Bab 05 Struktur DNA

'okok Bahasan: D N A sebagai Bahan Genetik Variasi Komposisi Basa D N A Bentuk dan Struktur Fisik D N A DNA Tipe Z (Putar-Kiri) Ukuran M o l e k u l D N A pada Beberapa Jasad H i d u p Faktor-faktor yang Menentukan Struktur D N A Tumpul<an-Basa * Itcatan Hidrogen Denaturasi D N A A s p e / r Fisiologis Denaturasi DNA Renaturasi D N A Persyaratan untuk Proses Renaturasi Topologi D N A Kandungan D N A dan Kapasitas Genetik Enzim yang Dapat Mendepolimerisasi D N AD N A ,ai Bahan Genetik1 Studi-studi \ Studi mengenai eksistensi asam nukleat pertama kali dilakukan oleh Friedrich\ asam n u k l e a t Miescher dari Jerman yang mengisolasi inti dari sel darah putih pada t a h u n 1869. MIescher menemukan bahwa dl dalam inti seltersebut terdapat senyawa yang/^ m e n g a n d u n g f o s f a t y a n g k e m u d i a n d i n a m a k a n nuklein. S e l a n j u t n y a p a d a a k h i r a b a d k e - 1 9 t e l a h b e r h a s l l d i l a k u k a n p e m i s a h a n a n t a r a D N A (deoxyribonucleic1 Eksperimen acid) d a n R N A (ribonucleic acid) d a r i p r o t e i n - p r o t e i n y a n g m e l e k a t k a n m o l e k u l\ Griffitt) asam n u k l e a t t e r s e b u t pada sel. Pada awal t a h u n 1 9 3 0 - a n , P. Levene, W . Jacobs, dan kawan-kawan menunjukkan bahwa R N A tersusun atas satu gugus gula ribosa dan empat basa yang mengandung nitrogen, sementara D N A tersusun atas gugus gula yang berbeda yaitu deoksiribosa. Pembuktlan bahwa D N A merupakan bahan genetik pertama kali dilakukan o l e h Frederick Griffith pada t a h u n 1 9 2 8 yaitu dengan e k s p e r i m e n transformasi p a d a b a k t e r i Streptococcus pneumoniae. B a k t e r i S. p n e u m o n i o e t i p e a l a m i m e m - punyai bentuk sel bulat (sferis) yang diselubungi oleh senyawa berlendir yang d i s e b u t kapsula. Sel-sel t i p e a l a m i a k a n m e m b e n t u k k o l o n i m e n g i l a t y a n g d i k e n a l sebagai k o l o n i halus (smootfi, S). Sel t i p e alami s e m a c a m ini bersifat viruien, yang

artinya dapat menyebabkan terjadinya kematian pada mencit yang diinjeksi dengans e l y a n g m a s i h h i d u p . S e l a i n i t u d i k e t a h u i a d a strain m u t a n S. pneumoniae y a n gkehilangan kemampuannya untuk m e m b e n t u k kapsula sehingga sel-selnya ber-ukuran kecil d a nakan m e m b e n t u k koloni yang kasar (rough, R). Sel mutans e m a c a m ini bersifat avirulen, a r t i n y a t i d a k dapat m e n y e b a b k a n k e m a t i a n padamencit yang diinjeksi oleh sel mutan. Eksperimen Griffith menunjukkan bahwa sel-sel yang avirulen dapat meng-alami transformasi (perubahan) menjadi sel yang viruien. Hal ini dibuktikan denganmenginjeksi mencit menggunakan sel-sel tipe alami yang masih hidup (sel tipe S).Diketahui kemudian bahwa injeksl dengan seltipe S yang hidup menyebabkankematian mencit. Selanjutnya eksperimen dilakukan dengan menginjeksi mencitmenggunakan sel tipe R yang hidup. Injeksl semacam ini ternyata tidak m e -nyebabkan kematian mencit. Hal yang serupa juga diperoleh yaitu bahwa injekslmencit menggunakan seltipe S yang sudah dimatikan ternyata juga tidak m e -nyebabkan kematian mencit. Pada eksperimen selanjutnya Griffith mencampursel-sel tipe S yang sudah dimatikan dengan sel-sel tipe R yang masih hidup dandilnjeksikan k edalam mencit. Hasll eksperimen menunjukkan bahwa injeksl dengancampuran sel semacam ini menyebabkan kematian mencit. Griffith kemudianm e n g i s o l a s i b a k t e r i S. pneumoniae d a r i m e n c i t y a n g s u d a h m a t i t e r s e b u t d a nm e m p e r o l e h sel-sel tipe S dan R yang hidup. Hal Ini m e m b e r i k a n indikasi bahwapencampuran sel tipe S yang mati dengan sel tipe R yang hidup telah menyebabkanperubahan (transformasi) seltipe R yang hidup menjadi seltipe S yang hidup. Bukti bahwa D N A merupakan bahan yang menyebabkan terjadinya prosest r a n s f o r m a s i p a d a S. pneumoniae d i t u n j u k k a n o l e h e k s p e r i m e n y a n g d i l a k u k a noleh Oswald Avery, Colin MacLeod, dan Mackyn McCarty pada tahun 1944.Mereka melakukan eksperimen serupa dengan yang dilakukan oleh Griffith, namunmereka melakukan pengujian lebih lanjut terhadap senyawa yang menyebabkant r a n s f o r m a s i S. pneumoniae. M e r e k a m e l a k u k a n e k s t r a k s i t e r h a d a p s e l v i r u i e ndan kemudian menghilangkan protelnnya. Hasil ekstraksi tersebut kemudiandiperlakukan dengan bermacam-macam enzim yang mendegradasi protein (tripsindan khimotripsin) maupun enzim yang menghancurkan R N A (RNase). Pengujianselanjutnya menunjukkan bahwa ekstrak sel tersebut ternyata masih dapatmenyebabkan proses transformasi. Hasll eksperimen membuktikan bahwa senyawayang menyebabkan proses transformasi bukanlah R N A . Sebaliknya, ketika ekstraksel tersebut diperlakukan dengan enzim deoksiribonuklease yang menghancurkanD N A , ternyata kemampuan untuk menyebabkan proses transformasi menjadihilang. Hasil ini memberikan indikasi bahwa senyawa yang menyebabkantransformasi adalah molekul D N A . Bukti lebih lanjut yang memperkuat asumsi bahwa senyawa yang menyebabkanproses transformasi adalah D N A ditunjukkan oleh eksperimen yang dilakukanoleh A . D. Hershey dan Martha Chase pada tahun 1952 dengan eksperimeny a n g d i k e n a l s e b a g a i Waring blender experiment. D a l a m e k s p e r i m e n t e r s e b u tdigunakan bakteriofag T 2 yang diketahui hanya terdiri atas protein dan D N A .Untuk membuktikan apakah senyawa yang bertanggung jawab terhadap perubahan

Bab 5 Struktur DNA 5 1sifat suatu sel berupa protein atau D N A , Hershey dan Chase melakukan pelabelant e r h a d a p p r o t e i n b a k t e r i o f a g T 2 d e n g a n ^^S. S e l a i n I t u , p a d a bagian e k s p e r i m e nyang lain, m e r e k a juga melabel D N A bakteriofag dengan ^^P. Bakteriofag yangt e l a h d i l a b e l t e r s e b u t k e m u d i a n d i g u n a k a n u n t u k m e n g i n f e k s i b a k t e r i Escherichiacoli. S e l u b u n g p a r t i k e l b a k t e r i o f a g y a n g s u d a h m e n g i n j e k s i k a n D N A - n y a k e d a l a msel kemudian diambil dan dianalisis. Hasil analisis m e n u n j u k k a n bahwa sebagianbesar protein berlabel tetap adadi luar sel, sedangkan D N Aberlabel ada didalam sel. Hal ini m e m b e r i k a n gambaran yang jelas bahwa senyawa yang masukke dalam seladalah molekul D N A .Hasil-hasil eksperimen seperti yang dijelaskan dl atas menunjukkan bahwamolekul yang merupakan bahan genetik di dalam sel adalah D N A . D N A merupakansalah satu m a k r o m o l e k u l yang mempunyai peranan sangat penting pada jasadhidup. D N A adalah polimer asam nukleat (lihat Bab 3) yang tersusun secarasistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepadaj a s a d k e t u r u n a n n y a . I n f o r m a s i g e n e t i k d i s u s u n d a l a m b e n t u k k o d o n (codon) y a n gberupa tiga pasang basa nukleotida dan m e n e n t u k a n bentuk, struktur, maupunfisiologi suatu jasad.Struktur molekul D N A pertama kali diungkapkan oleh James W a t s o nd a nFrancis Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuatoleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data kimia d a nfisik, W a t s o n d a n C r i c k m e m b u a t m o d e l s t r u k t u r D N Ay a n g d i s e b u t untai-g a n d a (double helix). U n t a i - g a n d a D N A t e r s u s u n o l e h d u a r a n t a i p o l i n u k l e o t l d ayang berpilin. Kedua rantai mempunyai orientasi yang berlawanan (antiparalel):rantai yang satu mempunyai orientasi 5' 3', sedangkan rantai yang lainberorientasi 3' 5'. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatanh i d r o g e n a n t a r a b a s a adenine ( A ) d e n g a n thymine ( T ) , d a n a n t a r a guanine ( G )d e n g a n cytosine ( C ) . I k a t a n a n t a r a A - T b e r u p a d u a i k a t a n h i d r o g e n , s e d a n g k a nantara G - C berupa tiga ikatan hidrogen sehingga ikatan G - C lebih kuat (Gambar5.1). Spesifisitas pasangan basa s e m a c a m ini disebut sebagai komplementaritas(complementarity). P r o p o r s i b a s a A d a n T s e r t a G d a n C s e l a l u s a m a s e h i n g g ak o m p o s i s i D N A d a p a t d i n y a t a k a n d e n g a n k a n d u n g a n G + C ( G + C content)y a n g b e r k i s a r d a r i 2 6 % s a m p a i 7 4 % . H a l ini d i k e n a l sebagai hukum Chargaff.Erwin Chargaff pada tahun 1 9 5 0 mempublikasikan hasil penelltiannya mengenaikomposisi basa D N A pada berbagai jasad hidup.Kerangka gula deoksiribosa d a nfosfat yang menyusun D N Aterletak dibagian luar molekul, sedangkan basa purin d a n pirimidin terletak di sebelahd a l a m u n t a i a n (helix). B a s a - b a s a p u r i n d a n p i r i m i d i n y a n g b e r p a s a n g a n t e r l e t a kpada bidang datar yang sama d a ntegak lurus terhadap aksis untaian D N A .Diameter untaian D N A adalah 20 A (angstrom). Diameter untaian bersifat konstankarena basa purin akan selalu berpasangan dengan basa pirimidin. Pasangan-pasangan basa yang b e r u r u t a n berjarak 3,4 A satu sama lain dan berotasi sebesar36°. S t r u k t u r u n t a i a n b e r u l a n g setiap 1 0 basa, a t a u d e n g a n k a t a lain a d a 1 0pasangan basa setiap putaran untaian. Untaian D N A mempunyai d u a lekukan(groove) e k s t e r n a l y a i t u l e k u k a n b e s a r (major groove) d a n l e k u k a n kecil (minor

