Bab 03 Makromolekul dan Interaksi Molekular

Pokok Bahasan: I Protein I Asam Nukleat I Interaksi Molekular Ikatan Hidrogen • Ikatan ionik • interaksi van der Waals • Interaksi Hidrofobik I Metode-metode Dasar yang Digunakan dalam Biologi Molekular Penggunaan Radioisotop • Sentrifugasi • ElektroforesisMolekul Ko m p o n e n sel jasad hidup terdlrl atas bermacam-macam molekul. Berdasarkanberdasarkan atas ukurannya, secara u m u m molekul yang ada dl dalam sel jasad hidupukurannya d i b e d a k a n atas d u a k e l o m p o k , y a i t u molekul kecil d a n makromolekul. M o l e k u l - molekul kecil mempunyai berat molekul kurang dari seribu, misalnya asam-asam amino (misalnya leusin), nukleotida (misalnya ATP), dan monosakarlda (misalnya glukosa). M a k r o m o l e k u l m e m p u n y a i b e r a t m o l e k u l yang sangat tinggi ( a n t a r a 10* sampai 10^^), misalnya protein,asam nukleat, dan polisakarida (misalnya amilum). Salah satu m a k r o m o l e k u l terbesar adalah kolagen yang merupakan protein yang terdapat d i dalam semua jasad multiselular. M a k r o m o l e k u l m e m p u n y a i peranan khusus d a nsangat penting bagi jasad hidup. Sifat-sifat genetik jasad hidup tersimpan di dalam untaian D N A yang merupakan polimer nukleotida. Sebagian energi yang diperlukan oleh jasad hidup tersimpan di dalam molekul polisakarida. Polisakarida juga merupakan penyusun dinding sel tanaman dan jasad renik. Protein juga merupakan m a k r o m o l e k u l yang mempunyai fungsi sangat penting, misalnya sebagai blokatallsator (enzim) reaksi- reaksi fisiologis, sebagai bagian dari sistem pengaturan ekspresi genetik (protein regulator), serta sebagai k o m p o n e n penyusun sel. Protein d a nasam nukleat merupakan d u akelompok m a k r o m o l e k u l yang mempunyai peranan sangat khusus bagi proses molekular dalam sel. O l e h karena

Bab 3 Makromolekul dan Interaksi Molekular ^ 3 Itu, dalam bab Ini akan dibahas s t r u k t u r dasar serta interaksi m o l e k u l a r dl antara keduanya sebagai dasar untuk m e m a h a m i proses molekular sel yang lebih kompleks. Protein Protein merupakan polimer asam-asam amino (polipeptida) yang mempunyai b e r m a c a m - m a c a m fungsi, antara lain:Fungsi-fungsiprotein 1 . Sebagai katalisator reaksi-reaksi biokimia dalam sel. P e r a n a n Ini d i m a l n k a n oleh molekul protein khusus yaitu enzim. Reaksi-reaksi yang dikatallsis oleh enzim berkisar dari reaksi-reaksi sederhana, misalnya hidrasi karbon dioksida, sampai reaksi kompleks, misalnya replikasi k r o m o s o m . Seperti telah disinggung dalam bab terdahulu, reaksi yang dikatallsis oleh enzim akan berjalan jauh lebih cepat daripada reaksi tanpa enzim. Enzim juga mempunyai peranan sangat penting d a l a m s t u d i b i o l o g i m o l e k u l a r , c o n t o h n y a e n z i m e n d o n u k l e a s e r e s t r l k s i (restric- tion endonuclease), e n z i m l i g a s e , D N A p o l i m e r a s e , d a n l a i n - l a l n . 2 . Sebagai pengangkut molekul-molekul kecil dan ion. T e l a h d i k e t a h u i b a h w a molekul-molekul berukuran kecil, misalnya okslgen, diangkut di dalam jaringan tubuh jasad multiselular oleh protein hemoglobin atau oleh myoglobin. Sistem pengangkutan nutrien k edalam sel jasad renik juga melibatkan protein pengangkut tertentu yang dikenal sebagai enzim permease, baik melalui mekanisme difusi b e r b a n t u a n (facilitated diffusion) a t a u t r a n s p o r a k t i f (active transport). S e b a g a i c o n t o h , m o l e k u l k a r b o n l a k t o s a d i a n g k u t k e d a l a m s e l b a k t e r i £. coli m e n g g u n a k a n p r o t e i n p e n g a n g k u t t e r t e n t u y a i t u e n z i m p e r m e a s e l a k t o s a (lactose permease), y a k n i s u a t u e n z i m y a n g s i n t e s i s n y a d i k o d e o l e h g e n lac. 3 . Berperanan di dalam sistem pergerakan yang terkoordinasi, m i s a l n y a d a l a m kontraksi otot, pergerakan k r o m o s o m menuju kutub-kutub sel selama proses mitosis, m a u p u n pergerakan flagela bakteri. 4. Sebagai komponen sistem kekebalan tubuh. S i s t e m kekebalan t u b u h ditentukan oleh adanya antibodi yang merupakan protein dengan fungsi sangat speslfik. Antibodi akan disintesis jika ada senyawa atau benda-benda asing masuk ke dalam tubuh. Antibodi berfungsi untuk mengenali benda-benda asing (anti- gen), misalnya sel bakteri, virus, atau sel-sel jasad hidup lain. 5 . Sebagai f e r o m o n . J a s a d e u k a r y o t t i n g k a t r e n d a h , m i s a l n y a k h a m i r Saccfiaro- myces cerevisiae, m e n g h a s i l k a n m o l e k u l b e r u k u r a n k e c i l y a n g d i s e k r e s i k a n k e l u a r s e l . K h a m i r h a p l o i d S. cerevisiae t e r d i r i a t a s d u a m a c a m t i p e mating y a i t u tipe a dan tipe a. K e d u a m a c a m tipe sel k h a m i r tersebut menghasilkan f e r o m o n b e r b e d a y a n g d i g u n a k a n u n t u k \" m e n a r i k \" s e l d e n g a n t i p e mating y a n g b e r b e d a sehingga akan terjadi konjugasi. F e r o m o n yang berfungsi di dalam proses \"per- kawinan\" antara d u asel khamir yang berbeda tipenya tersebut tidak lain juga berupa molekul protein.

