Bab 7. Enzim - Mekanisme Kerja

Enzimrffik*fiii 'Peter J. Kennelly, PhD & Viclor W. Rodwell, PhDPERAN BIOMEDIS asam D-amino. Karena berikatan dengan substrat melaluiEnzim adalah polimer biologis yang mengatalisis reaksi sedikitnya \"tiga titik perlekatan\", enzim bahkan dapatkimia yang memungkinkan berlangsungnya kehidupanseperti yang kita kenal. Keberadaan dan pemeliharaan mengubah sub xrat nonc h iral menjadi prod tk ch iral. Gambarrangkaian enzim yang lengkap dan seimbang merupakanhal yang esensial untuk menguraikan nutrien menjadi 7-1 melukiskan mengapa redulai substrat piruvat nonchiralenergi dan chemical building block (bahan dasar kimiawi); yang dikatalisis oleh enzim menghasilkan L-laktat dan bukanmenyusun bahan-bahan dasar tersebut menjadi protein. campuran rasemik Dlaktat dan L-laktat. Spesifisitas enzimDNA, membran, sel, dan jaringan; serra memanfaatkan yang sangat tinggi memberi sel hidup kemampuan untukenergi untuk melakukan motilitas sel, fungsi saraf, dan secara bersamaan melaksanakan dan secara independenkontraksi otot. Dengan pengecualian molekul RNA katalitik mengontrol beragam proses kimiawi.atau ribozim, enzim adalah protein. Kekurangan jumlah atauaktivitas katalidk enzim-enzim kunci dapat terjadi akibat ENZIM DIKLASIFIKASIKANkelainan genetik, kekurangan gizi, atau toksin. Defek enzim BERDASARKAN TIPE REAKSIdapat disebabkan oleh mutasi genetik atau infeksi olehvirus atau bakteri patogen (misalnya Vibrio cholerae). Para Nama-nama yang paling sering digunakan untuk kebanyakanilmuwan kedokteran mengatasi ketidakseimbangan aktivitasenzim dengan menggunakan bahan farmakologis untuk enzim menjelaskan tipe reaksi yang dikatalisis, diikuti olehmenghambat enzim-enzim tertentu dan sedang meneliti akhiran -ase. Contohnya, dehidrogenase mengeluarkanterapi gen sebagai cara untuk mengobati defisiensi jumlah atom-atom hidrogen, protease menghidrolisis protein, dan isomerasr mengatalisis tata-ulang dalam konfigurasi.atau Fungsi enzim. Pemodifikasi dapat teletak di depan atau di belakang nama enzim untuk menjelaskan substrat enzim (xantin olaidase),ENZIM ADATAH KATATIS sumber enzim (ribonuklease panhreas), pengaturannyaYANG EFEKTIF & SANGAT SPESIFIK (lipase peka-hormon), atau suatu gambaran dari mekanisme kerjanya (protease sistein). Jika diperlukan, ditambahkanEnzim yang mengatalisis perubahan satu atau lebih senyawa penanda alfanumerik untuk menunjukkan berbagai bentuk(substrat) menjadi satu atau lebih senyawa lain (produk)meningkatkan laju reaksi setidaknya 106 kali dibandingkan suatu enzim (misalnya RNA polimerase III; protein kinasejika tidak dikatalisis. Seperti semua katalis lain, enzim cp).tidak berubah secara permanen atau dikonsumsi sebagai Untuk menghilangkan ambiguitas, International Unionkonsekuensi dari keikutsertaannya dalam reaksi yang of Biochemists (IUB) menciptakan suatu sistem terpadubersangkutan. tatanama enzim yaitu setiap enzim memiliki nama dan Selain sangat efisien, enzim juga merupakan katalis kode khusus yang menunjukkan tipe reaksi yang dikatalisisyang sangat selektifl Tidak seperti kebanyakan katalis yang dan .substrat yang terlibat. Enzim dikelompokkan ke dalamdigunakan dalam bidang kimia sintetik, enzim bersifat enam kelas:spesifik baik bagi tipe reaksi yang dikatalisis maupun substratatau substrat-substrat yang berhubungan erat. Enzim juga 1. Oksidoreduktase (mengatalisis oksidasi dan re-merupakan katalis stereospesifik dan biasanya mengatalisisreaksi dari hanya satu stereoisomer suatu senyawa, misalnya, duksi)D-gula, tetapi bukan L-gula, asam L-amino, tetapi bukan 2. Transferase (mengatalisis pemindahan gugus seperti gugus glikosil, metil, atau fosforil) 3. Hidrolase (mengatalisis pemutusan hidrolitilz C-C, C-O, C-N, dan ikatan lain) 4. Liase, mengatalisis pemutusan C-C, C-O, C-N, dan ikatan lain dengan eliminasi atom yang menghasilkan ikatan rangkap 53

/54 BAGIAN l: STRUKTUR & FUNGSI PROTEIN & ENZIMv g(/-\ kovalen atau,nonkovalen. Contoh-contohnya antara lain V adalah piridoksal fosfat, flavin mononukleotida (FMN)' ) flavin adenin dinukleotida (FAD), tiamin pirofosfat,,: biotin, dan ion logam Co, Cu, Mg, Mn, dan Zn. LogamBagian enzim Substral adalah gugus prostetik yang paling sering di.fumpai. Sekitar sepertiga dari semua enzim mengandung ion-ion logam yangGambar 7-1. Representasi planar dari \"perlekatan tiga-titik\" suatu terikat erat dan disebut metaloenzim. Ion-ion logam yangsubstrat ke bagian (tempat) aktif sebuah enzim. Meskipun atom 1 ikut serta dalam reaksi redoks umumnya berikatan dengandan 4 identik, namun jika atom 2 dan 3 telah melekat ke bagian gugus prostetik, misalnya heme (Bab 6) atau kelompok besi-komplementernya di enzim, hanya atom -l yang dapat terikat. Karena sulfur (Bab 12).Logamjuga mempermudah pengikatan danitu, jika telah berikatan dengan enzim, atom-atom yang tampak orientasi substrat, pembentukan ikatan kovalen dengan zat- zat antara reaksi (Co2- pada koenzim B,r), atau berinteraksiserupa dapat dibedakan, dan hal ini memungkinkan perubahan dengan substrat untuk menyebabkannya lebih elektrofilik (kekurangan elektron) atau nukleofilik (kaya elektron).kimiawi stereospesifik. Kofoktor Berikqlon Secoro Reversibel 5. Isomerase (mengatalisis perubahan geometrik atau dengon Enzim ofou Substrot struktural di dalam satu molekul) Kofaktor memiliki fungsi serupa dengan gugus Prostetik tetapi berikatan secara transien dan mudah terlepas dengan 6. Ligase (mengatalisis penyatuan dua molekul yang enzim atau subsuat, misalnya ATP. Tidak seperti gugus prostetik yang terikat secaia stabil, kofaktor