ตัวอยาW งการสงั เคราะหB (D,L)-phenylalanine จาก 3-phenylpropanoic acid ดังรปู ที่ 11-24 รูปท่ี 11-24 การสังเคราะหB a-amino acid จากปฏิกิรยิ า amination ของ a-halo acid ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศริ อิ อ/ น ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บรู พา 334

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตนี 11.3.3 ปฏกิ ริ ยิ า Strecker synthesis การสังเคราะหB a-amino acid ด(วยวิธี Strecker synthesis ใช(สารต้ังต(นเปนx aldehyde ทำปฏิกริ ยิ ากับ ammonia (NH3) และ HCN ไดเ( ปxน a-amino nitrile จากนั้นทำการไฮโดรไลซีสหมูW nitrile (-CN) ไปเปนx หมWู carboxyl (-COOH) ดังรปู ที่ 11-25 รปู ที่ 11-25 การสงั เคราะหB a-amino acid จากปฏิกิริยา Strecker reaction โดยกลไกการเกิดปฏกิ ิริยาในขั้นแรกเปxนการทำปฏกิ ิริยาระหวWาง aldehyde กบั ammonia (NH3) ได( ผลติ ภณั ฑBเปนx imine จากนั้นในข้นั ทีส่ อง imine รับโปรตอนไดเ( ปนx protonated imine (activate form) และทำ ปฏิกิริยา cyanide ion (CN ) ไดเ( ปนx a-amino nitrile และข้ันทีส่ าม หมูW cyano (-CN) ของ a-amino nitrile ถกู hydrolysis ไดผ( ลติ ภัณฑBเปxน a-amino acid แสดงกลไกดงั รูปท่ี 11-26 รูปท่ี 11-26 ไกกลการเกิดปฏิกิรยิ า Strecker reaction 11.3.4 ปฏกิ ิรยิ า amidomalonate synthesis การสังเคราะหB a-amino acid จากสารต้ังต(น diethyl acetamidomalonate ทำปฏิกริ ยิ าในสภาวะเบส ได(เปxนสาร enolate ion จากนั้น enolate ion ทำปฏกิ ิรยิ ากับ 1o alkyl halide ผาW นปฏกิ ิรยิ า alkylation ตาม ดว( ยปฏิกริ ยิ า hydrolysis หมูW ester ใหเ( ปxน carboxylic acid จากนนั้ decarboxylation เอา carbon dioxide (CO2) ออก 1 หมWู ได(ผลติ ภณั ฑเB ปนx a-amino acid ดังรปู ที่ 11-27 ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศิริอ/อน ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 335

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน รูปที่ 11-27 ปฏิกิริยาการสังเคราะหB a-amino acid ดว( ยวิธี amidomalonate synthesis การสังเคราะหB a-amino acid จะไดผ( ลิตภณั ฑเB ปxนของผสมราซมี ิก (racemic a-amino acid) ซ่ึงสามารถ แยกออกจากกนั ได(โดยการทำ resolution โดยนำ racemic a-amino acid ซงึ่ เปxนโมเลกุลไครัสมาทำปฏิกิริยาที่ หมูW NH2 กับไครัสโมเลกลุ ได(ผลิตภัณฑBเปนx 2 distereomeric salts ทส่ี ามารถแยกได(ด(วยวธิ ี crystallization หรือ chromatography หรอื การทำ resolution โดยใช(เอนไซมเB รยี กวาW enzymatic resolution โดยนำ racemic a- amino acid ทำปฏกิ ิรยิ า acylation ได(เปxน acylate amino acid จากน้ันทำปฏิกิริยากับเอนไซมB โดยเอนไซมเB ปxน ไครลั โมเลกลุ และมคี วามเฉพาะในการเกดิ ปฏกิ ริ ิยา โดยจะทำปฏกิ ิรยิ าเฉพาะ L-configuration ดงั รปู ที่ 11-28 รปู ที่ 11-28 การทำ enzymatic resolution สำหรับแยก racemic a-amino acid 11.4 เพปไทดแJ ละโปรตีน (Peptide and Protein) เพปไทดB (peptide) เกิดจากการรวมกันของ a-amino acid ตง้ั แตWสองโมเลกุลขนึ้ ไป และสายของ peptide มีแอลฟาอะมิโน (a-NH2) ของกรดอะมโิ นตวั แรกอยูWแบบอสิ ระด(านซา( ยมอื เรียกวาW “ปลายเอ็น (N- terminal)” และกรดอะมโิ นตวั สุดท(ายเปxนหมWคู ารBบอกซิล (-COOH) อยWูแบบอสิ ระด(านขวามอื เรยี กวWา “ปลายซี (C-terminal)” โดยการเขยี นลำดบั กรดอะมโิ นในสายโพลีเพปไทดBเรมิ่ ตน( จาก N-terminal ไปยงั C-terminal แสดง ดังรูปท่ี 11-29 ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศริ อิ /อน ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บรู พา 336

