Bab 16 Penggunaan Teknik DNA Rekombinan dalam Dunia Kedokteran

f 6 Penggunaan Teknik D N A Rekombinan dalam Dunia KedokteranSeiring dengan makin bertambahnya pengetahuan kita tentang biologi molekularpada 20 tahun belakangan ini, semakin menjadi jelas bahwa perkembangan da-lam bidang ini menimbulkan revolusi dalam praktek dunia kedokteran. Kemung-kinan pemanfaatan teknik biologi molekular untuk diagnosis dan terapi penyakitsangatlah luas. Dalam populasi manusia, polimorfisme, perbedaan dalam urutan DNA yang di-wariskan, dijumpai dalam jumlah besar, dan perubahan dalam urutan DNA ber-kaitan dengan banyak penyakit. Pemeriksaan untuk variasi urutan DNA lebih sensi-tif dibandingkan dengan banyak teknik lain (seperti pemeriksaan enzim) dan me-mungkinkan kita mengenal penyakit lebih dini dan, oleh karena itu, kemungkinanbesar mengenal stadium yang lebih dapat diterapi. Pemeriksaan tersebutjuga da-pat mengidentifikasi pembawa ^ c a r r i e r ) penyakit yang diwariskan sehingga pem-bawa dapat menerima penyuluhan yang sesuai. Karena variasi genetik sedemikiankhusus, \"sidikjari\" DNA (analisisperbedaan urutan DNA) dapat digunakan untukmenentukan hubungan keluarga atau untuk membantu mengidentifikasi pelaku ke-jahatan. Teknik biologi molekular saat ini digunakan dalam pencegahan dan pengobatanpenyakit. Misalnya, dengan teknik ini dapat dibuat vaksin untuk mencegah hepati-tis, insulin manusia untuk mengobati diabetes, dan Faktor VIII untuk mengobati he-mofilia. Walaupun pengobatan penyakit dengan terapi gen masih dalam tahapperkembangan eksperimental, namun kemungkinan yang dapat terjadi hanya diba-tasi oleh imajinasi manusia dan, tentu saja, oleh pertimbangan etis. Untuk mengenali variasi genetik normal atau patologis, DNA harus diisolasidari sumber yang tepat dan harus tersedia dalamjumlah yang adekuat untuk dite-liti. Teknik untuk mengisolasi dan memperbanyak gen serta penelitian dan manipu-lasi urutan DNA terdiri dari restriksi enzim, pengklonaan, reaksi berantaipolimerase ^ p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . PCR), elektroforesis gel, b l o t di atas kertasnitroselulosa, dan pembuatan p r o b e berlabel yang melakukan hibridisasi terhadapurutan DNA sasaran yang sesuai. Terapi gen meliputi pengisolasian gen normaldan penyisipannya ke dalam sel yang sakit sehingga terjadi ekspresi gen normal,yang memungkinkan sel yang sakit kembali ke keadaan normal. Mahasiswa seyogyanya memiliki paling sedikit pemahaman umum mengenaiteknik ini agar benar-benar menyadari penggunaannya yang mutakhir dan harapanyang mungkin dijanjikan untuk masa depan. Erna Nemdy t e l a h m u l a i b e k e r j a d i b a n k d a r a h r u m a h s a k i t d u a m a l a m seminggu. Karena akan menangani produk darah manusia, ia harus menda- pat serangkaian vaksinasi hepatitis B . Ia mempunyai keberatan tertentu un-tuk pemberian vaksinasi ini dan meminta penjelasan mengenai kemanjuran dankeamanan vaksin yang sekarang ini digunakan. Sissy Fibrosa a d a l a h s e o r a n g a n a k p e r e m p u a n K a u k a s u s b e r u s i a 3 t a h u n yang selama setahun terakhirkecepatan pertumbuhannya berada di persen- til ke-30 bagian bawah. Sejak lahir, ia kadang-kadang mengalami episodesumbatan (obstruksi) usus halus yang ringan dan reversibel secara spontan. Episode

236 BAGIAN III / EKSPRESI GEN D A N SINTESIS PROTEIN ini bertumpangtindih dengan gejala saluran cerna yang mengisyaratkan derajat malabsorpsi lemak makanan, misalnya tinja yang berjumlah banyak, berkilau, dan berbau busuk 2 atau 3 kali sehari. D a l a m 10 bulan terakhir, ia mengalami bronkitis b a k t e r i r e k u r e n ( b e r u l a n g ) , y a n g s e t i a p k a l i d i s e b a b k a n o l e h Pseudomonas aerugi- nosa. P e m e r i k s a a n u j i k e r i n g a t i o n t o f o r e s i s p i l o k a r p i n k u a n t i t a t i f d e n g a n j e l a s m e m - beri hasil positif (dijumpai natrium dan klorida yang berlebihan dalam keringatnya dalam dua kali pemeriksaan). Berdasarkan temuan ini, dokter anak memberi tahu orangtuanya bahwa Sissy mungkin mengidap fibrosis kistik (FK). Contoh darahnya dikirim k e laboratorium biologi molekular dan riset genetik untuk menentukan secara spesifik mana dari ba- nyak mutasi genetik yang diketahui menyebabkan fibrosis kistik terjadi pada sel Sissy. K : = ^ B e r a t b a d a n Anne Sulin t e l a h s t a b i l . S e t e l a h m e n d a p a t d i e t d i a b e t e s y a n g i f 11*^1 sesuai, kadar glukosa darah puasa dan 2-jam pasca makan tetap dalam ren- sJMI! tang yang dapat diterima. Ia menyuntikkan 24 unit insulin manusia sintetik secara subkutan setiap pagi. Penggunaan insulin ini, yang dibuat dengan teknik D N A rekombinasi, tidak menimbulkan reaksi alergi pada Anne. Hasil pemeriksaan terakhir kadar hemoglobin terglikosilasi (HbAic) dalam serum adalah dalam rentang mid- normal. Tidak ada bukti yang mengisyaratkan perkembangan retinopati, nefropati, atau neuropati perifer diabetes. O Carrie Sichel, s a u d a r a p e r e m p u a n M i c h a e l y a n g b e r u s i a 19 t a h u n , b e r e n - cana untuk menikah. Pertumbuhan dan perkembangannya normal, dan ia I bebas dari gejala anemia sel sabit. Karena adik perempuannya, Amanda, diperiksa dan terbukti membawa sifat sel sabit, dan karena Michael berulang-ulang mengalami krisis sabit, Carrie ingin mengetahui apakah ia juga membawa sifat sabit tersebut. Dilakukan elektroforesis hemoglobin dan temyata komposisi hemoglobin- nya adalah H b A 52%, HbS 54%, dan H b F 1 % , suatu pola yang sesuai dengan adanya sifat sel sabit. A h l i hematologi yang memeriksanya di klinik pada kunjungan pertama sedang meneliti mutasi genetik pada sifat sel sabit, dan meminta izin Carrie untuk mengambil darah tambahan untuk analisis gangguan genetik yang menyebabkannya menghasilkan HbS dengan teknik yang lebih canggih. C a r r i e S i c h e l m e m b e r i t a h u t u n a n g a n n y a , Willie Havet, b a h w a i a m e m b a w a s i f a t sel sabit, dan ia ingin menunda pemikahan mereka sampai Willie juga diperiksa. Victoria Tim a d a l a h s e o r a n g w a n i t a b e r u s i a 2 1 t a h u n y a n g p e r g i m e n g e n - darai mobil ke toko yang dekat untuk membeli beberapa barang yang diper- lukan untuk membuat makan malam bagi orangtuanya. Karena ia tidak kembali setelah 1jam, ayahnya pergi mengendarai mobil ke toko tersebut untuk men- cari Vicky. Ia menemukan mobil anaknya masih terparkir di depan toko, tetapi Vicky tidak ada di sana. Ia memanggil polisi. Dilakukan pencarian di daerah di sekitar toko, dan tubuh Vicky ditemukan di daerah berpohon-pohon di belakang gedung. Vicky mengalami penganiayaan seksual dan dicekik. Para penyidik medis dari laboratorium kepolisian mengumpulkan sampel semen dari cairan vagina dan mengambil sampel darah yang telah mengering yang ditemu- kan di kuku jari tangan korban. B a t u k Ivy Sharer s e d i k i t b e r k u r a n g s e t e l a h m e n d a p a t r e j i m e n m u l t i o b a t untuk tuberkulosis paru, tetapi ia tetap mengalami keringat malam. Ia dapat mentoleransi didanosin cukup baik, tetapi mengeluh merasa lemas dan lelah. Pria yang saling bertukar jarum \"kotor\" dengannya untuk menyuntik obat menyertai Ivy pergi ke klinik dan meminta ia juga diperiksa untuk mengetahui ada tidaknya H I V . DASAR PENGGUNAAN DNA REKOMBINAN DALAM DUNIA KEDOKTERAN Perkembangan dalam bidang biologi molekular berlangsung sangat cepat. Berbagai teknik untuk menggabungkan urutan D N A menjadi kombinasi baru ( D N A rekom-