harus terdapat dikaitkan dengan hidrolisis AIP). dalam medium di sekitar enzim agar katalisis dapat terjadi. Kofaktor yang paling umum adalah ion logam. EnzimMeskipun sistem IUB ini jelas, namun nama-nama yang memerlukan kofaktor ion logam disebut enzim yang diaktifkan oleh logam (meul-actiaated enzjrmes) :untukenzim menjadi panjang dan relatif tidak praktis sehingga membedakannya dafi metaloenzim dengan ion logamkita biasanya tetap menamai enzim berdasarkan namatradisionalnya meskipun kadang-kadang nama itu berfungsi sebagai gugus prostetik.'menyesatkan. Nama IUB untuk heksokinase melukiskankejelasan sekaligus kompleksitas sistem IUB. Nama IUB Koenzim Berfungsi Sebogoi Pengongkut Substrqtuntuk heksokinase adalah AIP:D-heksosa 6-fosfotransferase Koenzim berfungsi sebagai pengangkut-atau bahan pe-E.C.2.7.1.1. Nama ini menunjukkan heksokinase sebagai mindah gugus-yang dapat didaur-ulang dan memindah-anggota dari kelas 2 (transferase), subkelas 7 (pemindahan kan banyak substrat dari tempat pembentukannya ke tempatsatu gugus fosforil), sub-subkelas I (alkohol adalah alaeptor pemakaiannya. Ikatan dengan koenzim juga menstabilkan substrat, seperti atom hidrogen atau ion hidrida yang ddakfosforil), dan \"heksosa-6\" menunjukkan bahwa alkohol yang stabil dalam lingkungan cair sel. Gugus kimia lain yang di-terfosforilasi berada di karbon enam heksosa. Namun, kita angkut oleh koenzim antara lain adalah gugus metil (folat), gugus asil (koenzim A), dan oligosakarida (dolikol).terus menyebutnya sebagai heksokinase. Bonyok Koenzim, Kofoktor, & GugusGUGUS PROSTETIK, KOFAKTOR. Prcstetik odqlqh Turunon Vitomin B& KOENZIM BERPERAN PENTING Vitamin B larut-air merupakan komponen penting berbagai koenzim. Selain vitamin B, beberapa koenzim mengandungDATAM KATATISIS gugus adenin, ribosa, dan fosforil AMP atau ADP (Gbr'Banyak enzim mengandung berbagai molekul nonprotein 7-2). Nikotinamid adalah komponen koenzim redoks NAD dan NADB sementara riboflavin adalah komponenkecil dan ion logam yang ikut serta secara langsung koenzim redoks FMN dan FAD. Asam pantotenat adalah komponen dari koenzim A pengangkut gugus asil. Sebagaidalam katalisis atau pengikatan substrat. Molekul/ion ini, pirofosfatnya, tiamin ikut serta dalam dekarboksilasi asamyang disebut gugus prostetik, kofaktor, dan koenzim,memperluas ragam kemampuan katalisis melebihi yangdimungkinkan oleh gugus fungsional (yang jumlahnyaterbatas) di rantai samping aminoasil peptida.Gugus Prostetik Terintegrosi Erot ke dolomStruktur EnzimGugus prostetik dibedakan berdasarkan integrasinya yangkuat dan stabil ke dalam struktur protein melalui Saya-gaya

/BAB Z; ENZIM:MEKANISME KEUA 55 tl---cH- | ENZIM MENGGUNAKAN BANYAK k\"j MEKANISME UNTUK MEMPERMUDAH HHH KATALISIS j#iO:P*O* HO OH Enzim menggunakan berbagai kombinasi dari empat o:l-o-?*, mekanisme umum unruk mempercepar laju reaksi kimia. o- l..l I Kotqlisis kqrenq Kedekoton Hr_\"H) Agar dapat bereaksi, molekul-molekul harus berada dalam jarakyang cukup dekat untuk membentuk ikatan saru sama HO 'ffi. lain. Semakin tinggi konsentrasinya, akan semakin sering Gambar 7-2. Struktur NAD. dan NADP*. UntukNAD.,R=H. molekul-molekul itu bertemu saru sama lain dan semakin besar laju reaksinya. Ketika mengikat molekul substrat di UntukNADP-,R=PO,,. bagian aktifnya, enzim rnenciptakan suaru regio dengan konsentrasi substrat lokal yang tinggi. Lingkungan ini jugao-keto dan koenzim asam folat dan kobamid berfungsi secara spasial mengatur arah molekui-molekul substrat sehingga diperoleh posisi ideal untuk berinteraksi. Haldalam metabolisme satu-karbon. tersebut menyebabkan laju reaksi meningkat sedikitnyaKATATISIS TERJADI DI BAGIAN AKTIF seribu kali lipat.Spesifisitas substrat yang ekstrem dan efisiensi katalitik Kotolisis Asom-Bosqenzimyang tinggi mencerminkan adanya lingkungan yangdirancang sedemikian cermar hanya untuk satu reaksi Gugus-gugus fungsional yang dapat terionisasi pada rantaitertentu. Lingkungan ini yang disebut bagian/tempat aktif samping aminoasil dan (jika ada) pada gugus prosrerik berperan dalam katalisis dengan berfungsi sebagai asam atau(actiue s//), umumnya berbentuk celah atau kantung. basa. Katalisis asam-basa dapat bersifat spesifik arau umum. \"Spesifik' dalam hal ini diartikan hanya proton (HrO-) atauBagian aktif pada enzim multimerik sering terletak pada ion OH-. Pada katalisis asarn spesifik atau basa spesifik\"pertemuan anura subunit-subunit dan merekrut residu-residu dari lebih satu monomer. Bagian aktif tiga-dimensi laju reaksi peka terhadap perubahan dalam konsentrasiini melindungi substrat dari pelarut dan mempermudah proton, tetapi tidak bergantung pada konsentrasi asam lainkatalisis. Substrat mengikat bagian aktifdi regio yang bersifat Arg 145komplementer dengan bagian substra t yang ti d/1 k mengalamiperubahan kimiawi sewakru reaksi berlangsung. Pengikaran oH./\"I\ *'*ini secara simultan menyatukan bagian-bagian substrat yangahan mengalami perubahan dengan gugus-gugus fungsional NH-:./4.*-NH'residu peptidil aminoasil. Bagian aktif juga mengikat danmengarahkan kofaktor atau gugus prosrerik. Banyak residu iamino asil yang diperoleh dari berbagai bagian rantai l- ll oepolipeptida (Gambar 7-3) lkut serra menentul<an karakter 4His 1t9l'l[/-6l\N^l\i'H'.I\"r'.)..H'.-\.'..-z,92\"int-rC''-\"o,/.r.-v'G|N=I \-oCH'H\"I'.''.H-)p/;-tiga dimensi dan ukuran yang besar pada bagian aktif. \: Tyr248 o\ctClulr.7'\o\2: ...,. His \6v9rq [/ I H Gambar 7-3. Cambaran dua-dimensi sebuah substrat dipeptida, glisil{irosin yang terikat'di dalam bagian aktif karboksipeptidase A.