52 Biologi IVlolel<ular Deoksiribosa ^ Deoksiribosa T Deoksiribosa ^ \ Deoksiribosa G a m b a r 5.1 ft I k a t a n h i d r o g e n a n t a r n u k l e o t i d a . I k a t a n a n t a r a a d e n i n e ( A ) d e n g a n thymine (T) dilakukan melalui d u a ikatan hidrogen, s e d a n g k a npada ikatan antara guanine ( G ) d a n cytosine (C) a d a tiga i k a t a n h i d r o g e n s e h i n g g a i k a t a n G - C lebih kuat dibandingkan dengan ikatan A - T .\ Konvensi groove). K e d u a l e k u k a n t e r s e b u t m e m p u n y a i p e r a n a n s e b a g a i t e m p a t m e l e k a t n y a penulisan molekul protein tertentu. Skema struktur untaian D N A dapat dilihat pada orientasi DNA Gambar 5.2. Oleh karena kedua rantai D N A tersusun secara antiparalel maka ada konvensi dalam penulisan orientasi D N A . Perlu diingat bahwa pada masing-masing rantai D N A ada ujung 5'-fosfat (5'-P) d a nujung 3'-OH. Molekul D N Ayang tersusun o l e h d u a r a n t a i (double-strarided) p o l i n u k l e o t l d a b i a s a n y a h a n y a d i t u l i s s a l a h s a t u rantainya, misalnya A T G C A A T T C C G G . D a l a m penulisan semacam ini ujung sebelah kiri (A) adalah ujung 5'-R sedangkan ujung sebelah kanan ( G )adalah ujung 3 ' - O H . O l e h karena i t um o l e k u l D N Atersebut dapat ditulis sebagai P-5'- A T G C A A T T C C G G - 3 ' - O H , atau kadang-kadang ditulis: p A p T p G p C p A p A p T p T p - C p C p G p G . U n t u k menylngkat biasanya D N A hanya ditulis urutan basa D N A - n y a saja.Variasi Komposisi Basa D N A Hasil studi pada berbagai jasad hidup menunjukkan bahwa komposisi basa D N A , y a n g d i n y a t a k a n s e b a g a i k a n d u n g a n G + C ( G + C content), s a n g a t b e r v a r i a s i . Diketahui bahwa [A]= [ T ]dan[ G ] = [C], tetapi nisbah (rasio) ([G] + [C])/([A]

Bab 5 Struktur DfMA 532 nm CG a m b a r 5 . 2 I S t r u k t u r u n t a i a n D N A h e l i k s g a n d a (double helix). P a n e l A m e n g -gambarkan struktur heliks d a n posisi basa nukleotida. Satu putaran heliks m e m -p u n y a i panjang 3 4 a n g s t r o m (3,4 n m ) d a n terdiri atas s e p u l u h p a s a n g a n basa.Panel B m e n g g a m b a r k a n struktur D N A secara lebih rinci. Tanda panahmenunjukkan orientasi masing-masing untaian D N A yang pada hakekatnyam e n g g a m b a r k a n arah sintesis m o l e k u l D N A . Panel C m e n g g a m b a r k a n m o d e ltiga dimensi struktur D N A . P a d a m o d e l s e m a c a m i n idapat dilihat adanya lekukan{groove) p a d a s t r u k t u r D N A .+ [T]) tidak sama antara jasad satu dengan jasad yang lain yaitu bervariasi dari0,37 sampai 3,16. Pada jasad hidup tingkat tinggi nilal kandungan G + C sekitar0,50 sedangkan pada jasad tingkat rendah variasinya cukup lebar yaitu 0,27 padag e n u s Clostridium s a m p a i 0 , 7 2 p a d a M i c r o c o c c u s hysodeikticus, s e m e n t a r a p a d aE coli k a n d u n g a n G + C a d a l a h 0 , 5 0 . S e m a k i n t i n g g i n i l a i k a n d u n g a n G + C m a k asemakin sukar molekul untai-ganda D N A tersebut dipisahkan. Oleh karena itujasad-jasad hidup termofilik (jasad yang m a m p u t u m b u h pada suhu tinggi) memilikikecenderungan mempunyai kandungan G + C yang tinggi. Tabel 5.1 memberikangambaran komposisi D N A yang adapada beberapa macam jasad hidup.

54 Biologi Molekular Tabel 5.1 >Komposisi basa D N A (%) pada beberapa m a c a m jasad hidup. Spesies A d e n i n e {%) G u a n i n e ( % ) Cytosine (%) Vtymine (%)Virus 32,6 18,1 16,6 32,6 Bakteriofag T2 13,8 37,7 35,6 12,8 Herpes simplex 26,0 23,8 24,3 25,8 LambdaBakteriE s c h e r i c h i a coli 26,0 24,9 25,2 23,9 29,8 20,5 18,0 31,6Diplococcus pneumoniae 14,4 37,3 34,6 13,7Micrococcus hysodeikticusFungi 23,0 27,1 26,6 23,3 N e u r o s p o r a crassa 31,7 18,3 17,4 32,6 S a c c h a r o m y c e s cerevisiae 25,0 25,1 25,0 24,9 Aspergillus niger Eukaryot tingkat tinggi 30,3 19,5 19,9 30,3 Homo sapiens ( m a n u s i a ) 29,8 20,2 18,2 31,8 liver 30,5 19,9 20,6 28,9 spermatozoa timus 25,6 24,5 24,6 25,3 32,1 17,6 18,0 32,2 Z e a mays ( j a g u n g ) 30,7 19,6 20,2 29,4 A r a c h i s hypogaea ( k a c a n g t a n a h ) 29,3 23,5 16,5 30,7 Drosophila melanogastcr Nicotiana tahacum ( t e m b a k a u )(Sumber: Paolella, 1997.)B e n t u k dan S t r u k t u r Fisik D N ATipe-tipe \ Struktur D N A seperti yang dikemukakan oleh W a t s o n dan Crick adalah strukturmolekul DNA yang paling u m u m terdapat di alam. S t r u k t u r semacam ini disebut sebagai s t r u k t u r untai p u t a r - k a n a n (right-handed helix). J i k a s e o r a n g p e n g a m a t m e l i h a t D N A 1 semacam ini ke arah bawah aksisnya, maka masing-masing rantai terlihat m e m u t a r sesuai dengan arah putaran j a r u m jam menjauh dari si pengamat. Dalam kondisi fisiologis, D N A mempunyai struktur untai putar-kanan yang setiap putarannya ada 1 0 basa D N A . I^eskipun demikian, studi menunjukkan bahwa banyaknya basa D N A tiap putaran ternyata bervariasi. Oleh karena itu pemikiran bahwa D N A hanya m e m p u n y a i satu m a c a m s t r u k t u r tidak sesuai dengan hasil pengamatan. Pada Tabel 5.2 di bawah ini disajikan beberapa variasi/alternatif struktur D N A . Berdasarkan Tabel 5.2, struktur D N A seperti yang dikemukakan oleh W a t s o n d a n C r i c k d a p a t d i k e l o m p o k k a n p a d a t i p e B. M o l e k u l D N A t i p e B m e m p u n y a i lekukan besar dan lekukan kecil. Dibandingkan dengan tipe A, lekukan besar pada tipe B lebih mudah mengikat protein tertentu karena lekukan besar pada tipe A lebih dalam. Bentuk A lebih menyerupai konformasi bagian untai-ganda molekul R N A (misalnya pada t R N A ) . Molekul hibrid D N A - R N A juga cenderung mempunyai bentuk tipe A .

5 6 Biologi MolekularBukti \ D N A t i p e Z a d a p a d a b a g i a n t e r t e n t u k r o m o s o m Drosophila. B u k t i l a i n j u g akeberadaan in m e n u n j u k k a n b a h w a D N A Z d a p a t d i t e m u k a n s e c a r a in vivo, y a i t u d e n g a nvivo DNA d i t e m u k a n n y a s u a t u p r o t e i n p a d a j a r i n g a n Drosophila y a n g h a n y a d a p a t b e r i k a t a ntipe Z dengan D N A Z sintetik, tetapi d d a k dapat b e r i k a t a n dengan D N A tipe B. Perbedaan antara D N Aputar-kanan dengan D N Aputar-kiri dapat dilihat pada Gambar 5.3. 3' 5' 5' '1 5' 3' 3' 5' DNA heliks putar-kanan DNA heliks putar-kiri G a m b a r 5.3 I S t r u k t u r h e l i k s D N A p u t a r - k a n a n d a n p u t a r - k i r i .Contoh Soal J1. Sebutkan beberapa variasi struktur D N A yang diketahui.jawaban:A d a empat macam variasi dasar struktur D N A , yaitu s t r u k t u r A , B, C, dan struktur Z. Keempatstruktur tersebut berbeda dalam hal jumlah pasangan basa tiap putaran, derajat rotasi, dand i a m e t e r untaiannya. Selain i t u dikenal juga s t r u k t u r D dan E.2. Apa yang dimaksud dengan D N A tipe Z ?Jawaban:D N A t i p e Z a d a l a h s u a t u s t r u k t u r D N A y a n g u n t a i a n n y a m e m p u n y a i o r i e n t a s i p u t a r - k i r i (left-handed). K e r a n g k a g u l a - f o s f a t n y a b e r b e n t u k z i g z a g s e h i n g g a d i s e b u t t i p e Z .

B a b 5 Struktur DNA 5 5 Tabel 5.2» Vaiiasi struktur D N A . Tipe Pasangan Rotasi/ Diameter Kondisiuntaian basa/putaran pasangan basa untaian*) terjadinya 11 •^32,7° 23 A Kelembapan Dalam relatif larutan 75% Na\" Cs\" 10 +36,0° 19 A 92% Kadar garam rendah 9,33 +38,6° 19 A 66% 12 -30,0° 18 A Kadar garam tinggi(Sumber: Lewin, 1987.)*) U k u r a n A: Angstrom.Catatan: Rotasi dinyatakan dengan nilai positif (+) untuk D N A putar-kanan, dan dinyatakan dengan nilai negatif (-) untukD N A putar-kiri. Bentuk C kemungkinan tidak ada dalam kcindisi in vivo. Selain bentuk-bentuk tersebut ada bentuk lain yanglebih ekstrem yaitu bentuk D dan E yang mempunyai pasangan basa per putaran hanya 8 dan 7,5. Kedua bentuk ekstremtersebut hanya terjadi secara in vitro pada molekul D N A '/ang tidak mempunyai basa guanine. DNA Tipe Z (Putar-Kiri) D N A tipe Z adalah satu-satunya D N A yang untaiannya mempunyai orientasi putar-kiri (left-iianded). M o l e k u l D N A t i p e s e m a c a m i n i m e m p u n y a i k e r a n g k a gula-fosfat yang berbentuk zigzag (sehingga disebut Z ) . D N A tipe Z pertama kali ditemukan oleh Alexander Rich dankelompoknya di Massachusets Institute o f Technology. D N AZ ditemukan dari hasil analisis kristalografi sinar X molekul- molekul D N A berukuran kecil yang tersusun oleh rangkaian basa-basa G - C yang berulang. Struktur D N A Z tidak hanya terjadi pada molekul yang mempunyai poli(dC-dG), melainkan juga terjadi pada bagian polinukleodda yang basa-basa purin d a n pirimidinnya bergantian, misalnya: A C A C A C A C . Lebih jauh lagi, jika basa-basa purin danpirimidin yang adasecara bergantian tersebut terletak pada molekul D N Ayang panjang, misalnya: TGATCCGCGCGCGCAGTCTT.... maka rangkaian purin-pirimicin tersebut dapat mempunyai konfigurasi Z pada konsentrasi N a C I sebesar 2 M sedangkan bagian D N A yang lain m e m p u n y a i konfigurasi B. D N A Z h a n y a m e m p u n y a i s a t u l e k u k a n y a n g m e m p u n y a i k e p e k a t a n (den- sity) m u a t a n n e g a t i f y a n g l e b i h b e s a r d i b a n d i n g k a n d e n g a n y a n g a d a p a d a l e k u k a n - lekukan D N A tipe B. P a d a a w a l n y a d i d u g a b a n w a D N A Z t i d a k a k a n d i t e m u k a n s e c a r a in vivo karena tipe ini hanya akan stabil dalam kondisi kadar garam yang tinggi. Akan tetapi bukti-buktl menunjukkan bahwa D N A Z dapat menjadi stabil dalam kondisi f i s i o l o g i s n o r m a l j i k a b a s a cytosine m e n g a l a m i m e t i l a s i m e n j a d i 5 - m e t h y / c y t o s / n e . D e n g a n t e k n i k antibodi f l u o r e s e n (fluorescent antibody) d a p a t d i b u k t i k a n b a h w a

