Bab 1. Histologi & Metode Pengkajiannya

Histologi & Metode PengkajiannyaPERSIAPAN JARINGAN UNTUK PENGKAJIAN MIKROSKOPI ELEKTRON Fiksasi Mikroskopi Elektron Transmisi Pemendaman dan Pemotongan Mikroskopi Elektron Pemindai Pemulasan AUTORADIOGRAFIMIKROSKOPI CAHAYA KULTUR SEL & JARINGAN Mikroskopi LaPang-Teran g HISTOKIMA & SITOKIMIA Mikroskopi Fluoresensi METODE DETEKSI DENGAN INTERAKSI SPESIFIK Mikroskopi Fase Kontras & Mikroskopi I nterferens Diferensial ANTAR MOLEKUL Mikroskopi Konfokal Mikroskopi Polarisasi lmunohistokimia Teknik Hibridisasi MASALAH PADA PENGKAJIAN SEDIAAN JARINGANHistologi adalah ilmu tentang jaringan tubuh dan cara jaringan terdiri atas jaringan saraf. Kombinasi yang tepat dari jaringan-ini menyusun organ-organ. Akar kata Yunani histo dapat di- jaringan tersebut memungkinkan berfungsinya setiap organterjemahkan sebagai 'jaringan' atau 'jaring' karena kebanyakanjaringan merupakan jaring filamen dan serat yang saling dan organisme secara keseluruhan. Ukuran sel dan matriksnya yang kecil menyebabkan histo-terjalin, baik selular mauPun non-selular, dengan lapisanmembranosa. Histologi mencakup semua aspek biologi logi bergantung pada penggunaan mikroskop. Kemajuan dijaringan, yang berfokus pada mekanisme susunan dan struktur bidang kimia, biologi molekular, fisioiogi, imunologi dansel dalam mengoptimalkan fungsi yang spesifik untuk setiap patologi-dan interaksi di antara bidang-bidang tersebut-or8an. penting untuk memperoleh pengetahuan yang lebih baik jaringan dibentuk oleh dua komponen yang saling ber- tentang biologi jaringan. Pembiasaan dengan alat dan metodeinteraksi: sel dan matriks ekstrasel. Matriks ekstrasel terdiriatas banyak jenis molekul, dan kebanyakan di antaranya sangat setiap cabang ilmu penting untuk memahami topik pem-rumit dan membentuk struktur kompleks, seperti serabut belajaran dengan baik. Bab ini membahas beberapa metodekolagen dan membran basal. Fungsi utama yang dulu di-katakan sebagai fungsi matriks ekstrasel adaiah sebagai yang lebih umum dipakai dalam mempelajari sel dan jaringanpenunjang mekanis bagi sel-sel, mengangkut nutrien ke sel- serta prinsip-prinsip yang terkait dengan metode tersebut.sel, dan membawa katabolit dan produk sekresi. Kita kinimengetahui bahwa, meskipun menghasilkan matriks ekstrasel, PER$IAPAN JARINGAN UhITI\"NKsel tersebut dipengaruhi dan terkadang diatur oleh molekul- PENGKAJIANmolekul matriks. Jadi, terdapat semacam interaksi intensifantara sel-sel dan matriks, dengan sejumlah komponen matriks Prosedur yang paling sering digunakan dalam mempelajariyang dikenali oleh dan tertambat pada reseptor-reseptor di jaringan persiapan sediaan histologi atau irisan jaringan yangpermukaan sel. Kebanyakan resePtor tersebut adalah molekul dapat dipetajari dengan bantuan mikroskop cahaya. Di bawah mikroskop cahaya, jaringan diamati melalui berkas cahayayang melewati membran sel dan berhubungan dengan yang menembus jaringan. Karena jaringan dan organ biasanya terlalu tebal untuk ditembus cahaya, jaringan tersebut haruskomponen struktural di dalam sitoplasma. Jadi, sel dan matriks diiris menjadi lembaran-lembaran tipis yang translusen danekstrasel membentuk semacam kesatuan yang berfungsi dan kemudian dilekatkan di atas kaca objek sebelum jaringanbereaksi terhadap rangsangan dan inhibisi secara bersama- tersebut dapat diperiksa. sama. Sediaan jaringan mikroskopik yang ideal harus dibuat se- Setiap jaringan fundamental tersebut dibentuk oleh be- demikian rupa sehingga jaringan pada sediaan tersebut tetapberapa jenis sel dan secara khas oleh asosiasi sel dan matriks memiliki struktur dan komposisi molekul yang sama seperti di tubuh. Namun pada praktiknya, hal ini jarang dapat dilakukan ekstrasel yang spesifik. Asosiasi yang khas ini mempermudah dan hampir selalu terdapat artefak, distorsi, dan hilangnya komponen-komponen akibat proses persiapannya. Tahap- pengenalan sejumlah besar subtipe jaringan oleh mahasiswa' tahap dasar yang diterapkan pada persiapan jaringan untuk Kebanyakan organ dibentuk oleh kombinasi beberapa jenis pengkajian histologi diperlihatkan pada Gambar 1-1 . jaringary kecuali susunan saraf pusat, yang hampir seluruhnya

2 I BABlFiksasi y(NanHgr)bapnroytaekindijpaariknagia, nd.ikPeatadhaugi lubtearreaalkdseihdidean,gaknerJgaug\"fuikssaasmininyaa diperkuat karena zat ini merupakan dialdehida yang dapatJika sediaan yang permanen dikehendaki, jaringan harus membentu k i ka tan-si lang antarprotein.difiksasi. Untuk menghindari pencernaan jaringan oleh enzimdi dalam sel (autolisis) atau oleh bakteri dan untuk mem_ mik_rMoseknogpinegleakt trtoinng, gdiipneyralukraensolelubsihi yang dihasilkan olehpertahankan struktur dan komponen molekul, potongan organharus segera diolah dengan tepat, sebelum atau secepat banyak perhatian dalammung,kin setelah organ diangkat dari tubuhhewan. pengolahanini-fiksasi-dapat dilakukan secara kimiawi atau, lebih proses fiksasi untuk mempertahankan rincian struktur ultra-jarang, dengan cara fisika. pada fiksasi kimiawi, jaringan nya. Unfuk itu, prosedur fiksasi ganda dengan menggunakanbiasanya