/56 BAGIAN l: STRUKTUR & FUNGSI PROTEIN & ENZIM Ala /c{o /cH NH. olt KG CH.NH. / CHO Glu E-cHoE*cHo..LE \\ +E f rE-Cl-l,NH- '+E ,, Pyr KG GluGambar 7-4.Mekanisme \"ping-pong\" untuk transaminasi. E-CHO dan E-CHTNH' masing-masinS Tewakll] kompleksenzim-piridoksal fosfat dan \"nii.-piridoksamin. (Ala, alanin; Pyr, piruvat; KC, cx,-ketoglutarat; Clu, Slutamat )(donor proton) atau basa (akseptor proton) yang terdapat dengan perubahan-Perubahan dinamik yang menyertaidi dalam larutan atau di bagian aktif. Reaksi yang lajunyaresponsifterh adap semua asam atau basa yang ada dikatakan k\"t\"'iirir. Kekurangan ini diatasi oleh Daniel Koshlanddapat mengalami katalisis basa umum atau asam umum' yang mengajukan model induced rtt' y^ng menyatakanKqtqlisis dengon \"Poksoqn\" bahwa ketika mendekati dan berikatan dengan enzim, substrat menginduksi perubahan konformasi pada enzim'Enzim yang mengatalisis reaksi lisis yang menyebabkanputusnya ikatan kovalen biasanya mengikat substratnya yaitu perubahan yang analog dengan memasukkan tangan irr'rbrti\"t) ke dalam sarung tangan (enzim) (Gambar 7-5)'d\"l\"- suatu konformasi yang agak sedikit kurang Akibat wajarnya adalah bahwa enzim memicu perubahanmenguntungkan bagi ikatan yang akan putus tersebut' timbal-balik pada substrat dengan memanfaatkan energi ikatan untuk memfasilitasi transformasi substrat menjadiKonformasi yang terjadi akan meregangkan atau mendistorsiikatan sasaran, melemahkannya, dan menyebabkannya lebih produk. Model induced ft ini rclah banyak dibuktikan olehrentan terputus. studi-studi biofisik pergerakan enzim sewaktu mengikat substrat.Kcrrqlisis Kovqlen PROTEASE HIV MENGGAMBARKAN KATALISIS ASAM.BASAProses katalisis kovalen melibatkan pembentukan suatu Enzim pada famili aspartat Protease yang mencakupikatan kovalen antara enzim dan satu atau lebih substrat' enzim pencernaan pepsin, katepsin lisosom, dan proteaseEnzim yang telah mengalami modifikasi tersebut kemudian Mf\/N'7menjadi suatu reaktan. Katalisis kovalen memasukkan Isuatu jalur reaksi baru dengan energi aktivasi yang lebihrendah-dan karena itu lebih cepat-daripada jalur realaidalam larutan homogen. Namun, modifikasi kimiawi padaenzim bersifat transien. Setelah reaksi selesai, enzim kembalike keadaannya sebelurn termodifikasi. Jadi, peran enzimtersebut tetap katalitik. Katalisis kovalen sering terjadipada enzim-enzim yang mengatalisis reaksi pemindahangugus. Residu di enzim yang ikut serta dalam katalisisLo,od..r umumnya adalah sistein atau serin dan kadang-kadang histidin. Katalisis kovalen sering mengikuti suatu^pe.krt\"armrair*y.an\"gpintegr-ipkoant gd\"a, nyapirtoudmukenkyaanisdmibeebdaesnkgaann substrat sebelumsubstrat keduanya terikat (Gamb ar 7 -4) 'SUBSTRAT MENGINDUKSI PERUBAHAN Gambar 7-5. Cambaran dua-dimensi model induced tt KoshlandKONFORMASI PADA ENZIM untuk bagian aktif sebuah I iase. Pengi katan substrat.A-B menginduksiPada akhir abad ke-19, Emil Fischer mengibaratkan ikatan perubahin konformasi di enzim yang menyeja.iarkan residu-residuyang sangat spesifik antara enzim dan substratnya sebagai latalitik yang ikut serta dalam katalisis serta meregangkan ikatankunci dan anak kuncinya. Meskipun perumPamaan antara A dan B sehingga ikatan tersebut mudah putus'\"kunci dan anak kuncinya' dapat menjelaskan spesifisitasyang sangat tinggi pada interaksi enzim-substrat' namunkesan bahwa bagian aktif enzim bersifat kaku tidak sesuai

/BAB Z: ENZIM:MEKANISME KEUA SZK t*-3o,,1<-/* transisi tetrahedral. Aspartat kedua (Asp Y, Gambar 7-6) kemudian memfasilitasi dekomposisi zat antara tetrahedralH/\" LH ini dengan mendonasikan sebuah proton ke gugus amino ..ottH yang terbentuk setelah putusnya ikatan peptida. Kedua aspartat yang berbeda bagian aktifnya dapat bekerja secarao,..9/oY-H 6t'-ro bersamaan sebagai basa umum atau sebagai asam umum li karena lingkungan sekitarnya mempermudah ionisasi salah CH, CH satunya, tetapi bukan keduanya.e=fv I * o\"l* KIMOTRIPSIN & FRUKTOS A.2,6.*'t.fl At BISFOSFATASE ADATAH CONTOH KATALISIS KOVATEN ?) NTC_R KimolripsinH,/': I Sementara katalisis oleh aspartar prorease melibatkan \ciH serangan hidrolitik langsung air pada ikaran pepdda, katalisis oleh serin protease kimotripsin melibatkan pembentukano.p1\o7,Ho ,l zat antata asil enzim kovalen. Sebuah residu seril yang sangat reaktif, serin 195, ikut serta dalam \"charge-relay netu,,ork\" H.\ dengan histidin 57 dan asparrar 102. Di bagian aktif, residu- residu yang terpisah jauh dalam struktur primer ini, beradaA\\_ccslt,'Hpci/rYl. I \ ll dalam jarak yang cukup dekat untuk membentuk ikatan satu sama lain. Dalam rangkaian Asp 102-His 57-Ser 195, cH. AspX residu-residu ini membentuk \"charge-relay network\" yang *o berfungsi sebagai'pemindah proton.\"R'\ ll Terikatnya substrat memicu pergeseran proton yangH/H/NO-H + C-R selanjutnya memindahkan proron hidroksil Ser 195 ke Asp 102 (Gambar 7-7). Peningkatan nukleofilisitas oksigen serilo\.