B a b 5 S t r u k t u r D N A 57 J3. Suatu virus mempunyai bahan genetik berupa D N A untai-ganda yang berukuran 100.500 pasangan basa (bp). Hitunglah: (a) jumlah putaran heliks yang ada pada D N A tersebut, (b) jumlah D N A tersebut dalam mikron jika 1 mikron = 1 0 angstrom, (c) berat molekul D N A tersebut.Jawaban: DNAa. Satu putaran heliks meliputi 1 0,5 bp. Dengan demikian banyaknya putaran heliks pada tersebut adalah100.500 bp X 1 putaran heliks/10,5 bp = 9.571 putaran heliksb. Jarak antarpasangan basa adalah 3,4 a n g s t r o m , a t a u 3,4 x 1 0\"^ m m sepanjang aksis heliks. Dengan demikian panjang D N A adalahlOaSOO bp X 3,4 X 10\"* mm/bp = 34,17 m mc. Satu pasangan D N A m e m p u n y a i berat m o l e k u l 6 6 0 dalton ( D ) , sehingga berat m o l e k u l D N A tersebut adalah1 0 0 . 5 0 0 bp X 6 6 0 D/bp = 6,6 x 1 0 ' D = 6,6 x 10\"* k DUkuran Molekul D N A pada Beberapa Jasad Hidup Ukuran molekul D N Abervariasi antara jasad yang satu dengan lalnnya. Pada jasad prokaryot variasinya tidak sebesar pada virus dan bakteriofag. Bahan genetik pada prokaryot danvirus pada umumnya berupa satu molekul tunggal D N A (kecuali virus tertentu yang bahan genetiknya R N A ) . Sebaliknya, bahan genetik pada eukaryot berupa beberapa molekul k r o m o s o m yang masing-masing berupa molekul D N Aberukuran besar. Ukuran D N Apada jasad eukaryot, terutama eukaryot tingkat tinggi, belum diketahui secara pasti karena kompleksitasnya. Ukuran molekul D N A pada beberapa bakteriofag, misalnya bakteriofag A, telah diketahui secara pasti bahkan urutan basa D N A - n y a pun telah diketahui secara akurat. Pada bulan April 2003, sebuah konsorsium yang menangani proyek pe- m e t a a n g e n o m m a n u s i a (Human Genome Project) m e n y a t a k a n b a h w a p e n e n t u a n urutan D N A pada g e n o m manusia secara prinsip sudah selesai meskipun jumlah gen sesungguhnya sampai buku iniditulis (2006) belum diketahui secara pasti. Diperkirakan terdapat sekitar 20.000 sampai 25.000 gen didalam genom manusia. G e n o m b e b e r a p a j a s a d l a i n j u g a s u d a h d i t e n t u k a n , m i s a l n y a b a k t e r i Escherichia coli d a n k h a m i r Saccharomyces cerevisiae. P a d a T a b e l 5 . 3 d i s a j i k a n u k u r a n beberapa molekul D N A pada jasad hidup.Faktor-faktor yang Menentukan Struktur DNA jSeperti telah dijelaskan didepan, molekul D N A mempunyai struktur yang tertentuyaitu dalam bentuk molekul beruntai-ganda. Meskipun pada umumnya genomjasad hidup t e r s u s u n o l e h m o l e k u l D N A d p e B, n a m u n s t r u k t u r D N A bersifatf l e k s l b e l . P e r u b a h a n p a d a s t r u k t u r D N A d a l a m k e a d a a n in vivo b e r k a i t a n e r a t

5 8 Biologi Molekular Tabel 5.3 I U k u r a n D N A p a d a b e b e r a p a j a s a d h i d u p / p l a s m i d .Jasad hidup/ (pico-g) Massa Pasangan PanjangPlasmid (dalton) basa (kbp) (mm)Escherichia coli 0,004 2,5 X 1 0 ' 4.700 1.250Plasmid Col E l 0,009 X 10~'' 3,6 X 10'^ 9 2Plasmid F 0,095 X 10'' 57 X 10\" 95 32Bakteriofag X 0,047 X 10^' 20 X 10\" 47 15Bakteriofag T 4 0,166 X 10\"' 86 X 10\" 45Saccharomyces ( n = 1 6 ) 81 X 1 0 ' 166Aspergillus ( n= 8 ) 0,014 16,2 X 10' 12.057 4.172Drosophila ( n = 4 ) * 0,028 51 X 1 0 ' 27.000 8.250A y a m ( n= 15)* 0,085 760 X 10' 85.000 25 X 1 0 'Mencit ( n= 20)* 1,260 1,8 X 10i2 1,3 X 1 0 \" 400 X 1 0 'Manusia (n= 23)* 2,0 X 10^2 3,0 X 10\" 1 X 10\"Jagung ( n= 10)* 3,0 5,0 X 10'^ 3,3 x 10\" 1 X 10\" 3,25 8,4 X 10\" 2,5 X 10\" 8,40Keterangan:Tabel d iatas menyatakan u k u r a n D N Apada gamet (haploid). 1 m = 10^ meter = 10'' m m . 1 p g (picog r a m ) = 1 0 \" ' \" g , k b p = kilo base pairs = 1 0 0 0 p a s a n g a n b a s a , n : j u m l a h k r o m o s o m p a d a k e a d a a n h a p l o i d . dengan proses fisiologis yang berlangsung pada sel.Sebagai contoh, pada w a k t u sel m e m b e l a h terjadi proses replikasi D N A .Replikasi D N A dapat dimulai setelah ada perubahan pada struktur D N Ayaitu berupa terlepasnya ikatan hidrogen yang m e m b e n t u k struktur untai-ganda. Demikian pula pada w a k t u terjadi proses transkripsi, untai-ganda D N A akan memisah sehingga informasi genetik yang ada pada salah satu untaian dapat disalin k edalam bentuk urutan nukleotida molekul RNA. S t r u k t u r u n t a i a n ( h e / / x ) D N A d i t e n t u k a n o l e h t u m p u k a n (stackirig) b a s a - basa nukleotida berdekatan yang ada pada satu untai, sedangkan struktur untai- gandanya ditentukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang berpasangan.\ Teknik-teknik Tumpukan-Basa\ untuk I mengetahui Basa-basa purin dan pirimidin yang menyusun molekul D N A terletak pada suatu ' tumpukan-basa bidang datar yang tegak lurus terhadap aksis untaian D N A . O l e h karena Itu, molekul D N A dapat dianggap sebagai tumpukan-basa-basa nukleotida.Tumpukan- basa merupakan hasil interaksi hidrofobik antara sistem e l e k t r o n pada basa-basa n u k l e o t i d a . T u m p u k a n - b a s a (base-stacking) d a p a t d i k e t a h u i d e n g a n t e k n i k dispersi r o t a t o r ! optik (optical rotatory dispersion) d a n d i k r o i s m e s i r k u l a r (circular dichroism). D e n g a n t e k n i k - t e k n i k t e r s e b u t d a p a t d i k e t a h u i b a h w a t u m p u k a n - basa tidak hanya ada pada molekul D N A untai-ganda, melainkan juga pada molekul R N A untai-tunggal maupun molekul dinukleotida yang berukuran kecil. T u m p u k a n - basa dapat dihilangkan dengan menggunakan reagensia yang melemahkan interaksi hidrofobik atau dengan menggunakan panas. Jika tumpukan-basa dihilangkan, misal- n y a d e n g a n p a n a s , m a k a a k a n t e r j a d i k e n a i k a n s e r a p a n / a b s o r b a n s i c a h a y a (A^^Q)

Bab 5 Struktur DNA 59karena basa-basa nukleotida akan terbebaskan dari untaian. Diketahui bahwabanyaknya cahaya yang dapat diserap oleh asam nukleat tergantung pada strukturmolekulnya. Jika strukturnya lebih teratur, maka cahaya yang terserap lebihsedikit. Oleh karena itu, nukleotida bebas menyerap lebih banyak cahaya di-bandingkan dengan D N A atau RNA. Reagensia yang merusak ikatan hidrogen tidak berpengaruh terhadaptumpukan-basa polinukleotlda untai-tunggal, tetapi mereduksi tumpukan-basa padaD N A untai-ganda. Reagensia semacam Itu menghilangkan ikatan hidrogen antarauntaian-untaian D N A yang berikatan sehingga molekul untai-ganda terpisah menjadimolekul untai-tunggal dan serapan cahayanya menjadi lebih besar. D N A untai-ganda mempunyai struktur yang sangat stabil berkat adanyaInteraksi antara efek tumpukan-basa dan ikatan hidrogen dl antara kedua untaianD N A . Ikatan hidrogen yang maksimal akan tercapai jika semua basa D N A m e m -punyai orientasi yang tepat. Tumpukan-basa juga akan lebih kuat jika semua basanukleotida tidak melenceng dari susunan tumpukan tersebut. Dengan demikianbasa-basa nukleotida akan lebih mudah m e m b e n t u k ikatan hidrogen jika basa-basa tersebut tersusun dalam tumpukan. Sebaliknya, basa-basa yang m e m b e n t u kikatan hidrogen akan lebih mudah m e m b e n t u k susunan tumpukan-basa. Olehkarena Itu, penambahan suatu reagensia yang merusak salah satu bentuk interaksi(Interaksi hidrofobik, atau ikatan hidrogen) sangat memengaruhi integritas molekulDNA. Tumpukan-basa sesungguhnya juga merupakan suatu bentuk interaksi yangkooperatif. Pada suatu molekul D N A linear, efek stabilisasi s t r u k t u r karenatumpukan-basa lebih kuat pada bagian yang terletak jauh dari ujung. Ujung-ujungmolekul D N A linear pada umumnya tidak membentuk ikatan hidrogen. Misalkanada suatu molekul D N A dengan urutan basa: 5 ' - A B C D E F G H - 3 ' . Basa nukleotidayang terletak dl tengah, misalnya D, cenderung akan m e m b e n t u k konformasit u m p u k a n - b a s a y a n g s t a b i l k a r e n a o r i e n t a s i b a s a D d i a t u r o l e h b a s a C d a n E.Sebaliknya, basa A akan lebih mudah \"bergeser\" dari konformasi tumpukan-basak a r e n a stabilitas basa A h a n y a d i t e n t u k a n o l e h basa B. O l e h k a r e n a a d a n y a e f e ksemacam ini, molekul D N A yang berukuran pendek mempunyai stabilitasstruktural yang lebih rendah dibandingkan dengan molekul yang berukuran lebihpanjang. Suatu molekul trinukleotida untai-ganda (hanya terdiri atas tiga pasangbasa nukleotida) bersifat tidak stabil pada suhu kamar. Di samping itu, molekulD N A yang mempunyai bagian untal berpasangan yang sangat pendek dan diapitoleh bagian untai yang tidak berpasangan, juga tidak akan stabil pada kondisi suhufisiologis.Ikatan H i d r o g e nPada m o l e k u l D N A , ikatan hidrogen berperanan di dalam m e m b e n t u k s t r u k t u rheliks antara untaian yang berpasangan. Pasangan antara nukleotida A - T ditentu-kan oleh adanya dua ikatan hidrogen, sedangkan antara G - C ditentukan oleh tigaikatan hidrogen. Oleh karena itu, untuk merusak ikatan G-C diperlukan suhuyang lebih tinggi daripada yang diperlukan u n t u k merusak ikatan A - T . Hal ini