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตนี รูปท่ี 11-29 โครงสรา( งของโพลเี พปไทดB การรวมกันของ a-amino acid จะเชอ่ื มกันดว( ยพันธะเอไมดB (amide bond) หรอื เรยี กวาW พันธะเพปไทดB (peptide bond) ผWานปฏกิ ริ ิยาการควบแนWน (condensation) ระหวWางหมWู carboxyl (a-COOH) ของ amino acid ตัวแรกกบั หมWู amino (a-NH2) ของ amino acid ตัวทสี่ อง ดังรูปที่ 11-30 รูปที่ 11-30 การรวมกันของ a-amino acid เกดิ เปนx เพปไทดB เพปไทดB (peptide) แบงW เปนx ประเภทตามจำนวนของกรดอะมิโนทม่ี ารวมกนั ได(ดังนี้ 1) ไดเพปไทด8 (dipeptide) เปxนเพปไทดทB ่เี กิดจากการรวมกนั ของ a-amino acid 2 โมเลกลุ ประกอบด(วย 1 พันธะเพปไทดB ตวั อยWางเชนW serylalanine (Ser-Ala หรือ S-A) เกิดจากการรวมกนั ระหวWาง serine กับ alanine โดยใชห( มWู -COOH ของ serine (amino acid ตัวแรก) ทำปฏิกริ ิยากับหมูW -NH2 ของ alanine (amino acid ตัวท่สี อง) ไดเ( ปนx พนั ธะเพปไทดB ดังรูปที่ 11-31 รปู ที่ 11-31 การเกิด dipeptide 2) ไตรเพปไทด8 (tripeptide) เปxนเพปไทดทB ี่เกดิ จากการรวมกนั ของ a-amino acid 3 โมเลกลุ ประกอบดว( ย 2 พนั ธะเพปไทดB ยกตวั อยาW งเชนW serylphenylalanylaspatic acid (Ser-Phe-Asp หรอื S-F-D) เกิด จากการรวมกนั ระหวWาง serine, phenylalanine และ aspartic acid ตามลำดับ ดังรปู ท่ี 11-32 ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศิรอิ /อน ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บรู พา 337

บทท่ี 11 กรดอะมโิ นและโปรตนี รปู ที่ 11-32 การเกดิ tripeptide 3) โพลีเพปไทด8 (polypeptide) เปxนเพปไทดBที่เกิดจากการรวมกันของ a-amino acid หลายโมเลกุล ประมาณสบิ โมเลกลุ ของกรดอะมโิ น 4) โปรตีน (protein) เปนx โพลีเพปไทดทB ่เี ปนx ไบโอโมเลกุลขนาดใหญW (biological macromolecule) มี น้ำหนักโมเลกุลประมาณ 5000 g/mol ประกอบดว( ยสายโพลีเพปไทดมB ากกวWาหนง่ึ สาย 11.5 การสังเคราะหJเพปไทดJ (Synthesis of Peptide) การสงั เคราะหBเพปไทดB จะนำกรดอะมิโน 2 โมเลกุล มาทำปฏิกิริยา condensation โดยใช(หมูW carboxyl (-COOH) ของ amino acid (aa1) ตัวแรกทำปฏกิ ริ ิยากบั หมWู amino (NH2) ของกรด amino acid (aa2) ตวั ทส่ี อง ไดผ( ลิตภณั ฑทB ีม่ ลี ำดับกรดอะมิโนเปxน aa1-aa2 ตามตอ( งการ ดงั รูปท่ี 11-33 อยาW งไรก็ตาม การสังเคราะหBเพปไทดBอาจทำใหไ( ดผ( ลิตภณั ฑBทีไ่ มWต(องการ เนอ่ื งจากเกิดปฏกิ ริ ยิ าระหวWางหมูW carboxyl ของ amino acid (aa2) ตัวท่สี องกบั หมWู amino ของกรด amino acid (aa1) ตัวแรก ได(ผลติ ภัณฑBท่มี ี ลำดับกรดอะมโิ นสลบั เปxน aa2-aa1 หรือเกดิ จากกรดอะมิโนท้งั สองทำปฏกิ ิรยิ ากันเอง ไดผ( ลติ ภัณฑเB ปนx aa1-aa1 และ aa2-aa2 รูปท่ี 11-33 ปฏิกริ ิยาการสังเคราะหBเพปไทดB วธิ กี ารแก(ไขคอื การทำการปอ£ งกันหมูWท่ีไมตW (องการใหเ( กิดปฏกิ ริ ยิ า โดยมีข้ันตอนการสงั เคราะหเB พปไทดB 3 ขัน้ ตอน ดงั น้ี 1) การปอ£ งกันหมWู a-amino (NH2) ของกรดอะมิโนตัวแรก (aa1) ไมWใหเ( กดิ ปฏกิ ริ ิยา 2) การ activate หมูW a-carboxyl (COOH) ของกรดอะมโิ นตัวแรก (aa1) ใหเ( กิดปฏิกริ ิยาเรว็ ขึ้น 3) การป£องกนั หมูW a-carboxyl (COOH) ของกรดอะมิโนตัวท่สี อง (aa2) ไมใW หเ( กดิ ปฏกิ ิริยา กลยทุ ธB (strategy) การสงั เคราะหBเพปไทดB ประกอบดว( ยหมWู protecting group (Z) หมWู activating group (Y) และหมูW protecting group X) ซ่งึ จะไดผ( ลิตภัณฑBเปxน dipeptide ทม่ี ีหมูW protecting groups (Z, X) คงอยูW (Z-aa1-aa2-X) แสดงดงั รปู ท่ี 11-34 ผศ.ดร. อทุ ยั วรรณ ศิรอิ อ/ น ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บรู พา 338