direndam dalam larutan yang menstabilkan atau larutan dapar glutaraldehid, yang diikuti fikiasi kedtia\"dengandalam bahan pengikat yang disebut bahan fiksasi. Karena dapar osmium tetroksida, menjadi prosedur baku persiapanbahan fiksasi memerlukan waktu untuk meresap sepenuhnya pengkajian struktur yang halus. Efek osmium tetroksidake dalam jaringary jaringan tersebut biasanya dipotong menjadi adalah mempertahankan dan memulas lipid dan protein.fragmen kecil sebelum difiksasi untuk mempermudah Pemendaman & Pemotonganpenetrasi bahan fiksasi dan unfuk menjamin pengawetanjaringan. Penyuntikan intravaskular bahan fiksasi dipat di_ ]aringan_umumnya dipendam dalam medium padat untuk memLriahkan pemotongan. Untuk memperoleh sediaan yanglakukan. Dalam hal ini, bahan fiksasi sampai di jaringan secara tipis dengan mikrotom, jaringan harus diinfiltrasi sesudahcepat melalui pembuluh darah sehingga fiksasi semakin baik. fiksasi.dengan substansi pemendam yang memberi sifat padat pada jaringan. Bahan pemendaman meliputi parafin, dan Salah safu bahan fiksasi terbaik untuk pemeriksaan damar plastik. Parafin digunakan secara rutin untui mikroskopmikroskop cahaya rutin adalah larutan dapar iiotonik dari cahaya; damar digunakan baik untuk mikroskop cahaya mau_ pun elektron.formaldehid 37%. Proses kimiawi yang terlibat dalam fiksasitersebut sangat rumit dan tidak selalu dimengerti dengan baik.Formaldehida dan glutaraldehida, yaitu bahan fikiasi lain J'..;* l m .W lnfiltrasi \"seii:' -> I .* ...............i,,.iJ ;l!,r F i{$F:,., .{6#., .. 1 Pembersihan '?if'l Dehidrasi Penempelan ,r%. , --+ r.j1w$'d + Fiksasia Roda kemudi Pemegang batang parafin Batang parafin Jaringan Pisau baja b ,riL##;l]'tl.ti.t#,i:=.lit-\"i'\";'-\":dmidaddlmBhacsesmreGaitiaaaieflesialbpsekekolealiarapnsitemarorkhaknon'omme'ntmh1nlgpidstodfkdpoogmieb0aegniepamalmbkrnmapiriaapsmdrkaaaearamriakruakahisadmokaftdeanpidifa1etsnfnaikbiknkaSnnfk-bpet'aualg7oagypeaaatknfaSnaiphaai'emrtmewknenaeamnnPmesgbtfapjlegceiaaanbdeankualhelersaszhaaanndntilkienriechcmbuggsim.atmagkarepreiybnraoihi(apatanirurapesarin'ugnaannaf)maetnisJd:regapldnnattiuydeauarkuPrefgaatnsaapnaiikeonrnjuepnklausltadgdajrpmiogmtidarsuama,aaahinaairnpninrpnarjaigraaunietgddaojlukarnuajlgltiaafaitaaknsbenior,annnprenrbuebrgninmuoabnkrtlaaugmoaltydddeugienaldanankacaiteamnpkikuntinljlmdneuauaea.snpugpitj'kr/nrrlleptanarakeieiuAdnknegkrdnmotnkeilassgrkgknikghtdfakiaaigaoagikknomekkmnehhdaranklasmhoreaocaapnmaynaidsnamlndraikakskiak,esirtpnraoiaaee1lnmoaaptagppnsgradysekmdpseaiiahakeanamkenrrdcaonnsgrkobgpaisepptdaigaanudrruhddmiinuulritlssaiaaieseianpknsatepkimyjltufiataeeeaanienuaenbpirnrkkkmwrt.titikktarndytaadcraaeasPauangaosieanednpsndae,amnpmiulirigni.namynaihda.nptyprayPrnsajaaauauaynyaKaporfddtdnnuaiig.naentiakiauyssnobnsgbariasmnargneuigaaslsnleailukagtin-uipm,srsdasina,yurnhtesuieiogieandk,jtpimmaeaalrdnkaaikliynhsoaaegayn5ee;a.iunangae8n-cftnpdn(nkanni\"negkubgjeagidntiragsicua)ngpnrngu:arad,iklgiudignsilsnMnialjitjfog.giabpaba<giirklierseLarereyiakarnsipirmahnahnnunrtaauagonwgnagteksnrapayotgagmaanaiotaennamuknfndkmiknrbtnaknsaaeeeagpladhamnspmrncnckad\"-mgiadaegairlai\"raaukadiiinmgnpgnirpsand\"mt,ayueeetse.tgirlytanal\"lraederiakaajraii'rnlmatrkmjraiaaonkkaeisrrnbrhglakmJrabeaaifrionnai\"kevaamtk;esnttgsnds\"nerlentuega'adbieam\"nrgpncsunigeurmmaaetuiknjlyunpaarlimdodyaksakaaatbriaanukrenamaeroopmntokjhnpggkrrusiagnaioeeemaskgit,mdtsklnnt,pono,aoldieaabegubpeorgbletnieojiibh.nukaudraihtragbiginsmnrsrcinhUigilsakgiydsaoynaausjsuyarmkkaatpaninninadleurabopasjyaaiin1kcapnnmlutliakkeg0,iooregglrt,aaih0erlkrnaodnamasn%ndd.pgnginpingfaeeeraiitslauokuerpannynynmiranstlrrsakggjaateaaaattraainaanaufkiassdsninngnennguk1i-.iil

HISTOLOGI DAN METODE PENGKAJIANNYA I 3 Proses pemendaman parafin, atau impregnasl Janngan/ Contoh pewarna basa adalah biru toluidin, biru alcian danbiasanya didahului oleh dua tahap utama: pengeringan biru metilen. Hematoksilin bekerja seperti pewarna basa,(tlehydration) dan penjernihan (clenring). Air mula-mula di-hitangkan dari potongan jaringan yang ingin dipendam artinya zat ini memulas komponen basofiIik iaringan'dengin cara merendamnya berfurut-turut secara bertahap Komponen jaringan utama yang mengionisasi dan bereaksidalam larutan etanol dan air, biasanya dari etanol 70\"/\" sampai100% (pengeringan). Etanol kemudian digantikan dengan dengan pewarna basa akan mengikat zatbasa karena adanyalarutan yang dapat bercampur dengan alkohol dan media asam dalam komposisi jaringan tersebut (asam nukleatpemendam. Sewaktu jaringan diinfiltrasi oleh pelarut, jaringan giikosaminoglikan, dan asam glikoprotein). Pewarna asamtiasanya menladi iernih (transparan). Setelah jaringan tersebut (misalnya, G jingga (orange G), eosin, asam fukhsin) memulasdipenuhi (terimpregnasi) dengan larutary jaringan dimasukkandalam parafin cair di dalam overy pada suhu 52-60\"C Panas komponen asidofilik jaringan seperti mitokondria, granulaakan menguapkan pelarut dalam jaringan dan celah iaringan sekretoris, dan kolagen.yang ditinggalkan akan diisi dengan parafin Setelah di- Dari