60 Biologi IVlolel<ular dapat dibuktikan dengan mengukur suhu yang diperlukan untuk memisahkan untaian D N A(suhu denaturasi) dengan adanya senyawa seperti misalnya urea d a n formamide. K e d u a s e n y a w a t e r s e b u t m a m p u m e m b e n t u k i k a t a n h i d r o g e n dengan basa-basa D N A .Denaturasi DNA Untai-ganda molekul D N A dapat dipisahkan dengan perlakuan suhu maupun senyawa alkali sehingga konformaslnya berubah dan dapat menjadi hampir acak. Makromolekul yang berada dalam konformasi hampir acak dikatakan berada d a l a m k e a d a a n d e n a t u r a s i (melting). S e b a l i k n y a , k e a d a a n t e r a t u r s u a t u m o l e k u l d i s e b u t s e b a g a i k e a d a a n a l a m i (native). J i k a m o l e k u l D N A u n t a i - g a n d a d i p a n a s k a n atau diperlakukan dengan alkali, ikatan hidrogen yang m e m b e n t u k struktur untai- ganda akan mengalami kerusakan sehingga molekul D N A akan berubah menjadi molekul untai-tunggal (s/ng/e-stronded).Tingkat denaturasi D N A tergantung pada tingginya suhu. Perubahan tingkat denaturasi D N Adapat diikuti dengan m e m - perlakukan D N A pada suhu yang bertingkat, kemudian diukur absorbansinya (A) pada Xjjo- ^^''1^ diketahui bahwa basa-basa asam nukleat menyerap dengan kuat c a h a y a p a d a X^^Q. K u r v a h u b u n g a n a n t a r a p e n l n g k a t a n s u h u d e n g a n n i l a i A ^ ^ g menunjukkan perubahan tingkat denaturasi D N A . Banyaknya cahaya yang dapat diserap oleh molekul D N A tergantung pada struktur molekulnya. Semakin teratur molekulnya maka semakin sedikit cahaya yang dapat diserap. Oleh karena Itu, nukleotida bebas menyerap cahaya lebih besar daripada molekul D N A untai- tunggal atau R N A . Nilai serapan cahaya oleh molekul D N A dengan struktur yang berbeda tetapi dengan konsentrasi yang sama (50 mg/ml) adalah sebagai berikut: D N A untai-ganda ^ 2 6 0 '= 1 , 0 D N A untai-tunggal ^260 = 1 , 3 7 Nukleotida bebas ^260 = 1 , 6 0hipokromilc Perlu diketahui bahwa molekul D N Amenyerap cahaya 4 0 % lebih sedikit d i -dan bandingkan dengan campuran nukleotida bebas yang mempunyai komposisi samahiperkromik dengan m o l e k u l D N A t e r s e b u t . F e n o m e n a s e m a c a m ini disebut efek hipokromik yang disebabkan oleh adanya Interaksi antara elektron-elektronpada basa nukleo- tida yang tersusun dalam bentuk untai-ganda yang sejajar. Pergeseran dari susunan semacam ini menyebabkan peningkatan serapan cahaya. Semakin besar pergeseran struktur tersebut maka semakin besar pula nilai serapan cahaya sehingga m e n l m b u l k a n efek hiperkromik. O l e h k a r e n a i t u , proses denaturasi D N A dapat diikuti dengan m e n g u k u r nilai serapan cahaya pada m o l e k u l D N A yang dipanaskan secara bertahap. Semakin tinggi tingkat denaturasinya maka semakin besar efek hiperkromiknya. Pola u m u m proses denaturasi D N A ditunjukkan pada Gambar 5.4.

Bab 5 Struktur DNA 6 1• I I I I I I I II30 40 50 60 70 80 90 S u h u (°C)G a m b a r 5.4 I K u r v a d e n a t u r a s i D N A . P a d a s u h u d i b a w a h T ^ , D N A m a s i hdalam keadaan untai-ganda. Semakin tinggi suhu denaturasi, m a k a semakin besarpula perubahan konformasi D N A yang terjadi.Beberapa hal penting yang perlu diperhatikan dalam kurva di atas antara lain:1 . Nilai Aj^Q t i d a k b e r u b a h sampai keadaan s u h u yang u m u m n y a dijumpai pada sel hidup di alam;2. Penlngkatan nilai A - . lerjadi d a b m kisaran 6-8°C;3 . N i l a i Aj^Q m a k s i m u m s e k i t a r 3 7 % l e b i h b e s a r d i b a n d i n g k a n d e n g a n n i l a i awalnya. Gambar 5.4 menunjukkan bahwa molekul D N A mengalami perubahanstruktur sesual dengan penlngkatan suhu. Pada tahap awal, molekul D N A masihberupa struktur untai-ganda. Kenaikan suhu menyebabkan sebagian ikatan hidrogenterlepas sehingga pada bagian tertentu ada s t r u k t u r untai-tunggal. H a l ini m e -nyebabkan nilai serapan cahaya meningkat. Semakin tinggi suhunya maka semakinbanyak bagian D N A yang berubah menjadi struktur untai-tunggal,sampai akhirnyastruktur untai-ganda terlepas sama sekali. Denaturasi lengkap biasanya terjadipada suhu di atas 90°C. Pada keadaan s e m a c a m ini nilai A^^^ m e n i n g k a t sebesar3 7 % dan suspensi D N A terdiri atas untai-tunggal. Jika suspensi D N A tersebutdidinginkan secara cepat pada suhu kamar dan konsentrasi garamnya di atas 0,05M , m a k a nilai A^^g yang dicapai pada suhu m a k s i m u m akan t u r u n secara cukup

nyata, sekitar 1,12 kali. Hal ini disebabkan oleh terjadinya pembentukan ikatanh i d r o g e n a n t a r a b a s a - b a s a d i d a l a m u n t a i a n D N A y a n g s a m a (intrastrand) s e h i n g g amolekulnya menjadi kompak. Jika konsentrasi garamnya 0,01 M atau kurang,maka kondisinya menjadi lain. Dalam keadaan semacam inigugus fosfat yangt i d a k t e r n e t r a l k a n m e n y e b a b k a n t e r j a d i n y a s a l i n g t o l a k (electrostatic repulsion)sehingga tidak terjadi pembentukan ikatan hidrogen di dalam untaian tunggalD N A yang sama.Parameter yang sering digunakan untuk menunjukkan fase translsl pada saatperubahan nilai A^^g sebesar setengahnya adalah nilai (melting temperature).Pola denaturasi D N A selalu menunjukkan bentuk yang serupa seperti pada Gambar5.4, tetapi posisi absolut pada skala suhu (nilai T,^) tergantung pada komposisimolekul D N A d a n kondisi yang digunakan untuk melakukan denaturasi. JikaD N A berada dalam larutan yang mempunyai kondisi kurang lebih sama dengankondisi fisiologis sel maka nilai berkisar 85-95°C. Oleh karena itu, dalamkondisi fisiologis sel yang n o r m a l m o l e k u l D N A bersifat stabil. Meskipun demikian,ada beberapa h a l yang m e n e n t u k a n nilai T^^ suatu m o l e k u l D N A .Nilai tergantung pada proporsi pasangan basa G - C karena ikatan G - Cmempunyai tiga ikatan hidrogen sehingga lebih stabil daripada A - T yang hanyamempunyai d u a Ikatan hidrogen. Semakin banyak ikatan G - C maka semakinbesar pula energi yang diperlukan untuk memisahkan untaian D N A . Keter-gantungan nilai T ^ terhadap komposisi basa bersifat linear, yaitu meningkat0,4°C u n t u k tiap persen peningkatan kandungan G - C . Dengan demikian D N Ayang mempunyai 4 0 % G - C mengalami denaturasi dengan nilai T ^ sekitar 87°Cdalam kondisi biasa, sedangkan D N A yang m e m p u n y a i 6 0 % G - C m e m p u n y a i nilaiT ^ sekitar 95°C dalam kondisi yang sama.Selain ditentukan oleh kandungan G - C , nilai T ^ juga dipengaruhi oleh kondisidenaturasi yaitu kekuatan ionik larutan. Nilai T ^ m e n i n g k a t 1 6,6°C u n t u k tiapsepuluh kali peningkatan konsentrasi kation monovalen. Jika D N A disuspensikandalam buffer natrium fosfat 0,12 M, sehingga konsentrasi monovalen Na* samadengan 0,18 M , maka nilai T^-nya sekitar 90°C. Senyawa tertentu yang m e -mengaruhi interaksi hidrofobik juga dapat memengaruhi nilai T^. Penambahanmetanol atau natrium trifluoroasetat k e dalam suspensi D N A m e n u r u n k a n nilaiT ^ karena kedua senyawa tersebut memengaruhi Interaksi hidrofobik yang me-nentukan stabilitas struktur D N A . Nilai T ^ pada awalnya meningkat denganmeningkatnya konsentrasi natrium trifluoroasetat,tetapi kemudian akan menurundengan semakin tingginya konsentrasi karena pengikatan airoleh trifluoroasetatdapat melemahkan interaksi hidrofobik. Sebaliknya, penambahan NaCI meningkat-kan nilai T ^ karena kekuatan ionik yang tinggi dapat menetralkan gugus fosfatbermuatan negatif d a n menstabllkan ikatan hidrogen. Pada konsentrasi NaCIyang tinggi, i o nyang bermuatan positif (Na*) m e m b e n t u k \"awan\" muatan disekitar gugus fosfat yang bermuatan negatif sehingga menutupi gugus fosfat ter-sebut. Dengan demikian, saling tolak antargugus fosfat dapat dicegah. Keadaansemacam ini terjadi pada konsentrasi garam sebesar 0,2 M yang mendekatikeadaan fisiologis.