บทที่ 11 กรดอะมิโนและโปรตนี รปู ท่ี 11-34 กลยุทธกB ารสังเคราะหเB พปไทดB โดยหลังจากการสงั เคราะหเB ปนx dipeptide หมูW protecting group (Z) จะถูกนำออก จากน้ันจะเกิดการ สงั เคราะหBเปxนโพลีเพปไทดตB อW เนอ่ื งไปทางด(าน N-terminal ในขณะที่ถ(าหมWู protecting group (X) ถูกนำออก การ สังเคราะหBโพลีเพปไทดจB ะตอW เน่ืองไปทางดา( น C-terminal โดยหมูW protecting group และ activating group ที่ ใช(ในการสังเคราะหเB พปไทดB มีดงั น้ี 1. Amino-protecting group การปอ£ งกนั หมWู amino (NH2) ของ amino acid ไมWใหเ( กดิ ปฏกิ ริ ิยาหรอื ลดความเปxน nucleophilicity ของ หมูW amino (NH2) ทำโดยเปลย่ี นเปนx หมูW amide โดยการทำปฏกิ ริ ิยาระหวาW งหมูW amino (NH2) กบั สารประกอบท่ี เปนx carboxylic derivative ซง่ึ ตวั ที่นิยมใช(เปนx amino-protecting group ในการสังเคราะหเB พปไทดB ไดแ( กW benzyloxycarbonyl chloride ได(เปนx หมูW benzyloxycarbonyl ซึ่งใช(สญั ลักษณBเปxนหมWู Z หรอื Cbz อีกตวั คอื di-tert-butyl dicarbonate ได(เปxนหมูW tert-butoxycarbonyl ซ่ึงใชส( ญั ลักษณBเปนx หมูW BOC ดงั รปู ที่ 11-35 รปู ท่ี 11-35 แสดงโครงสร(างของสารทใ่ี ช(เปนx amino-protecting group ในการสงั เคราะหเB พปไทดB ปฏกิ ริ ยิ าระหวาW งหมูW amino (NH2) ของ amino acid กบั สารที่เปนx amino-protecting group ได( ผลิตภัณฑเB ปนx สารประกอบ carbamate (ester ของ carbamic acid) ยกตัวอยWางเชนW ปฏิกิริยาระหวาW ง benzyloxycabonyl chloride กับ alanine ดังรปู ที่ 11-36 รูปท่ี 11-36 ปฏกิ ิริยาการป£องกนั หมูW amino ของ amino acid ด(วย benzyloxycarbonyl chloride (Z-Cl) สาร carbonate ทไ่ี ด(จะมีความเสถยี รในสารละลายเบส (base solution) แตสW ามารถหลุดออกได(ใน สารละลายกรด (acid solution) ดังนัน้ หลงั การสังเคราะหBเพปไทดB ในข้นั ตอนสดุ ทา( ยจะทำการเอาหมWู carbonate ออก หรอื เรียกวWาการทำ deprotecting group ซง่ึ จะทำในสภาวะกรด เชWน การใชก( รด HBr ในสารละลายกรด ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศิรอิ /อน ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บรู พา 339