6 . Sebagai pengatur el<:spresi genetik. P r o s e s r e p l i k a s i D N A , t r a n s k r i p s i ,dan translasi yang berlangsung dl dalam sel m e r u p a k a n proses selular yang sangatkompleks dan diatur oleh bermacam-macam protein, balk yang berupa proteinsebagai katalisator reaksi (enzim) maupun protein regulator. Ekspresi genetikpada dasarnya m e n e n t u k a n semua aktivitas biologis jasad hidup. Pada jasad renik,misalnya, hal ini akan m e n e n t u k a n apakah suatu substrat dapat dimetabollsme.Pada jasad tingkat tinggi, ekspresi genetik juga akan menentukan proses diferensiasi.O l e h karena Itu peranan protein dalam metabollsme jasad hidup sangat besardan vital.7. Sebagai penerus impuls saraf. P r o t e i n r e s e p t o r , m i s a l n y a r h o d o p s i n ,merupakan contoh protein yang berperanan meneruskan stimulus tertentu k esel saraf.8 . Sebagai k o m p o n e n p e n d u k u n g k e k u a t a n - r e g a n g {tensile strength) p a d akullt dan tulang, misalnya kolagen. Protein tersusun atas satuan yang berupa asam amino. Jumlah asam aminoyang u m u m terdapat pada jasad hidup ada 20 macam. Struktur dasar asam a m i n od a p a t d i l i h a t pada G a m b a r 3 . 1 . S a t u a s a m a m i n o t e r d i r i atas s a t u gugus amino,s a t u gugus karboksil, s a t u atom hidrogen, d a n s a t u rantai samping y a n g t e r i k a tpada a t o m karbon. Susunan tetrahedral keempat gugus tersebut menentukanaktivitas optIk asam amino sehingga ada dua bentuk isomer yaitu L-isomer danD - i s o m e r . Hanya bentuk L-isomer yang menyusun protein. P e r b e d a a n u t a m aantara satu asam amino dengan yang lalnnya terletak pada gugus sampingnya.A s a m a m i n o yang paling sederhana strukturnyaadalah gllsin yang hanya m e m p u n y a isatu a t o m hidrogen pada gugus sampingnya. Prolin adalah asam amino yangstruktur dasarnya berbeda dari asam a m i n o yang lain karena a t o m N-nya adad a l a m s t r u k t u r cIncIn, sehingga p r o l i n lebih sesual d i n a m a k a n asam imino.Struktur prolin yang demikian menyebabkan terjadinya bengkokan pada strukturprotein sehingga mempengaruhi arsltektur protein. Rantai s a m p i n g a s a m a m i n o dapat d i b e d a k a n atas: ( 1 ) polar, bermuatannegatif ( a s p a r t a t , a s a m g l u t a m a t ) , (2) polar, bermuatan positif ( a r g l n l n , h i s t i d i n ,lisin), ( 3 ) polar, tidak bermuatan (asparagin, g l u t a m i n , s e r i n , d a n t r e o n i n ) ,(4) nonpolar/hidrofobik (alanin, sistein, i s o l e u s i n , leusin, m e t i o n i n , f e n i l a l a n i n ,prolin, t r i p t o f a n , tirosln, dan valin), (5) netral (gllsin). K e d u a p u l u h m a c a m asamamino beserta singkatannya dapat dilihat pada Tabel 3.1. S t r u k t u r p r o t e i n d a p a t d i b e d a k a n d a l a m e m p a t a r a s (level). S t r u k t u r p r i m e rmenyatakan susunan linear asam-asam amino sepanjang rantai polipeptida.S t r u k t u r s e k u n d e r m e n g g a m b a r k a n p o l a p e l i p a t a n (folding) b a g l a n - b a g l a npolipeptida ke dalam strukturyang teratur, misalnya heliks dan lembaran terllpat-P (p-pleated sheet). S t r u k t u r t e r s i e r m e n g g a m b a r k a n p e l i p a t a n b a g l a n - b a g l a nantara hellks-a dan lembaran-p serta semua Interaksi nonkovalen yangmenyebabkan terjadinya pelipatan yang sesuai pada suatu rantai polipeptida.Interaksi nonkovalen tersebut antara lain ikatan hidrogen, Ikatan hidrofobik, dan

Bab 3 Makromolekul dan Interaksi Molel H OH H H H H I I ^.O I I ,.,0 I I ^OH I ^OH 1 ^OH I ^OH CHj CH, CHj CH, CH; CH, CH, ^,C^ CIH, HO' ^O Fenilalanin HN CH, I HjN-CI HjH j N - CII CI H, A s a m aspartat NI -H HO'^ ^^O Lisin Argmin Asam glutamat H H H H H I .^.o C C,I I ,0 10 IOH . NC^ < H,N CI H, -C- c f-OH C C^-O'^H /C1H OH OH H.N-^C < -OH H , N H,N CIH CIHj CH, CI H, CH, ^^C' HjC'^ \ H ', IS -'C H j HjC Valin Sistein Leusin Metionin Isoleusin HH H H H H3C/N^I ~/CiC\' H,C^^JOOH H,N-C c': I ^0 H,N c - c :H,N c - c r OH H,N —C- C ^COH CH H c CIHj OH HI OH CIH, Prolin Glisin NH H 9 . . ^ /\C H ^C c=c/ HC/^CH- \CH \ OH CH// Triptofan Histidin Tirosin H H H H c',;-' ,0 H,N C C* OH Cc!IH,H,N-C-C* OH H,N~~c ct; OH H,N-C c \"fOH H,N OH CM, CH, CH, OH I CH, H- C CH, Serin C- - NH, C~\"NH, OH il II O O Glutamin Asparagin Treonin Alanin Gambar 3.1 I S t r u k t u r d a s a r a s a m - a s a m a m i n o . interaksi v a nd e r Waals. A r a s s t r u k t u r keempat, yaitu struktur kuaterner, menunjukkan interaksi nonkovalen yang mengikat beberapa rantai polipeptida ke dalam satu molekul tunggal protein, misalnya hemoglobin.