Bab 5 Struktur DIMA 6 3 S e n y a w a l a i n y a n g j u g a d a p a t m e n u r u n k a n n i l a i T ^ ^ a d a l a h u r e a d a n formamide.Formamide d a p a t m e n u r u n k a n n i l a i s a m p a i s e k i t a r 4 0 ° C . U r e a d a n formamidedapat m e m b e n t u k ikatan hidrogen dengan basa-basa D N A . Senyawa Ini ber-kompetisi dengan basa-basa D N A untuk m e m b e n t u k pasangan. Dengan demikianuntaian D N A yang tidak berpasangan dapat dipertahankan dalam keadaansemacam ini pada suhu yang sebenarnya dapat menyebabkan untaian D N A yangl e p a s u n t u k b e r p a s a n g a n l a g i . O l e h k a r e n a I t u , p e m i s a h a n (melting) s u a t u u n t a i a nD N A dapat terjadi pada suhu yang lebih rendah. Kemampuan untuk menurunkannilal m e r u p a k a n sifat khas suatu senyawa yang dapat m e m b e n t u k ikatanhidrogen dengan nukleotida.A s p e k F i s i o l o g i s Denaturasi DNAProses denaturasi D N Asebenarnya juga terjadi dalam kondisi fisiologis danbahkan merupakan bagian dari proses fisiologis yang penting. D N A sebenarnyamerupakan struktur yang dinamis. Baglan-baglan tertentu struktur untai-gandanyam e m b u k a d a n m e n u t u p m e m b e n t u k s t r u k t u r gelembung untai-tunggal(single-stranded bubbles). F e n o m e n a s e m a c a m i n i d i s e b u t s e b a g a i b r e a t h i n g . D a l a maktivitas fisiologis jasad hidup, keadaan semacam ini sangat penting artinya karenaD N A dapat berlnteraksl dengan banyak protein, misalnya dalam proses replikasid a n t r a n s k r i p s i . F e n o m e n a breatiiing l e b i h b a n y a k t e r j a d i p a d a b a g i a n y a n gk a n d u n g a n A - T - n y a l e b i h t i n g g i . D e n g a n a d a n y a breatiiing m a k a p r o t e i n - p r o t e i nyang terlibat di dalam proses replikasi dan transkripsi dapat berlnteraksl denganmolekul DNA. B a n y a k p r o t e i n y a n g d a p a t m e n y e b a b k a n t e r j a d i n y a d e n a t u r a s i D N A invivo. P r o t e i n - p r o t e i n t e r s e b u t d i k e n a l s e b a g a i h e / / x destabilising protein a t a umelting protein. S a l a h s a t u c o n t o h p r o t e i n s e m a c a m i n i a d a l a h p r o t e i n y a n gd i k o d e o l e h g e n 32 p a d a b a k t e r i o f a g T 4 . P r o t e i n - 3 2 b e r i k a t a n e r a t d e n g a nu n t a i - t u n g g a l D N A p a d a w a k t u t e r j a d i breathing. K e b e r a d a a n i k a t a n t e r s e b u tmenyebabkan pasangan basa yang ada di dekatnya menjadi tidak stabil sehinggaikatan hidrogennya melemah sampai akhirnya pasangan basanya terlepas. Setelahpasangan basa Itu terlepas maka molekul protein-32 yang lain dapat melekatpada m o l e k u l D N A . Proses semacam ini terjadi secara t e r u s - m e n e r u s sampaiakhirnya D N Amengalami denaturasi total. Pada waktu terjadi replikasi D N A , bagian tertentu D N A m e m b u k a menjadiuntai-tunggal sehingga dapat berikatan dengan protein-protein yang terlibatd a l a m r e p l i k a s i , m i s a l n y a single-stranded binding protein, p r i m a s e , D N Apolimerase, dan lain-laln. Hal yang serupa juga terjadi pada waktu berlangsungproses transkripsi. Transkripsi tidak dapat terjadi kalau molekul D N A tidakm e m b u k a . O l e h k a r e n a i t u , p r o s e s d e n a t u r a s i D N A in vivo m e m p u n y a i a r t ifisiologis yang sangat penting sebab hal ini akan memengaruhi aktivitasselsecara keseluruhan. H a l ini akan dibicarakan lebih lanjut dalam bab mengenaireplikasi dan transkripsi.

6 4 Biologi IVIolekularRenaturasi DNAProses D e n a t u r a s i D N A a d a l a h s u a t u p r o s e s y a n g b e r s i f a t d a p a t b a l i k (reversible) d a l a mrenaturasi keadaan yang sesuai. Proses pembentukan kembali struktur untai-ganda dari k e a d a a n t e r d e n a t u r a s i d i s e b u t r e n a t u r a s i (rearinealmg). R e n a t u r a s i m e r u p a k a nPenghambat \ s u a t u p r o s e s y a n g d a p a t t e i - j a d i s e c a r a in vivo m a u p u n in vitro. R e n a t u r a s i inrenaturasi I vitro m e r u p a k a n s u a t u f e n o m e n a y a n g s a n g a t b e r g u n a u n t u k a n a l i s i s b i o l o g i molekular, misalnya untuk mengetahui kesamaan atau kedekatan genetis antara suatu organisme dengan organisme yang lain, u n t u k mendeteksi macam R N A tertentu, untuk mengetahui apakah suatu urutan nukleotida tertentu ada lebih dari satu pada suatu jasad, serta untuk mengetahui lokasi spesifik suatu urutan nukleotida pada g e n o m . Dalam bagian ini dibicarakan proses renaturasi secara in vitro. Renaturasi merupakan proses yang terjadi secara lambat dan berlangsung dalam dua tahap. Pertama, untai-tunggal D N A(sense) b e r t e m u dengan untai- t u n g g a l y a n g l a i n (antisense) s e c a r a a c a k . K e d u a , j i k a u r u t a n n u k l e o t i d a k e d u a untai-tunggal tersebut komplementer, maka akan terjadi ikatan hidrogen dan terbentuk struktur untai-ganda pada suatu bagian. Pembentukan ikatan hidrogen tersebut kemudian akan dilanjutkan pada bagian yang lain secara cepat sehingga terbentuk struktur untai-ganda yang lengkap. Tahapan yang menentukan kecepatan renaturasi bukan proses pembentukan untai-gandanya, melainkan proses tumbukan antara molekul untai-tunggal dengan molekul untai-tunggal yang lain. Dengan kata lain, renaturasi dipengaruhi oleh hambatan frikslonal. Proses ini berlangsung secara acak sehingga sangat ditentukan oleh konsentrasi molekul DNA. Jika suatu molekul untai-tunggal D N A mempunyai urutan nukleotida yang dapat berpasangan dengan ur-utan nukleotida pada bagian lain dari m o l e k u l yang s a m a , m a k a d a p a t t e r b e n t u k s t r u k t u r s e k u n d e r intra-strand y a n g b e r u p a lengkung j e p i t - r a m b u t (hair-pin loop). P e m b e n t u k a n s t r u k t u r s e k u n d e r s e m a c a m i n i (Gambar 5.5)dapat menghambat renaturasi karena akan memperkecil k e - m u n g k i n a n suatu m o l e k u l u n ' ' ' ..nggal u n t u k m e n e m u k a n untaian D N A pasangannya. Persyaratan u n t u k Proses Renaturasi Renaturasi dapat terjadi jika konsentrasi garam (NaCI) di dalam suspensi D N A cukup tinggi yaitu 0,15-0,5 M .I o nNa* yang bersifat positif akan menetralkan gugus fosfat D N Ayang bermuatan negatif sehingga tidak terjadi saling tolak (electrostatic repulsion) a n t a r a u n t a i a n D N A y a n g s a t u d e n g a n u n t a i a n D N A yang lain. Suhu renaturasi juga harus cukup tinggi n a m u n harus di bawah suhu denaturasi. Dengan suhu yang cukup tinggi maka struktur sekunder dapat di- hilangkan. Suhu renaturasi biasanya sekitar 20-25°C di bawah nilai T ^ . Faktor lain yang m e n e n t u k a n laju renaturasi adalah konsentrasi D N A . Semakin tinggi konsentrasinya maka probabilitas tumbukan antarmolekul untai-tunggal D N A menjadi semakin besar.

Bab 5 Struktur DNA 6 55'- -GATCCTAG- - CITIAIGIGI AITICI - I I I I I I II -CTAGGATC. -GATCCTAG.3' DENATURASI Struktur sekunder G A (hair-pin loop) T C C T A G Struktur sekunder (hair-pin loop)Gambar 5.5I Pembentukan struktur sekunder pada D N A . Struktur sekunderd a l a m b e n t u k loop d a p a t t e r b e n t u k j i k a p a d a s u a t u u n t a i a n t e r d a p a t u r u t a n b a s an u k l e o t i d a y a n g d a p a t m e m b e n t u k i k a t a n h i d r o g e n intra-strand s e p e r t i p a d a c o n t o hdi atas. Ketepatan (akurasi) suatu m o l e k u l untai-tunggal (sense) u n t u k m e n e m u k a nu n t a i a n D N A p a s a n g a n n y a (antisense) d i t e n t u k a n o l e h k e c e p a t a n p e r l a k u a nrenaturasi. Jika suatu molekul D N Adidenaturasi dengan perlakuan suhu tinggikemudian suhunya diturunkan secara cepat, maka probabilitas molekul D N As e n s e u n t u k b e r p a s a n g a n d e n g a n m o l e k u l antisense s e c a r a a k u r a t a k a n l e b i hkecll. Oleh karena Itu, proses renaturasi biasanya dilakukan dengan menurunkansuhunya secara bertahap. Pada waktu molekul D N A untai-ganda didenaturasi, molekul-molekul untai-tunggal yang terbentuk akan bercampur secara bebas. Dalam proses renaturasi,molekul-molekul untai-tunggal tersebut akan berpasangan dengan molekul untai-tunggal lalnnya secara acak. O l e h karena itu, suatu molekul untai-tunggal tidakselalu berpasangan lagi dengan m o l e k u l untai-tunggal pasangannya semula. H a l inidibuktikan dengan eksperimen menggunakan dua sampel D N A yang diisolasi darid u a k u l t u r b a k t e r i Esctierictiia coli y a n g s a l a h s a t u n y a d i t u m b u h k a n d a l a m m e -dium yang mengandung ^''NH^CI sedangkan kultur yang lain dalam m e d i u m yangmengandung ^^NH^CI. Kedua sampel D N A tersebut kemudian dicampur,