B A B 16 / P E N G G U N A A N T E K N I K D N A R E K O M B I N A N D A L A M D U N I A K E D O K T E R A N 2 3 7binan) semula dikembangkan sebagai alat riset untuk menyelidiki dan memanipulasi o E n d o n u k l e a s e r e s t r i k s i (restric-gen; tetapi teknik tersebut juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi gen yang ca- tion endonuclease) d i t e m u k a ncat yang berkaitan dengan suatu penyakit; akhirnya teknik tersebut akan digunakan dalam bakteri pada akhir tahununtuk memperbaiki defek (cacat) genetik. Teknologi D N A rekombinan sedikit ba- 1960-an d a n 1970-an. Enzim ini diberinyak telah digunakan di laboratorium klinik, dan survei sepintas lalu terhadap kepus- nama demikian karena kenyataannya bak-takaan yang sekarang beredar menghasilkan kesimpulan bahwa teknik iniakan segera teri m e n g g u n a k a n enzim ini untuk \" m e m -menggantikan banyak prosedur pemeriksaan klinis yang sekarang berlaku. b a t a s i \" (\"restrict\") p e r t u m b u h a n v i r u s (bakteriofaga) yang menginfeksi sel bak- TEKNIK DNA REKOMBINAN teri.Untuk memahami mengapa gen dari satu individuberbeda dari individu lain dan ba- 5'-- --3'gaimana memanfaatkan perbedaan ini untuk mendiagnosis penyakit, paling sedikitdiperlukan pemahaman dasar mengenai teknik D N A rekombinan. 'I I I II Langkah pertama dalam menentukan variasi individualdalam gen meliputi isolasi A ATTCgen (atau fragmen D N A )yang mengandung urutan yang berubah-ubah dan memper-oleh jumlah gen yang adekuat untuk penelitian. Untuk mencapai tujuan tersebut telah cTT AIGdigunakan sejumlah teknik. I IIStrategi untuk Memperoleh Salinan Gen atau Fragmen DNA 3'--FRAGMEN RESTRIKSI |EcoRIE n z i m y a n g d i s e b u t s e b a g a i e n d o n u k l e a s e r e s t r i k s i (restriction endonuclease) m e - 5'- •'3'mungkinkan para ahli biologi molekular memutuskan segmen D N A dari genom ber-bagai jenis sel atau untuk memperoleh fragmen D N A yang berasal dari sumber lain. G 1 1*1 t ' l C T T AA A ATT C Enzim restriksi adalah suatu endonuklease yang mengenali urutan pendek D N A , 1! 1 i1biasanya panjangnya 4-6 pb (pasangan basa), dan memutuskan kedua untai D N A d i 3'-- Gdalam urutan tersebut. Sifat utama enzim restriksi adalah spesifisitasnya. E n z i m ini 1selalu memutuskan urutan D N A yang sama dan hanya memutuskan di urutan tertentu.Sebagian besar urutan D N A yang dikenali oleh enzim restriksi adalah palindrom, --5'yaitu, kedua untai D N A memiliki urutan basa yang sama apabila dibaca dalam arah 5'k e 3'. P o t o n g a n y a n g d i b u a t o l e h e n z i m i n i m u n g k i n tumpul/Z?/w«/ ( s e h i n g g a p r o d u k Ujung \"lengket\"yang dibentuk beruntai-ganda di ujungnya) atau \"lengket\"/\"5//c^\" (sehingga produkyang dihasilkan beruntai-tunggal di ujungnya) (Gbr. 16.1). Telah berhasil diisolasi ra- Btusan enzim restriksi dengan spesifisitas yang berbeda (Tabel 16.1). 5'--Tabel 16.1. Urutan yang Dipisahkan oleh Enzim Restriksi yang Terseleksi 1 1 I51 11 C G C :G G GEnzim Restriksi Sumber Tempat Pemisahan G G G ;C c cm Arthrobacter luteus 5'-AGCT.3' Bacillus amyloliquofaciens H GA-S' 1 i 1 > 1 1. 1SamHI 3'-- 5'-GfeATCC-3' 3'-CCTAG|G-5' Sma\Hm\\\ EscherlchiacoHnYIS S' - G t A A T T C - 3' 5'- --3' Haemophilus aegyptius 3'.cTfAA|3-5' II I 11 IMsf>\ Haemophilus influenzae CGC G GG Spesies M o r a x e t f a 5' - G G C C - 3'Msm Microcoleus 3' - C C|G G . 5' GGG CGCNot\ N o c a r d i a otitidis III I II P r o v i d e n c i a s t u a r i i l 164 y-A|AGCTT-y 3'\" 3'-TTCG^A-5' --5' 5' - C i C G G - 3' UJung\"tumpul\" 3' - G G C | : - 5' Gbr. 16.1. Kerja enzim restriksi. Perhatikan 5' - C CfTNA G G - 3' bahwa masing-masing urutan D N A yang di- 3'«G G A N T J C C - 5' perlihatkan adalah palindrom; masing-masing untai D N A , apabila dibaca dalam arah 5' ke 3', 5' - G C f G G C C G C - 3' memiliki urutan yang sama. Pemutusan oleh 3' • C G C C G G | : G - 5' EcoRl m e n g h a s i l k a n u j u n g atau e k o r u n t a i - t u n g g a l ( a t a u \" l e n g k e t \" ) dan o l e h Smal m e n g - y>CTecAlG»y hasilkan ujung untai ganda (atau \"tumpul\"). 3' • G ^ C G T c - 5' Setratia marcescensSi^ 5'.CCCjGGG.3' 3' - G G q,C C C . 6'

238 BAGIAN III / EKSPRESI GEN DAN SINTESIS PROTEINPada anemia sel sabit, mutasi ti- Fragmen restriksi D N A dapat membentuk pasangan basa satu sama lain apabila fragmen tersebut memiliki ujung lengket yang bersifat komplementer. Oleh karenatik yang m e n g u b a h s e b u a h resi- itu, dua fragmen D N A yang tidak berhubungan dapat membentuk pasangan basa satu sama lain apabila keduanya diputuskan oleh enzim restriksi yang sama. Setelahdu glutamat menjadi sebuah re- fragmen-fragmen tersebut membentuk pasangan basa, ujung-ujungnya digabungkan secara kovalen oleh kerja D N A ligase (Gbr. 16.2). Oleh karena itu,penggunaan enzimsidu valin ( G A G menjadi G T G ) terjadi di restriksi bersamaan dengan D N A ligase dapat menghasilkan D N A rekombinan atau kimcrik (chimeric), y a i t u , m o l e k u l D N A y a n g d i r e k o m b i n a s i k a n i n v i t r o ( d a l a mtempat yang diputuskan oleh enzim res- \"kaca\"; yaitu, dalam tabung reaksi).triksi /WsflI (urutan pengenalanC C T N A G G , dim a n a N dapat diganti olehbasa apapun) didalam gen globin-p nor-mal. Mutasi sel sabit menyebabkan geng l o b i n - p k e h i l a n g a n t e m p a t r e s t r i k s i Mst\\ini. Oleh karena itu, tidak ada satupun darik e d u a a l e l g e n g l o b i n - p Michael Sichelakan diputuskan di tempat tersebut. DNA Y A N G D I H A S I L K A N O L E H REVERSE TRANSCRIPTASE Apabila m R N A yang ditranskripsikan dari suatu gen diisolasi, m R N A ini dapat digu- n a k a n s e b a g a i c e t a k a n o l e h e n z i m reverse trancriptase, y a n g m e n g h a s i l k a n s a l i n a n D N A (copy DNA, c D N A ) d a r i R N A . B e r b e d a d e n g a n f r a g m e n D N A y a n g d i p u t u s k a n d a r i g e n o m o l e h e n z i m r e s t r i k s i , D N A y a n g d i h a s i l k a n o l e h reverse transcriptase, karena menggunakan m R N A sebagai cetakan, tidak memiliki intron. S I N T E S I S DNA S E C A R A KIMIA Sekarang terdapat mesin automatis untuk mensintesis oligonukleotida (fragmen D N A untai-tunggal) dengan panjang sampai 100 nukleotida. Mesin ini dapat diprogram un- tuk menghasilkan oligonukleotida dengan urutan basa tertentu. Walaupun sintesis gen keseluruhan belum dapat dilakukan, dapat dipersiapkan oligonukleotida yang akan membentuk pasangan basa dengan segmen gen. Oligonukleotida ini dapat digunakan dalam proses identifikasi, isolasi, dan amplifikasi gen. DNAX DNA Y -3' 1:I| r r r r G : :A A T T C c T T A A: :G • 1 \ \ \ \i r'S Z'- EcoR\ menghasilkan ujung lengket 5'- -3' I ! tt 1 G A A TT C C T TAA ^Fragmen-fragmen membentuk pasangan basa dan disatukan oleh DNA ligase T—1111 DNA G A ATTC rekombinan C T T AAG 3'- - 5 ' Gbr. 16.2. P e m b u a t a n m o l e k u l D N A r e k o m b i n a n d e n g a n e n z i m r e s t r i k s i d a n D N A ligase.