Tabel 3.1 I D u a p u l u h m a c a m a s a m a m i n o y a n g u m u m t e r d a p a t d i a l a m .Asam amino Simbol satu-huruf Simbol tiga-hurufAlanin A AlaArglnln R ArgAsparagin N AsnA s a m aspartat D AspSistein C CysGlutamin GinAsam glutamat Q GluGlisin E GlyHistidin G HisIsoleusin H lieLeusin I LeuLisin L LysMetionin K MetFenilalanin M PheProlin F ProSerin P SerTreonin S ThrTriptofan T TrpTirosin W Tyr YValin V ValAsam Nukleat Asam nukleat adalah suatu polimer nukleotida yang berperanan dalam penyimpa- nan serta pemindahan informasi genetik. Satu nukleotida terdiri atas tiga bagian (Gambar 3.2) yaitu: 1. Cincin purin a t a u pirimidin, y a i t u basa n i t r o g e n y a n g t e r i k a t pada pada a t o m C n o m o r 1 suatu molekul gula (ribosa atau deoksiribosa) melalui Ikatan N-glukosidik. Ada dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat, yaitu b a s a p u r i n y a n g t e r d i r i a t a s adenine ( A ) d a n guanine ( G ) , s e r t a b a s a p i r i m l d i n y a n g t e r d i r i a t a s tiiymine ( T ) , cytosine ( C ) , d a n uroc/7 ( U ) . B a i k D N A (deoxyn- bonucleic acid) m a u p u n R N A (ribonucleic acid) t e r s u s u n a t a s A , G , C , t e t a p i T hanya ada pada D N A sedangkan U hanya ada pada R N A . Akan tetapi ada perkecualian, yaitu bahwa pada beberapa molekul t R N A terdapat basa T , sedang- kan pada beberapa bakteriofag D N A - n y a tersusun atas U d a nbukan basa T . Struktur basa nitrogen penyusun asam nukleat dapat dilihat pada G a m b a r 3.3. 2 . Molel<ul gula dengan 5 a t o m C (pentosa). P a d a R N A g u l a n y a a d a l a h ribosa, s e d a n g k a n p a d a D N A g u l a n y a a d a l a h deolcsiribosa. P e r b e d a a n a n t a r a k e d u a b e n t u k gula tersebut terletak pada a t o m C n o m o r 2. Pada R N A ,a t o m C n o m o r 2 berikatan dengan gugus hidroksil ( O H )sedangkan pada D N A a t o m C n o m o r 2 berikatan dengan atom H.

Bab 3 Makromolekul dan Interaksi Molekular Fosfat Adenine OO Ikatan glikosidik -O P — O — P - 0 — P — O — C H 2 Deoksiribosa O\" Deoksiadenosin Deoksiadenosin trifosfat (dATP) G a m b a r 3.2 I S t r u k t u r d a s a r n u k l e o t i d a .Purin Adenine Guanine CH3 Cytosine Thymine G a m b a r 3.3 I S t r u k t u r d a s a r b a s a n i t r o g e n a s a m n u k l e a t .

2 8 Biologi Molekular3. Gugus fosfat y a n g t e r i k a t p a d a a t o m C n o m o r 5 m e l a l u i I k a t a n fosfoesterGugus fosfat Inilah yang menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat. S u a t u basa yang t e r i k a t pada satu gugus gula d i s e b u t nukleosida, s e d a n g k a nnukleotida adalah satu nukleosida yang berikatan dengan gugus fosfat. D l dalammolekul D N A atau R N A , nukleotida berikatan dengan nukleotida yang lain melaluiikatan fosfodiester ( G a m b a r 3.4). Basa p u r i n dan p i r i m i d i n t i d a k b e r i k a t a n secarakovalen satu sama lain. O l e h karena itu, suatu polinukleotlda tersusun ataskerangka gula-fosfat yang berselang-seling dan m e m p u n y a i ujung 5'-P dan 3'-OH.Asam nukleat yang mempunyai ujung demikian u m u m terdapat dialam, meskipunasam nukleat yang mempunyai ujung 5'-OH d a n 3'-P dapat disintesis secarakimiawi. Penamaan asam nukleat disajikan dalam Tabel 3.2. o--p=o Basa I O I CH2 O\"—p=0 Ikatan fosfodiester G a m b a r 3.4 I I k a t a n f o s f o d i e s t e r a n t a r n u k l e o t i d a .Contoh Soal 1. Secara u m u m ukuran molekul di dalam sel dibedakan atas dua kelompok. Sebutkan. Jawaban: Dua kelompok molekul dalam sel adalah molekul kecil dan makromolekul. Molekul kecil mempunyai berat molekul kurang dari seribu, sedangkan makromolekul mempunyai berat molekul sangat tinggi (kurang lebih 10'* sampai 10^^). C o n t o h molekul kecil adalah asam amino, nukleotida, monosakarlda, sedangkan contoh makromolekul adalah protein, asam nukleat, polisakarida. 2. Sebutkan k o m p o n e n - k o m p o n e n penyusun asam amino. jawaban: Komponen penyusun asam amino: (1) gugus amino, (2) gugus karboksil, (3) atom hidrogen, dan (4) g u g u s r a n t a i s a m p i n g .