didenaturasi, dan direnaturasi.Setelah disentrifugasi dalam gradien CsCI diperolehtiga macam molekul D N A : 2 5 % terdiri atas molekul yang mengandung ^''N padakedua untaiannya, 5 0 % mengandung ^''N pada untaian yang satu d a n^^N padauntaian yang lain, d a n 2 5 % mengandung ^ ^ N pada kedua untaiannya. H a l Inimenunjukkan bahwa proses renaturasi berlangsung secara acak. Fenomena inikemudian digunakan sebagai dasar u n t u k pengembangan teknik analisis molekulary a n g d i k e n a l sebagai hibridisasi. T e k n i k s e m a c a m i n i d a p a t d i g u n a k a n u n t u km e n g e t a h u i a d a n y a k e s e r u p a a n (similarity) a n t a r a m o l e k u l D N A y a n g d i i s o l a s idari suatu jasad dengan D N Adari jasad lain. Hibridisasi juga dapat dilakukanantara molekul D N A dengan RNA. T e k n i k hibridisasi merupakan salah satu teknik analisis yang sangat pendngdalam biologi molekular karena dapat digunakan untuk membantu:1. identifikasi d a n isolasi suatu gen dari suatu jasad hidup.2. Analisis keserupaan dan/atau h o m o l o g i antara g e nsatu dengan g e n yang lain.3. Analisis kompleksitas g e n o m suatu jasad.Konsep renaturasi dapat dinyatakan sebagai suatu konsep kinetika reasosiasiantara molekul D N A yang satu dengan molekul D N A . Renaturasi D N A tergantungpada tumbukan acak antar-untaian D N A yang komplementer. Laju reaksi reasosiasidapat dinyatakan dalam persamaan: f--^ 0)C adalah konsentrasi D N A yang berada dalam keadaan untai-tunggal pada w a k t ut, sedangkan k adalah konstanta laju reasosiasi. Jika persamaan ( 1 )diintegralkand e n g a n l i m i t k o n s e n t r a s i a w a l D N A p a d a t = 0 (CQ) d a n k o n s e n t r a s i D N Asetelah waktu t ( Q ,maka akan diperoleh persamaan: 1 (2) C o ^ + l< CotPersamaan (2) tersebut menunjukkan bahwa parameter yang menentukan reaksir e a s o s i a s i a d a l a h CQ d a n w a k t u i n k u b a s i ( t ) , a t a u s e r i n g k a l i d i s e b u t s e b a g a i p a -rameter Cgt. Pada w a k t u reaksi reasosiasi berlangsung setengahnya, yaitu padaw a k t u ty^, m a k a p e r s a m a a n ( 2 ) m e n j a d i : -^ = 1= ' (3) Co 2 1+ Cot^asehingga: Co£i,2 =C g t i /J a d a l a h n i l a i y a n g m e n y a t a k a n r e a k s i r e a s o s i a s i D N A b e r l a n g s u n g s e t e n g a h -nya. O l e h karena Cot, m e r u p a k a n fungsi konsentrasi D N A dan w a k t u m a k a nilal

Bab 5 Struktur DNA 67Cgt yang lebih besar m e n u n j u k k a n reaksl yang lebih lambat. K i n e t i k a reasosiasiD N A d a p a t d i t u n j u k k a n d e n g a n m e m b u a t k u r v a C^t y a i t u d e n g a n m e m p l o t f r a k s lD N A y a n g t e l a h m e n g a l a m i reasosiasi ( 1 - C/C^) t e r h a d a p nilai l o g a r i t m a Cgt. Cara yang mudah untuk menunjukkan proses renaturasi suatu molekulD N A adalah dengan m e m b u a t kurva hubungan antara nilai absorbansi padapanjang gelombang 260 n m (A^jg) dengan v^aktu (t), seperti ditunjukkan padaGambar 5.6.f ,/2 f 1/2 W^l^'\"G a m b a r 5 . 6 I H u b u n g a n a n t a r a n i l a i A^^^g d e n g a n w a k t u p a d a p r o s e s r e n a t u r a s iD N A . Semakin rendah konsentrasi D N A - n y a maka semakin lama waktu yangdiperlukan untuk renaturasi. G a m b a r 5.6 m e n u n j u k k a n b a h w a renaturasi b e r a k h i r pada w a k t u nilai A^^gmencapai 1 (satu).Waktu yang diperlukan untuk renaturasi mencapai setengahnya(t-^ij) d a p a t d i k e t a h u i d e n g a n m e l i h a t n i l a i t e n g a h a n t a r a n i l a i A ^ ^ g m a k s i m u m(yaitu pada w a k t u D N A m e n g a l a m i denaturasi m a k s i m u m ) dengan nilai A^^gmencapai 1 (satu) (yaitu pada w a k t u proses renaturasi berakhir). Titik pada aksisAj^Q k e m u d i a n d i t a r i k k e k a n a n s e h i n g g a m e m b a g i k u r v a m e n j a d i d u a b a g i a n y a n gsama secara vervikal. Pada dtik potong dengan kurva tersebut kemudian ditarikgarls vertikal sehingga akan m e m o t o n g aksis waktu (t). O l e h k a r e n a nilai Cgt^^^ m e n y a t a k a n h u b u n g a n a n t a r a k o n s e n t r a s i D N Adan w a k t u , m a k a nilai Cgt yang lebih besar m e n u n j u k k a n reaksi yang lebih lambat.Nilai Cgt,y2 berbanding lurus dengan banyaknya D N A dalam g e n o m . Semakinkompleks suatu genom maka semakin sedikit jumlah turunan (kopi) suatu sekuens

68 Biologi Molekular D N A tertentu dalam massa D N A tertentu. Sebagai contoh, jika nilal D N A suatu bakteri yang b e r u k u r a n 0,004 pgadalah sebesar 1 2 pg, m a k a D N A t e r s e b u t mengandung 3.000 kopi masing-masing sekuens. Sebaliknya, di dalam D N A e u k a r y o t yang berukuran 3 pg, hanya ada 4 kopi masing-masing sekuens jika nilal CQ D N A - n y a s a m a . D e n g a n d e m i k i a n , p a d a k o n s e n t r a s i absolut y a n g s a m a , y a n g dinyatakan dalam m o l nukleotida per liter (Cg), konsentrasi masing-masing sekuens eukaryot adalah 3.000/4 = 750 kali lebih rendah dibanding dengan konsentrasi masing-masing sekuens pada bakteri. Laju reasosiasi D N A ditentukan oleh konsentrasi sekuens yang komplementer. Oleh karena itu,agar sekuens eukaryot m e m p u n y a i k o n s e n t r a s i relatif y a n g s a m a d e n g a n k o n s e n t r a s i s e k u e n s b a k t e r i , maka diperlukan 750x lebih banyak D N A , atau dengan menginkubasikan sejumlah D N A y a n g s a m a d a l a m w a k t u 7 5 0 x l e b i h l a m a . D e n g a n d e m i k i a n , nilai Cgt^^^ u n t u k r e a k s i r e a s o s i a s i D N A e u k a r y o t a d a l a h 7 5 0 x n i l a i C^tyj u n t u k r e a k s i reasosiasi pada bakteri. N i l a i C g t , ^2 m e m b e r i k a n g a m b a r a n m e n g e n a i panjang total sekuens-sekuens yang berbeda y a n g a d a p a d a m o l e k u l D N A , a t a u y a n g d i k e n a l d e n g a n i s t i l a h kompleksitas yang biasanya dinyatakan dalam pasangan basa. Renaturasi D N A s u a t u g e n o m m e n u n j u k k a n nilai Cgt^^^ y a n g p r o p o r s i o n a l d e n g a n k o m p l e k s i t a s n y a . Oleh karena itu kompleksitas suatu D N A dapat ditentukan dengan membanding- k a n n i l a l C^t-^ j^^-nyci d e n g a n D N A s t a n d a r y a n g s u d a h d i k e t a h u i k o m p l e k s i t a s n y a , m i s a l n y a g e n o m Escherictiia coli. O l e h k a r e n a g e n o m £. coli b e r u k u r a n 4 , 2 x 1 0 * pasangan basa, maka kompleksitas suatu g e n o m dapat diketahui dengan per- hltungan sebagai berikut: ^0^1/2 ( D N A g e n o m ) _ K o m p l e k s i t a s Coty2 ( D N A E. coli) \" 4 , 2 X 1 0 ^ b p Analisis CgtD N A pada banyak macam jasad hidup menunjukkan bahwa ada perbedaan yang nyata dalam hal organisasi urutan nukleotida antara prokaryot d a n e u k a r y o t . K u r v a C g t p a d a £. coli m e n u n j u k k a n p o l a k u r v a y a n g h a l u s d a n terdiri atas satu-langkah. H a l ini memberikan indikasi bahwa jarang terdapat u r u t a n n u k l e o t i d a y a n g b e r u l a n g p a d a D N A £ coli, a t a u d e n g a n k a t a l a i n m a s i n g - m a s i n g u r u t a n n u k l e o t i d a b e r s i f a t unik. H a l ini b e r b e d a d e n g a n k u r v a Cgt p a d a eukaryot yang memberikan gambaran pola kurva yang tidak halus dan terdiri atas beberapa langkah. Oleh karena itu, pada u m u m n y a pada i<omposisi D I \ AEmpat \ e u k a r y o t t e r d a p a t 4 ( e m p a t ) k e l o m p o k u r u t a n n u k l e o t i d a , y a i t u : ( 1 ) unik (unique,kelompok 'urutan j t e r d a p a t s a t u k o p i p e r g e n o m ) , ( 2 ) b e r u l a n g sedikit (slighdy repetitive, t e r d a p a tnukleotida i s a t u s a m p a i s e p u l u h k o p i ) , ( 3 ) b e r u l a n g c u k u p banyak (moderately repetitive, t e r d a p a t s e p u l u h sampai b e b e r a p a ratus k o p i ) , dan (4) berulang sangat banyak (iiighly repetitive, b e b e r a p a r a t u s s a m p a i b e b e r a p a j u t a k o p i p e r g e n o m ) . R a n g k a i a n n u k l e o t i d a b e r u l a n g (repetitive DNA sequences) b e r v a r i a s i ukurannya, dari dua basa saja sampai lebih dari seribu basa D N A . Sebagai c o n t o h , pada sejenis kepiting ada perulangan nukleotida A T , sedangkan pada sapi terdapat perulangan rangkaian nukleotida sepanjang 1.400 pasangan basa. Frekuensi per- ulangan sekuens semacam itu dapat mencapai beberapa juta kali, misalnya pada