B A B 16 / P E N G G U N A A N T E K N I K D N A R E K O M B I N A N D A L A M D U N I A K E D O K T E R A N 2 3 9Teknik untuk Mengidentifikasi Urutan DNAPROBE DNA untai- gandaProbe a d a l a h D N A u n t a i t u n g g a l y a n g d a p a t m e m b e n t u k p a s a n g a n b a s a d e n g a n u r u t -an komplementer pada polinukleotidauntai-tunggal lain yang tersusun dari D N A atau Panas atau basaR N A . P r o s e s i n i d i k e n a l s e b a g a i p e n y a t u a n k e m b a l i (reannealing) a t a u h i b r i d i s a s i .U n t u k m e n g i d e n t i f i k a s i u r u t a n s a s a r a n , probe h a r u s m e m b a w a s u a t u l a b e l . A p a b i l aprobe m e m b a w a l a b e l r a d i o a k t i f m i s a l n y a ^^?, probe d a p a t d i d e t e k s i d e n g a n a u t o r a -d i o g r a f i . D i b u a t a u t o r a d i o g r a m d e n g a n m e m b u n g k u s b a h a n y a n g m e n g a n d u n g probedengan selembar film sinar-X. Elektronyang dipancarkan akibat kehancuran (disinte-g r a s i ) a t o m r a d i o a k t i f m e n y e b a b k a n f i l m t e r p a j a n d i d a e r a h t e p a t d i a t a s probe ( G b r .16.3). Probe d a p a t t e r d i r i d a r i c D N A ( d i h a s i l k a n d a r i m R N A o l e h reverse transcrip-tase), f r a g m e n D N A g e n o m ( d i p u t u s k a n d a r i g e n o m o l e h e n z i m r e s t r i k s i ) , o l i g o n u -kleotida yang disintesis secara kimiawi, atau, kadang-kadang, R N A . Terdapat sejum-l a h t e k n i k u n t u k m e m a s u k k a n l a b e l k e d a l a m probe t e r s e b u t . T i d a k SQm\xdi probe d i b -e r i l a b e l r a d i o a k t i f S e b a g i a n a d a l a h p r o d u k k i m i a t a m b a h a n (adduct) ( s e n y a w a y a n gberikatan secara kovalen dengan D N A ) yang dapat diidentifikasi,misalnya, denganfluoresens.ELEKTROFORESIS GEL DNA untai- tunggalGel elektroforesis adalah suatu teknik yang menggunakan medan listrik untuk memi-sahkan molekul berdasarkan ukuran. Karena mengandung gugus fosfat yang ber- , Labelmuatan negatif, di dalam medan listrik D N A akan bergerak menuju elektroda positif ' Probe(Gbr. 16.4). Molekul yang lebih pendek bermigrasi lebih cepat melalui pori-pori geldaripada molekul yang lebih panjang, sehingga pemisahan didasarkan pada panjang. Probe membentuk hibridisasiGel yang tersusun dari poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul D N A yang dengan sekuens komplementer pada DNAperbedaan panjangnya hanya satu nukleotida dan digunakan untuk menentukan urut- Gbr. 16.3. P e n g g u n a a n probe u n t u k m e n g i -an basa D N A . Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen D N A yang m e m i - d e n t i f i k a s i u r u t a n D N A . Probe m u n g k i n b e -liki perbedaan ukuran lebih besar. rupa D N A atau R N A . Pita D N A pada gel dapat dilihat dengan berbagai teknik. Pemberian zat w a m a Western blot saat ini digunakanmisalnya etidium bromida memungkinkan visualisasi langsung semua pita D N A di sebagai salah satu pemerik-b a w a h s i n a r u l t r a v i o l e t . U r u t a n s p e s i f i k b i a s a n y a d i d e t e k s i d e n g a n probe b e r l a b e l . saan untuk virus AIDS. Dalam hal ini, adanya protein virus didalam da-D E T E K S I URUTAN DNA S P E S I F I K rah dideteksi oleh antibodi. Pemeriksaan y a n g d i l a k u k a n t e r h a d a p t e m a n IvyUntuk mendeteksi urutan spesifik, D N A biasanya dipindahkan ke suatu penyokong Sharer, Doug Bewser, m e m p e r l i h a t k a nyang padat, misalnya selembar kertas nitroselulosa. Misalnya, apabila bakteri ditum- bahwa ia positif HIV. Namun, tidak sepertibuhkan pada suatu lempeng agar, sel dari masing-masing koloni akan melekat ke lem- Ivy, ia b e l u m memperlihatkan gejala AIDS.bar kertas nitroselulosa yang ditekankan ke agar tersebut, dan tiruan koloni bakteriyang persis akan dipindahkan ke kertas nitroselulosa tersebut (Gbr. 16.5). T e k n i k se-rupa digunakan untuk memindahkan pita D N A dari gel elektroforetik ke lembar ni-troselulosa. Setelah koloni bakteri dipindahkan ke kertas nitroselulosa, kertas diberilamtan basa. D a l a m hal di mana D N A dipisahkan pada gel agarosa, gel juga diberi suatulamtan basa. Larutan basa menyebabkan denaturasi D N A ,yaitupemisahan kedua untaidari masing-masing heliks ganda. D N A untai-tunggal dapat dihibridisasikan dengan su-a t u probe, d a n d a p a t d i l a k u k a n i d e n t i f i k a s i t e r h a d a p b a g i a n - b a g i a n p a d a k e r t a s n i t r o s e -l u l o s a y a n g m e n g a n d u n g D N A y a n g m e m b e n t u k p a s a n g a n b a s a d e n g a n probe. E.M. Southern menciptakan suatu teknik, yang menggunakan namanya, untukm e n g i d e n t i f i k a s i u r u t a n D N A p a d a g e l . T e r b e n t u k Southern blot a p a b i l a D N A p a d ablot n i t r o s e l u l o s a g e l e l e k t r o f o r e s i s d i h i b r i d i s a s i d e n g a n probe D N A . P a r a a h l i b i o -logi molekular memutuskan untuk menggunakan kompas sewaktu memberi namad u a t e k n i k t a m b a h a n . D i h a s i l k a n Northern blot a p a b i l a m R N A p a d a blot n i t r o s e l u l o s ad i h i b r i d i s a s i d e n g a n probe D N A . S u a t u t e k n i k y a n g s e d i k i t b e r b e d a t e t a p i m a s i hb e r k a i t a n , y a n g d i k e n a l s e b a g a i Western blot, m e l i p u t i p r o s e s p e m i s a h a n p r o t e i n o l e he l e k t r o f o r e s i s g e l d a n probing d e n g a n a n t i b o d i b e r l a b e l t e r h a d a p p r o t e i n s p e s i f i k(Gbr. 16.6).

240 BAGIAN III / EKSPRESI GEN DAN SINTESIS PROTEIN Southern Northern Western Elektroforesis gel Sampel DNA DNA RNA/ Protein/ y Rjuiin y rLn.ji^ [uuin Lempeng agar dengan koloni-koloni bakteri Arah Tekan kertas Pindahkan ke kertas migrasi nitroselulosa ke lempeng (pita tidak terlihat) Penanda Sel-sel dari masing-masing koloni radioaktif melekat ke kertas Kertas nitroselulosa Tambahkan p r o b e mengandung sel-sel untuk melihat pita bakteri cDNA cDNA Anti- Diberi lamtan basa untuk merusak sel bodiA Elektroforesis dan menimbulkan denaturasi DNA Molekul besar Molekul DNA untai-tunggal Autoradiografi kecil melekat ke kertas G b r . 16.6. Southern, N o r t h e r n , dan Western blot. Pada prosedur Southern blot, molekulB Fragmen-fragmen gel DNA ^ Tambahkan probe DNA radioaktif DNA dipisahkan oleh elektroforesis, didena- tidak tampak sampai digunakan f untuk sekuens DNA spesifik turasi, dipindahkan ke kertas nitroselulosa (dengan cara b l o t t i n g ) , dan dihibridisasi de- teknik untuk melihat mereka Kerarh. lalu cuci untuk membersih- ngan probe cDNA. Pada prosedur N o r t h e r n kan projbe yang tidak melakukan blot, dilakukan elektroforesis dan pengolah-G b r . 16.4. Elektroforesis gel DNA. A. Sampel hibridisasi an dengan cara yang sama terhadap RNA,DNA ditempatkan dalam bagian yang rendah kecuali tidak digunakan basa. (Basa menye-(\"sumur') di salah satu ujung gel. Lalu diberi- Probe yang membentuk babkan hidrolisis RNA). Pada Western blot,kan suatu medan listrik. DNA bermigrasi hibrida dengan DNA dilakukan elektroforesis terhadap protein danmenuju elektroda positif dengan kecepatan digunakan probe bersama antibodi spesifik.yang bergantung pada ukuran molekul. Mo- Probe diberi label untuk melihat pita-pitalekul yang lebih pendek bermigrasi lebih cepat yang membentuk hibridisasi dengan probedaripada molekul yang lebih panjang. B . Gel tersebut.dikeluarkan dari perangkat. Pita tidak tampaksampai digunakan teknik untuk melihat pita Lakukantersebut (lihat Gbr. 16.6). autoradiografi Bagian-bagian film sinar-X yang terpajan G b r . 16.5. Identifikasi koloni bakteri yang mengandung urutan DNA spesifik. Autora- diogram dapat digunakan untuk mengidenti- fikasi koloni bakteri pada lempeng agar asli yang mengandung urutan DNA yang di- inginkan.

B A B 16 / P E N G G U N A A N T E K N I K D N A R E K O M B I N A N D A L A M D U N I A K E D O K T E R A N * 2 4 1PENENTUAN URUTAN DNA Ivy Sharer s e d a n g d i o b a t i d e - ngan didanosin. Obat ini adalahWalaupun semula dianggap sebagai pekerjaan yang mustahil, penentuan urutan nu- suatu nukleosida purin (inosin)kleotida pada untai D N A sekarang merupakan teknik laboratorium yang rutin dilaku- yang mengandung basa hipoxantln me-kan. Prosedur yang paling lazim diciptakan oleh Frederick Sanger dan melibatkan lekat melalui ikatan glikosidat k e dideok-penggunaan dideoksinukleotida (Gbr. 16.7). siribosa. Dalam sel, didanosin diubah menjadi nukleosida trifosfat yang ikut ber- Dilakukan empat reaksi terpisah d imana hanya satu dari empat dideoksinukleo- gabung ke dalam untai D N A yang sedangtida (ddNTP) ditambahkan k e masing-masing tabung. Masing-masing tabung m e - tumbuh. Karena dideoksinukleotida tidakngandung larutan dengan keempat deoksinukleotida normal (dNTP), D N A polime- memiliki gugus 2'-hidroksil dan 3'-hidroksil,r a s e , s u a t u primer, d a n u n t a i c e t a k a n D N A . D N A p o l i m e r a s e m e n g k a t a l i s i s p o l i m e r i - tidak dapat dilakukan penambahan n u -sasi untai D N A yang komplementer terhadap cetakan. Dideoksinukleotida d i dalam kleotida tambahan k e untai yang sedangmasing-masing tabung secara acak melekat ke ujung-3' untai yang sedang tumbuh, t u m b u h tersebut, d a nsintesis D N A ter-membentuk pasangan basa dengan nukleotida yang sesuai pada untai cetakan. N a - h e n t i . Reverse transcriptase, e n z i m y a n gmun, karena dideoksinukleotida tidak memiliki gugus 3'-hidroksil, setelah terjadi menggunakan R N Avirus sebagai cetakanpenggabungan ddNTP, tidak dapat terjadi polimerisasi untai lebih lanjut, dan sintesis untuk menghasilkan salinan D N A , lebihterhenti. ddNTP bersaing dengan d N T P normal sehingga penghentian pembentukan peka terhadap aktivitas penghentian-untairantai bersifat acak tetapi basa tempat terjadinya penghentian tersebut sesuai dengan didanosin daripada D N A polimerase sel.ddNTP tertentu dalam campuran reaksi. Misalnya, untuk untai polinukleotida yangsedang tumbuh d imana adenin ( A ) seharusnya melekat diposisi 10,15, dan 17, per-saingan antara d d A T P dan d A T P untuk masing-masing posisi tersebut menyebabkanbeberapa rantai berhenti pada posisi 10, beberapa pada posisi 15, dan beberapa padaposisi 17.Cetakan DNA3'- .T-G-C-A-C-T-A-T-5' 5'primer Nukleotida: 5 ' — p r i m e r — 1 0 - 1 1 - 1 2 - 1 3 - 1 4 - 1 5 - 1 6 - 1 7 - 3 ' ) DNA polimerase + dATP, dGTP, dCTP. dTTP, dan salah satu dari 4 ddNTPApabila sintesis ddGTP ddCTP ddTTP terhenti dengan: ddATP 12 11 13 10 16 Ukuran produk _ 15(dalam nukleotida) 17 / Elektroforesis gel poliakrilamidUkuran fragmen DNA u Sekuens untai yang baru(dalam nukleotida) i3 disintesis dibaca dari dasar gel 11 5'—ACGTGATA — 3 ' 10 9Gbr. 16.7. Penentuan urutan D N A dengan metode dideoksinukleotida. Digunakan empatt a b u n g . M a s i n g - m a s i n g m e n g a n d u n g s e b u a h c e t a k a n D N A y a n g d i h i b r i d i s a s i k e s u a t u primer,D N A p o l i m e r a s e , d i t a m b a h d A T P , d G T P , d C T P , d a n d T T P . Primer a t a u n u k l e o t i d a h a r u smemiliki label radioaktif, sehingga pita-pita pada gel dapat dilihat dengan autoradiografi. Salahsatu dari empat dideoksinukleotida (ddNTP) ditambahkan k e dalam masing-masing tabung.Terjadi penghentian sintesis di mana ddNTP bergabung dengan rantai yang sedang tumbuh.Cetakan bersifat komplementer terhadap urutan untai yang baru disintesis.