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน acetic acid (CH3COOH) ได(เปxนหมWู amino (NH2) และ benzyl bromide กับแกŸส CO2 ดังรปู ที่ 11-37 แสดง กลไกดังรูปท่ี 11-38 รปู ที่ 11-37 การทำ deprotecting group ของหมูW carbonate ในสภาวะกรด รปู ท่ี 11-38 กลไกการทำ deprotecting group ของหมWู carbonate ในสภาวะกรด อยาW งไรก็ตาม การ deprotecting group หมูW carbonate ในสภาวะกรด สามารถทำให(เกดิ การแตกพันธะ เพปไทดไB ด( (hydrolysis) ดังนัน้ อีกหนึง่ วธิ ที ส่ี ามารถใชใ( นการ deprotection หมูW carbonate แทนการใช(กรด เพ่ือ หลกี เลยี่ งการแตกพนั ธะเพปไทดB คือการใชแ( กŸส H2 และตัวเรWงปฏิกริ ิยาทเี่ ปxนโลหะทรานสิชนั เชWน palladium (Pd) ผาW นปฏกิ ิริยาท่เี รียกวาW hydrogenolysis ดังรปู ที่ 11-39 รปู ท่ี 11-39 การทำ deprotecting group ของหมWู carbonate ผาW นปฏิกริ ิยา hydrogenolysis สำหรบั protecting group ท่ีเปนx tert-butoxycarbonyl (-BOC) จะได(ผลิตภัณฑBเปนx carbonate ท่ี สามารถทำการ deprotection ไดด( (วย trifluoroacetic acid (CF3COOH, TFA) ดงั รปู ที่ 11-40 รปู ท่ี 11-40 ปฏิกริ ยิ าการป£องกนั หมWู amino ของ amino acid ดว( ย di-tert-butyl dicarbonate (BOC) ผศ.ดร. อทุ ยั วรรณ ศริ อิ /อน ภาควชิ าเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 340

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตนี 2. Carboxyl-protecting group การป£องกนั หมูW carboxyl (COOH) ของ amino acid ไมWใหเ( กดิ ปฏกิ ิริยา ทำโดยเปลยี่ นเปxนหมWู ester ผาW น ปฏิกริ ยิ า esterification ระหวาW งหมWู COOH ของ amino acid กบั แอลกอฮอลB ได(แกW methanol, ethanol หรอื benzyl alcohol ได(ผลิตภณั ฑBเปนx methyl, ethyl หรือ benzyl ester ตามลำดับ ซ่งึ หลังจากการสังเคราะหB เพป ไทดB ในขน้ั ตอนสุดท(ายจะทำการเอาหมWู ester ออก โดยในกรณขี อง methyl และ ethyl ester จะทำปฏกิ ริ ยิ า ไฮโดรไลซสิ ในสารละลายเบส (NaOH) หรือสารละลายกรด ( H3O ) สวW น benzyl ester จะทำปฏกิ ิรยิ า hydrogenolysis โดยใช( H2/Pd ดงั รูปที่ 11-41 หรือในสภาวะกรด HBr/CH3COOH กไ็ ดเ( ชนW กัน รูปท่ี 11-41 ปฏิกริ ยิ าการปอ£ งกนั หมWู carboxyl ของ amino acid 3. Activate-carboxyl group รีเอเจนตทB ี่ใช(ในการ activate หมูW carboxyl สำหรบั การสังเคราะหเB พปไทดB ได(แกW 1,3-dicyclohexyl- carbodiimide (DCC) ซง่ึ เมอ่ื ทำปฏกิ ริ ิยาน้ำจะไดเ( ปxนสรประกอบยูเรียทมี่ ชี ือ่ วWา N,N’-dicylcohexylurea (DCU) ดังรปู ที่ 11-42 รูปที่ 11-42 โครงสรา( งของ DCC และ DCU ปฏกิ ิรยิ าการสงั เคราะหBเพปไทดB ทำโดยนำ amino acid ตัวแรกท่ี protect หมWู a-amino (Z-aa1) มาทำ ปฏิกริ ิยากบั amino acid ตัวท่สี องท่ี protect หมWู a-COOH (aa1-OCH3) โดยใชร( ีเอเจนตเB ปนx DCC ดงั รูปท่ี 11-43 และแสดงกลไกดงั รปู ที่ 11-44 ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศิริออ/ น ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 341

บทที่ 11 กรดอะมิโนและโปรตีน รูปท่ี 11-43 ปฏกิ ริ ยิ าการสงั เคราะหเB พปไทดBโดยใช( DCC รูปที่ 11-44 กลไกการเกดิ ปฏกิ ิรยิ าการสงั เคราะหBเพปไทดBโดยใช( DCC การสงั เคราะหเB พปไทดB สามารถทำไดท( ้ังแบบ solution-phase และ solid-phase รายละเอียดดงั น้ี 1. แบบ solution-phase เปนx การสงั เคราะหเB พปไทดBทที่ ำในสารละลาย ประกอบดว( ย 5 ขัน้ ตอนหลกั ยกตวั อยาW งการสงั เคราะหB dipeptide (Ala-Leu) ดังนี้ ทำการ protect หมWู amino ของ amino acid ด(วย BOC (1) ทำการ protect หมWู carboxyl ของ amino acid ดว( ย methyl ester (2) ทำปฏิกิรยิ าการสงั เคราะหBพนั ธะเพปไทดBโดยใช( DCC (3) ทำ การ deprotect หมูW BOC ด(วย trifluoroacetic acid (CH3COOH, TFA) (4) และทำการ deprotect หมWู ester ด(วยปฏิกริ ิยาไฮโดรไลซสิ ในสารละลายเบส (NaOH) (5) ดังรปู ที่ 11-45 ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศิริออ/ น ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บรู พา 342