semua pewarna, kombinasi hematoksilin dan eosinieluarkan dari oven, Potongan jaringan dengan parafin di (H&E) paling banyak dipakai. Hematoksilin memulas DNAdalamnya akan menjadi keras. Jaringan yang akan dipendam intisei dan struktur asam lainnya di sel (seperti bagian sito- plasma yang kaya-RNA dan matriks tulang rawan) menjadidalam damar plastik juga menjadi kering dalam etanol dan- biru. Sebaliknya, eosin memulas sitoplasma dan kolagen men-bergantung pad,a jenis damar yang dipakai-kemudian jadi merah muda (Gambar 1-2)' Banyak pewarna lain, sepertidiinfiltrasi dengan larutan plastik. Etanol atau zat Pelarut trikrom (misalnya, pewarna Mallory, Pewarna Masson), di- pakai pada prosedur histologi lainnya. Trikrom, selain me-kemudian diganti oleh larutan plastik yang mengeras akibat nampakkan inti dan sitoplasma dengan jelas, lebih baik dalamikatan-silang polimer. Pemendaman dengan damar plastik membanfu membedakan komponen jaringan ekstrasel ke- mencegah pengerutan akibat suhu yang tinggi yang diperlukanpuda ptoses pemendaman parafin dan sedikit atau tidak me- timbang dengan H&E. Teknik yang baik untuk membedakan kolagen adalah dengan Penggunaan pikrosirius, terttama bila nimbulkan distorsi sel. dilihat dengan cahaya polarisasi (lihat Mikroskopi Polarisasi). Blok keras yang berisi jaringan kemudian diletakkan pada Dasar kimiawi untuk prosedur pemulasan lainnya lebih suatu alat yang disebut mikrotom (Gambar 1-1) dan dilris dengan pisau baja atau pisau kaca mikrotom menjadi potongan sulit daripada interaksi elektrostatik yang mendasari basofilia setebal 1-10 ptm. Ingatlah bahwa satu mikrometer (1 pm) = dan asidofilia. DNA secara spesifik dapat diidentifikasi dan di- 1/1000 mm = 10 6 m. Satuan jarak lain yang umum digunakan pada histologi adalah nanometer (1 nm = 0,001 pm: 10 6 mm: kuantifikasi dalam inti sel dengan menggunakan reaksi io n -; dan ingstrom (1 A = 0,1 nm atau 10 a prm)' Lembaran Feulgen; pada reaksi ini, gula deoksiribosa dihidrolisis oleh asam hidroklorat lemah, yang diikuti dengan pengolahan jaringan diapungkan di atas air dan dipindahkan ke atas kaca dengan reagen asam periodat dan Schiff (PAS). Teknik PAS objek untuk dipulas. didasarkan pada transformasi gugus 1,2-glikol yang terdapat Cara lain unfuk mempersiapkan sediaan iaringan adalah dalam gula menjadi residu aldehld, yang lalu bereaksi dengan pemaparan jaringan dengan pembekuan cepat Pada proses reagen Schiff untuk menghasilkan warna magenta atau ungu' inl, jaiingan difiksasi melalui pembekuan (secara fisika, bukan fiksasi kimiawi) dan sekaligus menjadi keras dan siap untuk Polisakarida membentuk suatu kelompok yang sangat dipotong. Sebuah mikrotom pembeku-cryostat-laht di- heterogen di jaringan dan terdapat baik dalam bentuk bebas gunakan untuk memotong jaringan tersebut yangbeku' Karena atau kombinasi dengan protein dan lipid. Karena kandungan cara ini cepat menghasiikan preparat tanPa mengikuti prosedur gula heksosanva, sejumlah besar polisakarida juga dapat di- pemendaman yang panjang seperti yang dijelaskan se- perlihatkan dengan reaksi PAS. Polisakarida bebas yang ber- Lelumnya, cryostat digunakan secara rutin di rumah sakit limpah di sel hewan merupakan glikogery yang dapat diper- lihatkan oleh PAS di hati, otot lurik, dan jaringan lain yang menimbunnya. Rantai gula bercabang pendek (oligosakarida) melekatuntuk mengkaji spesimen selama prosedur pembedahan' pada asam amino glikoprotein sehingga kebanyakan gliko-Pembekuan iaringan juga efektif untuk studi histokimiawi protein terpulas positif oleh PAS. Gambar 1-2b rnemperlihatkanenzim yang sangat sensitif atau molekul kecil, karena suatu contoh sel yang dipulas oleh reaksi PAS'pembekuary tidak seperti fiksasi, tidak menginaktifkan se- Glikosaminoglikan (GAG) merupakan polisakarida anioniktagian besar enzim. Terakhir, karena pencelupan jaringan yang berantai panjang dan tidak bercabang dan mengandungyang terfiksasi dalam pelarut seperti xylene akan melarutkan gula teraminasi. Banyak glikosaminoglikan yang disintesislipiJ set, sediaan beku juga bermanfaat ketika suatu struktur ketika melekat pada inti protein dan membentuk suatu golongan makromolekul yang disebut proteoglikan, yangyang mengandung lipid ingin dipelajari. menjadi bagian penting matriks ekstrasel (ECM) ketikaPemulasan disekresi (lihat Bab 5 dan 7). Tidak seperti glikoprotein, rantaiAgar dapat dipelajari di bawah mikroskop, sediaan biasanya karbohidrat glikoprotein memiliki berat dan volume yangha\"rus dipulas itau diwarnai karena kebanyakan iaringan tidak lebih besar ketimbang inti protein molekul. GAG dan banyakberwarna. OIeh sebab itu, sejumlah metode pemulasan iaringan glikoprotein asam tidak mengalami reaksi PAS, tetapi me- nunjukkan interaksi elektrostatis yang kuat dengan biru alciantelah dirancan g agat betbagai unsur iaringan jelas terlihat dandapat dibedakan safu dengan yang lain. Pewarna memulas dan pewarna basa lairy karena tingginya kandungan gugusbeibagal unsur jaringan, kurang lebih secara selektif Ke- karboksil dan sulfat anionik pada senyawa-senyawa tersebut.banyakan pewama ini