2 4 2 BAGIAN III / EKSPRESI GEN DAN SINTESIS PROTEIN 16.1: Pada penelitian awal pada Akibat penghentian acak, dari satu cetakan dihasilkan untai-untai D N A yang pan- fibrosis kistik, penentuan urutan jangnya berbeda-beda. Untai terpendek terletak paling dekat dengan ujung-5' untai DNA digunakan untuk menentu- D N A yang sedang tumbuh karena untai tumbuh dalam arah 5'k e3'.Apabila untai-kan jenis defek pada penderita. Diambil sel untai iniditaruh dalam elektroforesis gel, urutan untai D N A dapat ditentukan dari po-bukal melalui pembilasan membran m u - sisi pita pada gel.kosa mulut, D N A yang diisolasi dari selinidiamplifikasi dengan cara reaksi berantai Teknik untuk Amplifikasi Urutan DNApolimerase (PCR), dan dilakukan penen-tuan urutan D N A gen fibrosis kistik. Di ba- Untuk meneliti genatau urutan D N A lainnya, harus diperoleh bahan dalam jumlahw a h ini diperlihatkan gel p e n e n t u a n urutan yang memadai. Isolasi D N A dalam jumlah yang bermakna dari sumber asli sering su-untuk regio di mana gen normal berbeda lit dilakukan. Misalnya, individu biasanya tidak dapat menyediakan cukup jaringandari gen mutan. untuk menghasilkan jumlah D N A yang diperlukan bagi pemeriksaan klinis. Oleh karena itu,jumlah D N A yang adaharus diperbanyak (diamplifikasi). Normal Mutan PENGKLONAAN DNAG A TC G A TC G A T C GAT C Teknik pertama yang diciptakan untuk memperbanyak jumlah D N A dikenal sebagai p e n g k l o n a a n (cloning) ( G b r . 1 6 . 8 ) . S u a t u f r a g m e n D N A d a r i s u a t u o r g a n i s m e ( D N A Apa perbedaan antara urutan gen fi- \" a s i n g \" ) d i s i s i p k a n k e d a l a m v e k t o r ( a t a u p e m b a w a ) y a n g t e r d i r i d a r i D N A , d a n chi-brosis kistik normal dan mutan yang tam- mera ( v e k t o r y a n g m e n g a n d u n g D N A r e k o m b i n a n ) d i g u n a k a n u n t u k m e n g u b a h b e n -pak pada gel, dan apa efek perbedaan ini tuk sel pejamu. Sewaktu sel pejamu membelah, selain melakukan replikasi terhadappada protein yang dibentuk dari g e n ini? D N A n y a sendiri, sel-sel tersebut juga melakukan replikasi D N A vektor, yang menca- kup D N A asing. Kemudian, dapat diisolasi D N A asing dalam jumlah relatif besar. Apabila sel pejamunya adalah bakteri, langkah pertama dalam prosedur pengklo- naan adalah menyisipkan D N A asing k e dalam suatu vektor yang kemudian dapat membawa D N A ini k edalam bakteri. Vektor yang paling sering digunakan adalah bakteriofaga (virus yang menginfeksi bakteri), plasmid (potongan ekstrakromosom D N A sirkular yang diserap oleh bakteri), atau kosmid (plasmid yang mengandung urutan D N A dari faga lambda). Segmen D N A asing atau D N A vektor biasanya diputuskan oleh enzim restriksi yang sama. Proses paling sederhana menggunakan suatu enzim yang menghasilkan ujung-ujung lengket komplementer pada D N A asing dan D N A vektor. Regio untai- tunggal komplementer dapat membentuk pasangan basa, dan molekuldapat diikatse- cara kovalen oleh D N A ligase. Apabila digunakan sel eukariotik sebagai pejamu, vektor sering tidak diperlukan karena tersedia teknik yang memungkinkan D N A asing masuk ke dalam sel pejamu. D N A asing kemudian dapat berintegrasi ke dalam genom sel pejamu melalui proses rekombinasi yang belum sepenuhnya dipahami. Sel pejamu yang mengandung D N A rekombinan sering disebut sel yang menga- l a m i t r a n s f o r m a s i (transformedcells) a p a b i l a s e l t e r s e b u t a d a l a h b a k t e r i , a t a u s e l y a n g m e n g a l a m i t r a n s f e k s i (transfected cells) a p a b i l a s e l t e r s e b u t a d a l a h e u k a r i o t . D i g u - nakan penanda pada D N A vektor untuk mengidentifikasi selyang telah mengalami t r a n s f o r m a s i , d a n d i g u n a k a n probe u n t u k D N A a s i n g u n t u k m e n e n t u k a n b a h w a s e l p e j a m u s e b e n a m y a m e n g a n d u n g D N A a s i n g . P r o s e s i n i d i s e b u t p e n a p i s a n (screen- ing){Ghx. 1 6 . 9 ) . Sel pejamu yang mengandung D N A asing diinkubasikan dibawah kondisi yang mendorong sel-sel tersebut membelah dengan cepat. D N A asing kemudian diisolasi dari sel tersebut. Apabila selpejamu ditumbuhkan d i bawah kondisi yang memung- kinkan ekspresi D N A asing, protein yang dihasilkan dari D N A ini dapat diisolasi.• \"Perpustakaan\" dalam istilah REAKSI BERANTAI POLIMERASE (PCR) para ahli biologi molekular ada- lah kumpulan sel pejamu yang Reaksi berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang dapat digunakan untuk pembuatan cepat D N A dalam j u m l a h sangat besar. Metode ini sangat cocok untuksecara kolektif mengandung s e m u a urut- memperbanyak D N A untuk prosedur pemeriksaan klinis atau forensik karena hanya diperlukan sampel D N A yang sangat sedikit sebagai bahan awal. D N A dapat diper-an D N A dari g e n o m organisme lain. banyak oleh reaksi berantai polimerase dari sehelai rambut atau setetes darah atau se- men.

B A B 16 / P E N G G U N A A N T E K N I K D N A R E K O M B I N A N D A L A M D U N I A K E D O K T E R A N 2 4 3 Tempat Tempat Walaupun hanya diperoleh se- *••*.. p e m u t u s a n pemutusan dikit s e m e n d a r i t u b u h Vicky Tim, jumlah D N Ayang terdapatPlasmid DNA yang dalam spesimen inidapat diperbanyak ^ J i l T akan diklona dengan reaksi berantai polimerase. ! ! (DNA asing) D i p u t u s k a n o l e h restriction endonuclease y a n g sama LigasiKromosom P l a s m i d chimeric (mengandung DNA plasmid dan DNA asing) Transformasi sel bakteri •ipilih sel-sel yang mengan- d u n g p l a s m i d chimeric Tumbuhkan sel dalam jumlah besar „ Untuk memperoleh Tumbuhkan di bawah Untuk memperoleh D N A p r o t e i n kondisi yang memungkinkan Isolasi plasmid ekspresi genyang telah diklona P u t u s k a n d e n g a n restriction Isolasi protein 16.1: Pada individu keturunan endonuclease Eropa utara, 7 0 % kasus fibrosis kistik (FK) disebabkan oleh de- Isolasi DNA yang diklona lesi 3 basa pada g e nfibrosis kistik. Di regio gen yang diperlihatkan padaDNA yang diklona Protein gel, urutan basa (dibaca dari bawah k e atas gel) 6posisi pertama s a m a untuk g e nGbr. 16.8. Skema sederhana untuk pengklonaan D N Adalam bakteri. normal dangenmutan, danbasa pada po- sisi 10-16 g e n normal s a m a dengan basa pada posisi 7-13gen mutan. Oleh karena itu, terjadi delesi 3 basa pada g e n mutan yang sesuai dengan basa 7-9 pada gen normal Mula-mula, harus dilakukan isolasi terhadap sampel D N A yang mengandung seg- lle I lie I Phe . Gly .m e n y a n g a k a n d i a m p l i f i k a s i . D i t a m b a h k a n primer, k e e m p a t d e o k s i r i b o n u k l e o s i d atrifosfat, dan D N A polimerase tahan-panas dalam j u m l a h besar ke dalam larutan di Urutan n o r m a l : ATC ATC TTT GGTm a n a D N A d i p a n a s k a n u n t u k m e m i s a h k a n u n t a i - u n t a i . Primer a d a l a h d u a o l i g o n u -kleotida sintetik. Setiap oligonukleotida bersifat komplementer (saling melengkapi) Urutan F K : T|ATC|AT T|GGT|terhadap urutan yang pendek pada satu untai D N A untuk diamplifikasi. Sewaktu larut-an mendingin, oligonukleotida membentuk pasangan basa dengan D N A dan ber- ' ile . lle Glyf u n g s i s e b a g a i primer u n t u k s i n t e s i s u n t a i D N A y a n g d i k a t a l i s i s o l e h D N A p o l i m e -rase tahan-panas. Keempat deoksiribonukleosida trifosfat berfungsi sebagai pre- Hilangnya 3 pasangan basa (dinyata-kursor untuk sintesis untai D N A baru. Proses pemanasan, pendinginan, dan sintesis kan dengan garis terputus-putus) m e m -D N A baru diulang berkali-kali sampai diperoleh salinan D N A dalam j u m l a h besar. pertahankan kerangka baca, sehinggaProses dapat diautomasikan sehingga setiap putaran replikasi hanya memerlukan hanya satu asam amino fenilalanin ( F )waktu beberapa menit (Gbr. 16.10). Dalam 2 0daur pemanasan dan pendinginan, yang hilang. Dalam keadaan normal, fenil-D N A mengalami amplifikasi lebih dari sejuta kali. alanin muncul sebagai residu 5 0 8 pada protein. Oleh karena itu, delesi disebut se- b a g a i AF503. U r u t a n a s a m a m i n o s i s a n y a pada protein normal dan protein mutan adalah sama.