\@/ H mempermudah serangannya ke karbon karbonil ikatan I oo 'il peptida substrat yang membentuk suatu zat antara asil- t'cH_ I enzim kovalen. Proton di Asp 102 kemudian berpindah Asp Y melalui His 57 ke gugus amino yang dibebaskan ketika clH-, ikatan peptida rerpurus. Bagian pepdda asli dengan satu Asp X gugus amino bebas kemudian meninggalkan bagian aktif enzim dan digantikan oleh molekul air. Charge-relay networkGambar 7-6. Mekanisme katalisis oleh suatu aspartat proteasemisalnya protease HlV. Tanda panah melengkung menun.jukkan kini mengaktifkan molekul air dengan menarik sebuaharah gerakan elektron. O Aspartat X bekerja sebagai basa untukmengaktifkan molekul air dengan mengambil sebuah proton.@ proton melalui His 57 ke Asp 102. Ion hidroksida yangMolekul air yang telah aktif menyerang ikatan peptida, membentuk terbentuk menyerang zat antara asil-enzim dan pergeseranzat antara tetrahedral yang bersifat sementara. @ Aspartat y balik proton mengembalikan proron ke Ser 195 yang memulihkan keadaannya semula. Kimotripsin, meskipunbekerja sebagai asam untuk mempermudah pemutusan zat antara menga.lami modifikasi sewakru proses katalisis, muncultetrahedral dan membebaskan produk-produk pecahan dengan tanpa perubahan ketika reaksi selesai. Tiipsin dan elastasememberikan sebuah proton ke gugus amino yang baru terbentuk. menggunakan mekanisme katalitik serupa, tetapi jumlah residu di pemindah proron Ser-His-Asp berbeda.Pemindahan proton selan.iutnya dari Asp X ke Asp y memulihkan Fru ktosq -2,6-Bisfosfqtqseprotease ke keadaan awalnya. Fruktosa-2,6-bisfosfatase, yakni suatu enzim regulatorikyang diprodulai oleh virus imunodefisiensi manusia (HI\t, pada glukoneogenesis (Bab 20), mengatalisis pembebasan hidrolitik fosfat di [arbon 2 fruktosa 2,6-bisfosfat. Gambarmemiliki kesamaan mekanisme katalisis. Katalisis melibatkan 7-8 melukiskan peran ketujuh residu bagian aktif enzim.dua residu aspartil yang bekerja sebagai katalis asam-basa.Pada tahap perrama reaksi, sebuah asparrat yang berfungsisebagai basa umum (a.p X, Gambar 7-6) mengekstraksisebuah proton dari molekul air dan menyebabkannya lebihbersifat nukleofilik. Nukleofil yang terbentuk ini kemudianmenyerang karbon karbonil elektrofilik pada ikatan pepridayang menjadi sasaran hidrolisis yang membentukzatantafa

/58 BAGIAN l: STRUKTUR & FUNGSI PROTEIN & ENZIM HliOl Rr-N-rC-RrOn H ,/N-{.^\N.-Y'\-H1{-O_ o-\c--&-t t{. }rrss I His 57 Asp 102 H oq -*T* I 14I R?o \,/ n-\" r*z'i\J I E . Fru-2,6-P\" E-P. Fru-6-P OI - I Ser 195 I Asp 102 His 57 R,-NH. \\c-R.@ oro@*n- ruAnt I oI \ Ser 195 Asp 102 His E-P. HzO E.P \". \-* Gamhar 7-8. Katalisis oleh fruktosa-2,6-bisfosfatase. (1) Lys 356 dan Arg 257, 3O7, dan 352 menstabilkan muatan negatif quadruple@ o*S*l7<*_-\F>,,* l= .substrat melalui interaksi antarmuatan Clu 327 menstabilkan Asp 102 His 57 muatan positif di His 392. (2) Nukleofil His 392 menyerang guguso fosforil C-2 dan memindahkannya ke His 258 yang membentuk Asp 102 His 57 suatu zat antara fosforil-enzim. Fruktosa-6-fosfat meninggalkan enzim tersebut. (3) Serangan nukleofilik oleh molekul air, mungkin HOOC-R- dibantu oleh Clu 327 yang bekerja sebagai sebuah basa dan membentuk fosfat anorganik. (4) Ortofosfat anorganik dibebaskan dari Arg 257 dan Arg 307 (Diproduksi ulang dengan izin dari Pilkis Sl et al: 6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisfosfatase: A metabolic signaling enzyme. Annu Rev Biochem 1995;64:799. O by Annual Reviews, www' annualreviews.orS. Dicetak ulang dengan izin)'@ ooTo9---n-ruqA,r+'- n-o-'-r Katalisis melibatkan \"trias katalitik' residu satu Glu dan dua His serta satu zat antara fosfohistidil kovalen. Ser 1e5 RESIDU KATALITIK BERSIFAT 'H'GHLY AsP\"102 His 57 CONSERVED'Gambar 7-7. Katalisis oleh kimotripsin. O Sistem charge-relay Anggota-anggota dari suatu famili enzim, misalnya Proteasemengeluarkan satu proton dari Ser 195, menyebabkannya menjadi aspartat atau serin menggunakan mekanisme serupa untuknukteofil yang lebih kuat. @ Ser .195 yang telah aktif menyerang mengatalisis suanr tipe reaksi tetapi bekerja pada substratikatan peptida membentuk suatu zat antara tetrahedral transien. yang berbeda. Famili-famili enzim tampaknya btrasal dari@ Pembebasan peptida terminal amino dipermudah oleh donasi proses duplikasi gen yang menciptakan salinan kedua darisebuah proton ke gugus amino yang baru terbentuk oleh His 57 dari g..r y\".rg -.ttyandi enzim tefientu. Protein yang disandi olehsistem charge-relay ini menghasilkan zat antara asil-Ser 'l 95. @ His Ledua gen kemudian dapat mengalami evolusi secara mandiri57 dan Asp 102 berkolaborasi untuk mengaktifkan satu molekul air untuk mengenal substrat yang berbeda-dan membentuk, contohnya, kimotripsin, yang memecah ikatan peptida diyang menyerang asil-Ser 195 dan membentuk zat antara te-trahedralkedua. O Sistem charge-relay mendonasikan satu proton ke Ser195 yang mempermudah penguraian zat antara tetrahedral untukmembebaskan peptida terminal karboksil @.