bersifat sebagai senyawa asam atau basa Material basofilik atau yang terpulas positif dengan PASdancenderung membentuk ikatan elektrostatik (garam) denganradikal yang dapat terionisasi di jaringan. Komponen jaringan selanjutnya dapat diidentifikasi oleh pengolahan awal sediaandengan'muitan netto negatif (anionik) lebih mudah dipulas jaringan melalui Pencernaan enzim dengan suafu enzim yangdengan pewama basa dan disebut basofilik; komponen kationik, secara spesifik mencerna suatu substrat, dan membiarkan bagian lainnya yang berdekatan. Contohnya, pengolahan awalseperti protein dengan banyak gugus amino yang terionisasi, dengan ribonuklease akan sangat mengurangi sifat basofiliamlmihii afinitas untuk Pewama asam dan disebut asidofilik' sitoplasma dengan sedikit efek pada kromosom, yang meng-

4 / BAB1rndikasikan kepentingan RNA untuk pemulasan sitoplasma, merlukan waktu dari 12 jam sampai 2\/zhari,yang bergantungDemikian halnya, polisakarida bebas dicerna oleh amilase, pada ukuran jaringary bahan fiksasi, media plme\"ndaman dansehingga dapat digunakan untuk membedakan glikogen dari metode pemulasan. Langkah terakhir sebelum pengamatanglikoprotein pada materi yang terpulas positlf olJh pAS. adalah meletakkan kaca penutup pada kaca ob;uk\"d\"rrgu.,Pada banyak prosedur, struktur teitentu seperti inti sel media perekat.TD\"a.l\"afm\"dh] atel rinlar,beplu, latestaanpi bagian sel lain sering tidak tampak. MIKROSKOPI CAHAYA balik (counterstain) digunakun .,r-rtr.rkmemberikan informasi tambahan. pemulas Lalik biasanya fMasiker-oksoknotrpais,cainhateyrafekroennvsendsifieorneanfsisael,rtakomnikforoksakfojpai nflupoorelasreisnassi,iadalah pewama tunggal yang diberikan pada suatu sediaandengan metode lain untuk mempermudih pengenalan inti semua bekerja berdasarkan interaksi cahaya dengan kom_atau struktur lain. ponen jaringan dan dapat digunakan unfuk memperlihatkan dan mempelajari gambaran jaringan.d.enSgtarunkztuart yang kaya akan lipid paling baik diperlihatkan pewarna yang larut-lipid untuk menghindari Mikroskopi Lapang-Teranglangkah persiapan seperti pengolahan dengan panas, xylene, Dengan mikroskop lapang-terang yang banyak digunakanatau,parafin, yang dapat membuang lipid. Sediaan bekudipulas dalam larutan alkohol yang teisaturasi dengan suatu mahasiswa histologi, sediaan yu\"g ,\"all, dipulas diperiksapewarna lipofilik seperti Sudan black. Zat warna larut dalam nM19a-:3imkl)gr.pouBusa\"nkggoimapdneatnnoegmprgdteuiikmrniatfeoakrktaadunsisrikbcaaaantghaiasacayn3haamsyyisaeit,nekymgiannil*seg\"nrmds.aa,e\".nm*Kbbooerprnntcdfiukeksnipcskeaoesmrrimubmceaeun_rt.droplet lipid sel dan struktur lain yang kaya_lipid, yangmenjadi terpulas hitam. Metode khusus untui menentukan cahaya yang menyinari obyek ying\"diJnati. Lensa objektiflokasi kolesterol, fosfolipid, dan glikolipid bermanfaat pada memperbesar dan meneruskan bayangan dari objek ke arahdiagnosis penyakit metabolik dengan ierjadinya akumulasi o,kular. Eyepiece atau lensa okular meriperbesar bayangan iniberbagai jenis lipid di dalam sel. Selain pemuLasan jaringan fdoatnogmraefmikp, roaytaeuks(ikuanntunykamkeenrdeatpinaatkapneng\"baumyaut,ngsuuraltuaigleiitrapie; nkg!dengan pewarna, teknik impregnasi logam yurlg biuruiyu detektor seperti kamera CCD (charged ci\"pia deoice). pem_menggunakan garam perak merupakan metode yang umumdalam memperlihatkan serat matiiks ekstrasel tertentu danelemen sel yang spesifik di jaringan saraf. Lama keseluruhan prosedur, mulai dari saat fiksasi sampaipengamatan jaringan di bawah mikroskop cahaya dapat me_ Sel gobiet Sel otot polos vili Epitel silinder penyerappokppDMGealaaieigryakdlnlioiranamhgosgaagaagbtnrkikklanaiaakaftHnnreor&iynpd7maEisran-onu't2ptigsdiena'sianitdedniPnila,ps.deeuspimKplelosaeeubplesdrialesmlausardgsatoukeiaofkanigunblaragilitaudeemaHnnartnbpgesMauyHmearlaauelp,anssdmigtitrknoepauamkedtnldosrgispambkiulesaeni,inilsltliisgkaanteol&irtindakn&y3aoujEao0npEo.0lsgraxoeoskJn.talsianeingtrniiinont(.rsHbg(opibltaEeeou)nrEt:pimlpl)'iyatureads/mkinnkmaayrglanmoaenglkteiaerlriarsesrkppfaesiluvlilmarl\"mm\"as,pis\"puegmi\"ekmd\"eourenbirsionaepgdgdhiuiiakaiiklanlt.mao-nspppureicrhdAsoahaaaStkn.iesfsifiDdliny(ipaaapp(eosunuArsajglauaSimthnsit)fi-g.dspbueaLeapnrkarlatidipukonteeitacsndrhaappge)tnnau-nsnldsgeacaapsnsknnieiattdejrrdueh(etpimnensAggmarilarSaianahtn)nidtnoburbgikuelsaagsnsiiiakutnlsuir.nsyekuaopkusrgruieknglliaahtktoounsoasrkdaplaiukunrkmsonay.tpgereai(AmadinannaSg_).:

HISTOLOGI DAN METODE PENGKAJIANNYA I 5besaran total diperoleh dengan mengalikan daya pembesaran okular tidak memperbaiki resolusi. Oleh sebab itu, bila kita membandingkan lensa-lensa objektif dengan pembesaranlensa objektif dan lensa okular. yang berbeda-beda, kita akan melihat bahwa mikroskop Faktor penentu dalam memperoleh bayangan yang tajam dengan pembesaran yang lebih kuat juga memiliki dayadan rinci dengan mikroskop cahaya adalah daya resolusinya, resolusi yang Iebih tinggi.yaitu jarak terkecil di antara dua partikel yang masih dapat Video kamera yang sangat sensitif meningkatkan dayamemperlihatkan kedua partikel tersebut sebagai objek terpisah'Daya resolusi maksimal mikroskop cahaya adalah sekitar 0,2 mikroskop lapang-terang dan mikroskop cahaya lain dan me- mungkinkan perolehan gambar yang dapat disimpan di dalampm; daya ini memberikan gambar yang baik dengan pem- komputer untuk analisis bayangan secara kuantitatif dan di-besaran 1000 sampai 1500 kali. Objek dengan ukuran yangiebih kecil atau lebih tipis dari 0,2 pm (misalnya, ribosom, cetak. Keterbatasan mikroskop cahaya telah berubah denganmembran atau filamen aktin) tidak dapat dibedakan dengan adanya kamera video yang sangat sensitif terhadap cahaya'alat ini. Demikian halnya, dua objek seperti mitokondria akan Dengan kamera dan program penaiam-gambar (contohnya,tampak sebagai satu objek bila letak keduanya berjarak kurang untuk memperkuat kontras), objek yang semula tidak tampak dengan mikroskop cahaya melalui lensa okular, dapat dilihatdari 0,2 prm. Kualitas gambar-kejelasan dan rincian- pada layar video. Sistem video ini juga bermanfaat untukbergantung pada daya resolusi mikroskop tersebut. Pem- mempelajari sel-sel hidup untuk waktu yang lama' karenabesaran hanya berguna bila disertai dengan daya resolusi yang sistem ini menggunakan cahaya berintensitas rendah sehinggatinggi. Daya resolusi sebuah mikroskop terutama bergantung akan menghindari kerusakan sel yang dapat timbul akibatpada kualitas lensa obiektifnya. Lensa okular hanya mem- pencahayaan yang intensif. Selain itu, perangkat lunak untukperbesar bayangan yang diperoleh dari lensa objektif; lensa analisis gambar memungkinkan pemeriksaan struktur mikros- kopis.Lensa okular Penoatur Mikroskopi Fluoresensi (eyepiece) anta;pupil Tab.ung Bila zat tertentu disinari cahaya dengan panjang gelombang yang sesuai, zat tersebut dapat memancarkan cahaya dengan binokuler panjang gelombang yang lebih panjang. Fenomena ini disebut fluoresensi. Pada mikroskopi fluoresensi, sediaan jaringan Kisi pengukur Pem sah berkas \" Struktur biasanya disinari dengan sinar ultraviolet (UV) dan emisinya(measuring graticule) penyangga terdapat dalam bagian spektrum cahaya-tampak. Zat fluoresen tampak sebagai partikel halus mengilap dengan latar belakang Bagian pemuiar lensa (stand) gelap. Dalam hal ini, diperlukan mikroskop dengan sumber (revolving nosepiece) cahaya ultraviolet yang kuat dan filter khusus yang menyeleksi .',.1 cahaya dengan berbagai panjang gelombang yang dipancarkan Lensa objektifPenahan spesimen f''Ji[)Ti,, oleh zat.Panel F [?J;'$\"\" Senyawa fluoresen yang memPunyai afinitas terhadap makromolekul sel, digunakan sebagai pewarna fluoresen. Kondensor : pencahayaan Salah satu contohnya adalah jingga akridiru yang dapat bergabung dengan DNA dan RNA. Bila diamati dengan Lensa lapang pandang mikroskop fluoresen, asam nukleat tersebut memendarkan (field fluoresensi yang sedikit berbeda sehingga lokasi asam-asam tersebut dapat ditentukan secara terpisah dalam sel (GambarDiafragma lapang Pandaog 1-4a). Senyawa lain seperti pulasan Hoechst dan DAPI secara (field diaphragm) spesifik mengikat DNA dan digunakan untuk memulas inti sel, yang melepaskan fluoresensi biru yang khas dengan sinar Lensa UV Aplikasi penting lainnya dari mikroskopi fluoresensi Mekanisme translasi X-Y adalah dengan menggabungkan zat fluoresen dengan molekul penanda yang secara spesifik terikat pada komponen sel Lampu tertentu sehingga memungkinkan pengenalan struktur ter- halogen sebut dengan mikroskop (Gambar 1-4b). Aniibodi yang dilabel tungsten dengan senyawa fluoresen sangat penting pada pemulasan histokimiawi. (lihat Metode Deteksi dengan Interaksi SpesifikGambar 1-3. Komponen dan jalur cahaya pada mikroskoplapang-terang. Fotograf mikroskop cahaya lapang-terang yang antar Molekul).memperlihatkan komponen-komponen utamanya dan jalur cahaya Mikroskopi Fase Kontras & Mikroskopidari lampu di bawah stage mekanis ke mata pengamat Sistem lnterferens Diferensialoptis memiliki tiga set lensa: suatu kondensor, set lensa objektif,dan satu atau dua lensa okular. Kondensor mengumpulkan dan Susunan optik tertentu memungkinkan observasi sel danmemfokuskan cahaya, yang membentuk suatu kerucut cahaya sediaan jaringan yang tidak terpulas. Spesimen biologis yangyang menyinari kaca objek jaringan pada stage tersebut' Lensa tidak terpulas umumnya transparan dan sukar dilihat secaraobjektif memperbesar dan memproyeksikan bayangan objek yang detil, karena semua bagian spesimen memiliki densitas optikdisinari dalam arah lensa okular. Untuk studi histologis rutin, lensa yang hampir sama. Namun, mikroskop fase-kontras mem-objekiif yang memiliki tiga pembesaran berbeda umumnya di-gunakan: 4x untuk pengamatan dengan pembesaran lemah untuk punyai sistem lensa yang menghasilkan bayangan yang terlihatarea (lapang) jaringan yang besar; 10x untuk pembesaran medium dari objek transparan (Gambar 1-5).lapang yang lebih kecil; dan 40x untuk pembesaran kuat area yanglebih detail. Lensa okular selanjutnya memperbesar bayangan ter-sebut 10x dan memproyeksikannya ke retina pengamat, sehinggamenghasilkan pembesaran total 40x, 100x, atau 400x' (Atas izindari Nikon lnstruments.)

