พันธุวิศวกรรมและการโคลนยีน

6.1 พนั ธวุ ิศวกรรมและการโคลนยีน 6.2 การหาขนาดของ DNA และการหาลาดบั นิวคลีโอไทด์ 6.3 การประยุกตใ์ ช้เทคโนโลยีทางดีเอน็ เอ 6.4 เทคโนโลยีทางดีเอน็ เอกบั ความปลอดภยั ทางชีวภาพ และชีวจริยธรรม

6.1 พันธุวิศวกรรมและการโคลนยีน เทคโนโลยีชีวภาพ (Biotechnology) การใชเ้ ทคโนโลยีเพือ่ ทาให้สง่ิ มีชวี ิตหรือองค์ประกอบของสิ่งมีชวี ิต มีคณุ สมบตั ิตามที่ตอ้ งการ พันธุวิศวกรรม (Genetic Engineering) การใชเ้ ทคโนโลยีเก่ยี วกับ DNA ตดั ต่อและเคลือ่ นย้ายยีนที่ตอ้ งการ เข้าสู่สิง่ มีชีวติ จะได้ส่งิ มีชวี ิตดดั แปรพันธุกรรม (GMO)

6.1 พนั ธวุ ิศวกรรมและการโคลนยีน  ขั้นตอนการสร้างสิง่ มีชวี ิตดัดแปรพันธกุ รรมจะตอ้ งมีการเพิ่มจานวน DNA ที่ เหมือนกัน เรยี กวา่ การโคลนดีเอน็ เอ (DNA Cloning)  ถา้ DNA บริเวณดงั กลา่ วเป็นยีน เรยี กวา่ การโคลนยนี (Gene Cloning)  การเพิ่มจานวน DNA ที่เหมือนกนั อาจทาได้ในสิ่งมีชวี ิต  เช่น การโคลนยีนโดยใช้พลาสมิดของแบคทีเรีย หรือทาในหลอดทดลอง ( การเพิ่มจานวน DNA ด้วยเทคนิค PCR)



6.1 พันธวุ ิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.1 การโคลนยีนโดยใช้พลาสมิดของแบคทีเรีย การเพิ่มปรมิ าณยนี หรือ DNA ทต่ี ้องการโดยใช้ DNA พาหะ หรือเวกเตอร์ (Vector) เช่น พลาสมิด (Plasmid) ของแบคทเี รีย

6.1 พันธุวิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.1 การโคลนยีนโดยใชพ้ ลาสมิดของแบคทีเรีย  พลาสมิดเป็น DNA สายคลู่ ักษณะเปน็ วง  แบคทีเรีย 1 เซลล์อาจมีพลาสมิดตงั้ แต่หนึ่งถงึ หลายรอ้ ยพลาสมดิ ยีนต้านยาปฏิชวี นะ บริเวณที่เป็นตาแหนง่ ตดั ของ เอนไซม์ตัดจาเพาะ  มียนี ทีส่ รา้ งเอนไซมท์ ีท่ าให้แบคทีเรยี มีลกั ษณะจาเพาะ เช่น ยีนต้านยาปฏชิ ีวนะ  มีเอนไซม์ตัดจาเพาะ ***ซึ่งใช้เป็นเครื่องหมายในการคัดเลือกแบคทีเรียที่ นามาใชใ้ นการโคลนยีน***

6.1 พันธุวิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.1 การโคลนยีนโดยใชพ้ ลาสมิดของแบคทีเรีย มีองค์ประกอบ ดงั นี้ • DNA ทีต่ ้องการโคลน • DNA พาหะ/เวกเตอร์ (Vector) หรือ พลาสมิด(Plasmid) • เอนไซมต์ ดั จาเพาะ (Restriction enzyme) • เอนไซมด์ ีเอ็นเอไลเกส (DNA ligase) • เซลลเ์ จ้าบา้ น

6.1 พันธุวิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.1 การโคลนยีนโดยใช้พลาสมิดของแบคทีเรีย แบง่ ออกเปน็ 5 ขัน้ ตอน คอื 1. การสกดั DNA จากสิ่งมชี ีวติ ทีม่ ียนี ทีต่ อ้ งการและ DNA พาหะ 2. ตดั สว่ นของ DNA ดว้ ยเอนไซม์ตดั จาเพาะ (Restriction enzyme) 3. การสร้าง DNA สายผสม (recombinant DNA) 4. การนา DNA สายผสมเขา้ สู่เซลล์เจา้ บา้ น (host cell) เรียกว่า transformation 5. การคดั เลือกเซลลเ์ จา้ บา้ นทีไ่ ด้รบั จากDNA สายผสม