Bab 3 Makromolekul dan Interaksi Molekular ^ 9 » 'i3. Sebutkan fungsi-fungsi utama protein. Jawaban: Fungsi utama protein antara lain adalah: (1) katalisator reaksi dalam sel, (2) pengangkut molekul kecil dan ion, (3) berperanan dalam sistem pergerakan yang terkoordinasi, (4) bagian sistem kekebalan tubuh, (5) sebapl feromon, (6) sebagai pengatur ekspresi genetik, (7) penerus impuls saraf, dan (8) pendukung kekuatan regang.4. Sebutkan komponen penyusun asam nukleat. Jawaban: Asam nukleat tersusun atas: (1) gugus gula pentosa, (2)cincin basa purin atau pirimidin, dan (3) gugus fosfat. T a b e l 3.2 ft P e n a m a a n a s a m n u k l e a t .Basa Nukleosida NukleotidaAdenine ( A ) Purin Adenosin (rA)' A s a m adenilat, atau adenosinGuanine (G) Deoksiadenosin (dA)^ monofosfat ( A M P ) A s a m deoksiadenilat, atau Guanosin' (rG) deoksiadenosin monofosfat (dAMP) Deoksiguanosin (dG) A s a m guanilat, atau guanosin monofosfat (GMP) Asam deoksiguanilat, atau deoksiguanosin monofosfat (dGMP) PirimidinCytosine (C) Sitidin (rC) A s a m sitidilat, D e o k s i s i t i d i n (dC) atau sitidin monofosfat ( C M P ) A s a m deoksisitidilat, atau deoksisitidin monofosfat (dCMP)Thymine (T) Timidin* (dT) A s a m timidilat, atauUracil ( C ) Uridin (rU) timidin monofosfat (TMP) A s a m uridilat, atau uridin monofosfat ( U M P )Keterangan:' ribo: menyatakan basa R N A^ d: deoksiribo, menyatakan basa D N A^ Guanosin berbeda dari guanidin (bukan basa asam nukleat)^ Timidin (thymidine) adalah bentuk deoksi. Bentuk ribo tidak ada dalam asam nukleat.^ Uridin adalah bentuk ribo, deoksiuridin umumnya tidak ada.

30 Biologi MolekularInteraksi MolekularInteraksi Semua m o l e k u l dalam sel akan berlnteraksl satu sama lain. Interaksi antarmolekulnonkovalen tersebut akan menentukan sifat-sifat biologis molekul-molekul dldalam sel. Padadan kovalen u m u m n y a Interaksi m o l e k u l a r t e r s e b u t b e r u p a interaksi nonkovalen, y a i t u Interaksi a n t a r a t o m yang tidak t e r i k a t secara kovalen satu s a m a lain. Ikatan kovalen adalah Ikatan yang a d a d l a n t a r a a t o m - a t o m y a n g m e n y u s u n s u a t u molekul, misalnya ikatan antara atom H dan C pada molekul CH^. Ikatan kovalen adalah ikatan yang paling kuat dan paling stabil antara a t o m - a t o m . Sebaliknya, ikatan nonkovalen tidak sekuat ikatan kovalen namun mempunyai peranan penting dalam sel antara lain karena m e m b a n t u menstabllkan struktur m a k r o m o l e k u l dalam sel, misalnya protein dan asam nukleat. Beberapa ikatan nonkovalen yang penting dalam selantara lain ikatan hidrogen, ikatan ionik, interaksi van d e r Waals, dan interaksi hidrofobik. Ikatan H i d r o g e n Ikatan hidrogen adalah suatu bentuk interaksi lemah antara suatu a t o m elektro- n e g a t l f ( a t o m akseptor) dengan atom hidrogen yang terikat secara kovalen pada a t o m y a n g lain (atom donor). A t o m h i d r o g e n t e r l e t a k l e b i h d e k a t d e n g a n a t o m donor ( D )daripada dengan a t o m akseptor ( A )seperti terllhat dalam skema berikut ini: D - H+A < > D — H .... A ikatan hidrogen Ikatan hidrogen merupakan ikatan yang banyak terdapat dalam sistem biologis, misalnya pada asam nukleat dan protein. Pada asam nukleat, Ikatan hidrogen m e n y e b a b k a n t e r j a d i n y a p a s a n g a n a n t a r - u n t a i a n (interstrand) a n t a r b a s a n u k l e o d d a , m i s a l n y a a n t a r a adenine d e n g a n thymine ( A - T ) , d a n a n t a r a guanosine d e n g a n cytosine ( G - C ) . P a d a p r o t e i n , i k a t a n h i d r o g e n t e r j a d i a n t a r a g u g u s N H d a n C O pada rantai utama a-hellks. Gugus C O pada residu asam amino n berikatan hidrogen dengan gugus N H pada residu n + 4 , seperti terllhat pada skema berikut: HI HI IHI O HI HI IHI O HI -N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C- II I I I I N H H R 3 O R4 H R 5 O Ikatan I o n i k Ikatan ionik adalah ikatan antaratom yang terjadi karena adanya perbedaan muatan pada a t o m - a t o m yang berlnteraksl. Sebagai contoh, asam amino aspartat dan glutamat bermuatan negatif, sedangkan lisin, histidin, dan arglnln bermuatan positif. Muatan yang berbeda-beda itu menyebabkan asam-asam amino tersebut dapat