/BAB Z: ENZIM:MEKANISME KEUA 59Tabel T-1. Sekuens asam amino di sekitar tempat katalitik beberapa protease sapi. Regio yang diperlihatkanadalah regio di kedua sisitempat katalitik residu seril (S)dan histidil (H) sisi terminal karboksil asam-asam amino hidrofob besar; l\ * dan tripsin yang memuruskan ikatan peptida di sisi terminal karboksil asam-asam amino basa. Kesamaan nenek-moyang u1 (asal-mula) enzim dapat diperkirakan dari adanya asam-asamamino spesifik di posisi yang sama di setiap anggota famiii tenzim. Residu-residu ini disebut sebagai conseraed residues (residu yang tidak mengalami perubahan evolusi). Protein- rTprotein yang memiliki banyak residu jenis ini dianggap ffi 4bersifat homolog saru sama lain. Tabel 7-1 menggambarkankonservasi struktur primer dua komponen dari charge-relay Gambar 7-9. Pengamatan langsung proses pemutusan DNAnetwork untuk beberapa prorease serin. Residu-residu yangikut serta secara langsung dalam katalisis termasuk dalam tunggal yang dikatalisis oleh suatu endonuklease restriksi. Molekulresidu dengan derajat konservasi yang tinggi. DNA yang telah diimobilisasi menjadi manik-manik (abu-abu) diletakkan dalam suatu aliran arus dapar (tanda panah tebal), yangISOZIM ADATAH BENTUK ENZIMBERBEDA YANG MENGATATISIS REAKSI menyebabkan konformasinya memanjang. Pemutusan di satuYANG SAMA tempat restriksi (ditandai oleh warna) oleh suatu endonukleaseOrganisme tingkat-tinggi sering mengeluarkan beberapa menyebabkan molekul DNA memendek yang dapat diamati secaraversi yang secara fisik berbeda dari suatu enzim, dan masing- langsung dengan mikroskop karena basa-basa nukleotida pada DNAmasing mengatalisis reaksi yang sama. Seperti anggota famili memperlihatkan fluoresensi. Meskipun endonuklease (lingkaranprotein lainnya, katalis-katalis protein atau isozim ini berasal terbuka) tidak memperlihatkan fluoresensi, dan karenanya tidakdari duplikasi gen. Isozim dapat memperlihatkan perbedaan terlihat, namun cara molekul DNA memendek secara progresifringan dalam sifat seperti sensitivitas terhadap faktorregulatorik terrenru (Bab 9) atau afinitas substrat (misalnya +(1 4) mengungkapkan bahwa endonuklease berikatan denganheksokinase dan glukokinase) yang mengadaptasikan isozimke jaringan atau lingkungan tertentu. Sebagian isozim ujung bebas molekul DNA dan bergerak di sepanjang molekuljuga dapat meningkatkan kelangsungan hidup denganmenyediakan salinan \"cadangan\" suatu enzim esensial. tersebut dari satu tempat ke tempat lain.AKTIVITAS KATATITIK ENZIM yang sesuai (iihat Bab 8), laju reaksi katalitik yang dipantauMEMPERMUDAH DETEKSINYA setara dengan jumlah enzim yang ada, yang memungkinkan kita mengukur konsentrasi enzim.Jumlah enzim yang relatif sedikit di dalam sel mempersulitpenentuan keberadaan dan konsentrasi enzim tersebut. Enzimologi Molekul TunggolNamun, kemampuan untuk secara cepar mengubah Terbatasnya sensitivitas pengukuran konsentrasi enzim tradisional mengharuskan digunakannya sekelompok besar,ribuan molekul suatu substrat rerrentu menjadi produk atau ansambel, molekul enzim untuk menghasilkan produkmemudahkan masing-masing enzim untuk mengungkapkan dalam jumlah yang dapat diukur. Oleh sebab itu, data yangkeberadaanya. Pengukuran aktivitas katalitik enzim sering diperoleh mencerminkan kemampuan katalitik rata-raradigunakan dalam laboratorium klinis dan riset. Pada kondisi

60 / BAGIAN l: STRUKTUR & FUNGSI PROTEIN & ENZIMmasing-masing molekul. Kemajuan-kemajuan terkini dalam Enzyme-Li nked lm m u noas sdrlbidang nanoteknologi memungkinkan kita mengamati' Sensitivitas pengukuran enzim dapat digunakan untuk mende- teksi protein yang tidak memiliki aktivitas katalitik. Enzyme'biasanya dengan mikroskop fuoresen, katalisis oleh masing- linhed immt\"moassay (ELISA) menggunakan antibodi yang secara kovalen terhubung ke suatu \"enzim reportel'misalnyamasing enzim dan molekul substrat. Oleh karena itu, para alkali fosfatase atau peroksidxe horseradish (sejenis tanamanilmuwan kini dapat mengukur laju proses katalisis tunggal lobak) yang produk-produknya mudah didetetsi, umumnyadan kadang-kadang masing-masing tahap dalam katalisis melalui penyerapan sinar atau dengan fluoresensi' Serum atauoleh suatu proses yang disebut enzimologi molekul tunggal sampel biologis lain yang akan diperiksa diletakkan dalam lem-(single molecule en4rnologli (Gambar 7-9). peng mikrotiter plastik, tempat protein melekat pada permu- kaan plastik dan tidak dapat bergerak. Semua permukaan pe-Penemuon Obqr Memerlukqn Pemeriksoqn nyerap dinding sumur yang tersisa kemudian \"diblok' dengan menambahkan protein nonantigenik, misalnya albumin serumEnzim yong Sesuoi untuk Penopison 'High' sapi. Kemudian ditambahkan suatu larutan antibodi lang diikat secara kovalen ke suatu enzim reponer. Antibodi melekat padaThroughput'' antigen yang telah diimobilisasi sehingga ikut terimobilisasi.Enzim adalah satu dari beberapa kelas utama biomolekul Kelebihan molekul antibodi bebas kemudian dihilangkan de-yang menjadi sasaran untuk pembuatan obat dan agenterapeutik lain. Contohnya, banyak antibiotik menghambat ngan pembilasan. Keberadaan dan jumlah antibodi yang terikatenzim yang khas untuk mikroba patogen. Penemuan obat kemudian ditentukan dengan menambahkan substrat untukbaru sangat dipermudah jika kita dapat memeriksa secaracepat dan otomatis