244 BAGIAN III / EKSPRESI GEN D A N SINTESIS PROTEIN Vektor DNA genom plasmid manusia Regio DNA yang alon diamplifikasi Gen (Q Potong resistensi denganUntai 13 c ampisilin Tempat EcoRIUntai 2 5C (penanda) EcoRI IHittHiUlllIlIttiltt» Siklusi Dipanaskan untuk memisahkan untaiUntai 1 3'C Didinginkan dan Campur dan ligasikan Untai 2 5 T ^ ditambahkan p r i m e r oOoooOUntai 13'C Eh* Ditambahkan DNA polimerase tahan-panasUntai 2 5 t : 15- Plasmid rekombinan Siklus 2 P i n d a h k a n D N A k e E . coli I Dipanaskan danUntai 1 31 didinginkan (dengan penambahan DNA polimerase dan primer) Lempeng agar Koloni dengan resisten ampisilin ampisilinUntai 2 5 1 Buat replika nitroselulosa dan lakukanUntai 1 3't hibridisasi klona yang diinginkan dengan probe (»-) Kantung Saringan hibridisasi nitroselulosa Untai 25' Siklus 3 Siklus pemanasan Cuci dan pajankanke film sinar-X;Untai 1 3' dan pendinginan ambil klona yang diinginkandari lempeng 1 r diulangUntai 2 5' Autoradiogram Siklus 4 Siklus pemanasan Gbr. 16.9. P e n a p i s a n s e l u n t u k m e n c a r i D N A y a n g t e l a h d i k l o n a . D a l a m c o n t o h i n i , v e k t o r , sampai 20 dan pendinginan plasmid bakteri yang membawa sebuah gen resistensi ampisilin, dipotong oleh enzim restriksi berulang-ulang EcoRI, seperti j u g a D N A g e n o m , y a n g d i d a l a m n y a m e n g a n d u n g f r a g m e n y a n g d i i n g i n k a n . Ujung-ujung lengket dapat diligasi bersama untuk menghasilkan serangkaian molekul rekom- T e r d a p a t s e k i t a r 10® s a l i n a n binan, di mana berbagai fragmen genom telah disisipkan ke dalam vektor. Campuran ini kemu- d i a n d i t r a n s f e k s i k a n k e d a l a m E. coli p e k a - a m p i s i l i n y a n g t e l a h d i b e r i k a l s i u m k l o r i d a u n t u kGbr. 16.10. R e a k s i berantai p o l i m e r a s e ( P C R ) . meningkatkan daya serap bakteri tersebut terhadap D N A . Hanya bakteri yang menyerap plas-Untai 1 dan untai 2 adalah untai D N A asli. mid dengan gen resistensi ampisilin akan membentuk koloni apabila ditanam dalam mediumF r a g m e n p e n d e k y a n g d i a r s i r adalah primer. yang mengandung ampisilin. Sel bakteri yang lain akan dimatikan. Untuk mengidentifikasi re-Setelah siklus pemanasan dan pendinginan kombinan spesifik yang membawa fragmen genom yang diinginkan, dilakukan hibridisasi.berulang-ulang, untai asli akan tetap ada, tetapi Dari lempeng dibuat tiruan dari saringan nitroselulosa dan diinkubasikan dalam kantung hi-sebagian besar D N A terdiri dari salinan seg- bridisasi d e n g a n probe berlabel z a t r a d i o a k t i f , y a n g m e n g a n d u n g p a l i n g s e d i k i t sebagian darimen yang mengalami amplifikasi (yang diper- u r u t a n D N A y a n g d i i n g i n k a n . Probe a k a n secara s e l e k t i f b e r i k a t a n d e n g a n D N A dari k o l o n ilihatkan berwarna hitam) yang disintesis oleh yang memiliki plasmid yang diinginkan sehingga dapat diidentifikasi dengan menempatkanD N A polimerase tahan-panas. saringan terhadap f i l m s i n a r - X . D i m o d i f i k a s i d a r i G e l e h r t e r T , C o l l i n s F . Principles ofmedical genetics. B a l t i m o r e : Williams & Wilkins, 1 9 9 0 : 7 4 .

B A B 16 / P E N G G U N A A N T E K N I K D N A R E K O M B I N A N D A L A M D U N I A K E D O K T E R A N 245 PENGGUNAAN TEKNIK DNA REKOMBINAN UNTUK D N A polimerase yang digu- DIAGNOSIS PENYAKIT nakan untuk reaksi berantai po- l i m e r a s e d i i s o l a s i d a r i ThermusPolimorfisme DNA aquaticus, s u a t u b a k t e r i y a n g t u m b u h d i sumber air panas. Polimerase ini dapatPolimorfisme dalam genom berfungsi sebagai dasar bagi penggunaan teknik D N A re- menahan panas yang diperlukan untukkombinan dalam diagnosis penyakit. Polimorfisme adalah variasi dalam urutan D N A . memisahkan untai DNA.Dalam genom manusia mungkin terdapat jutaan polimorfisme yang berlainan. Yangpertama diidentifikasi adalah mutasi titik, substitusi (penggantian) satu basa oleh basa Mutasi yang menyebabkan ane-lain. Penelitian selanjutnya menunjukkan bahw^a delesi (penghilangan) d a n insersi mia sel sabit meniadakan tem-(sisipan) juga bertanggung jawab atas variasi dalam urutan D N A . Sebagian poli- p a t r e s t r i k s i u n t u k e n z i m Mst\\ d imorfisme terjadi di dalam regio pengkode pada gen. Yang lain ditemukan diregio bu- gen globin-p. Akibat dari mutasi ini adalahkan pengkode yang berkaitan erat dengan genyang terlibat dalam etiologi (penyebab) bahwa fragmen restriksi yang dihasilkanpenyakit keturunan. oleh /Ws/ll y a n g m e n c a k u p ujung-5' g e n globin-p berukuran lebih besar/panjangDeteksi Polimorfisme (1,3 kilobasa (kb))untuk individu dengan anemia s e lsabit daripada untuk IndividuRESTRIKSI POLIMORFISME PANJANG FRAGMEN normal (1,1 kb). Analisis terhadap fragmen restriksi merupakan pemeriksaan lang-Kadang-kadang terjadi mutasi titik di tempat pengenalan untuk enzim restriksi. Oleh sung untuk mengetahui mutasi. Padakarena itu, enzim dapat melakukan pemotongan ditempat pengenalan yang lain tetapi k a s u s Michael Sichel, k e d u a a l e l u n t u ktidak ditempat mutasi. Akibatnya, fragmen restriksi yang dihasilkan oleh enzim beru- globin-p tidak memiliki t e m p a t /Ws/ll d a nkuran lebih besar untuk individu dengan mutasi dibandingkan dengan untuk individu menghasilkan fragmen restriksi 1,3 kb.normal. Mutasi juga dapat menciptakan tempat restriksi yang tidak terdapat di gennormal. Dalam hal ini, fragmen restriksi akan lebih pendek untuk individu dengan P e m b a w a (carrier) m e m i l i k i s e b u a hmutasi daripada untuk individu normal. Variasi dalam panjang fragmen restriksi dike- alel normal d a n sebuah alel mutan. Olehn a l s e b a g a i r e s t r i k s i p o l i m o r f i s m e p a n j a n g f r a g m e n (restriction fragment lengthpoly- karena itu, D N Ap e m b a w a akan mengha-morphism [RFLP]). s i l k a n f r a g m e n r e s t r i k s i Mst\\ y a n g l e b i h besar d a nyang lebih kecil. Pada beberapa kasus, mutasi yang menyebabkan penyakit mempengaruhi tempatrestriksi di dalam regio pengkode suatu gen. Namun, pada sebagian besar kasus, mu- Sewaktu saudara perempuan Michaeltasi mempengaruhi tempat restriksi yang terletak di luar regio pengkode tetapi berkait- S i c h e l , Carrie Sichel, d i p e r i k s a , t e r n y a t aan erat (yaitu, secara fisik dekat molekul D N A ) dengan gen abnormal yang menye- ia memiliki fragmen restriksi besar d a n ke-babkan penyakit. cil, d a n statusnya sebagai p e m b a w a sifat anemia s e lsabit, yang diperkirakan ber- dasarkan elektroforesis protein, menjadi pasti.DETEKSI MUTASI OLEH PROBE OLIGONUKLEOTIDA SPESIFIK-ALEL gen A (normal)—GOT—G A A o - oKarena banyak mutasi yang berkaitan dengan penyakit genetik tidak terjadi di tempat Tempat M s t IIrestriksi, untuk mendeteksi mutasi tersebut telah dikembangkan teknik lain. gen S (sabit) — C C T - G m G - G - ^ D a p a t d i s i n t e s i s probe o l i g o n u k l e o t i d a y a n g k o m p l e m e n t e r b a g i s u a t u u r u t a n (tidak ada tempat M s t II)D N A p e n d e k y a n g m e n g a n d u n g m u t a s i . D i b u a t b e r m a c a m - m a c a m probe u n t u k a l e lyang mengandung mutasi dan untuk alel yang memiliki urutan D N A normal. Regio ' Tidak terdapat tempat Genpada genom yang mengandung gen abnormal diperbanyak melalui reaksi berantai po- globin- plimerase, dan sampel D N A ditempatkan dalam pita sempit pada kertas nitroselulosa restriksi di(\"slot blotting\"). K e r t a s k e m u d i a n d i b e r i probe u n t u k u r u t a n n o r m a l a t a u u r u t a n m u - Mstnt a n . A u t o r a d i o g r a m m e n u n j u k k a n apakahprobe n o r m a l a t a u m u t a n s e c a r a i s t i m e w a glob!n-f5 sel sabitmembentuk pasangan basa dengan D N A , yaitu apakah alelnya normal atau menga- Jlami mutasi. Pembawa, tentu saja, m e m i l i k i dua alel yang berbeda, satu berikatan de- Mstn ,Xn g a n probe n o n n a l d a n s a t u n y a l a g i b e r i k a t a n d e n g a n probe m u t a n . JL P e m e r i k s a a n i n i j u g a d a p a t d i l a k u k a n d e n g a n e l e k t r o f o r e s i s g e l d a n t e k n i k South-ern blot. N a m u n , m e t o d e slot blotting l e b i h s e d e r h a n a d a n l e b i h d a p a t d i p e r t a n g g u n g - ZEjawabkan untuk digunakan sebagai pemeriksaan penapisan. gen A -1.1 kbPEMERIKSAAN ADANYA MUTASI OLEH REAKSI BERANTAIPOLIMERASE gen S -1.3kb-Apabila urutan D N A dalam suatu regio yang mengandung suatu mutasi diketahui, da- Southern blot Ps(1.3kb)pat disintesis sebuah oligonukleotida yang komplementer dengan regio ini. Oligonu- DNA yang pA(l.lkb)kleotida tersebut akan membentuk pasangan basa hanya dengan D N A yang diperoleh dipotong dengan M s t II dan dihibridisasi dengan p r o b e globin-3 Kontrol sel sabit \" Kontrol normal *— Carrie Sichel -Michael Sichel