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน รปู ท่ี 11-45 ขน้ั ตอนการสงั เคราะหB dipeptide (Ala-Leu) ด(วยวธิ ี solution-phase 2. แบบ solid-phase เปxนการสงั เคราะหเB พปไทดโB ดยใช( resin เข(ามาจับกับโมเลกุลของ amino acid โดยเรซินทน่ี ยิ มใช( ไดแ( กW Merrifield resin ซึ่งเปxน polystyrene ดงั รปู ที่ 11-46 และแสดงการสังเคราะหแB บบ solid-phase ดังรูปท่ี 11-47 รูปท่ี 11-46 โครงสร(างของ Merrifield resin ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศิรอิ /อน ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บูรพา 343

บทท่ี 11 กรดอะมโิ นและโปรตนี รูปท่ี 11-47 ข้ันตอนการสงั เคราะหB dipeptide ดว( ยวิธี solid-phase 344 ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศิริออ/ น ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บรู พา

บทที่ 11 กรดอะมิโนและโปรตนี โดยเมื่อเปรียบทยี บการสังคราะหเB พปไทดทB ั้งแบบ solution-phase และ solid-phase จะได(วาW วิธแี บบ solution-phase มขี ้นั ตอนทสี่ น้ั แตหW ลงั จากส้ินสดุ ปฏกิ ิรยิ าตอ( งทำการแยกเพปไทดBดว( ยเทคนิค chromatography แตเW นื่องจากความมีขั้วที่สงู และโมเลกุลทีม่ ขี นาดใหญWของเพปไทดB ทำใหแ( ยกไดย( ากดว( ยเทคนิค chromatography ในขณะทว่ี ิธแี บบ solid-phase สามารถลดขัน้ ตอนการทำใหส( ารบรสิ ทุ ธไ์ิ ด( แสดงดังรูปท่ี 11-48 รปู ท่ี 11-48 เปรียบเทียบกระบวนการสงั เคราะหแB บบ solution-phase และแบบ solid-phase อยาW งไรกต็ าม กระบวนการสังเคราะหเB พปไทดดB ว( ยวิธแี บบ solution-phase สามารถสังเคราะหBเพปไทดB จากลำดบั กรดอะมโิ นจาก N ไป C หรือ C ไป N ได( ในขณะท่ีวิธีแบบ solid-phase จะเปนx การสงั เคราะหแB บบ C ไป N เนื่องจากจากเรซินจะเชอื่ มกับ amino acid ด(าน C-terminal 11.6 โครงสรา8 งของโปรตีน (Structure of Protein) ดงั ทีไ่ ดก( ลาW วมาแล(ว โปรตีนเปxนโพลีเพปไทดB (polypeptide) ท่ีเปxนไบโอโมเลกลุ ขนาดใหญW (biological macromolecule) มนี ำ้ หนักโมเลกลุ ประมาณ 5000 g/mol ประกอบด(วยสายโพลีเพปไทดมB ากกวWาหนง่ึ สาย และ พันธะภายในโมเลกลุ และระหวาW งโมเลกลุ อยูWหลายแบบ ทำใหโ( ปรตนี มโี ครงสร(างได( 4 ระดับ ดงั นี้ ผศ.ดร. อทุ ยั วรรณ ศิริอ/อน ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 345

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตีน 11.6.1 โครงสรา= งปฐมภูมิ (primary structure) เปxนโครงสรา( งของโปรตีนทแี่ สดงลำดบั ของกรดอะมโิ นในสายโพลีเพปไทดB โปรตนี แตลW ะชนดิ จะมจี ำนวน และลำดบั ของกรดอะมโิ นท่เี ฉพาะ การอWานลำดบั ของกรดอะมโิ นอาW นจาก N-terminal ไปยัง C-terminal แสดงดงั รปู ท่ี 11-49 รูปที่ 11-49 โครงสรา( งปฐมภูมขิ องโปรตีน วธิ ีการวิเคราะหชB นิดของกรดอะมิโนในสาย polypeptide ทำการไฮโดรไลซสิ (hydrolysis) พนั ธะเพปไทดB ของ polypeptide ให(ได(เปxนกรดอะมโิ น จากน้นั ทำการวเิ คราะหBชนิดของกรดอะมิโนท่ไี ด(จากการไฮโดรไลซิสด(วย เทคนิค ion-exchange chromatography ตวั อยWางดงั รูปท่ี 11-50 เปนx การวเิ คราะหB amino acid ทไ่ี ด(จากการ ไฮโดรไลซสิ ดว( ยเทคนิค ion-exchange chromatography ทใ่ี ช( Amberlite IR-120 (sulfonated polystyrene resin เปนx เรซินทม่ี หี มูW SO3Na ) โดยทำการวเิ คาะหทB ่ี pH 3.25, 4.25 และ 5.28 ได(ผลดงั รูปท่ี 11-50 ผศ.ดร. อุทัยวรรณ ศริ อิ /อน ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 346