sejumlah besar farmakofor potensial- enzim reporter tersebut.suatu proses yang disebut sebagai bigh'throughput Dehidrogenqse Dependen-NAD(P).screening. Pemeriksaan penyaring high-throughput ini Diperikso Secqro Spektrofotometrisideal untuk menyurvei berbagai produk combinatorial Sifat fisikokimia reaktan dalam suatu reaksi yang dikatalisis olehchernistry, sintesis secara bersamaan berbagai senyawa kimia enzim menentukan jenis pemeriksaan yang dapat digunakanyang mengandung semua kemungkinan kombinasi dari untuk menilai aktivitas enzim. Pemeriksaan spektrofotometrisatu set zat kimia prekursor. Pemeriksaan kadar enzim yang memanfaatkan kemampuan suatu subsffat atau produk unrukmenghasilkan produk kromagenik atau fluoresen merupakan menyerap sinar. Koenzim tereduksi NADH dan NADPH yanghal ideal dalam bigh-tbrougbput screening karena detektoroptik dapat dirancang secara mudah untuk menganaiisis ditulis sebagai NAD(P)H, menyerap cahaya pada panjangsecara cepat sampel dalam jumlah banyak. gelombang 340 nm, sedangkan bentuk teroksidasinya NAD(P)- tidak demikian (Gambar 7-10). Jika NAD(P)- teredulai, penyerapan pada340 nm meningkat sebanding dengan--dan dengan kecepatan yang ditentukan oleh-jumlah NAD(P)H yang dihasilkan. Sebaliknya, untuk suatu dehidrogenase yang mengatalisis oksidasi NAD(P)H, akan dijumpai penurunan penyerapan pada 340 nm. Pada masing-masing kasus tersebut, laju perubahan dalam densitas optik pada 340 nm akan sebanding dengan jumlah enzim yang ada.200 250 300 350 400 Bonyok Enzim Diukur dengon Menggobungkqnnyq ke Dehidrogenose Panjang gelombang (nm) Pengukuran enzim dengan reaksi yang tidak disertai olehGambar 7-10. Spektrum absorpsi NAD- dan NADH. Densitas perubahan penyerapan atau fluoresensi umumnya lebih sulit'adalah untuk larutan 44 mg/L dalam sebuah sel dengan jalur sinar Pada beberapa kasus, produk atau substrat yang tersisa dapat1 cm. NADP. dan NADPH masing-masing memiliki spektrum yang diubah menjadi senyawa yang lebih mudah dideteksi. Pada kasus yang iain, produk reaksi mungkin perlu dipkahkananalog dengan NAD. dan NADH. dari substrat yang tidak bereaksi sebelum diukur. Strategi alternatif adalah dengan merancang suatu substrat sintetik dengan produk yang menyerap sinar atau berfuoresensi'

/BAB Z: ENZIM: MEKANISME KEUA OIContohnya, p-nitrofenil fosfat adaiah substrat artifisial Tabel 7-2. Enzim serum utama yang digunakan dalamuntuk fosfatase rertentu dan untuk kimotripsin yang tidak diagnosis klinis.menyerap sinar tampak. Namun, setelah hidrolisis, anionp-nitrofenilat yang terbentuk akan menyerap sinar pada 419 Pendekatan yang sangat umum lainnya adalahmenerapkan pengukuran \"gabungan\" (Gambar 7-11).Biasanya, suatu dehidrogenase dengan substrat berupaproduk enzim yang akan diteliti ditambahkan ke dalamkelebihan kataiitik. Laju kemuncuian arau menghilangnyaNAD(P)H akan bergantung pada laju reaksi enzim rempardehidrogenase digabungkan.ANATISIS ENZIM TERTENTU MEMBANTUDIAGNOSISDari ribuan enzim berbeda yang ada di tubuh manusia,enzim-enzim yang fungsinya tidak-tergantikan bagi vitalitassel akan terdapat di seluruh jaringan tubuh. Enzim iain atauisozim diekspresikan hanya di sel tertentu pada periodetertentu perkembangan, atau sebagai respons terhadapperubahan fisiologis atau patofisiologis tertentu. Analisistentang keberadaan dan distribusi enzim d2n i567lm-dsng2nekspresi yang biasanya spesifik untuk jaringan, waktu, araulingkungan-sering membantu penegakan diagnosis.Enzim Plqsmo Nonfungsionol Membqntu Catatan: Banyak enzim di atas tidak spesifik untuk pen),akit ),ang tercantum.Menentukon Diignosis & Prognosis fisiologis dalam darah. Contoh enzim plasma fungsionalEnzim dan proenzim tertenru serta substratnya terdapat ini antara lain adalah lipoprotein lipase, pseudokolinesterase,setiap saat dalam darah orang normal dan menjalankan fungsi dan proenzim koagulasi darah dan pelarutan bekuan darah (Bab 50). Sebagian besar enzim ini disintesis dan disekresi Glukosa oleh hati. --I nre,rvrg'. Plasma juga mengandung banyak enzim lain yang fungsi fisiologisnya dalam darah tidak diketahui. Enzim plasma V IHEKS'K'NASEI yang tampaknya nonfungsional ini berasal dari kerusakan normal rutin eritrosit, leukosit, dan sel lain. Kerusakan ataLr It oo''tn'. nekrosis jaringan akibat cedera atau penyakit umumnya disertai peningkatan kadar beberapa enzim plasma Glukosa,6-foslat nonfungsional. Tabel 7-2 mencantrtmkan beberapa enzim fID,EuHq|oDR,rOyGuEqNrA-lS+E|'I\-Irta_INoADPP'HI+ H. yang digunakan dalam enzimologi diagnostik. 6-Fosfoglukonolakton lsozim loktot Dehidrogenose Digunqkqn untuk Mendeteksi lnfork MiokqrdiumGambar 7-1'l . Pemeriksaan enzim gabungan untuk aktivitas L-Laktat dehidrogenase adalah enzim tetramerik yangheksokinase. Pembentukan glukosa 6Josfat oleh heksokinase keempat subunitnya terdapat dalam dua bentuk isodikaitkan dengan oksidasi produk ini oleh glukosa-6-fosfat (isoform) yang dinamai H (untuk jantung) dan M (untukdehidrogenase dengan keberadaan enzim tambahan dan NADP.. otot). Subunit-subunit ini dapat berkombinasi sepertiJika terdapat kelebihan glukosa-6-fosfat dehidrogenase, laju diperlihatkan di bawah untuk menghasilkan isozim L-laktatpembentukan NADPH, yang dapat diukur pada 340 nm, ditentukan dehidrogenase yang secara katalitik aktif:oleh laju pembentukan glukosa 6Josfat oleh heksokinase.

