nav

Návod k praktickému cvičení z biochemie Téma: Vyšetření moči 1. Kvalitativní vyšetření hlavních patologických součástí moči Uvedené reakce proveďte vždy s fyziologickým vzorkem moči, se vzorky obsahujícími příslušné patologické součásti a s neznámými vzorky moči. Zkumavkové reakce A. Průkaz bílkovin v moči  zkouška s kyselinou sulfosalicylovou Reagencie: 200 g/l 1. Kyselina sulfosalicylová dihydrát 2. Vzorek moči s bílkovinou 3. Vzorek fyziologické moči 4. Neznámé vzorky moči 1  4 Pracovní postup: K asi 1 – 2 ml vzorku s bílkovinou přikápneme několik kapek kyseliny sulfosalicylové. V přítomnosti bílkoviny vznikne zákal až sraženina. Zákal se hodnotí proti tmavému pozadí nebo proti stránce s textem. Semikvantitativní hodnocení intenzity reakce Nález Hodnocení Přibližná koncentrace bílkoviny v g/l Opalescence stopy 0,05 – 0,1 Lehký zákal + 0,1 – 0,2 (průhledný, lze číst podložený text) Mléčný zákal ++ 0,5 – 1,0 (neprůhledný, bez vloček) +++ 2,0 – 5,0 Mléčný zákal s tvorbou vloček Vločkovitá sraženina ++++  5,0 1

B. Průkaz krve a krevního barviva v moči Reagencie: 1. O-tolidin (3,3´- dimethylbenzidin) 2. Heitz-Boyerovo činidlo (bezbarvý redukovaný fenolftalein v alkalickém prostředí, uchováván s několika granulemi Zn) 3. Kyselina octová koncentrovaná 30 g/l 4. Peroxid vodíku 5. Ethanol 6. Vzorek moči s krví 7. Vzorek fyziologické moči 8. Neznámé vzorky moči 1  4 Pracovní postup: „Benzidinová“ zkouška Několik zrníček o-tolidinu rozpustíme asi ve 2 ml ethanolu a okyselíme koncentrovanou kyselinou octovou. Přidáme asi 2 ml peroxidu vodíku (roztok nesmí zmodrat) a poté asi 1 – 2 ml vzorku moči. Pozitivním výsledkem je modré až modrozelené zbarvení vzorku. Heitz-Boyerova zkouška Ve zkumavce smícháme asi 1 ml moči se stejným dílem Heitz-Boyerova činidla. Opatrně převrstvíme po stěně zkumavky peroxidem vodíku. V přítomnosti hemoglobinu vznikne na styčné ploše červenofialový prstenec. C. Průkaz cukrů v moči  Fehlingova zkouška Reagencie: 1. Fehlingův roztok I (pentahydrát síranu měďnatého) 70 g/l 2. Fehlingův roztok II (hydroxid sodný 250 g a tetrahydrát vinanu draselno-sodného 350 g v 1 l destilované vody) 3. Vzorky moči s glukózou 4. Vzorek fyziologické moči 5. Neznámé vzorky moči 1  4 Pracovní postup: Čerstvý pracovní roztok Fehlingova činidla připravíme smícháním Fehlingova roztoku I a II v poměru přibližně 1:1. Samotné činidlo nesmí při povaření měnit barvu. Asi k 1 ml moči přidáme stejný díl Fehlingova činidla a povaříme. V přítomnosti glukózy vznikne zelenožlutá, žlutá až cihlově červená sraženina. Barva sraženiny závisí na koncentraci redukujícího cukru v moči (zakalení se zeleným nádechem – cca 8 – 15 mmol/l, zelená sraženina – cca 25 mmol/l glukózy, zelenohnědá sraženina – cca 50 mmol/l, hnědočervená sraženina – cca 100 mmol/l glukózy, červená sraženina – nad cca 150 mmol/l glukózy). 2