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน รูปที่ 11-50 ตัวอยWางการวเิ คราะหชB นดิ ของกรดอะมโิ นด(วยเทคนิค ion-exchange chromatography ทใ่ี ช( Amberlite IR-120 ท่ี pH ตาW งๆ ดัดแปลงจาก: Brown, W. H., Iverson, B. L., Anslyn, E. & Foote, C. S. (2017). Organic Chemistry. USA: Brooks Cole. (8th ed.) ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศิรอิ /อน ภาควชิ าเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บูรพา 347

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน ปฏกิ ิริยาการแตกพันธะเพปไทด8 1. ปฏกิ ริ ิยาการแตกพันธะเพปไทด8ดว= ย cyanogen bromide (BrCN) ไซยาโนเจนโบรไมดB (BrCN) จะทำปฏกิ ิรยิ าแตกเพปไทดBท่หี มWู carboxyl ของ methionine ได(ผลติ ภณั ฑB เปนx substituted g-lactone ดังรูปที่ 11-51 โดยมกี ลไกการเกดิ ปฏกิ ิรยิ าสามขัน้ ตอน ดังรปู ที่ 11-52 รูปที่ 11-51 ปฏิกริ ิยาการแตกพนั ธะเพปไทดดB ว( ย BrCN ท่ีหมWู carboxyl ของ methionine รปู ท่ี 11-52 กลไกการเกดิ ปฏิกิรยิ าการแตกพนั ธะเพปไทดBด(วย BrCN ทห่ี มูW carboxyl ของ methionine ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศริ ิออ/ น ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 348

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน 2. ไฮโดรไลซสิ พนั ธะเพปไทด8ดว= ยเอนไซม8 (enzyme-catalyzed hydrolysis of peptide bond) เอนไซมสB ามารถแตกพนั ธะเพปไทดไB ด( โดยเอนไซมBแตWละชนดิ จะมคี วามเฉพาะในการแตกพนั ธะเพปไทดB ของกรดอะมิโนท่เี ฉพาะในโมเลกุลของโปรตีน แสดงดงั ตารางที่ 11.5 ตารางท่ี 11.5 การแตกพันธะเพปไทดดB (วยเอนไซมB trypsin และ chymotrypsin เอนไซมB แตกพนั ธะเพปไทดBทห่ี มูW carboxyl ของกรดอะมิโน Trypsin Arginine, lysine Chymotrypsin Phenylalanine, tyrosine, trytophan 3. ปฏกิ ิรยิ าการแตกพนั ธะเพปไทดด8 =วยวธิ ี Edman degradation วิธี Edman degradation เปนx การใช( phenylisothiocyanate ทำปฏิกริ ิยากบั โพลีเพปไทดB ซึ่งจะเกิดการ แตกพันธะเพปไทดทB ี่ปลาย N-terminal ของสายเพปไทดB ดังรูปที่ 11-53 โดยมีกลไกการเกิดปฏิกริ ิยาสามขั้นตอน ดงั รปู ท่ี 11-54 รูปท่ี 11-53 ปฏิกิรยิ าการแตกพนั ธะเพปไทดBด(วยวิธี Edman degradation ผศ.ดร. อทุ ยั วรรณ ศริ อิ /อน ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 349

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตนี รูปที่ 11-54 กลไกการเกดิ ปฏิกริ ยิ าการแตกพันธะเพปไทดดB ว( ยวธิ ี Edman degradation 350 ผศ.ดร. อทุ ยั วรรณ ศริ ิอ/อน ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา

บทท่ี 11 กรดอะมโิ นและโปรตนี 11.6.2 โครงสรา= งทุติยภมู ิ (secondary structure) เปxนโครงสรา( งของโปรตีนทเ่ี กิดจากพันธะไฮโดรเจนภายในสายโพลีเพปไทดBหรอื ระหวWางสายโพลีเพปไทดB เปxนพนั ธไฮโดรเจนระหวาW งหมูW carbonyl (C=O) ของกรดอะมโิ นตัวหน่งึ กบั N-H ของกรดอะมิโนอกี ตัวหนง่ึ โดย อาจอยใูW นสายโพลีเพปไทดเB ดียวกันหรอื คนละสายโพลีเพปไทดได( ดงั รูปที่ 11-55 รูปท่ี 11-55 พันธะไฮโดรเจนทเี่ กดิ ในโมเลกลุ ของโพลีเพปไทดB ทำใหโ( ครงสร(างแบบทตุ ิยภูมิของโปรตีนมลี ักษณะเปxนแบบมว( นตัวหรือเรยี งตัวเปxนแผนW โดยมโี ครงสร(างได( 2 แบบ คอื 1) โครงสรา( งแบบแอลฟาฮลี กิ ซB (a-helix) เกดิ จากพันธะไฮโดรเจนภายในโมเลกลุ ทำให(โครงสร(างมกี าร ม(วนตวั และบดิ เปนx เกลียว ดงั รปู ท่ี 11-56 2) โครงสร(างแบบแผนW เบต(าพลที ซที (b-pleated sheet) เกดิ จากพนั ธะไฮโดรเจนระหวWางสายโพลีเพปไทดB ทอ่ี ยWใู กลก( นั ทำให(โครงสรา( งมลี ักษณะเปนx แผWน ดังรปู ที่ 11-57 รูปที่ 11-56 โครงสรา( งทุตยิ ภมู ิของโปรตีนแบบ a-helix ผศ.ดร. อุทัยวรรณ ศริ อิ /อน ภาควชิ าเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 351

บทที่ 11 กรดอะมิโนและโปรตีน รปู ท่ี 11-57 โครงสร(างทุติยภูมขิ องโปรตนี แบบ b-pleated sheet ดดั แปลงจาก: Brown, W. H., Iverson, B. L., Anslyn, E. & Foote, C. S. (2017). Organic Chemistry. USA: Brooks Cole. (8th ed.) 11.6.3 โครงสรา= งตติยภูมิ (tertiary structure) เปxนโครงสรา( งของโปรตนี ท่ีมกี ารขดตัว และทำใหโ( มเลกุลของโปรตีนมีลักษณะเปนx ก(อนมากขนึ้ เกดิ จาก การยดึ เหนย่ี วระหวWางหมูฟW «งกBชนั ของ side chain ของ amino acid ในโมเลกลุ ของโปรตีน ได(แกW พันธไอออนิก (ionic forcesม, a) พันธะไฮโดรเจน (hydrogen bonding, b) แรงไฮโดรโฟบกิ (hydrophobic interaction, c) และแรงระหวาW งข้วั (dipole-dipole interaction, d) ดังรปู ที่ 11-58 นอกจากน้ียังมพี นั ธะไดซัลไฟลB (disulfide bond) ทีเ่ กดิ จาก side chain ของ cysteine ซึง่ อาจเกิดภายในสายโพลีเพปไทดเB ดยี วกนั หรือคนละสายโพลีเพป ไทดกB ไ็ ด( โดยจะมบี ทบาทสำคัญในเกิดโครงสร(างของโปรตนี แบบตติยภมู ิ ดังรปู ที่ 11-59 รปู ท่ี 11-58 แรงยึดเหน่ยี วระหวาW งหมฟWู «งกBชนั ของ side chain ของ amino acid ในโมเลกลุ โปรตนี ผศ.ดร. อทุ ัยวรรณ ศิริออ/ น ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บรู พา 352

บทท่ี 11 กรดอะมิโนและโปรตนี รปู ท่ี 11-59 พันธะไดซลั ไฟดรB ะหวาW ง side chain ของ cysteine ดดั แปลงจาก: Brown, W. H., Iverson, B. L., Anslyn, E. & Foote, C. S. (2017). Organic Chemistry. USA: Brooks Cole. (8th ed.) รูปท่ี 11-60 โครงสรา( งของไมโอโกลบนิ ทจ่ี ับอยWกู บั ฮีมและโมเลกลุ ออกซเิ จน ท่ีมาจาก: William, H. Brown, Brent L. Iverson, Eric V. Anslyn, & Chistopher S. Foote. Organic Chemistry. 8th ed., 2017. ผศ.ดร. อทุ ยั วรรณ ศิรอิ อ/ น ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 353