Bab 5 Struktur DNA 6 9Struktur ' Drosophila virilis a d a s u a t u s e k u e n s 5 ' - A ( T C ) A A A ( T C ) T - 3 ' y a n g b e r u l a n g s e b a n y a ksekunder 1 0 ^ kail. Rangkaian n u k l e o t i d a b e r u l a n g t e r s e b u t m e m b e n t u k s u a t u D N A satelitr a n g k a i a n basa yang dapat dipisahkan dengan sentrifugasi menggunakan gradien caesium klorida (CsCI). Fraksl D N A satelit dapat mencapai 1- 3 0 % dari total D N A yang dimiliki oleh suatu jasad. Fungsi molekular D N A satelit tersebut tidak diketahui dengan j e l a s s e h i n g g a s e r i n g k a l i s e k u e n s s e m a c a m i t u d i s e b u t s e b a g a i selfish DNA (junk D N A ) . Pada manusia, fraksl D N A yang tidak diketahui peranannya tersebut bahkan lebih besar dari fraksi D N A yang sudah diketahui fungslnya. Diestimasikan b a h w a d a l a m g e n o m m a n u s i a , f r a k s i junk DNA d a p a t m e n c a p a i s e k i t a r 9 5 % d a r i total genomnya. Beberapa rangkaian basa berulang mempunyai urutan yang spesifik sehingga dapat m e m b e n t u k s t r u k t u r s e k u n d e r , misalnya rangkaian yang d i s e b u t rangkaian berulang-ballk (inverted repeats). R a n g k a i a n s e m a c a m i n i d a p a t m e m b e n t u k s t r u k t u r b a t a n g ( s t e m ) d a n lengkung (loop), s e p e r t i d a p a t d i l i h a t p a d a G a m b a r 5.7. Rangkaian berulang-balik semacam ini mempunyai fungsi yang penting, misalnya pada rangkaian basa pada gen yang mengkode pembentukan r R N A ( R N A ribosom) d a n t R N A (transfer RNA). P a d a w a k t u g e n y a n g m e n g k o d e r R N A d a n t R N A ditranskripsi, maka molekul R N A yang terbentuk akan membentuk struktur sekunder berupa batang dan lengkung karena ada rangkaian berulang-balik pada molekul RNA-nya. Struktur sekunder pada r R N A dan t R N A tersebut merupakan struktur yang sangat penting karena akan menentukan fungslnya sebagai k o m p o n e n dalam proses translasi (penerjemahan kode-kode genetik pada m R N A menjadi rangkaian asam-asam amino). G0 G^ AT A •T TA TA CG CG c G CG T A TA A T A •T G C G0 Batang dan lengkung Struktur hair-pin G a m b a r 5.7 I S t r u k t u r b a t a n g d a n l e n g k u n g y a n g d a p a t t e r j a d i p a d a D N A k a r e n a a d a n y a p a s a n g a n b a s a n u k l e o t i d a d a l a m s a t u u n t a i a n D N A y a n g s a m a (intra- strand pairing).Topologi DNA ^ S t r u k t u r m o l e k u l D N A di dalam sel berada dalam keadaan dinamis. Pada fase- f a s e t e r t e n t u , m o l e k u l D N A d a p a t b e r u p a m o l e k u l y a n g relaxed, y a i t u s u a t u keadaan pada saat D N A tidak mengalami torsi. Sebagai contoh, pada w a k t u

terjadi proses replikasi D N A , bagian tertentu molekul D N Aakan mengalamirelaksasi sehingga dapat diakses oleh seperangkat enzim yang digunakan dalamproses replikasi. Sebaliknya, pada fase atau bagian lain molekul D N A dapat beradad a l a m k e a d a a n terpilin ( s u p e r c o / 7 e d ) . K e a d a a n berpilin (supercoiling state) p a d amolekul D N A merupakan bagian sangat penting dalam proses pengemasan D N A ,baik pada prokaryot maupun eukaryot. Keadaan berpilin adalah suatu keadaan dimana molekul D N A , yang pada dasarnya sudah m e m b e n t u k struktur heliks,m e n g a l a m i p r o s e s \" p e m u t a r a n \" (twist) l e b i h l a n j u t . K e a d a a n s e m a c a m i n i m e m -buat D N A yang berpilin akan mengalami torsi. Keadaan berpilin dapat berupapilinan negatif (negative supercoiling) a t a u pilinan positif (positive supercoiling).Pilinan negatif t e r j a d i j i k a D N A d i p u t a r k e a r a h berkebalikan d a r i a r a h p e m u t a r a nh e l i k s n y a y a n g b e r u p a h e l i k s g a n d a p u t a r - k a n a n (rigiit-iianded double helix).D N A dengan keadaan pilinan negatif semacam inilah yang pada u m u m n y a banyakd i k e t e m u k a n dialam. Pada jasad e u k a r y o t , p e m b e n t u k a n nukleosom m e n y e b a b k a nterbentuknya pilinan negatif. Pada kelompok bakteri dan archaea, terdapat enzimy a n g d i s e b u t D N A girase, y a n g j u g a d i k e n a l s e b a g a i D N A topoisomerase II,yang dapat menyebabkan t e r b e n t u k n y a k o n f o r m a s i pilinan negatif. Topoisomeraseadalah enzim yang menyebabkan perubahan topologi D N A . Pilinan negatif dapatterbentuk jika D N A lingkar diputar sehingga sebagian molekul terletak di atasbagian lain D N A yang sama. Enzim D N A t o p o i s o m e r a s e II k e m u d i a n m e l a k u k a np e m o t o n g a n pada kedua untaian D N A yang terletak dl atas bagian lain m o l e k u lD N A yang sama. Bagian yang t e r p o t o n g t e r s e b u t k e m u d i a n disambung lagi padasisi yang lain dari bagian m o l e k u l D N A yang utuh. Aktivitas D N A girase diketahuid a p a t d i h a m b a t o l e h a n t i b i o t i k nalidixic acid d a n novobiocin. B e b e r a p a j a s a d p r o k a r y o t d i k e t a h u i m e m p u n y a i e n z i m r e v e r s e gyrase, y a i t usuatu enzim topoisomerase yang dapat menyebabkan terbentuknya pilinan positifpada molekul D N A . Jasad yang mempunyai enzim semacam inimisalnya jasadyang tahan hidup pada suhu sangat tinggi (termofil). Sebagai contoh, jasad hiperter-m o f l l Methanothermus fervidus m e m p u n y a i s t r u k t u r m e n y e r u p a i n u k l e o s o mseperti pada eukaryot dan D N A - n y a dalam keadaan berpilin positif. Selain enzim yang dapat menyebabkan terbentuknya struktur pilinan, dikenalj u g a e n z i m y a n g menghilangkan s t r u k t u r p i l i n a n p a d a D N A y a i t u e n z i m D N At o p o i s o m e r a s e I. P e n g h i l a n g a n s t r u k t u r p i l i n a n d a p a t t e r j a d i d e n g a n a d a n y apemotongan pada salah satu untaian D N A yang kemudian diikud dengan pindahnyasalah satu untaian D N A melev/ati untaian yang lain. Hal semacam ini menyebabkanperubahan struktur pilinan, baik pilinan negatif maupun positif, menjadi struktury a n g relax. E n z i m y a n g m e m p u n y a i a k t i v i t a s s e m a c a m i n i t e r d a p a t p a d a p r o k a r y o tm a u p u n eukaryot. M o l e k u l D N A utama ( \" k r o m o s o m \" ) pada sel bakteri dikemasdalam struktur pilinan sehingga menjadi lebih kompak. Dalam struktur k r o m o s o mbakteri semacam itu u m u m n y a terdapat banyak domain pilinan. Jika salah satudomain mengalami relaksasi, maka d o m a i n yang lain tidak terpengaruh. Padaj a s a d h i d u p , p e r u b a h a n d a r i s t r u k t u r b e r p i l i n m e n j a d i relax, a t a u s e b a l i k n y a ,merupakan dinamika sangat penting yang menentukan perilaku D N A di dalamsel. Pada sebagian besar prokaryot, aras aktual pembentukan struktur pilinan

Bab 5 Struktur D N A 71\ Parameter \ negatif merupakan hasil keseimbangan antara aktivitas D N Agirase d a n D N A\ kuantltatif I t o p o i s o m e r a s e I. Selain i t u juga d i k e t a h u i b a h w a s t r u k t u r pilinan m e m e n g a r u h itopologi DNA ekspresi genetik. Beberapa gen diekspresikan secara lebih aktif jika D N A dalam keadaan berpilin, sebaliknya transkripsi gen-gen lain dihambat oleh derajat pilinan yang terlalu besar. Topologi D N A dapat dinyatakan secara kuantltatif yaitu dengan parameter ( 1 ) banyaknya putaran molekul D N A untai-ganda (T, t w i s t i n g n u m b e r ) , (2) banyaknya putaran aksis heliks untai-ganda dalam ruang (W, w r i t h e ) , d a n (3) banyaknya saling-silang kedua untai-ganda suatu molekul D N A tertutup (L, linking n u m b e r ) . U n t u k s u a t u m o l e k u l D N A y a n g d i k e t a h u i u k u r a n n y a , n i l a i T dapat dinyatakan sebagai jumlah total pasangan basa dibagi banyaknya pasangan basa untuk setiap putaran. Nilai W suatu molekul D N A lingkar yang mempunyai takik (n/ck) sama dengan 0 (nol). Jika suatu m o l e k u l lingkar terletak m e n d a t a r p a d a s u a t u p e r m u k a a n , m a k a n i l a i L d a p a t d i n y a t a k a n s e b a g a i b a n y a k n y a revolusi satu untaian terhadap untaian yang lain. Nilai L adalah positif jika revolusinya dengan arah putar-kanan, d a n berharga negatif jika arah putarannya k e kiri. Hubungan antara ketiga parameter tersebut dapat dinyatakan dengan persamaan sebagai berikut: L = W + T dan A L = A W + A T Lambang A menyatakan perubahan dalam nilai parameter tersebut. Persamaan kedua sangat penting sebab secara eksperimental, pengukuran dilakukan terhadap perubahan nilai L (AL). Persamaan tersebut m e n u n j u k k a n bahwa penurunan nilai L m e n u n j u k k a n beberapa kombinasi pilinan negatif, sedangkan kenaikan nilai L menunjukkan penurunan pilinan negatif. U n t u k molekul lingkar yang mempunyai t a k i k , nilai T = L. S a t u h a l p e n t i n g y a n g p e r l u d i p e r h a t i k a n a d a l a h b a h w a nilai L tidak dapat diubah tanpa memutuskan suatu untaian, merotasikan untaian yang satu terhadap yang lain, dan m e n y a m b u n g k a n n y a lagi.Kandungan DNA dan Kapasitas Genetik Seperti telah diungkapkan sebelumnya, ukuran dan kandungan molekulD N A yang dimiliki oleh suatu jasad sangat bervariasi (lihat Tabel 5.3) sesuai dengan kompleksitas jasadnya. Secara logika sederhana semestinya ada suatu korelasi positif antara kandungan D N A dengan kompleksitas jasad, yaitu bahwa semakin kompleks suatu jasad maka semakin besar pula kandungan D N A - n y a p e r sel haploid (dikenal sebagai C value). Sebagai contoh, kandungan D N A pada khamir Sacctiaromyces cerevisiae l i m a k a l i l e b i h b e s a r d i b a n d i n g k a n d e n g a n k a n d u n g a n D N A b a k t e r i Esciiericiiia coli k a r e n a s e c a r a s t r u k t u r a l b a k t e r i i n i l e b i h s e d e r h a n a . Meskipun demikian studi menunjukkan bahwa banyaknya kandungan D N A suatu jasad tidak selalu berkorelasi positif dengan kompleksitas jasad tersebut. Sebagai contoh, kandungan D N Apada setiap sel katak adalah 7 kali lebih banyak d i - bandingkan dengan kandungan D N A pada sel manusia, sedangkan kandungan