การสร้างรีคอมบิแนนท์ DNAหรือดีเอ็นเอสายผสม (recombinant DNA)  คือ DNA ที่ได้จากการตัดตอ่ ทางพนั ธวุ ศิ วกรรมเพื่อให้ไดส้ ิง่ มชี ีวติ ตามต้องการ  อาจทาไดโ้ ดยใช้เอนไซมต์ ัดจาเพาะ (Restriction enzyme) เพื่อตัดสาย DNA  จากนั้นใช้เอนไซม์ดีเอน็ เอไลเกส เชื่อมสาย DNA ทถ่ี กู ตัดกับ DNA ช้ินอื่นให้ตอ่ กนั ได้เปน็ ดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์

การสรา้ งรีคอมบิแนนท์ DNAหรือดีเอ็นเอสายผสม (recombinant DNA) 1.1 การตัดสาย DNA ดว้ ยเอนไซมต์ ัดจาเพาะ  เอนไซม์ตัดจาเพาะมีคณุ สมบตั ิพิเศษ (Restriction enzyme) คือ สามารถจดจาเบส ท่ีจาเพาะได้ประมาณ 4-6 เบส แล้วแต่ชนิดของเอนไซม์ เรียกว่า บริเวณจดจา (Recognition site)  ตาแหน่งที่เอนไซมต์ ดั เรยี กวา่ ตาแหน่งตดั จาเพาะ (Restriction site)  ลักษณะท่ีเอนไซม์ตัดจาเพาะมีร่วมกัน คือ การเรียงลาดับเบสจาเพาะจะมีทิศทาง 5’ ไป 3’  ซึ่งมีลักษณะเปน็ พาลินโดรม (palindrome) คือ ถ้าอ่านสายบนจากหน้าไปหลัง จะมลี ักษณะเหมือนกนั กับอา่ นสายล่างจากหลังไปหน้า



สาย DNA หลังถกู ตัดแลว้ แบง่ ออกเปน็ 2 แบบ 1. ปลายเหนียว (sticky end) 2. ปลายทู่ (blunt end)

1. ปลายเหนียว (sticky end) คือ สาย DNA ท่ีได้จากการตัดของเอนไซม์ตัดจาเพาะ โดยสลายพันธะ โควาเลนต์ระหว่างฟอสเฟตและคาร์บอนของน้าตาลแล้วมีนิวคลีโอไทด์ปลายสาย เดี่ยวยื่นออกมา ปลายเหนียวเป็นปลายที่ง่ายต่อการต่อมากกว่าปลายทู่ 5’…G AATTC…3’ 5’…G AATTC…3’ 3’…CTTAA G…5’ 3’…CTTAA G…5’ - เอนไซม์ EcoRI (Escherichia coli RY13) : จะจดจาตาแหน่งเบส 6 เบส คือ 5’…GAATTC…3’ และตดั เบสตาแหน่ง G กับ A 5’…G GATCC…3’ 5’…G GATCC…3’ 3’…CCTAG G…5’ 3’…CCTAG G…5’ - เอนไซม์ BamHI (Bacillus amyloliquefaceins H) : จะจดจาตาแหน่งเบส 6 เบส คือ 5’…GGATCC…3’ และตัดเบสตาแหน่ง G กบั G

1. ปลายเหนียว (sticky end) 5’…A AGCTT…3’ 5’…A AGCTT…3’ 3’…TTCGA A…5’ 3’…TTCGA A…5’ - เอนไซม์ HindIII (Haemophilus influenza Rd) : จะจดจาตาแหน่งเบส 6 เบส คือ 5’…AAGCTT…3’ และตัดเบสตาแหน่ง A กับ A 5’…G TCGAC…3’ 5’…G TCGAC…3’ 3’…CAGCT G…5’ 3’…CAGCT G…5’ - เอนไซม์ SaII (Streptomyces albus) : จะจดจาตาแหน่งเบส 6 เบส คือ 5’…GTCGAC…3’ และตดั เบสตาแหน่ง G กบั T