/62 BAGIAN l: STRUKTUR & FUNGSI PROTEIN & ENZIM lsozim Loktot Subunit dalam sampel bioiogis dan forensik. Pada teknik PCR, suatuDehidrogenose HHHH DNA polimerase yang termostabil yang diarahkan oleh l1 HHHM l2 HHMM primer oligonukleotida yang sesuai menghasilkan ribuan l3 HMMM salinan dari suatu sampei DNA yang pada awalnya terdapat l4 MMMM dalam kadar yang terlalu rendah untuk dideteksi secara l5 iangsung. Subunit H dan M disandi oleh gen-gen tersendiri yangekspresinya diatur secara diferensial di berbagai jaringan' Deteksi res*ietion fragment lengtb pofumorpbismsKarena jantung mengekspresikan subunit H hampir secara (RFLP) memungkinkan kita meiakukan deteksi pranatal berbagai penyakit herediter, sePerti sifat sel sabit, talasemiaeksklusif, isozim I, mendominasi di jaringan ini. Sebaliknya' beta, fenilketonuria bayi, dan penyakit Huntington. Deteksiisozim I, mendominasi di hati. Dalam plasma secara normal RFLP melibatkan p€mutusan DNA untai ganda oleht.rdap\"i sejumlah kecil laktat dehidrogenase. Setelah suatu endonuklease restriksi, yang dapat mendeteksi perubahaninfark miokardium atau pada penyakit hati, jaringan yang ringan pada DNA yang memengaruhi temPat-tempatrusak membebaskan berbagai bentuk iso laktat dehidrogenase pengenalannya (recognized sites). Bab 39 menyajikan rincianyang khas ke dalam darah. Peningkatan kadar isozim I' atau lebih ianjut mengenai pemakaian PCR dan enz'im-enzimI, yan1terjadi dapat dideteksi dengan memisahkan berbagai restriksi untuk diagnosis.iigo-.. laktat dehidrogenase dengan eiektroforesis dan DNA REKOMBINAN MERUPAKAN ALATmengukur aktivitas katalitiknya (Gambar 7 -12). PENTING UNTUK MEMPETAIARI ENZIMENZIIYI MEMPERMUDAH DIAGNOSIS Teknologi DNA rekombinan telah muncul sebagai asetPENYAKIT GENETIK penting dalam penelitian rentang enzim. lJntuk meneliti itrrlktur dan fungsi enzim diperlukan sampel enzimMeskipun banyak penyakit telah lama diketahui disebabkan dengan tingkat kemurnian yang sangat tinggi' Ir4engisolasioleh perubahan pada DNA seseorang, namun teknik atau suatu enzim, terutama yang terdapat daiam konsentrasialat untuk mendeteksi mutasi genetik hanya baru-baru ini rendah, dari ribuan protein yang ada daiam sebuah sel mungkin sangat sulit dilakukan. Jika gen untuk enzimiersedia secara luas. Teknik-teknik ini mengandalkan efisiensi yang bersangkutan telah dapat diklon, biasanya kita dapatkatalitik dan spesifisitas katalis enzim. Contohnya, reaksi menghasilkan sejumlah besar protein yang disandi oleh gen ,..r.Lrr, melalui Escherichia coli atau sei ragi. Namun, tidakberantai polimerase Qtolymerase chain reactioz, PCR) semua protein hewani dapat diekspresikan dalam bentukmengandalkan kemampuan enzim untuk berfungsi sebagai aktif di sel mikroba. Demikian iuga dengan mikroba' tid:rkpenguat katalitik untuk menganalisis DNA yang terdapat{Laktat) SH S (Piruvat) JantungNAD. NADH + H PMS teroksidasi(tidak berwarna) formazan biru)ddCLiiDpawemHarrlbinphaaaaridt.k7aap-n,sote2ladr.upiAmokilara,ddi.iapn(liNaosaBhrmhTsk,aeulnrnuidtmraoonbledlpuhaaeriteotsleeleoktogrirariasoznfoogblrieeuprsmbaisas;giePdanMai Sndis,econf{ezgilniiamhanaztlianindkfemtaanretkgtdailmesnuhioplifdkaeraton)r.ggdegDiunuiamnksa;ueknBau(LnnaDdtsaaHklmae)hmpdaaasklearreemulaemkkssternioroupfermemrnoagmgglr;aaadnmbauunnsyigaaCan'ngalsdotyaezalliaannhhgrserum dari seorang pasien dengan penyakit hati. Angka-angka menandai isozim LDH spesifik'

/BAB Z: ENZIM: MEKANISME KEUA 63dapat melaksanakan proses-proses pengolahan pascatranslasi sering menyandi suatu tempat pemutusan untuk suatutertentu. Oleh sebab itu, suatu gen dapat diekspresikan protease yang sangat spesifik misalnya trombin di regio yang menghubungkan dua bagian protein. Hal ini memungkinkandalam biakan sistem sel hewan yang menggunakan vektor kita mengeiuarkan domain fusi yang ditambahkan tersebutekspresi baculovirus untuk mentransformasikan biakan sel seteiah tindakan pemurnian afi nitas.serangga. Untuk rincian lebih lanjut mengenai teknik DNArekombinan, lihat Bab 39. Mutogene sis Site - Di recfed Mem beri ko n Pemqhomon MekonistikProfein Fusi Rekombinqn Dimurnikondengon Kromotogrofi Afiniros Jika kemampuan untuk mengekspresikan suatu protein dari gen klon-nya telah diperoleh, residu-residu aminoasilTeknologi DNA rekombinan juga dapat digunakan untukmenciptakan protein modifikasi yang mudah dimurnikan spesifik dari protein tersebut dapat diubah dengan mengubahdengan kromatografi afinitas. Gen dari protein yang kodon-kodonnya menggun akan site-directed mutagenesis.bersangkutan dikaitkan ke suatu sekuens oligonukleotida Pendekatan ini, jika digunakan bersama