D. Průkaz ketolátek Reagencie: 1. Lestradetovo činidlo (síran amonný 20 g, uhličitan sodný bezvodý 20 g, dihydrát nitroprussidu sodného 0,2 – 1,0 g) 2. Dihydrát nitroprussidu sodného (před použitím rozpustíme několik krystalů ve zkumavce s destilovanou vodou) 3. Hydroxid sodný 100 g/l 4. Kyselina octová koncentrovaná 5. Vzorek moči s ketolátkami 6. Vzorek fyziologické moči 7. Neznámé vzorky moči 1  4 Pracovní postup: Lestradetova zkouška Navlhčíme filtrační papír, nasypeme na něj malé množství práškového Lestradetova činidla a přidáme 1 – 2 kapky moči s ketolátkami. Asi do 1 minuty se v přítomnosti ketolátek vytvoří fialové zbarvení. Zkoušku provedeme s močí obsahující ketolátky i s fyziologickou močí. Legalova zkouška Asi ke 2 ml moči přidáme 2 – 3 kapky nitroprussidu sodného a zalkalizujeme 3 kapkami NaOH. Vznikne červené zbarvení způsobené reakcí kreatininu. Červeně zbarvený roztok rozdělíme do dvou zkumavek a do jedné přidáme několik kapek koncentrované kyseliny octové. Pokud jsou přítomny ketolátky, zbarvení se změní do červenofialova, pokud se roztok odbarví, bylo červené zbarvení způsobeno pouze kreatininem (fyziologická součást moči). Vyšetření moči polyfunkčními diagnostickými proužky Vyšetření polyfunkčními proužky provedeme pouze u neznámých vzorků moči. Reagencie: 1. Polyfunkční proužek PHAN (Erba-Lachema s.r.o.) 2. Neznámé vzorky moči 1  4 Pracovní postup: Proužek ponoříme do vyšetřované moči na 2 – 3 s. Otřením o okraj nádoby odstraníme přebytečnou moč a po uplynutí předepsané reakční doby (cca 60 s výjimkou leukocytů, u nichž se reakční doba prodloužená na 120 s) hodnotíme vzniklé zbarvení srovnáním s barevnou stupnicí na štítku tuby. 3

2. Jednoduché chemické reakce v moči používané při vyšetření dědičných poruch metabolismu aminokyselin Ve vzorcích fyziologické moči a moči s příslušnou patologickou součástí proveďte všechny uvedené reakce. A. Föllingova zkouška s chloridem železitým Reagencie: 100 g/l 1. Roztok FeCl3 . 6 H2O (uchovávat v tmavé dobře uzavřené lahvi) 2. Vzorek moči s kyselinou fenylpyrohroznovou 3. Vzorek fyziologické moči Pracovní postup: Do čisté zkumavky odlijeme přibližně 1 ml moči s kyselinou fenylpyrohroznovou a přidáme 2 – 3 kapky roztoku FeCl3 a promícháme. V pozitivním případě se vyvine modrozelené zbarvení. Zkoušku proveďte i s fyziologickou močí. B. Brandova zkouška s nitroprussidem sodným Reagencie: 1. Hydroxid sodný 80 g/l 200 g/l 2. Nitroprussid sodný 3. Vzorek moči s cysteinem 4. Vzorek fyziologické moči Pracovní postup: K asi 1 ml moči, kterou zalkalizujeme 3 – 4 kapky NaOH, přikápneme 1 – 2 kapky nitroprussidu sodného a promícháme. V pozitivním případě se vyvíjí višňově červené zbarvení, které postupně vymizí. Zkoušku proveďte i s fyziologickou močí. C. Test s 2,4-dinitrofenylhydrazinem Reagencie: 1. 2,4-dinitrofenylhydrazin (1 g 2,4-dinitrofenylhydrazinu v 1 l HCl 2 mol/l) 2. Hydroxid sodný 80 g/l 3. Vzorek moči s ketokyselinami 4. Vzorek fyziologické moči Pracovní postup: Asi k 0,1 ml moči přidáme stejný objem 2,4-dinitrofenylhydrazinu a necháme 5 minut stát. Pak přikápneme asi 3 kapky NaOH a zamícháme. V případě pozitivity ihned odečítáme hnědovínové zbarvení, které po promíchání nemizí. Reakci provádíme současně se vzorkem moči s ketolátkami i s fyziologickou močí. 4

3. Demonstrace poloautomatického reflexního fotometru pro objektivní semikvantitativní analýzu moči pomocí diagnostických proužků Reagencie a pomůcky: 1. přístroj LAURA Smart 2. diagnostické proužky pro přístroj LAURA Smart 3. vzorky moči Pracovní postup: Úloha bude demonstrována vyučujícím. 4. Stanovení relativní hustoty moči urometrem Reagencie: Vzorek moči – infekční materiál Pracovní postup: Vzorek moči se nalije do odměrného válce a ponoří se do ní urometr. Na stupnici urometru se odečte relativní hustota moči. Úloha bude demonstrována vyučujícím. 5. Vyšetření močového sedimentu ve fázovém kontrastu Reagencie: Vzorek moči – infekční materiál Pracovní postup: Čerstvý vzorek moči se centrifuguje při 400  600 g 10 minut při 10 °C, skladuje se na ledu. Odsaje se větší část supernatantu. V malém množství supernatantu se reusupenduje sediment. Z takto koncentrovaného močového sedimentu se vyrobí mikroskopický preparát, který se pozoruje ve fázovém kontrastu. 5