1. ปลายเหนียว (sticky end) 5’…CTGCA G…3’ 5’…CTGCA G…3’ 3’…G ACGTC…5’ 3’…G ACGTC…5’ - เอนไซม์ PstI (Providencia stuartii) : จะจดจาตาแหน่งเบส 6 เบส คือ 5’…CTGCAG…3’ และตดั เบสตาแหน่ง A กบั G 5’…C CCGGG…3’ 5’…C CCGGG…3’ 3’…GGGCC C…5’ 3’…GGGCC C…5’ - เอนไซม์ XmaI (Xanthomonas malvacearum) - เอนไซม์ XcyI (Xanthomonas cyanopsidis) จะจดจาตาแหน่งเบส 6 เบส คือ 5’…CCCGGG…3’ และตดั เบสตาแหน่ง C กับ C คแู่ รก

2. ปลายทู่ (blunt end) คือ สาย DNA ท่ไี ด้จากการตัดของเอนไซม์ที่มนี ิวคลีโอไทดไ์ ม่เกิดปลายสาย 5’…GG CC…3’ 5’…GG CC…3’ 3’…CC GG…5’ 3’…CC GG…5’ - เอนไซม์ SmaI (Serratia marcescens) : จะจดจาตาแหน่งเบส 4 เบส คือ 5’…GGCC…3’ และตัดเบสตาแหน่ง G กบั C 5’…CCC GGG…3’ 5’…CCC GGG…3’ 3’…GGG CCC…5’ 3’…GGG CCC…5’ - เอนไซม์ HaeIII (Haemophilus aegyptius) : จะจดจาตาแหน่งเบส 6 เบส คือ 5’…CCCGGG…3’ และตดั เบสตาแหน่ง C กบั G

1.2 การเชื่อมสาย DNA ด้วยเอนไซมด์ ีเอ็นเอไลเกส  เอนไซม์ดีเอ็นเอไลเกส (DNA ligase) สามารถเร่งปฏิกิริยาการสร้างพันธะ ฟอสโฟไดเอสเทอร์ระหว่างปลายสาย DNA สองปลายให้เชื่อมต่อกนั  เช่น การตัดและเชื่อมต่อพลาสมิดและ DNA ท่มี ียนี ทต่ี ้องการได้เปน็ ดีเอน็ เอ รคี อมบแิ นนท์  ดีเอ็นเอรีคอมบแิ นนทใ์ นรปู พลาสมิด ซึง่ มี DNA ท่ตี ้องการแทรกอยู่นนั้ ***ยงั ไม่สามารถนาไปใชป้ ระโยชน์ได้ จะต้องมีวิธีการท่ีจะให้ดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์คงอยู่ และเพิม่ จานวนเพือ่ นาไปใชป้ ระโยชน์ตอ่ ไป***

1.3 การถา่ ยดีเอน็ เอรคี อมบิแนนท์เข้าสูเ่ ซลลแ์ บคทีเรีย และคัดเลือกเซลล์ทีต่ ้องการ  นาดีเอ็นเอรีคอมบแิ นนท์ ใสเ่ ข้าไปในเซลลแ์ บคทีเรีย เรียกวา่ transformation และคัดเลือกเซลล์ทีต่ อ้ งการ  เซลล์แบคทีเรียที่ได้รับพลาสมดิ จะเจรญิ ไดใ้ นอาหารเลีย้ งเชื้อที่ใสย่ าปฏิชีวนะ  เมื่อแบคทีเรียมกี ารแบ่งเซลล์ พลาสมิดจะมกี ารจาลองตวั เองและถา่ ยทอดไปยังเซลลล์ กู ได้  ทาให้ดีเอ็นเอรีคอมบแิ นนทแ์ ละDNA ทีต่ อ้ งการเพม่ิ จานวนด้วย

1.3 การถา่ ยดีเอน็ เอรคี อมบิแนนทเ์ ขา้ สู่เซลล์แบคทีเรีย และคัดเลือกเซลล์ทีต่ ้องการ  การโคลนยีนโดยใชพ้ ลาสมิดของแบคทเี รียจะทาให้ได้ยนี ทต่ี ้องการปรมิ าณมาก เพือ่ นาไปใชศ้ ึกษาด้านตา่ ง ๆ เชน่ อินซูลิน วคั ซนี หรือยารักษาโรคต่าง ๆ อินซลู นิ