2 4 6 BAGIAN III / EKSPRESI GEN DAN SINTESIS PROTEIN 16.2: Pemeriksaan a d a n y a fibro- dari individu dengan mutasi tersebut. Oligonukleotida ini dapat digunakan sebagai sis kistik dengan penentuan primer u n t u k r e a k s i b e r a n t a i p o l i m e r a s e ( P C R ) . A p a b i l a D N A d i a m p l i f i k a s i o l e h urutan D N A memerlukan b a - PCR, D N A yang digunakan sebagai cetakan P C R harus mengandung mutasi. Apabilanyak waktu dan mahal. Oleh karena itu, di- D N A a d a l a h n o r m a l , primer t i d a k a k a n m e n g i k a t n y a d a n D N A t i d a k a k a n d i p e r b a -ciptakan teknik lain y a n g m e n g g u n a k a n nyak. Konsep ini dapat digunakan untuk pemeriksaan klinis.probe n u k l e o t i d a s p e s i f i k - a l e l . S i s s y F i -brosa d a n k e l u a r g a n y a d i p e r i k s a d e n g a n Dapat diciptakan oligonukleotida yang secara selektif berikatan dengan regiometode ini.Telah berhasil diciptakan pada D N A genom yang mengandung berbagai mutasi. Oligonukleotida ini, yangpro/?e oligonukleotida, yang komplementer masing-masing spesifik untuk setiap mutasi danmasing-masing mengandung labeldengan regio tempat delesi 3 basa terle- y a n g b e r l a i n a n , d a p a t d i g u n a k a n s e b a g a i primer d a l a m s a t u r e a k s i P C R . O l i g o n u k l e o - .t a k . S a t u probe b e r i k a t a n d e n g a n g e n m u - t i d a y a n g b e r f u n g s i s e b a g a i primer d a n m e n g a l a m i a m p l i f i k a s i a d a l a h o l i g o n u k l e o -t a n (AFgog) d a n y a n g s a t u n y a b e r i k a t a n tida yang sesuai dengan mutasi yang terdapat pada D N A individu yang digunakandengan gen normal. sebagai cetakan untuk PCR. Dilakukan isolasi dan amplifikasi D N A(dengan cara P C R ) dari Sissy, orangtua- DETEKSI MUTASI YANG MENGANDUNG REGIO YANG SANGATnya, dan dua saudara kandungnya. Sam- VARIABELpel D N A ditaruh pada kertas nitroselulosa,diberi p r o t e oligonukleotida, dan diperoleh D N A manusia mengandung banyak urutan yang diulang dua-dua beberapa kali dihasil berikut.(Titik-titik hitam menunjukkan lokus tertentu pada genom. Regio ini disebut regio hipervariabel karena mengandungpengikatan pro/?e). j u m l a h u l a n g a n d u a - d u a y a n g b e r u b a h - u b a h (variable number of tandem repeats (VNTR)). P e n c e r n a a n o l e h e n z i m r e s t r i k s i y a n g m e n g e n a l i t e m p a t y a n g m e n g a p i t r e - Autoradiogram gio V N T R menghasilkan fragmen yang mengandung lokus ini, yang ukurannya ber- beda dari satu individu k e individu lain, bergantung pada jumlah ulangan yang ada. Ayah Probe y a n g d i g u n a k a n u n t u k m e n g i d e n t i f i k a s i f r a g m e n r e s t r i k s i i n i b e r i k a t a n d i a t a u Anak1 dekat dengan urutan yang diulang (Gbr. 16.11). Anak 2 Sissy Fibrosa Pola fragmen restriksi yang dihasilkan dari lokus inidapat digunakan untuk meng- identifikasi individusama akuratnya seperti sidik jari tradisional. Pada kenyataannya. EcoRI EcoRI Siapa anggota keluarga Sissy yang VNTR Individu Cmengidap fibrosis kistik, siapa y a n g nor- Fragmen-fragmen EcoRImal, d a n siapa p e m b a w a sifat fibrosiskistik? yang dihasilkan dari: Individu B Autoradiogram Gbr. 16.11. F r a g m e n r e s t r i k s i y a n g d i h a s i l k a n d a r i sebuah g e n dengan variable number oftan- dem repeats (VNTR). M a s i n g - m a s i n g i n d i v i d u m e m i l i k i d u a h o m o l o g d a r i setiap k r o m o s o m so- matik dan, dengan demikian, memiliki dua gen yang masing-masing mengandung regio dengan V N T R ini. Pemutusan masing-masing D N A genom individu oleh suatu enzim restriksi menghasilkan duafragmen yang mengandung regio ini. Panjang fragmen bergantung pada j u m l a h u l a n g a n y a n g m e r e k a k a n d u n g . E l e k t r o f o r e s i s m e m i s a h k a n f r a g m e n , d a n probe berla- bel y a n g b e r i k a t a n dengan f r a g m e n d i g u n a k a n u n t u k m e l i h a t fragmen tersebut.

B A B 16/ P E N G G U N A A N T E K N I K D N A R E K O M B I N A N D A L A M D U N I A K E D O K T E R A N 2 4 7 Para saksi mengidentifikasi tiga DNA kromosom pria yang berbicara dengan Vicky Tim sewaktu ia berbe- Dicema denganlanja membeli makanan di toko tersebut.Sampel DNA diambil dari ketiga tersangka restriction erKtonudeasedan digunakan untuk pemeriksaan sidikjari DNA. Sampel dibandingkan dengan Fragmen DNADNA dari semen yang diambil dari korbandan dengan DNA korban sendiri. Hasilnya,dengan menggunakan probe untuk salahsatu dari urutan berulang pada DNA ma-nusia, diperlihatkan di bawah untuk meng-gambarkan proses pemeriksaan. Untukidentifikasi yang lebih positif, digunakansejumlah enzim restriksi dan probe yangberbeda. DNA dari tersangka 2 menghasilkanpola restriksi yang sama dengan DNA se-men yang diperoleh dari korban. Apabilapemeriksaan dengan enzim restriksi danprobe lain menguatkan temuan ini, ter-sangka 2 dapat diidentifikasi oleh sidik jariDNA sebagai pemeri^osa/pembunuh. 1Denaturasi dan pemindahan DNA ke kertas nitroseluk>saPIroteDNA Inkubasi dengan probe, cuci dan radk>aktir lakukan autoradiografi untuk meng- t amati pilaiNta DNA yang beriabel _^ ^ 16.2: Jelaslah, ayah dan ibu ke- ~ duanya adalah pembawa alel ~~ detektif, seperti juga salah satu dari dua kakak kandung (Anak 2). Sissy — _^ mengidap penyakit tersebut, dan saudara kandung yang lain (Anak 1) normal. Ijp. —^

248 BAGIAN III / EKSPRESI GEN D A N SINTESIS PROTEIN teknik fragmen restriksi i n i disebut \"sidik jari D N A \" dan semakin luas digunakan da- lam analisis forensik. Hubungan keluarga dapat ditentukan melalui metode ini, dan metode i n i dapat digunakan untuk membantu membebaskan atau menghukum ter- sangka dalam kasus kriminal. Individu yang secara genetik berhubungan erat akan memiliki pola fragmen restriksi (sidik jari D N A ) yang lebih serupa daripada individu yang hubungan gene- tiknya lebih jauh. Hanya kembar monozigotikyang akan memiliki pola yang identik. PENGGUNAAN TEKNIK DNA REKOMBINAN UNTUK K PENCEGAHAN DAN PENGOBATAN PENYAKIT Erna N e m d y m e n d a p a t v a k s i n Vaksin hepatitis B, d a n selain Itu diberi keterangan berikut oleh dokter Sebelum penemuan teknologi D N A rekombinan, vaksin dibuat dari agen infeksiosayang melakukan penyuntikan. yang dimatikan atau dilemahkan (diubah sehingga agen ini tidak lagi dapat berkem- Virus hepatitis B ( H B V ) menginfeksi bang biak dalam individu yang diinokulasikan dengan agen tersebut). Kedua jenishati, m e n y e b a b k a n kerusakan parah. V i - vaksin ini kemungkinan besar berbahaya karena dapat tercemar oleh agen infeksiosarus tersebutmemiliki suatu antigen permu- yang masih hidup. Pada kenyataannya, terdapat sejumlah kecil kasus, penyakit yangkaan (HBsAg) atau proteinselubung yang benar-benar disebabkan oleh vaksinasi.gennya telah berhasil diisolasi. Namun,karena protein mengalami glikosilasi, pro- Karena sistem kekebalan manusia berespons terhadap protein antigenik yang ter-tein Ini tidak dapat diproduksi dalam dapat pada permukaan agen infeksiosa, kemungkinan pembuatan antigen ini melaluiEscherichia coli. ( B a k t e r i , k a r e n a t i d a k m e - teknik D N A rekombinan sangatlah menarik. Dengan teknik D N A rekombinan, dapatmiliki organel subsel, tidak dapat mengha- dihasilkan protein yang sama sekali bebas dari agen infeksiosa, dan digunakan seba-silkan protein terglikosilasi). Oleh karena gai vaksin. Dengan demikian, semua risiko infeksi dapat disingkirkan. Vaksin D N Aitu, d i g u n a k a n s i s t e m ekspresi ragi (euka- rekombinan pertama yang berhasil dibuat adalah vaksin untuk virus hepatitis B (Gbr.riotik) y a n g menghasilkan protein bentuk 16.12).terglikosilasi. Protein virus, yang dipisah-kan dari sejumlah kecil protein ragi pence- Pembuatan Protein Terapeutikmar, digunakansebagal vaksin untuk Imu-nisasi terhadap infeksi H B V . INSULIN DAN HORMON PERTUMBUHAN Ann Sulin t i d a k lagi m e n d e r i t a Sekarang ini teknik D N A rekombinan digunakan untuk menghasilkan protein yang reaksi alergi setelah la mulai memiliki sifat terapeutik. Salah satu protein semacam ini yang pertama kali dibuat menggunakan Insulin manusia adalah insulinmanusia. Karena tidak mengalami glikosilasi, protein ini dapat dihasil-yang direkayasa secara genetik untuk k a n d a l a m E. coli. D i p e r s i a p k a n D N A y a n g s e s u a i u n t u k r a n t a i A d a n B i n s u l i n m a n u -menggantikan insulin sapi. sia dan disisipkan k e dalam plasmid yang digunakan untuk mengubah bentuk ( m e n y e b a b k a n t r a n s f o r m a s i ) s e l E. coli. K e m u d i a n b a k t e r i i n i m e n s i n t e s i s r a n t a i i n s u - lin yang kemudian dimurnikan dan dibiarkan membentuk lipatan serta ikatan disul- fida sehingga dihasilkan molekul insulin aktif (Gbr. 16.13). H o r m o n p e r t u m b u h a n m a n u s i a j u g a d i h a s i l k a n d i d a l a m E. coli, y a n g d a p a t d i g u - nakan untuk mengobati anak-anak dengan defisiensi hormon pertumbuhan. PROTEIN MANUSIA KOMPLEKS M a k i n banyak protein kompleks yang dapat dihasilkan dalam biakan sel mamalia. Pada individu dengan hemofilia, terjadi defek pada gen untuk Faktor VIII, suatu pro- tein yang terlibat dalam pembekuan darah. Sebelum tersedianya Faktor VIII yang di- rancang secara genetik, banyak penderita hemofilia meninggal akibat A I D S atau hepatitis yang mereka dapatkan dari transfusi darah yang tercemar atau dari Faktor V I I I yang diperoleh dari darah yang tercemar. A k t i v a t o r p l a s m i n o g e n j a r i n g a n (tissueplasminogen activator, TPA) a d a l a h s u a t u protease dalam darah yang mengubah plasminogen menjadi plasmin, suatu protease yang memutuskan fibrin, sehingga bekuan darah larut. T P A rekombinan, yang diha- silkan dalam biakan sel mamalia, sering diberikan selama atau segera setelah serang- an jantung untuk melarutkan trombus yang menyumbat arteri koronaria dan meng- hambat aliran oksigen ke otot jantung.