Bab 3 Makromolekul dan Interaksi Molekular 31m e m b e n t u k ikatan lonik. Jika asam-asam amino yang muatannya berbeda terletakpada bagian rantai polipeptida yang berjauhan, maka rantai polipeptida tersebutdapat melipat sedemikian rupa sehingga baglan-baglan tersebut dapat menjadiberdekatan karena adanya ikatan ionik. Sebaliknya, jika baglan-bagian rantai poli-peptida tersebut terdiri atas asam-asam amino yang bermuatan, maka akan terjadiefek tolak-menolak. Ikatan lonik merupakan Interaksi nonkovalen yang palingkuat. Meskipun demikian, Ikatan ini dapat dihilangkan oleh p Hyang ekstrem ataudengan kadar garam yang tinggi.Interaksi van der WaalsPada a t o m apa pun, fluktuasi acak distribusi elektron-elektronnya akan menyebab-k a n t e r j a d i n y a d w i k u t u b s e m e n t a r a {transition dipole), a t a u d e n g a n k a t a l a i ndistribusi muatan tidak simetris. Jika dua a t o m yang terikat secara nonkovalenberada cukup dekat satu sama lain, maka dwikutub sementara pada a t o m yangsatu akan menyebabkan terjadinya dwikutub sementara pada atom kedua. D w i -kutub sementara pada atom kedua tersebut akan menarik dwikutub pada atomyang pertama sehingga terjadi interaksi lemah di antara keduanya. Interaksisemacam ini disebut sebagai interaksi v a nd e rWaals d a nhanya terjadi jikakedua a t o m terletak sangat berdekatan dengan jarak antara 1 sampai 2 Ang-strom. Jika Interaksi antara dua a t o m tepat seimbang dengan kekuatan sallng-tolak antara keduanya, maka dikatakan kedua atom tersebut berada pada jarakk o n t a k van der W a a l s . Energi ikatan van der Waals pada sepasang atom kurang lebih sebesar 1kcal/mol. Energi inilebih kecil dibanding dengan energi pada ikatan hidrogenyang besarnya kurang lebih 3 sampai 7 kcal/mol. Oleh karena itu satu Ikatan vander Waals dapat dikatakan tidak berarti apa-apa. Ikatan van der Waals baruberarti cukup besar jika ada banyak a t o m dalam sepasang molekul yang dapatberada cukup dekat satu sama lain. H a l inihanya terjadi jika kedua molekultersebut mempunyai bentuk yang sepadan atau komplementer. Oleh karena itui n t e r a k s i v a n d e r W a a l s y a n g e f e k t i f t e r g a n t u n g p a d a k o m p l e m e n t a r i t a s sterik.Interaksi van der Waals terjadi misalnya antara molekul antibodi dengan antigenspesifiknya, dan antara enzim dengan substratnya yang spesifik.Interaksi HidrofobikMolekul-molekul nonpolar bersifat tidak larut dalam airsehingga disebut jugasebagai molekul hidrofobik. Ikatan kovalen antara dua a t o m karbon dan antaraa t o m karbon dengan a t o m hidrogen adalah contoh-contoh ikatan nonpolar.Gugus samping alifatik dan aromatik suatu protein dan basa-basa asam nukleatmempunyai sifat nonpolar. Kekuatan yang m e n d o r o n g terjadinya asosiasi atauagregasi antara m o l e k u l - m o l e k u l hidrofobik di dalam air disebut sebagai interaksihidrofobik. Interaksi hidrofobik merupakan kekuatan utama yang menyebabkanterjadinya pelipatan makromolekul, misalnya protein, dan pembentukan membransel.

Metode-metode Dasar yang Digunakan dalam BiologiMolekular Studi biologi molekular pada dasarnya berkaitan erat dengan analisis makromolekul. Analisis makromolekul dapat dilakukan berdasarkan atas reaksi kimiawi yang ditimbulkan oleh interaksinya dengan makromolekul/molekul lain, atau dengan mempelajari struktur fisiknya. Beberapa metode dasar yang digunakan dalam studi biologi molekular yang akan dijelaskan dalam buku iniantara lain adalah penggunaan radioisotop, sentrifugasi, d a n elektroforesis.radioisotop P e n g g u n a a n Radioisotop Isotop adalah elemen-elemen kimia yang mempunyai jumlah proton yang sama di dalam Inti a t o m n y a , tetapi massa a t o m n y a (jumlah p r o t o n d a n n e u t r o n ) berbeda. Beberapa isotop bersifat tidak stabil dan mengalami peluruhan secara spontan yang kadang-kadang diikuti oleh penyebaran radiasi elektromagnetik. A t o m - a t o m yang bersifat d e m i k i a n disebut sebagai radioisotop. Sebagai c o n t o h , a t o m sulfur selalu mempunyai 16 proton, tetapi dialam ada tiga bentuk isotop y a i t u ^^S, ^''S, d a n ^^S. ^^S m e m p u n y a i 1 6 p r o t o n d a n 1 9 n e u t r o n s e r t a b e r s i f a t s e b a g a i r a d i o i s o t o p . ^^S b e r s i f a t s a n g a t t i d a k s t a b i l d a n m e n g a l a m i p e l u r u h a n secara spontan menjadi ^^P serta melepaskan e l e k t r o n (partikel beta). Radioisotop banyak digunakan dalam studi biologi molekular. Contohnya, ^^S d i g u n a k a n u n t u k m e l a b e l p r o t e i n , a t a u u n t u k m e l a b e l n u k l e o t i d a y a n g d i g u n a k a n d a l a m p e n e n t u a n u r u t a n b a s a D N A ( D N A sequencing). P e n g g u n a a n e l e m e n radioaktif menyebabkan proses yang berlangsung di dalam sel akan lebih mudah diikuti. Penggunaan elemen radioaktif tidak akan mengubah sifat-sifat kimia molekul yang bersangkutan. Sebagai contoh, enzim tidak akan membedakan apakah molekul-molekul yang reakslnya dikatallsis tersebut bersifat radioaktif atau tidak. Salah satu contoh penggunaan bahan radioaktif adalah dalam transkripsi d a n t r a n s l a s i in vitro, m i s a l n y a u n t u k m e m p e l a j a r i k e k u a t a n p r o m o t e r s u a t u g e n dalam mengatur proses transkripsi. H a linidapat dilakukan dengan melakukan t r a n s k r i p s i s u a t u g e n y a n g d i k e n d a l i k a n o l e h p r o m o t e r t e r s e b u t s e c a r a in vitro dengan menggunakan campuran reaksi yang mengandung nukleotida radioaktif, misalnya [a-^^P]UTP. R N A yang disintesis kemudian dielektroforesis dan dianalisis autoradioaktivitasnya. Nukleotida radioaktif juga digunakan dalam analisis urutan basa D N A , misalnya menggunakan metode Sanger atau metode Maxam-Gilbert. Nukleotida berlabel yang digunakan u m u m n y a adalah [a-^^S]dATP atau [a-^^P]dATP. Urutan basa D N A dapat ditentukan dengan membaca autoradioaktivitas fragmen-fragmen polinukleotlda pada gel elektroforesis. Pada dasarnya a d ad u a macam m e t o d e untuk mendeteksi radioaktivitas pada hasil suatu reaksi kimia yang dilakukan dengan menggunakan bahan radioaktif, yaitu:

Bab 3 Makromolekul dan Interaksi Molekular 33 3*1 . D e n g a n prinsip autoradiografi, misalnya pada p e n e n t u a n u r u t a n basa D N A .Hasll reaksi penentuan urutan basa D N Akemudian dielektroforesis pada gelpoliakrilamid. Selembar film sinar X kemudian diletakkan di atas gel poliakrilamidtersebut sehingga radioaktivitas yang memancar dari gel akan mengenal film danakan m e m b e n t u k cItra sesual dengan pola urutan fragmen-fragmen polinukleotldapada gel. Setelah film tersebut diproses maka akan tampak pita-plta pada filmyang menggambarkan urutan basa D N A .2. R a d i o a k t i v i t a s d a p a t juga d i u k u r d e n g a n menggunal<an alat y a n g d i s e b u tGe/ger-ZVIuWer c o u n t e r , a t a u d e n g a n scintillation counter (solid a t a u liquid). Geiger-Muller counter d i g u n a k a n t e r u t a m a u n t u k m e n d e t e k s i i s o t o p y a n g m e m a n c a r k a np a r t i k e l P b e r e n e r g i t i n g g i , m i s a l n y a ^^P, ^ ' ' N a . Solid scindllation counter d i g u n a k a nu n t u k m e n d e t e k s i i s o t o p y a n g m e m a n c a r k a n s i n a r g a m m a , s e d a n g k a n l i q u i d scin-tillation counter d i g u n a k a n u n t u k m e n d e t e k s i I s o t o p y a n g m e m a n c a r k a n p a r t i k e lp berenergi rendah. Jika m e t o d e yang digunakan adalah autoradiografi, maka besarnya energiyang dihasilkan dalam proses peluruhan bahan radioaktif tersebut harus diper-timbangkan. Besarnya energi tersebut akan mempengaruhi kemudahan dalammelokallsasi t e m p a t terjadinya penggabungan bahan radioaktif di dalam sel. Sebagaicontoh, partikel P yang dipancarkan oleh^^P sangat kuat sehingga citra yangd i t i m b u l k a n p a d a film p a n j a n g n y a k u r a n g - l e b i h 3 m m . C i t r a s e p a n j a n g i n i j a u hlebih panjang daripada diameter satu sel sehingga akan menlmbulkan kesulltandalam menentukan lokasi partikel yang tepat dl dalam sel yang memancarkanradioaktivitas tersebut. Untuk menentukan lokasi atau struktur dalam sel yangmemancarkan radioaktivitas secara lebih tepat biasanya digunakan isotop H .Dengan Isotop ini citra yang ditimbulkan hanya sepanjang 0,47 m m . Dengan demikian,struktur dl dalam selyang dilabel dengan ^ Hdapat ditentukan dengan ketepatansekitar 0,5 sampai 1 m m , atau kurang lebih seperlima diameter inti sel mamalia.SentrifugasiSentrifugasi merupakan salah satu m e t o d e dasar yang sangat penting dalam studibiologi sel m a u p u n biologi molekular. Sentrifugasi tidak hanya dapat dipergunakanuntuk memisahkan selatau organel subselular, melainkan juga digunakan untukpemisahan molekular. Prinsip sentrifugasi didasarkan atas fenomena bahwa partikelyang tersuspensi di dalam suatu wadah (tabung atau bentuk-bentuk lain) akanmengendap k edasar wadah karena pengaruh gravitasi. Laju pengendapan tersebutdapat ditingkatkan dengan cara meningkatkan pengaruh gravitasional terhadappartikel. H a l inidapat dilakukan dengan menempatkan tabung berisi suspensipartikel k edalam rotor suatu mesin sentrifugasi kemudian diputar dengan k e -cepatan tinggi. Jika gaya F diterapkan pada suatu partikel dengan massa m , maka partikelakan dipercepat dengan arah linear sehingga: F =ma