สรปุ การโคลนยีน (gene cloning) คือ การเพิม่ จานวนของ DNA ที่มยี ีน ทาให้ได้ยนี ที่เหมือนกนั ทกุ ประการจานวนมากการโคลนยีนที่ นิยม คือ อาศัยการรับฝากไว้กบั พลาสมดิ ของแบคทีเรียหรือ DNA พาหะ (DNA vector) ขั้นตอน • แยก DNA ที่มยี ีนที่ต้องการโคลนออกจากสิง่ มชี ีวติ และแยกพลาสมดิ ทีน่ ามาเป็นพาหะ (vector) โดยใช้เอนไซม์ที่ตดั จาเพาะ (Restriction enzyme) ชนิดเดียวกัน • นา DNA ที่มยี ีนแทรกเขา้ ไปในพลาสมิดทเี่ ป็นพาหะ โดยนามาเชือ่ มตอ่ กันด้วย DNA ligase ซึง่ สามารถสร้างพนั ธะโควาเลนตร์ ะหว่างสาย DNA ให้เชือ่ มต่อกนั ทาให้เกิด ดีเอน็ เอสายผสม (DNA recombinant) • นาดีเอน็ เอสายผสม (DNA recombinant) ใส่เขา้ ไปในเซลล์แบคทีเรยี เรียกวา่ transformation • จากน้ันนาแบคทีเรียไปเพาะเลยี้ ง เมื่อแบคทีเรียเพิ่มจานวน ยีนทีอ่ ยู่ภายในพลาสมิดของ แบคทีเรียกจ็ ะเพิ่มขนึ้ ตาม เมือ่ แบคทีเรียจานวนมากพอแล้ว นาแบคทีเรียที่ได้สกัดแยกยีนที่ โคลน ยีนที่ได้ เรียกว่า (gene clon)

กรณีศึกษา ในการสรา้ ง DNA สายผสม (recombinant DNA) ไมส่ ามารถสร้างได้ 100% เพราะในขั้นตอนการนา DNA สายผสมเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน (host cell) เรียกว่า transformation อาจเปน็ การนา DNA สายผสมหรือ DNA พาหะเปล่า ๆ เข้าไปใน เซลล์แบคทีเรีย จึงต้องมีการตรวจสอบว่า เซลล์แบคทีเรียใดท่ีมี DNA สายผสมอยู่ ภายใน โดยการนาเซลล์แบคทีเรยี ไปเลีย้ งและมีการคัดเลือก

การเลือก DNA พาหะ ตัวอย่าง

การเลือก DNA พาหะ จากนั้นแทรก DNA เข้าไปในบริเวณ lac Z ซึง่ เอนไซม์ตัดจาเพาะตัดได้ หลงั จากนาดีเอ็นเอสายผสมใส่เข้าไปในเซลล์แบคทเี รีย แล้วนาไปเลี้ยงในจาน เลี้ยงเชื้อ ซึ่งประกอบด้วย ampicillin เพื่อปอ้ งกันแบคทีเรียชนิดอื่นเจริญ (แบคทีเรยี ท่มี ียนี ต้าน ampicillin จะเจริญได้) และ X-gal (galactose + สีฟ้า)

ผลการทดลอง - เซลล์แบคทีเรียท่ี Plasmid ไม่มียีนดีเอ็นเอสายผสมแต่มียีน lac Z สร้าง เอนไซม์ beta-galactosidase สามารถย่อย X-gal ซึ่งมี galactose และสีฟ้าเป็น ส่วนประกอบ ทาใหเ้ ห็นเป็นจุดสีฟ้าบนอาหารเลี้ยงเชือ้ - ส่วนเซลล์แบคทีเรียที่มียีนดีเอ็นเอสายผสม จะไม่มียีน lac Z ในการย่อย X-gal ทาให้เห็นเป็นจุดขาวบนอาหารเลี้ยงเชื้อ ***จึงเลือกเซลล์แบคทีเรียนี้ไป เพาะเลีย้ ง เพือ่ เพ่มิ ปรมิ าณ***