6 I BABll.i;;;r; ;;;;;sfRsmtGleeuearepoallninerhgmieagraitsniitbkejRaaddnaileestsryknnif,i,ags7lainaDlt-nmagn4NdseA'ikmanumGniirnkaaiaakrtniomkrUogsmtbifnkniealopiavnrpamelagidnrneesatfillnituutsysaodeeyrraSkalle-nacnssdnhgeedeolninplwoetsgeulabtarlroiash(nnfasea)Mbbm:dekueeSuistdknenaimrgcliornigadnesgineinmk,tjboDaepapBlrAeagylrPonialafiogIlhnnumag(od4ttiaenrk'd,enp6gaipsi-tnosduesinilwtanaeo.m)slsapmirli.dannuesoaKdmn-zaogfal-hamupnoryptrreeijoeinrnnnsliygiehe[tgin\"annaytso.siuoae(blGkelria)raiddukmaianldynba,aaamynnnraNgnbf1Aigilm-aa4tkmmeabanm,eeangnnptiag-ksaaisaekkktraiitzktnDi\"rnegnaNmstdAdeaea,rmrrplaridiunhaDnlaaanutrnsskdn.tdaeeiclteaanaltnarug.igi.arDjaiennengnpEggsh.aeaaw.nnlloay(mbiladc)wii:zknaarB,okisyaydkaakaonanpngng Prinsip mikroskop fase-kontras adalah berdasarkan ke- titik fokus lensa, dan lubang kecil detektor, kesemuanyanyataan bahwa kecepatan cahaya akan berubah ketika me- terkonjugasi atau tersusun secara optik satu dengan lainnyanerobos strukfur sel dan ekstrasel dengan indeks refraksi yang pada bidang fokus (konfokal) dan .ihuyu yang tidak terfokusberbeda-beda. Perubahan tersebut digunakan oleh sistem fase_ tidak melewati lubang kecil tersebut. Fiul lerseb.rt sangatkontras sehingga struktur-struktur terlihat relatif lebih terang memperbaiki resolusi objek pada fokus dan memungkinklanatau lebih gelap satu sama 1ain. Karena tidak memerlukan lfe:nbeihtabpeasnar lokasi komponen spesimen dengan ketelitiin yangfiksasi atau pemulasary mikroskopi fase-kontras me, ketimbang dengan mikroskop lJpang_terang.mungkinkan pengamatan kultur jaringan dan sel-sel hidup, Kebanyakan mikroskop konfokal mencakuf suatu sistem cermin yang dikendalikan komputer (pemisahberkas) untukdan mikroskop semacam itu menjadi alat yang penting ii menggerakkan titik iluminasi melalui spesimen secara cepat dan automatis. Bayangan digital yang iitangkap di banyaksemua laboratorium ku1fur sel. Cara lain untuk mengamati sel titik pada suatu, bidang fokus yang iangat t.-ipli digunaianatau sediaan jaringan yang tidak terpulas adalah dengan untuk menghasilkan suatu,irisan optik, bidang ie.sebut. Selainmikroskop interferens diferensial Nomarski, yang meng_ mitue, lpaelumi bsepnetsuikmaenniritsearnseobputtikmpeamdaunsegrkainnkgakna[nirisbaidnantgersfoekbuusthasilkan bayangan tiga-dimensi yang lebih nyati tcelimUar! direkonstruksi secara digital menjadibuyurlgur-, tiga,dimensi.dengan mikroskopi fase-kontras rutin lGambai 1-5). Fitur penting mikroskop konfokal diperlihatkan pada GambarMikroskopi Konfokal 1-6.Dengan mikroskop lapang-terang biasa, berkas cahaya relatif Mikroskopi Polarisasibesar dan mengisi spesimen. Sebaran cahaya mengurangi Mikroskopi polarisasi memungkinkan terlihatnya strukfur_kontras di dalam bayangan dan membentuk daya resoluii struktur yang dibentuk oleh molekul yurlg ,ur-rgut rumit. Bila cahaya normal melewati filter polarisasi (sep-erti polaroid),pleennsyae_boabrajenktcifa. hMayikarodsaknopmieknognhfaoskialklamn ernegsionlduasiriyatenrjgadleinbyiha cahaya tersebut akan bervibrasi hanya dalam safu arah. Jikabesar dengan menggunakan (1) titik kecil cahaya berintensitastinggi yang dihasilkan oleh laser dan (2) suatu lempeng denganlubang kecil di depan detektor bayangan. Sumbeititik cahiya,

HISTOLOGI DAN METODE PENGKAJIANNYA I 7rlrelrtyn.:*L* l- 9rit^,/.i.;:*'', -' i {i-','r\Gambar 7-5, Gambaran sel-sel yang tidak terpulas dengan tiga jenis mikroskop cahaya. Sel-sel krista neuralis (neural crest cells)yang tumbuh berupa sebuah lapisan dalam biakan tampak berbeda dengan berbagai teknik mikroskopi cahaya. Sel-sel tersebut tidakdipulas, dan sel yang sama, termasuk dua sel pigmen yang berdiferensiasi, muncul di setiap foto. (a): Mikroskop lapang-terang: tanpafiksasi dan pemulasan, hanya dua sel pigmen yang dapat dilihat. (b): Mikroskop fase kontras: tepi sel, inti, dan struktur sitoplasmadengan indeks refraksi yang berbeda memengaruhi sinkronisasi cahaya secara berbeda dan menghasilkan bayangan tersebut di semuasel. (c): Mikroskop interferens diferensial: detail sel ditonjolkan secara berbeda dengan menggunakan optik Nomarski. Mikroskopi fasekontras, dengan atau tanpa mikroskop inteferens, digunakan secara luas untuk mengamati sel hidup yang tumbuh di biakan jaringan.Semua dengan pembesaran 200x. (Atas izin dari Sherry Rogers, Department of Cell Biology and Physiology, University of New Mexico.)filter kedua diletakkan di dalam mikroskop di atas filter yang kumparan listrik yang dapat dianggap sebagai 'lensa'elektro-pertama dengan sumbu utamanya yang tegak lurus terhadapsumbu fi1ter pertama, tidak akan ada cahaya yang iewat. Akan magnetik.tetapi, jika struktur jaringan dengan molekul terorientasi ter- Lensa pertama adalah suatu kondensor yang memfokuskandapat di antara dua filter polarisasi, struktur repetitif molekultersebut akan mengitari (rotasi) sumbu cahaya yang keluar berkas elektron pada sediaan. Sebagian elektron berinteraksidari poiarisator dan tampak sebagai struktur terang denganlatar belakang yang gelap (Gambar 1-7). Kemampuan merotasi dengan atom-atom di dalam sediaan dan mengubah per-arah vibrasi cahava terpolarisasi disebut birefringensi jalanannya, sedangkan sebagian lagi melalui spesimen tanpa berinteraksi. Elektron yang melewati spesimen mencapai lensa(birefringence) dan merupakan karakteristik zat berkristal atau objektif, yang membentuk