BAB 16 / PENGGUNAAN TEKNIK DNA REKOMBINAN DALAM DUNIA KEDOKTERAN 2 4 9 DNA Isolasi gen untuk Rantai A Rantai B HBV protein permu- insulin Insulin yang telah diklona kaan HBV VektorO Amp»^ Transfonmasi ke E. coli Gen untuk protein permu- kaan HBV Vektor Kromosom bakteriVektor ragi Transformasi sel ragi Biakan sel / \ H 4 /... Tumbuhkan ragi dalam medium yang selektif untuk Pemumian rantai sel yang mengandung plasmid insulin Sel dalam biakan > \y\/\/ .../\/ Sel diisolasi dengan Rantai A Rantai B pemusingan Membentuk lipatan dan Sel ragi oksidasi sistein dipecahkan Rantai A NH2 COOH Insulin Protein diisolasi Rantai B aktif Protein permukaan HBV Ikatan disuifidaGbr. 16.12. P e m b e n t u k a n v a k s i n h e p a t i t i s B d e n g a n c a r a t e k n i k D N A r e k o m b i n a n . Gbr. 16.13. P e m b e n t u k a n i n s u l i n m a n u s i a d a - l a m E. coli. Amp^ = g e n u n t u k r e s i s t e n s i a m - pisilin. Faktor pertumbuhan hematopoietik juga telah dibuat dalam biakan sel mamaliadengan teknik D N A rekombinan. Eritropoietin dapat digunakan dalam jenis anemiatertentu untuk merangsang pembentukan sel darah merah. Faktor perangsang-koloni(colony-stimulatingfactors, CSF) d a n i n t e r l e u k i n ( I L ) d a p a t d i g u n a k a n s e t e l a h t r a n s -plantasi sumsum tulang dan setelah kemoterapi untuk merangsang produksi sel darahputih dan menurunkan risiko infeksi. Suatu metode untuk menghasilkan protein manusia yang sekarang sedang diujimeliputi hewan transgenik. Hew^an ini dirancang secara genetik agar menghasilkanprotein manusia yang disekresikan kedalam susu (Gbr. 16.14).

250 BAGIAN III / EKSPRESI GEN D A N SINTESIS PROTEIN•o Willie Havet, tunangan Carrie Penyuluhan Genetik•-•w' Sichel, nnennutuskan untuk me- meriksa ada tidaknya gen sel Salah satu cara untuk mencegah penyakit adalah menghindari pewarisan gen defektif kepada keturunan. Pemeriksaan untuk mengetahui adanya penyakit genetik, terutamasabit pada dirinya. Ternyata ia memiliki ke- dalam keluarga yang diketahui membawa gen defektif, memungkinkan individu me- mutuskan sebelumnya apakah mereka akan menikah atau tidak dan/atau memilikidua fragmen restriksi Ms1\\ 1 , 3 kb dan 1 , 1 anak atau tidak.kb yang mencakup sebagian dari gen glo- Telah diciptakan pemeriksaan penapisan, yang didasarkan pada teknik D N A re- kombinan yang dibahas dalam bab ini, untuk banyak penyakit keturunan. Walaupunbln-p. Oleh karena Itu, seperti Carrie, ia pemeriksaan tersebut saat rni masih relatif mahal, terutama apabila dilakukan pena- pisan terhadap seluruh anggota keluarga, biaya tersebut mungkin kecil apabila diban-juga merupakan pembawa gen sel sabit. dingkan dengari beban yang ditanggung untuk membesarkan anak dengan cacat berat. Jelaslah, pertimbangan etis harus diperhitungkan, tetapi teknologi D N A rekombinan Suatu defek pada gen adenosin memberi kesempatan individu melakukan pilihan. deaminase (ADA) menyebab- Pemeriksaan penapisan dapat dilakukanpada pasangan yang akan menjadi orang- tua sebelum konsepsi terjadi. Apabila mereka memutuskan untuk memiliki anak, da- kan sindrom imunodefisiensi pat dilakukan pemeriksaan terhadap janin untuk mencari adanya kelainan genetik. Apabila janin menderita kelainan genetik, pengobatan dapat diberikmi pada tahapkombinasi yang. parah (severe combined dini, bahkan in utero. Untuk penyakit tertentu, terapi dini memberi hasil yang lebih positif.immunodeficiency syndrome, SCIDS). Terapi GenApabila terjadi defek pada ADA, adenosin Penyembuhan tuntas bagi penyakit genetik adalah dengan memasukkan gen normalmenumpuk dan secara tidak langsung ke dalam individu yang menderita defek gen. Saat ini, terapi gen sedang diupayakan dalam tahap eksperimental dalam biakan sel atau hewan dan, pada beberapa kasus,menyebabkan penurunan pembentukan pada subjek manusia.deoksiribonukleotida yang diperlukan un- Hewan Transgeniktuk sintesis DNA. Oleh karena itu, sel sis- Introduksi gen normal ke dalam sel somatik yang mengalami defek gen akan memper- baiki defek hanya pada individu yang diterapi, bukan pada ketunmaimya. Untuktem imun tidak dapat berproliferasi dengan menghilangkan defek pada generasi selanjutnya, gen normal tersebut harus dimasuk- kan ke dalam sel germinativum (sel yang membentuk sperma pada pria atau sel telurkecepatan nonmal, dan anak yang mengi- pada wanita). Eksperimen pada hewan menunjukkan bahwa terq)i gen pada sel ger- minativum dapat dilakukan dengan mudah. Gen dapat dimasukkan ke dalam telurdap SCIDS biasanya meninggal dalam yang telah dibuahi. Telur ini akan berkembang menjadi hewan transgenik, dan hewan transgemk ini dapat menghasilkan keturunan yang normal.usia dini karena tidak dapat melawan in- Jelaslah, eksperimen ini menimbulkan banyak pertanyaan etis yang sulit dijawab.feksi. Untuk bertahan hidup, penderita ter- KOMENTAR KLINIS. Setelah membaca mengenai perkembangan vaksinsebut harus dikurung dalam \"gelembung\" hepatitis B , Erna Nemdy menyadari babwa vaksin pertama yang tersedia untuk HBV, yang dipasarkan pada tahun 1982, adalah vaksin yang dimurni-lingkungan yang steril. Apabila tersedia kan dan \"diinaktifkan\", mengandung virus HBV yang dimatikan secara kimiawi. Vi- rus diperoleh dari darah pembawa HBV yang diketahui. Kemudian, digunakan vaksindonor yang sesuai, dapat dilakukan trans- ''yang dilemahkan\" di mana virus tetap hidup tetapi tidak lagi dapat berkembang biak dalam pejamu yang diinokulasikan. Baik vaksin yang diinaktifkan maupun yang dile-plantasi sumsum tulang dengan tingkat ke- mahkan memiliki potensi bahaya karena dapat terkontaminasi oleh HBV hidiq). Vaksin \"subunif yang modem, pertama kali dipasarkan pada tahun 1987, dibuatberhasilan yang cukup baik. oleh teknik DNA rekombinan yang dijelaskan pada awal bab ini. Karena vaksin ini hanya mengandung protein permukaan atau antigen virus yang merangsang responsPada tahun 1990, seorang anak pe- sistem imun,tidakterdapat risiko terinfeksi HBV.rempuan berusia 4 tahun, yang tidakmemiliki donor, diterapi dengan pemberianinfus limfosit sendiri yang telah diterapidengan retrovims yang mengandung genADA nonmal. Walaupun tidak beresponstertiadap terapi sebelumnya, la mengalamipert^aikan bermakna setelah usaha terapigen ini. Sejak itu, dua anak lain telah men-jalani terapi serupa untuk SCIDS. Fibrosis kistik adalah penyakit genetik resesif autosom yang dapat disebabkan oleh bermacam-macam mutasi di dalam gen fibrosis kistik yang terletak di kromosom 7. Sissy Fibrosa terbukti mengalami delesi 3 pasangan basa di residu 508 gen fibrosis

B A B 16/ P E N G G U N A A N T E K N I K D N A R E K O M B I N A N D A L A M D U N I A K E D O K T E R A N 251 PromotorImplantasi ke induk angkatProgeni transgenikdiidentifikasi dengan PCR Ekspresi gen manusia terbatas pada jaringan payudaraDiperoleh susu dari hewan transgenik Produk gen manusia disekresikan ke dalam susuFrakskmisasiprotein susu I 'B UProduk gen manusia mumiGbr. 16.14. Hewan transgenik digunakan untuk menghasilkan protein kan fraksionisasi protein susu dan hewan ini untuk memperoleh pro-manusia. Gen disisipkan ke dalam suatu vektor yang berada di l^awah tein manusia yang mumi. Dari: Recombinant DNA 2/E oleh Watson,kontrol promotor laktoglobulin-p, yang hanya aktif pada sel mamalia. Gilman, Witkowski, dan Zoller. Hak Cipta © 1992 oleh James D. Wat-Progeni transgenik (yang membawa gen manusia) diidentifikasi oleh son, Michael Gilman, Jan Witkowski, dan Mark ZoUer. DigunakanPCR dengan menggunakan primer untuk umtan gen manusia. Dilaku- dengan izin W.H. Freeman and Co.