บทที่ 11 กรดอะมิโนและโปรตีน 11.6.4 โครงสร=างจตุรภมู ิ (quaternary structure) เปxนโครงสรา( งของโปรตีนท่ีประกอบด(วยสายโพลีเพปไทดมB ากกวWาหน่ึงก(อนมารวมกนั หรือโมเลกกุลของ ก(อนโปรตนี แบบตตยิ ภมู ิหลายๆกอW นมารวมกนั กลายเปxนโปรตีนทีม่ โี ครงสร(างเปxนจตุรภมู ิ ซึง่ ยดึ เหนี่ยวกนั ด(วยแรงท่ี ไมWใชพW ันธะโควาเลนตB ดงั รูปท่ี 11-61 รูปท่ี 11-61 โครงสร(างของฮีโมโกบนิ ท่ปี ระกอบด(วย 4 ก(อนโปรตนี ท่ีมาจาก: William, H. Brown, Brent L. Iverson, Eric V. Anslyn, & Chistopher S. Foote. Organic Chemistry. 8th ed., 2017. โดยโครงสร(างแบบจตรุ ภูมขิ องโปรตีนแตWละชนดิ จะประกอบดว( ยก(อนโปรตนี ทม่ี ารวมกันตาW งกนั ไป ยกตัวอยWางดังตารางที่ 11.6 ตารางที่ 11.6 แสดงตวั อยาW งโปรตนี แบบจตุรภูมิ (quaternary structure) โปรตนี จำนวนของ subunite Alcohol dehydrogenase 2 Aldolase 4 Hemoglobin 4 Lactate dehydrogenase 4 Insulin 6 Glutamine synthetase 12 Tobacco mosaic virus protein disc 17 ผศ.ดร. อุทัยวรรณ ศิรอิ อ/ น ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 354

บทที่ 11 กรดอะมิโนและโปรตนี สรุประดบั โครงสร=างของกรดอะมิโน 1. โครงสร(างปฐมภูมิ (primary structure) เปนx โครงสร(างท่แี สดงจำนวนและลำดับของกรดอะมิโนใน สายโพลีเปปไทดB 2. โครงสร(างทุติยภมู ิ (secondary structure) เปxนโครงสร(างท่มี ีลกั ษณะเฉพาะ เกิดจากการสรา( งพนั ธะ ไฮโดรเจนทอ่ี ยหWู าW งกนั บนสายโพลเี ปปไทดB ทำให(สายเปปไทดมB ีลักษณะเปxนเกลียว หรือเรยี งตWอกนั เปxน แผWน พันธะไฮโดรเจนน้ีเกิดจากไนโตรเจนอะตอม (-NH2) กับคารบB อนิลคารบB อน (C=O) โครงสรา( ง ทตุ ยิ ภมู มิ ี 2 แบบ คือ แบบเกลียวแอลฟา (a-Helix) และแบบแผนW พับ (b-Pleated Sheet) 3. โครงสรา( งตตยิ ภูมิ (tertiary structure) เปxนโครงสรา( งทเี่ กดิ จากงอตวั หรอื โคง( ตวั ของเกลยี ว แอลฟา หรอื แผนW พบั ทำให(เกดิ โครงสรา( ง 3 มิติ โดยกรดอะมโิ นท่อี ยูWไกลกันในโครงสร(างปฐมภมู เิ ขา( มาใกล(กนั แล(ว เกิดการยดึ เหนีย่ วด(วยแรงตาW งๆ 4. โครงสร(างจตุรภมู ิ (quaternary structure) พบในโปรตีนบางชนดิ ทป่ี ระกอบดว( ยสายโพลีเปปไทดB ตง้ั แตW 2 สายข้ึนไป และยึดกนั อยดWู ว( ยแรงท่คี ลา( ยกบั แรงที่เกดิ ในครงสร(างตติยภูมิ รูปท่ี 11-62 โครงสรา( งของกรดอะมโิ นและโปรตนี ทีม่ าจาก: Leroy, G. Wade, JR. Organic Chemistry. 9th. ผศ.ดร. อุทยั วรรณ ศริ อิ /อน ภาควิชาเคมี คณะวทิ ยาศาสตร; ม. บรู พา 355

บทที่ 11 กรดอะมโิ นและโปรตีน 11.7 แบบฝ<กหดั เสรมิ ความเขCาใจ 1. แสดงโครงสร(างของ a-amino acid 2. แสดงปฏิกิริยาการสังเคราะหB amino acid จากปฏกิ ิริยาตWอไปนี้ พร(อมเขียนกลไกการเกิดปฏิกิริยา 2.1 Reductive Amination of a-Keto acids 2.2 Amination of a-halo acid 2.3 Amidomalonate synthesis 2.4 Strecker synthesis 3. แสดงปฏกิ ริ ยิ าการทดสอบ amino acid หรือ protein โดยใช(รเี อเจนตBตอW ไปน้ี พร(อมแสดงกลไก 3.1 Ninhydrin 3.2 Cyanogen bromide 3.3 Edman degradation 4. แสดงวิธีการสังเคราะหB tripeptide 5. แสดงโครงสร(างของ tetrapeptide Cys-Arg-Met-Asn ที่ pH 6.0, net charge +1 6. แสดงโครงสร(างของ arginine ที่ net charge = 0 พร(อมคำนวณคาW pI 7. จากโครงสรา( งท่ีกำหนดให( ระบุตำแหนWงของ peptide bond และแสดงโครงสรา( งของ amino acid ทง้ั หมด ผศ.ดร. อุทัยวรรณ ศริ อิ อ/ น ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร; ม. บูรพา 356