suatu bayangan vang diperbesarzat yang rnengandung molekul dengan susunan yang sanEiat dan terfokus, yang kemudian diperbesar lagi melalui lensaterorientasi, misalnya selulosa, kolagen, mikrotubulus, dan lain dan tertanp;kap pada layar monitor. Bayangan spesimenmikrofilamen. memperlihatkan area berwarna putih, hitam dan abu-abu yang menyatakan area yang mudah dilalui elektron (tampak terangNNIKROSKOPI ELEKTR.ON atau electron lucent) dan area tempat elektron diserap atau dibiaskan (terlihat gelap atau electron dense).Mikroskop elektron transmisi dan mikroskop elektron pe-mindai bekerja berdasarkan interaksi elektron dengan kom- Agar dapat terjadi interaksi yang baik antara spesimen danponen jaringan. Panjang gelombang pada berkas elektron jauh elektron, mikroskopi elektron memerlukan sediaan yangIebih pendek ketimbang panjang gelombang cahaya sehingga sangat tipis (40-90 nm); karena itu, pemendaman dikerjakanmemungkinkan peningkatan resolusi ribuan kali lipat. dengan larutan plastik epoksi keras dan pemotongan di- kerjakan dengan pisau kaca atau intan. Sediaan yang sangatMikroskopi Elektron Transmisi tipis tersebut dikumpulkan pada kisi-kisi logam dan di-Mikroskop elektron transmisi (TEM, trnnsmission electronmicroscope) adalah sebuah sistem pembentuk bayangan yang pindahkan ke bagian interior mikroskop untuk dianalisis.memungkinkan resoiusi sekitar 3 mm (Gambar 1-8a). Resolusi Teknik pembekuan (fraktur beku, cryofracture, freezetinggi ini memunp;kinkan pembesaran sampai 400.000 kali etched) yang dikombinasi dengan mikroskopi elektron sangatuntuk melihat secara rinci. Sayangnya, Pembesaran demikian berguna untuk memeriksa strukfur membran. Spesimenhanya berlaku untuk molekul atau partikel yang terisolasi.Irisan jaringan yang sangat tipis dapat diamati secara rinci jaringan yang sanpiat kecil cepat dibekukan dalam nitrogendengan pembesaran sampai sekitar 120.000 kali. cair dan dipatahkan dalam suatu ruang hampa dengan pisau. Suatu replika permukaan yang masih beku dihasilkan dengan Fungsi TEM berdasar pada prinsip bahwa berkas elektron menaruh lapisan tipis uap karbory platinum atau- atom 1ain.dapat dibiaskan oleh medan elektromagnetik dengan cara Jaringan kemudian dilarutkan dan replika permukaan tersebutyang serupa dengan pembiasan cahaya dalam lensa kaca. diperiksa dengan mikroskop elektron pemindai. Bidang patah-Berkas elektron dihasilkan oleh suatu katoda di bagian atas an yang acak sering memisahkan lapisan ganda-lipid membran, alat dan melewati ruang ke dalam suatu ruang hampa. Karena dan memaparkan protein dengan ukuran, bentuk dan distri-elektron berubah arah ketika berada dalam medan elektro- busi yang kemudian dapat dipelajari. magnetik, berkas tersebut dapat difokuskan dengan melalui Mikroskopi Elektron Pemindai (SEM, Scanning Electron Microscopyl Mikroskopi elektron pemindai memungkinkan pandangan pseudo-tiga-dimensi dari permukaan sel, jaringan dan organ.

8 I BAB,1 MDetektor ffiw$ffi Sumber laser * -1r:T Pemindai 1.r:,ij11 ir'iij.,!: r :i:lttr:ll llijl: ir!li:i rj1,.]f:+ ,*tii,,]fi, Bidang lain yang beradaGambar 7-6. Prinsip mikroskop konfokal. Meskipun suatu titik Gambar 7-7. Gambaran jaringan dengan mikroskop lapang-cahaya yang berasal dari satu bidang irisan mampu menembus terang dan polarisasi. Mikroskop cahaya polarisasi menghasilkanlubang kecil (pinhole) dan mencapai detektor, berkas cahaya gambar material yang memiliki struktur makromolekul periodiklainnya tertahan oleh lempeng penutup. Jadi, hanya satu bidangtipis spesimen yang difokuskan pada satu waktu. Diagram mem- yang berulang; gambaran tanpa struktur semacam itu tidak terlihat.perlihatkan susunan praktis suatu mikroskop konfokal. Cahaya Pada gambar ini, tampak sepotong mesenterium tipis yang dipulas dengan pikrosirius merah, orsein, dan hematoksilin, dan lalu di_dari sumber laser menerpa spesimen dan dipantulkan. Sebuah pe-misah berkas mengarahkan cahaya yang dipantulkan ke lubang letakkan secara langsung pada suatu kaca objek dan diamatikecil dan detektor. Cahaya dari komponen spesimen yang berada dengan mikroskop lapang{erang dan polarisasi. (a): Dengandi atas atau di bawah bidang fokus ditahan oleh suatu penutup. mikroskop lapangterang biasa, serat kolagen tampak merahLaser memrndai spesimen sehingga area spesimen yang diamatidapat lebih luas. dengan serat elastin yang tipis dan gelap serta inti sel. (b): Dengan mikroskop polarisasi, hanya serat kolagen yang dapat terlihat danSeperti TEN! mikroskop ini menghasilkan dan memfokuskan serat ini menunjukkan birefringensi kuat dan tampak merah atauberkas elektron yang sangat halus, tetapi berkas elektron dialat ini tidak menembus spesimen (Gambar 1-8b). Alih-alih, kuning terang; serat elastin dan inti sedikit memiliki strukturpermukaan spesimen pertama-tama dikeringkan dan dilapisidengan suatu lapisan tipis atom logam yang tidak mudah makromolekular yang terorientasi sehingga tidak terlihat,ditembus elektron. Ketika berkas dipindai dari satu titik ketitik lain melalui spesimery berkas tersebutberinteraksi dengan Metabolit yang terlabel secara radioaktif (nukleotida, asamatom logam dan menghasilkan elektron yang dipantulkan atau amino) dan bergabung dengan makromolekul melepaskanelektron sekunder yang dilepaskan dari logam tersebut. radiasi lemah yang terbatas pada regio selular tempat molekulElektron tersebut ditangkap oleh suatu