dengan analisisyang menyandi suatu perpanjangan terminal karboksil atau kinetik dan kristalografi sinar-X, mempermudah kitaamino ke protein yang disandi tersebut. Protein modifikasi mengidentifikasi peran-peran spesifik residu aminoasilyang terbentuk, disebut protein fusi, mengandung suatudomain yang dirancang untuk berinteraksi dengan matriks tertentu pada pengikatan dan katalisis substrat. Contohnya,afinitas spesifik. Salah satu pendekatan yang populer adalah kesimpuian bahwa suatu residu aminoasil tertentu berfungsimelekatkan suatu oligonukleotida yang menyandi enam sebagai asam umum dapat diuji dengan me nggaatinya dengan suatu residu aminoasil yang tidak mampu mendonasikanresidu hisitidin berurutan. Protein \" His ta!' (\"berlabel sebuah proton.histidin') yang diekspresikan ini kemudian mengikatmatriks kromatografik yang mengandung ion iogam RINGKASANdivalen, misalnya Ni2-. Cara lain, domain pengikat-substrat . Enzim adalah katalis yang sangat efektifdan spesifik.pada glutation S-transferase (GST) dapat berfungsi sebagai . Gugus prostetik organik dan anorganik, kofaktor, dan\"GST tad'. Gambar 7-13 melukiskan pemurnian suatu koenzim berperan penting dalam katalisis. Koenzimprotein fusi-GST dengan menggunakan matriks afinitas yang banyak di antaranya berupa turunan dari vitamin B, berfungsi sebagai \"pengangkut\".yang mengandung glutation yang terikat. Protein fusi juga . Mekanisme katalitik yang digunakan oleh enzim mGST mencakup introduksi sra in (vntai), aproksimasi reaktan,Plasmid yang menyandi GST Klon DNAyang katalisis asam-basa, dan katalisis kovalen. dengan tempat trombin (T) menyandi enzim . Pada semua kelas dari suatu enzim tertentu, residu Disatukan aminoasil yang ikut serta dalam katalisis sangatGST terkonservasi (tidak berubah selama evolusi) Substrat dan enzim saling memicu perubahan konformasiGambar 7-13. Pemakaian protein fusi glutation S-transf-erase (CST) yang mempermudah pengenalan dan katalisis substratuntuk memurnikan protein rekombinan- (CSH, Blutation.) Aktivitas katalitik enzim mengungkapkan keberadaan- nya, mempermudah deteksinya, da4 menjadi dasar bagi berbagai pemeriksaan enzyme- linked immunoassay. Banyak enzim dapat diukur secara spektrofotometrik dengan menggabungkannya ke dehidro genase dependen- NAD(P).. Ilmu kimia kombinatorial menghasilkan beragam aktivator dan inhibitor enzim potensial yang dapat diuji dengan h igh- t hro ughp u! screen i ng. Pengukuran enzim plasma membantu diagnosis dan prognosis. Contohnya, infark miokardium meningkat- kan kadar isozim I, laktat dehidrogenase dalam serum. Endonukiease restriksi mempermudah diagnosis penyakit genetik dengan mengungkapkan restiction fagment length po $morphism.

64 / BAGIAN l: STRUKTUR & FUNGSIPROTEIN & ENZIM Geysen HM, Schoenen F,'Wagner D, lVagner R: Combinatorial compound libraries for drug discovery: An ongoing challenge.. Site-directed mutagenesis yang digunakan untuk Nature Rev Drug Disc 2003;2:222. mengubah residu yang dicurigai penting dalam katalisis Goddard J-B Reymond J-L: Enzyme assays for high-throughput atau pengikatan substrat, memberikan pemahaman screening. Curr Opin Biotech 2004;15:314. Hedstrom L. Serine protease mechanism and specificiry. Chem Rev tentang mekanisme kerja enzim. 2002;102:4501.. Protein fusi rekombinan, misalnya enzim fusi GST Ishijima A, Yanagida T: Single molecule nanobioscience. Tiends atau enzim berlabel-His mudah dimurnikan dengan kromatografi afinitas. Biochem S ci 200 1 ;26:438.REFERENSI Schafer B, Gemeinhardt H, Greulich KO' Direct microscopic observation of the time course of single-molecule DNABrik A, Vong C-H. HIV-1 protease: Mechanism and drug restriction reacdons. Agnew Chem Int Ed 2001 ;40:4663 discovery. Org Biomol Chem 2003;1:5. Silverman RB: The Organic Chemistry of Enzyme-CatalyzedConyers GB et al: Metal requirements of a diadenosine Reactions. Academic Press, 2002. pyrophosphatase from Bartonella bacilliformis. Magnetic Suckling CJ: Enzyme Chemistry. Chapman & Hall, 1990. resonance and kinetic studies of the role of Mn2.. Biochemistry 2000;39:2347. Sundaresan Y Abrol R: Towards a general model for protein-Fersht A. Strucnrre and Mechanism in Protein Science: A Guide to substrate stereoselectiviry. Protein Sci 2002;11 :1330. Todd AE, Orengo CA, Thornton JM: Plasticiry of enzyme active Enzyme CataQsis and Protein Folding. Freeman, 1999Frank RA'S7, et al: A molecular switch and proton wire synchronize sites. tends Biochem Sci 2002;27 :419. the active sites in thiamine enzymes. Science2004;306:872 \falsh CT: Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, 1979.