72 Biologi IVIolekular D N A pada sel bunga HI1100 kali lebih banyak dibanding pada sel manusia. F e n o m e n a s e m a c a m I n i d i s e b u t s e b a g a i C value paradox. P a r a d o k s s e m a c a m I n i t i d a k h a n y a antarkelompok jasad yang berbeda, tetapi juga diketahui terjadi pada kelompok jasad yang sama. Sebagai contoh, beberapa spesies amfibi mempunyai kandungan D N A 1 0 0 kali lebih banyak dibandingkan dengan spesies amfibi yang lain. Jasad yang m e m p u n y a i nilai-C yang lebih besar tidak selalu berarti m e m p u n y a i l e b i h b a n y a k g e n d i b a n d i n g d e n g a n j a s a d y a n g n i l a i - C - n y a k e c i l . C value paradox dapat terjadi karena beberapa k e l o m p o k jasad mempunyai banyak urutan basa D N A y a n g t i d a k m e n g k o d e a s a m a m i n o {non-codmg DNA). U r u t a n b a s a D N A s e m a c a m i n i b a n y a k t e r d a p a t p a d a b a g i a n intron d a n u r u t a n b e r u l a n g (repetitive DNA).Enzim yang Dapat Mendepolimerisasi D N ATipe-tipe Molekul D N A dapat didepollmerlsasi menjadi komponen dasar penyusunnyanuldease (yaitu n u k l e o t i d a ) d e n g a n m e n g g u n a k a n e n z i m nuklease. E n z i m n u k l e a s e t e r d i r iTipe-tipe atas beberapa tipe yang secara u m u m dibedakan menjadi ( 1 )DNase (mendepoli-enzim merisasi D N A ) d a n(2) RNase (mendepolimerisasi R N A ) . D N a s e ada yang hanyaendonulflease memotong molekul D N A untai-tunggal dan ada yang hanya m e m o t o n g D N Aretrii<si untai-ganda. D N a s e dapat dibedakan lagi m e n j a d i 2 m a c a m , yaitu: ( 1 ) ekso- nuklease, y a i t u D N a s e yang m e m o t o n g D N A dari u j u n g m o l e k u l 5 ' a t a u dari ujung 3', dan ( 2 ) endonuklease, yaitu D N a s e yang m e m o t o n g D N A dari bagian dalam untaian D N A .Beberapa contoh nuklease disajikan pada Tabel 5.4. S I e n d o n u k l e a s e y a n g d i i s o l a s i d a r i j a m u r Aspergillus oryzae m e m p u n y a i kekhususan karena hanya m e m o t o n g polinukleotida untai-tunggal atau bagian untai-tunggal suatu molekul D N A . Enzim iniberbeda dari enzim nuklease untai- tunggal yang lain karena dapat m e m o t o n g untai-tunggal yang hanya terdiri atas satu atau dua basa nukleotida. Dalam bagian sebelumnya telah dijelaskan bahwa D N A b e r p i l i n (supercoiled DNA) s e r i n g k a l i m e n g a n d u n g b a g i a n y a n g b e r u p a u n t a i - t u n g g a l k a r e n a a d a n y a f e n o m e n a breathing. D N A b e r p i l i n d a p a t d i p o t o n g dengan S I nuklease karena adanya bagian beruntai-tunggal semacam ini. Enzim ini dapat digunakan u n t u k m e m b e d a k a n antara D N A berpilin dengan yang tidak berpilin maupun D N A yang mempunyai takik karena D N A t a k berpilindan D N A bertakik bersifat resisten terhadap enzim ini. Selain beberapa contoh enzim nuklease seperti pada Tabel 5.4, ada sekelompok enzim endonuklease yang bersifat khusus yaitu yang disebut dengan e n d o n u k l e a s e restrlksi (restriction endonuclease). E n z i m i n i m e m p u n y a i k e k h u s u s - an karena hanya m e m o t o n g D N Auntai-ganda yang mempunyai urutan nukleotida t e r t e n t u . Enzim endonuklease restrlksi dibedakan menjadi tiga tipe, yaitu tipe I, t i p e II, d a n t i p e III. Enzim endonuklease restrlksi tipe I m e r u p a k a n e n z i m nuklease y a n g k o m p l e k s , m i s a l n y a e n z i m y a n g a d a p a d a £. coli B ( d i s e b u t e n z i m £coB), d a n £. coli K 1 2 ( d i s e b u t £ c o K ) . E n z i m i n i m e m p u n y a i a k t i v i t a s e n d o n u k l e a s e sekaligus metilase dan m e m e r l u k a n A T P , Mg^\"^, d a nS-adenosil m e t i o n i n sebagai kofaktor. Aktivitas restrlksi dan modifikasi (metilasi) terletak pada subunit yang

Bab 5 Struktur DNA 73 Tabel 5.4 I Beberapa m a c a m nuklease d a n aktlvltasnya.Macam nuklease Substrat Sifat dan Hasil pemotongan sisi pemotongan 5'-P mononukleotidaSI nuklease Bagian untai-tunggal molekul D N A Endonuklease, memotongEksonuklease I pada bagian untai-tunggald a r i E . coli Untai-tunggal D N A Eksonuklease pada 5'-P mononukleotida ujung 5'-OH plus ujung dinukleotidaEksonuklease III Untai-ganda D N A Eksonuklease, memotong 5'-P mononukleotidad a r i E. coli d e n g a n a r a h 3 ' - O H -» 5 ' - P Untai-tunggal D N AEksonuklease V I I Eksonuklease, memotong 5'-P mononukleotidad a r i E . coli Untai-ganda dan d e n g a n a r a h 3 ' - O H —» 5 ' - P untai-tunggal D N ANuklease B A L 31 serta R N A a. Eksonuklease, m e m o t o n g D N A berujung tumpul dari ujung 5'-P dan3 ' - O H b. Endonuklease terhadap untai-tunggal D N ANuklease mung Untai-tunggal D N A dan Endonuklease 5'-P nukleotidabean ( k a c a n g h i j a u ) RNA, pada konsentrasi tinggi juga memotong untai-ganda dari kedua ujungDNase 1 pankreas D N A dan R N A Endonuklease Oligonukleotida RNARibonuklease H Endoribonuklease, Nukleotida dengan(RNase H ) memotong ikatan ujung 5'-P d a n3 ' - O H hidrogen dalam hibrid RNA-DNA berbeda. Selain itu, enzim endonuklease restrlksi tipe I juga mempunyai aktivitas A T P a s e . E n z i m i n i m e n g e n a l i u r u t a n n u k l e o t i d a t e r t e n t u (recognition site) y a n g b e r u p a u r u t a n pasangan basa sebagai b e r i k u t : £coK mengenali u r u t a n 5 ' - A A C N N N N N N G T G C - 3 ' , s e d a n g k a n £coB m e n g e n a l i u r u t a n 5 ' - T G A N N N N N N N N T G C T - 3 ' . N menyatakan basa nukleotida apasaja (tidak spesifik). Meskipun enzim inisecara spesifik mengenali daerah tertentu, tetapi enzim ini m e m o t o n g D N A pada daerah yang berlainan dengan daerah pengenalan- nya tersebut sehingga pemotongannya tidak spesifik. Dalam aplikasinya untuk rekayasa genetik, enzim endonuklease tipe I tersebut tidak banyak dipergunakan. Endonuklease tipe II m e m p u n y a i p e r b e d a a n m e n d a s a r d e n g a n t i p e I k a r e n a e n z i m t i p e II m e m p u n y a i spesifisitas. D a e r a h y a n g dikenali m a u p u n d a e r a h y a n g dipotong enzim tersebut bersifat spesifisitas dan terletak pada bagian yang sama. Enzim ini sangat stabil d a n hanya m e m e r l u k a n Mg^* sebagai kofaktor. Enzim e n d o n u k l e a s e restrlksi tipe II dapat dibedakan atas u r u t a n n u k l e o t i d a yang dikenali yaitu dapat berupa urutan empat, lima, atau enam basa yang spesifik. Sampai saat ini t e l a h r a t u s a n m a c a m e n z i m t i p e II y a n g berhasll diisolasi dari b e r m a c a m - m a c a m b a k t e r i . C o n t o h n y a , e n z i m £coRI y a n g d i i s o l a s i d a r i b a k t e r i Esciierictiia coli R Y 1 3 m e m p u n y a i d a e r a h p e n g e n a l a n d a n p e m o t o n g a n D N A b e r u p a u r u t a n

7 4 Biologi Molekular5'-GAATTC-3'. Jika basa nukleotida k o m p l e m e n urutan tersebut dibaca dariujung 5' maka juga akan m e m b e r i k a n urutan yang sama sebagai berikut: 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'U r u t a n basa n u k l e o t i d a s e m a c a m ini disebut u r u t a n palindrom. E n z i m EcoRIsecara spesifik m e m o t o n g ikatan antara G dan A sehingga hasil pemotongannyamenghasilkan molekul D N A dengan ujung yang tidak sama panjang dan seringd i s e b u t s e b a g a i ujung l<ohesif a t a u ujung lekat (cohesive end a t a u sticky end)sebagai berikut: 5'-G A A T T C - 3 ' 3'-CTTAA G-5'K e d u a ujung hasil p e m o t o n g a n t e r s e b u t akan dengan m u d a h d i s a m b u n g lagid e n g a n m e n g g u n a k a n e n z i m D N A ligase, o l e h k a r e n a i t u u j u n g - u j u n g n y a s e r i n gdisebut u j u n g kohesif. E n z i m e n d o n u k l e a s e r e s t r l k s i t i p e II yang lain m e n g e n a l idan m e m o t o n g daerah yang berbeda sehingga ujung-ujung yang dihasilkan jugab e r b e d a , m i s a l n y a e n z i m Alu\. E n z i m i n i m e n g e n a l i u r u t a n 5 ' - A G C T - 3 ' d a n m e -m o t o n g D N A t e r s e b u t m e n j a d i m o l e k u l d e n g a n u j u n g t u m p u l (blunt end) k a r e n am e m o t o n g ikatan a n t a r a G dan C . E n z i m e n d o n u k l e a s e restrlksi t i p e II m e r u p a k a nk e l o m p o k enzim yang paling banyak digunakan dalam teknologi D N A rekombinan(rekayasa genetik) untuk m e m o t o n g D N A secara spesifik. Endonuklease restrlksi tipe III j u g a m e m o t o n g D N A p a d a bagian y a n g s p e s l f i ktetapi pada daerah yang berdekatan dengan daerah pengenalannya. Enzim ini jugam e m e r l u k a n A T P dan Mg^'^ u n t u k aktlvltasnya, tetapi tidak m e m p u n y a i aktivitasATPase serta tidak memerlukan S-adenosil metionin seperti enzim endonukleaserestrlksi tipe I. Salah satu c o n t o h e n z i m e n d o n u k l e a s e restrlksi tipe III adalahenzim Hgol yang mengenali urutan basa nukleotida 5'-GACGC-3', tetapi m e -m o t o n g D N A pada urutan basa kelima atau kesepuluh dari urutan yang dikenalitersebut. Enzim tipe ini sangat jarang digunakan dalam teknologi D N A rekombinan. Soal-soal1. Jelaskan pendekatan eksperimental yang dilakukan oleh Frederick Griffith untuk menjelaskan fenomena t r a n s f o r m a s i p a d a Streptococcus pneumoniae.1 Jelaskan bagaimanaAvery dan kawan-kawan, sarta Hershey dan Chase, membuktikan bahwa penyebab t r a n s f o r m a s i S . pneumoniae a d a l a h m o l e k u l D N A .3. G a m b a r k a n s t r u k t u r m o l e k u l D N A u n t a i - g a n d a . T u n j u k k a n p o s i s i i k a t a n f o s f o d i e s t e r d a n i k a t a n / j e m b a t a n hidrogen.4. Jelaskan f a k t o r - f a k t o r yang m e n e n t u k a n s t r u k t u r m o l e k u l D N A .5. A p a yang d i m a k s u d d e n g a n renaturasi dan denaturasi?6. A p a yang d i m a k s u d d e n g a n e f e k h i p o k r o m i k d a n h i p e r k r o m i k ?7. P a r a m e t e r apa saja y a n g m e n e n t u k a n t o p o l o g i s u a t u D N A ?