252 BAGIAN III / EKSPRESI GEN D A N SINTESIS PROTEIN kistik (terdapat pada sekitar 7 0 % penderita Kaukasus dengan fibrosis kistik d i Amerika Serikat) yang berkaitan dengan perjalanan penyakit yang lebih parah di- bandingkan dengan mutasi lain yang menyebabkan penyakit tersebut. Protein fibrosis kistik yang normal mungkin berfungsi sebagai saluran ionklorida. Tidak adanya protein ini dalam jaringan penderita fibrosis kistik menyebabkan peru- bahan komposisi keringat dan, selain itu, menyebabkan penyumbatan dan dilatasi (pelebaran) kelenjar eksokrin dan duktusnya. Pada penderita fibrosis kistik, keringat mengandung natrium dan klorida dalam jumlah berlebihan (dasar untuk uji keringat), dan tidak terjadi pembersihan mukus dari percabangan trakeobronkial. Mukus yang berlebihan ini menyumbat jalan napas, sangat menurunkan pertukaran udara dan menimbulkan predisposisi stasis sekresi sehingga mudah terjadi infeksi sekunder. Sumbatan duktus pankreatikus menyebabkan sekresi enzim pankreas ke dalam lumen usus halus berkurang yang menyebabkan malabsorpsi lemak dan bahan makanan lainnya. Sekresi usus halus yang abnormal menyebabkan kekentalan isi lumen me- ningkat yang menyebabkan sumbatan usus halus dengan derajat yang berbeda. Se- kresi hati dan kandung empedu dapat terkena dengan cara yang sama. Fibrosis kistik adalah penyakit genetik yang relatif sering dijumpai di Amerika Se- rikat, dengan angka pembawa sekitar 5% pada orang Kaukasus. Penyakit ini terjadi pada 1per 1.600-2.000 kelahiran Kaukasus di negara ini (1 per 17.000 pada orang Amerika Afrika dan 1 per 100.000 pada orang Asia). S e t e l a h m e m p e l a j a r i h a s i l p e m e r i k s a a n u n t u k g e n sel sabit, Carrie S i c h e l dan Willie Havet b e r k o n s u l t a s i d e n g a n s e o r a n g k o n s u l t a n g e n e t i k . K o n s u l t a n t e r s e b u t memberitahu mereka bahwa, karena mereka berdua adalah pembawa gen sel sabit, kemungkinan mereka memiliki anak dengan anemia sel sabit cukup tinggi (sekitar 1 dalam 4). Konsultantersebut mengatakan bahwa dapat dilakukan pemeriksaan prana- tal terhadap D N A janin yang diperoleh dari sel dengan cara amniosentesis atau peng- ambilan sampel vilus korionik. Apabila pemeriksaan tersebut mengisyaratkan bahwa j a n i n mengidap anemia sel sabit, dapat dilakukan pengguguran. Carrie, karena latar* belakang agamanya, tidak yakin bahwa pengguguran kandungan adalah pilihan bagi- nya. Tetapi setelah m e n y a k s i k a n krisis sel sabit yang dialami saudara laki-lakinya se- lama bertahun-tahun, ia juga tidak yakin bahwa ia berani mengambil risiko memiliki a n a k d e n g a n p e n y a k i t t e r s e b u t . Willie Havet, t u n a n g a n n y a , j u g a m e r a s a k a n b a h w a pada usianya yang 25 tahun, bahwa ia belum siap menghadapi masalah sulit seperti itu. Mereka saling setuju untuk menunda rencana pernikahannya. Sidik jari D N A merupakan suatu kemajuan penting dalam dunia kedokteran fo- rensik. Sebelum ditemukannya teknik ini, identifikasi pelaku kejahatan kurang bersi- fat i l m i a h . T e r s a n g k a d a l a m k a s u s p e m e r k o s a a n d a n p e m b u n u h a n Vicky Tim d i t a h a n dan dihukum terutama berdasarkan hasil analisis sidik jari D N A . Namun, perlu dicatat bahwa teknik ini telah mendapat tantangan di beberapa pe- ngadilan karena masalah teknis termasuk interpretasi statistik terhadap data. Semua kontrol yang tepat harus benar-benar dilakukan, termasuk sampel dari D N A korban serta D N A tersangka. Timbul tantangan lain terhadap prosedur sidik jari D N A karena reaksi berantai polimerase adalah teknik yang sangat kuat sehingga dapat menyebab- kan amplifikasi sejumlah kecil D N A yang tercemar yang berasal dari sumber yang ti- dak ada kaitannya dengan kasus. n K O M E N T A R B I O K I M I A . Sekarang inisedang dilakukanusaha untuk me- m e t a k a n s e l u r u h g e n o m m a n u s i a . The Human Genome Project s e c a r a r e s m i dimulai pada tahun 1990 dan diharapkan selesai pada tahun 2005. Walau- pun pendanaannya terutama disediakan oleh pemerintah Amerika Serikat, banyak laboratorium di seluruh dunia ikut berpartisipasi. G e n o m manusia mengandung lebih dari 3 x 10^ (3 milyar) pasangan basa. Se- bagian besar persentase dari genom ini (95%) tidak mengkode urutan asam amino protein atau R N A fungsional (misalnya r R N A atau tRNA), tetapi terdiri dari urutan repetitif, intron, dan elemen non-pengkode lain yang tidak diketahui fungsinya. Ge-

BAB 16 / PENGGUNAAN T E K N I K DNA R E K O M B I N A N D A L A M DUNIA K E D O K T E R A N 253nom manusia diperkirakan hanya mengandung antara 50.000 sampai 100.000 gen. Si-lang pendapat mengenai kebijaksanaan pemetaan sedemikian banyak D N A \"sampah\"C j i w k \" DNA) y a n g m e m e r l u k a n b i a y a s a n g a t b e s a r ( d i p e r k i r a k a n a n t a r a S I d a n $ 1 0per pasangan basa, atau total $3 sampai $30 milyar) semula menyebabkan proyek ge-nom manusia ini terhenti. Tetapi, daya tarik untuk menelitihal yang tidak diketahui,dengan harapan imbalan yang besar, memenangkan perhatian d a n kehematan.Akhimya, para ahli yang pesimis terpaksa harus mengakui mereka yang optimis,tetapi dalam jangka pendek kekecewaan dan kekacauan niscaya terjadi. Seiring dengan munculnya pengumuman identifikasi gen yang tidak patuh di suratkabar pagi, rata-rata warganegara mengharapkan penyembuhan penyakit genetiktelah muncul dalam edisi petang. Kemajuan dalam pengobatan penyakit genetiktentu tidak akan semudah itu. Selain memecahkan teka-teki molekular yang terlibatdalam terapi gen, kita akan harus menghadapi banyak pertanyaan yang tidak dapat ter-jawab. Apakah layak apabila untuk menggantikan gen defektif dalam sel somatik untukmenghilangkan penderitaan manusia? Banyak orang mungkin setuju dengan tujuanini. Tetapi terdapat suatu pertanyaan terkait: apakah layak untuk menggantikan gend e f e k t i f dalam sel germinativum u n t u k m e n g h i l a n g k a n p e n d e r i t a a n m a n u s i a ? S e -dikit orang yang mungkin setuju dengan tujuan ini. Manipulasi genetik terhadap selsomatik hanya akan mempengaruhi satu generasi; selini akan mati bersama dengankematian individu. N a m u n , sel germinativum terus hidup, menghasilkan setiap ge-nerasi berturut-turut. Teknik yang dikembangkan untuk menyelidiki genom manusia dapat digunakanuntuk banyak tujuan. A p a batas penerapan pengetahuan yang diperoleh dari kemajuandalam bidang biologi molekular? Siapa yang memutuskan batas itu, dansiapa yangbertindak sebagai polisi genetik? Apabila kita mengizinkan eksperimen yang melibatkan manipulasi genetik selgerminativum manusia, bagaimanapun mulianya tujuannya, mungkinkah kita, dalamusaha \"memperbaiki\" diri sendiri, secara genetis malah merancang perlombaan umatmanusia menuju pemusnahan?Bacaan AnjuranHousman D. DNA on trial—the molecular basis of DNA fingerprinting. N Engl J Med 1995;332:534-535.Trent RJ. Molecular medicine. New York: Churchill Livingstone, 1993.Watson JD, Gilman M. Witkowski J, Zoller M. Recombinant DNA, 2nd ed. Scientific American Books. New York: WHFreeman, 1992.SOAL Ukuran MA H A C X Cy M B fragmenDua bayi perempuan (Cx dan Cy) dilahirkanpada hari yang sama di rumah sakit yangsama. Karena kekhawatiran bahwa bayi-bayi tersebut tertukar di kamar perawatan (kb)bayi rumah sakit, dilakukan pemeriksaan genetik yang didasarkan pada fragmenrestriksi D N A yang memperlihatkan polimorfisme karena fragmen tersebut m e - 10ngandung jumlah ulangan dua-dua yang berulang-ulang (VNTR). Darah diambil dari 8orangtua dan kedua bayi tersebut, lalu dilakukan ekstraksi D N A , serta reaksi berantaip o l i m e r a s e . K e m u d i a n D N A d i b e r i e n z i m r e s t r i k s i Bani, d a n f r a g m e n d i p i s a h k a nd e n g a n e l e k t r o f o r e s i s g e l . H a s i l Southern blot d i p e r l i h a t k a n d i s e b e l a h k a n a n . D i g u -n a k a n probe r a d i o a k t i f y a n g b e r i k a t a n d e n g a n u r u t a n d i d a l a m f r a g m e n Bani y a n gmemperlihatkan polimorfisme. Berdasarkan pemeriksaan i n i saja, siapa yang palingmungkin menjadi orangtua anak X dan siapa yang paling mungkin menjadi orangtuaanak Y ? (MA adalah salah satu ibu dan HAadalah suaminya. MB adalah ibu satunyadan HBadalah suaminya).

254 BAGIAN III / EKSPRESI G E N DAN SINTESIS PROTEIN JAWABAN Anak Cx mungkin merupakan keturunan ibu MA dan suaminya, HA. Anak ini dapat menerima kromosom yang mengandung fragmen 8-kb dari ayah HA dan kromosom homolog yang mengandung fragmen 7-kb dari ibu MA. A n a k C y m u n g k i n m e n e r i m a fragmen 5 - k b d a r i i b u M B , t e t a p i fragmen 8 - k b t i d a k mungkin berasal dari ibu MB atau suaminya, HB. Pada kenyataannya, kecil kemung- kinannya HB adalah ayah dari kedua anak tersebut. (HA mungkin merupakan ayah Cy, tetapi diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk memastikan suatu hubungan).