6.1 พันธวุ ิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.2 การโคลนยีนโดยใช้เทคนคิ พีซอี าร์ (Polymerase Chain Reaction : PCR) เปน็ การเพิ่ม DNA ในหลอดทดลองโดยไม่ต้องอาศัยเซลล์ แต่อาศัยเครื่องมือ ท่ีเรียกว่า เทอร์มอไซเคลอร์ (Thermocycler) เครื่องมือนี้สามารถควบคุม อณุ หภมู ิให้สูงขึ้นและลดลงได้อยา่ งรวดเรว็ ในเวลาไม่กีน่ าที

6.1 พันธวุ ิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.2 การโคลนยีนโดยใช้เทคนคิ พีซอี าร์ (Polymerase Chain Reaction : PCR) องค์ประกอบของการเกิดปฏกิ ิรยิ าในหลอดทดลอง 1. DNA ที่ตอ้ งการโคลน เป็น DNA แม่แบบ 2. DNA Primer เป็น DNA สายส้ัน ๆ ทจ่ี บั กบั DNA แม่แบบ เปน็ จดุ เรม่ิ ต้นในการสังเคราะห์ DNA 3. Deoxynucleotides ทั้ง 4 ชนิด (A T C และ G) เพื่อท่ีจะนาไปใช้ใน การสงั เคราะห์สาย DNA 4. เอนไซม์ DNA Polymerase 5. สารละลายบัฟเฟอร์ สารละลายของกรดอ่อนกับเกลือของกรดอ่อน เพื่อรกั ษาสภาพ pH ของสารละลาย

6.1 พนั ธุวิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.2 การโคลนยีนโดยใช้เทคนคิ พีซอี าร์ (Polymerase Chain Reaction : PCR) ข้นั ตอน ปฏกิ ริ ยิ า PCR จะทาให้เกิดซ้า ๆ อย่างน้อย 25-40 รอบ ซึ่งการเกิดปฏิกิริยา 1 รอบ จะมลี าดับดังนี้ 1. Denaturation (95ºC) : เร่ิมจากการเพิม่ อุณหภูมิสูง ประมาณ 94ºC เวลา 30 วินาที ทาให้ DNA คลายเกลียวแยกออกจากกัน ดังน้ันเราจึง ต้องเลือกใช้ เอนไซม์ DNA polymerase ท่ีสามารถทนความร้อนได้สูง เพื่อไม่ให้เอนไซม์เสื่อสภาพไป กอ่ น

6.1 พันธวุ ิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.2 การโคลนยีนโดยใช้เทคนคิ พีซอี าร์ (Polymerase Chain Reaction : PCR) ขัน้ ตอน 2. Annealing (50-60ºC) : จากน้ันเทอร์มอไซเคลอร์ (Thermocycler) จะลด อณุ หภมู ลิ ง ประมาณ 50-55ºC เพื่อใหเ้ กิดการจบั กันระหวา่ งดีเอ็นเอไพรเมอร์ (DNA Primer) DNA ต้นแบบ (ด้วยพันธะไฮโดรเจน)

6.1 พันธวุ ิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.2 การโคลนยีนโดยใชเ้ ทคนคิ พีซอี าร์ (Polymerase Chain Reaction : PCR) ขั้นตอน 3. Extension (72ºC) : เป็นข้ันตอนการสังเคราะห์ DNA อาศัยการทางานของ DNA Polymerase โดยปรับอุณหภูมิประมาณ 72ºC เพื่อให้เหมาะต่อการทางาน ของเอนไซม์ DNA Polymerase และมีการสงั เคราะห์ DNA ในทิศทาง 5’ ไป 3’



6.1 พันธวุ ิศวกรรมและการโคลนยีน 6.1.2 การโคลนยีนโดยใช้เทคนคิ พีซอี าร์ (Polymerase Chain Reaction : PCR) การประยกุ ต์ใช้ในดา้ นต่าง ๆ ด้านการแพทยใ์ ช้ตรวจหาโรคทางพันธุกรรม ด้านนิติวทิ ยาศาสตร์ ใช้ตรวจสอบหลักฐานในคดี รวมทัง้ โรคทีเ่ กิดจากการตดิ เชอ้ื จุลนิ ทรยี ์ อาชญากรรม หรอื ตรวจหาความสมั พันธท์ างสายเลอื ด

THE END