3 4 %ologi Molekular a adalah laju percepatan linear, akan tetapi yang terjadi pada sentrifugasi adalah p e r c e p a t a n angular s e h i n g g a : a = v^lx V = kecepatan rotasi X = radius yang ditempuh selama sentrifugasi Biasanya nilal yang dlberlkan u n t u k gaya yang berlaku pada partikel yang di- sentrlfugasi berupa nilai relatif, yaitu dibandingkan dengan gaya tarik gravitasi bumi yang juga berlaku pada partikel tersebut. Gaya tersebut disebut gaya s e n t r l f u g a l r e l a t i f {relative centrifugal force, R C F ) . G a y a g r a v i t a s i y a n g b e r l a k u p a d a partikel dengan massa m adalah: F =mg g adalah percepatan gravitasi yang besarnya 980 cm/detik^. Dengan demikian: ~ '^entriftigas/'Vavitasi Dengan perhltungan matematis yang tidak akan dijelaskan disinl maka nilalR C F adalah: RCF = 1,119 X 10-5(rpm)^(x) rpm = revolutions per minute ( p u t a r a n t i a p m e n i t ) R C F t i d a k m e m p u n y a i s a t u a n n a m u n b i a s a n y a d i b e r l s i m b o l g.Faktor yang ^ Kecepatan proses pengendapan (sedimentasi) suatu partikel atau molekulmempengaruhi yang disentrifugasi dipengaruhi oleh dua macam faktor yaitu:kecepatanpengendapan 1 . Berat molekul ( B M ) . S e m a k i n t i n g g i B M - n y a m a k a k e c e p a t a n n y a j u g a s e m a k i n tinggi. 2 . Bentuk partikel. G e r a k a n s u a t u p a r t i k e l m e l a l u i c a i r a n a k a n d i p e n g a r u h i o l e h gaya gesekan. Partikel yang mempunyai bentuk lebih kompak akan bergerak lebih cepat di dalam cairan dibandingkan dengan partikel lain, yang bentuknya kurang kompak meskipun BM-nya sama. Dalam pembahasan mengenai proses sedimentasi d i k e n a l s u a t u k o n s t a n t a y a n g d i s e b u t koefisien sedimentasi (s) y a n g n i l a i n y a : s = kecepatan molekular/gaya sentrifugal Nilai s suatu partikel menunjukkan karakteristiknya di dalam suatu medium (larutan) pada suhu tertentu. Nilai s umumnya sama pada larutan yang berbeda sehingga s dianggap sebagai suatu konstanta dan dinyatakan dalam detik. Seringkali nilai s juga dinyatakan dalam satuan Svedberg (S) yang besarnya 1 S = 10\"^^ detlk yang berlaku dalam kondisi standar yaitu dalam air pada suhu 20°C. Koefisien sedimentasi m a k r o m o l e k u l dalam sel berkisar antara 1 S sampai 2 0 0 S. Svedberg adalah ahli biokimia pemenang hadiah Nobel yang mengembangkan ultra- sentrlfugasi.

i,Sentrifugasi ^ Bab 3 Makromolekul dan Interaksi Molekular^^pberdasarlcanprinsip umum Dua macam prinsip sentrifugasi yang u m u m digunakan untuk pemisahanpemisahan partikel didasarkan atas: ( 1 ) massa, ukuran, atau panjang partikel, (2) densitaspartikel partikel. Sentrifugasi Zonal Jika partikel atau molekul berada dldalam suatu k o l o m cairan di dalam tabung kemudian disentrifugasi, maka partikel atau molekul tersebut akan mengendap. Laju pengendapan tersebut ditentukan oleh massa partikel, perbedaan densitas antara partikel dengan cairan, dan gaya gesekan antara partikel dengan cairan. Jika partikel tersebut terdiri atas beberapa macam partikel yang berbeda ukuran atau panjangnya maka setelah disentrifugasi partikel-partikelyang berbeda ukuran- n y a a k a n t e r p i s a h p a d a l a p i s a n - l a p i s a n (zones) y a n g b e r b e d a p a d a t a b u n g sentrifugasi. Teknik pemisahan partikel berdasarkan massa semacam ini disebut sentrifugasi zonal. Sentrifugasi Keseimbangan Gradien-Densitas Dalam teknik sentrifugasi ini,partikel berada di dalam suatu cairan yang densltasnya bergradlen dari atas k e bawah, misalnya larutan cesium klorlda (CsCI). Setelah disentrifugasi, partikel di dalam cairan tersebut akan berada di lapisan cairan yang densltasnya sama dengan densitas partikel tersebut. Meskipun disentrifugasi dengan kecepatan yang sangat besar, partikel tersebut tidak akan mengendap melalui lapisan cairan yang densltasnya lebih tinggi daripada partikel t e r s e b u t . Prinsip sentrifugasi s e m a c a m i n i d i s e b u t sentrifugasi keseimbangan gradien-densitas k a r e n a partikel d a ncairan b e r a d a pada aras k e s e i m b a n g a n d e n s i t a s ( k e a d a a n isopycnic). T e k n i k s e n t r i f u g a s i i n i d a p a t d i g u n a k a n u n t u k memisahkan molekul-molekul yang perbedaan densitasnya sampai 0,02 g/ml. Teknik sentrifugasi semacam inibiasanya digunakan untuk memisahkan molekul- molekul protein, D N A , dan R N Ayang densitasnya didalam larutan CsCI berturut- turut adalah 1,3;1,6-1,7; dan 1,75-1,8 g/ml.\ Prinsip kerja Elektroforesis\ elektroforesis Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu m e - dium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya D N A yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub k ekutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif k e kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. T e k n i k elektroforesis dapat digunakan u n t u k analisis D N A ,R N A , maupun protein. Elektroforesis D N Adilakukan misalnya untuk menganalisis fragmen-

fragmen D N A hasil p e m o t o n g a n dengan enzim restrlksi. Fragmen m o l e k u l D N Ayang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuatgel agarosa, yaitu suatu bahan seml-padat berupa polisakarida yang diekstraksld a r i r u m p u t l a u t . G e l a g a r o s a d i b u a t d e n g a n m e l a r u t k a n n y a d a l a m s u a t u buffer.Agar dapat larut dengan balk, pelarutannya dibantu dengan pemanasan, misalnyam e n g g u n a k a n o v e n g e l o m b a n g m i k r o {microwave oven). D a l a m k e a d a a n p a n a s ,g e l a k a n b e r u p a c a i r a n s e h i n g g a m u d a h d i t u a n g k e a t a s s u a t u l e m p e n g {plate)yang biasanya terbuat dari Perspex. Sebelum mendlngin d a nmemadat, padaujung gel tersebut dibuat lubang-lubang dengan menggunakan lembaran Perspextipls yang dibentuk m e n y e r u p a i sisir. Sisir t e r s e b u t ditancapkan pada salah satuujung gel yang masih cair. Dengan demikian, pada w a k t u gel m e m a d a t d a nsisirnya diambil terbentuklah lubang-lubang kecil. K e dalam lubang-lubang kecilItulah sampel molekul D N Adimasukkan. G e l agarosa yang sudah terbentukk e m u d i a n d i m a s u k k a n k e d a l a m s u a t u t a n k i y a n g b e r i s i buffer y a n g s a m a d e n g a ny a n g d i g u n a k a n u n t u k m e m b u a t g e l . Buffer d a p a t d i b u a t m i s a l n y a d e n g a n t r i s -asetat-EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE). Setelah D N Adimasukkan k e dalam lubang sampel, arus listrik dialirkan.Kutub yang sejajar dengan lubang sampel D N A berupa kutub negatif, sedangkankutub lalnnya positif. Oleh karena D N A bermuatan negatif maka molekul-molekul D N A akan bergerak k e arah kutub positif. Setelah beberapa w a k t ugelkemudian direndam dalam larutan yang mengandung etidlum bromida. Etidiumbromida akan menginterkalasi (menyisip k e dalam) D N A . Penggunaan etidiumbromida dimaksudkan untuk m e m b a n t u visualisasi karena etidium bromida akanm e m e n d a r k a n sinar ultraviolet. Jika gel disinarl dengan ultraviolet dari bawah,maka akan tampak citra berupa pita-plta pada gel. Pita-pita tersebut adalahmolekul-molekul D N Ayang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis.Molekul R N A dapat dianalisis dengan prinsip yang sama, yaitu menggunakan gela g a r o s a , n a m u n d e n g a n m e n g g u n a k a n buffer y a n g b e r b e d a y a i t u y a n g m e n g a n d u n gformaldehid. T e k n i k elektroforesis D N A pun berkembang sehingga analisis molekul D N Atidak hanya dapat dilakukan dengan prinsip elektroforesis linear. Beberapa teknikb a r u d i k e m b a n g k a n , m i s a l n y a t e k n i k pulse field gel electrophoresis {PFGE), orthogonalfield alternation gel electrophoresis {OFAGE), transverse alternating fieldelectrophoresis ( T A F E ) d a n l a i n - l a l n . D i s a m p i n g i t u , u n t u k k e p e r l u a n t e r t e n t u ,m i s a l n y a u n t u k p e n e n t u a n u r u t a n b a s a D N A ( D N A sequencing), e l e k t r o f o r e s i sD N A d i l a k u k a n d e n g a n m e n g g u n a k a n g e l y a n g b e r b e d a y a i t u gel poliakrilamid. Elektroforesis protein pada dasarnya dilakukan dengan prinsip serupa sepertiyang digunakan dalam elektroforesis D N A , n a m u n gel yang digunakan adalah gelp o l i a k r i l a m i d . S e r i n g k a l i d a l a m p e m b u a t a n g e l a k r i l a m i d d i t a m b a h k a n sodiumdodecyl sulphate ( S D S ) y a n g m e r u p a k a n s e n y a w a u n t u k m e n d i s o s i a s i k a n p r o t e i nm e n j a d i s u b u n i t n y a . M e t o d e e l e k t r o f o r e s i s y a n g d e m i k i a n d i s e b u t SDS-PAGE{sodium dodecyl sulphate polyacrylamid gel electrophoresis). B e r b e d a h a l n y a d e n g a nD N A , protein yang dielektroforesis dapat dianalisis dengan pengecatan meng-gunakan Coomassie Blue. Senyawa Ini biasanya ditambahkan bersama-sama dengan

B a b 3 Makromolekul dan Interaksi Molekular _^?7_,Teknik l a i n ^ sampel. Pengecatan protein dapat juga dilakukan dengan larutan perak nitratanalisis d a l a m y a n g l e b i h s e n s i t i f d i b a n d i n g d e n g a n coomassie blue.biologimolekular Selain penggunaan radioisotop, teknik sentrifugasi dan elektroforesis, studi biologi molekular juga melibatkan teknik-teknik analisis yang lain, misalnya peng- g u n a a n m i k r o s k o p e l e k t r o n d a n t e k n i k blotting. M i k r o s k o p e l e k t r o n d i g u n a k a n t e r u t a m a u n t u k analisis struktur fisik D N A , misalnya untuk mengamati struktur superkoil, atau untuk mengetahui posisi relatif Intron pada suatu g e n setelah d i l a k u k a n h i b r i d i s a s i R N A - D N A . T e k n i k blotting a d a l a h t e k n i k p e m i n d a h a n molekul D N A , RNA, atau protein dari gel k e suatu membran, misalnya nitro- selulosa. Molekul D N A , R N A , atau protein yang berada pada membran tersebut kemudian dianalisis lebih lanjut, misalnya dengan m e t o d e hibridisasi atau dengan antibodi.^ Soal-soal1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan struktur primer, sekunder, tersier, dan kuaterner suatu protein.2. J e l a s k a n p e r b e d a a n f u n g s i b i o l o g i s a s a m n u k l e a t d e n g a n a s a m a m i n o .3. Sebutkan dan jelaskan secara singkat beberapa teknik atau m e t o d e untuk melakukan analisis biologi molekular.