detektor dan sinyal tersebut berada. Sediaan jaringan atau sel yang terlabelyang terbenfuk diproses untuk menghasilkan bayangan hitam- radioaktif diletakkan dalam ruang gelap dengan emulsiputih pada monitor. Bayangan SEM biasanya mudah dipahami fotografik yang mengandung kristal perak bromida, yang be-karena bayangan tersebut menyajikan gambar yang tampak kerja sebagai mikrodetektor radiasi tersebut dengan cara yangseperti disinari dari atas, seperti halnya dunia makroskopik sama seperti mikrodetektor yang berespons terhadap cahayakita yang dipenuhi oleh cahaya dan bayangan yang terbentuk pada film fotografik yang umum digunakan. Setelah diletakkanakibat penyinaran dari atas. dalam kotak yang terlindung dari cahaya dalam waktu cukup lama, slide dibuat secara fotografi. Kristal perak bromida yangAUTORADIOGRAFI tereduksi oleh radiasi dikurangi menjadi butiran hitam perak kecil, yang mengindikasikan lokasi makromolekul yangAutoradiografi adalah suatu metode untuk menentukan lokasi terlabel dengan radioaktif di jaringan. prosedur umum tersebut dapat digunakan pada persiapan mikroskopi cahaya dan TEMmakromolekul yang baru disintesis (DNA, RNA, protein,glikoprotein dan polisakarida) di se1 atau sediaan jaringan. (Gambar 1-9). Banyak informasi yang dapat diperoleh melalui auto- radiografi sel atau jaringan. Jadi, jika suatu asam amino radioaktif digunakan, sel jaringan yang menghasilkan banyak

HISTOLOGI DAN METODE PENGKAJIANNYA I 9 Penembak elektron II- penembak \"'\"*'\"Lensa kondensor Kisi-kisi tembaga LensaKumparan listrik dengan 3 irisan sediaanLensa objektif Kumparan listrikLensa intermedia Penahan spesimen KolomLensa proyektor Jendela kaca Penguat sinyalLayarfluoresenFilmfotografika MonitorGambar 1-8. Mikroskop elektron. Mikroskop elektron merupakan instrumen besar yang biasanya diletakkan dalam fasilitas mikroskopelektron yang khusus. (a): Gambaran skematis mikroskop elektron transmisi (TEM) dengan lensanya dan jalur berkas elektron. Dengankeseluruhan kolum mikroskop dalam suatu ruang hampa, elektron dilepaskan dengan memanaskan suatu filamen (katoda) logam(biasanya tungsten) yang sangat tipis\" Elektron yang terlepas kemudian diberikan perbedaan tegangan sebesar 60-1 20 kV antara katodadan anoda, yang merupakan suatu lempeng logam dengan lubang di tengahnya. Jadi, elektron tertarik ke anoda, yang terakselerasidengan kecepatan tinggi, dan membentuk berkas elektron ketika elektron tersebut melalui lubang sentral di anoda. Ketika melaluikumparan listrik, berkas elektron dibiaskan dengan cara yang agak analog dengan efek lensa optik terhadap cahaya, karena jalur elektronberubah ketika elektron tersebut terpapar dengan medan elektromagnetik. Konfigurasi TEM serupa dengan konfigurasi mikroskop cahaya. Lensa pertama merupakan suatu kondensor yang memfokuskanberkas elektron pada irisan jaringan. Beberapa elektron berinteraksi dengan atom irisan tersebut dan melanjutkan perjalanannya,sementara yang lain menembus spesimen tanpa berinteraksi. Kebanyakan elektron mencapai lensa objektif, yang membentuk perbesaranbayangan yang kemudian diprojeksikan melalui lensa pembesar lainnya. Karena mata manusia tidak sensitif terhadap elektron, bayangantersebut diprojeksikan ke suatu layar fluoresensi atau terdeteksi oleh lempeng fotografik atau suatu kamera CCD. Dengan TEM, area spesimen yang dapat dilalui elektron tampak terang (electron lucent), sementara area yang padat atau mengikatlogam berat selama pembuatan atau 'pemulasan' spesimen menyerap atau membiaskan elektron dan terlihat gelap (electron dense).Jadi, bayangan semacam itu selalu terlihat hitam, putih atau abu-abu. (b): Gambaran skematis mikroskop elektron pemindai (SEM) dengan sejumlah besar kemiripan dengan TEM. Namun, pada gambarini, berkas elektron yang difokuskan oleh lensa elektromagnetik tidak melalui spesimen, tetapi digerakkan secara berurutan (dipindai) darisatu titik ke titik lain melalui permukaannya yang serupa dengan pemindaian berkas elektron melalui suatu tabung televisi. Spesimensebelumnya dilapisi oleh suatu lapisan atom logam yang sangat tipis dan berkas tersebut berinteraksi dengan atom-atom tersebut, danmenghasilkan elektron yang dipantulkan dan elektron sekunder yang baru dilepaskan. Semua elektron tersebut ditangkap oleh suatudetektor dan ditransmisikan ke penguat dan perangkat lain yang membentuk suatu sinyal ke layar tabung sinar katoda, dan menghasilkanbayangan hitam-putih. SEM hanya menunjukkan gambaran permukaan spesimen yang dilapisi, tetapi dengan kualitas tiga-dimensi yangmencolok. Bagian dalam organ atau sel dapat dianalisis dengan mengirisnya untuk memaparkan permukaan internalnya.protein dan sel yang sedikit menghasilkan protein akan dike- sepanjang percobaary akan menunjukkan migrasi proteintahui, karena jumlah butiran perak yang terbentuk di atas sel radioaktif. Jika seseorang ingin mengetahui tempat pembentuk- an sel yang baru di dalam organ dan arah migrasinya, sejumlahsebanding dengan intensitas sintesis protein. Jika prekursor hewan akan diberi suntikan timidin radioaktif dan jaringannya dikumpulkan pada waktu yang berbeda setelah penyuntikan.DNA radioaktif (seperti timin radioaktif) digunakan, kita Autoradiografi sediaan tersebut akan menunjukkan tempat pembelahan sel-sel dan arah sel-sel tersebut bermigrasi.dapat mengetahui sel dalam jaringan (dan jumlahnya) yang KULTUR SEL & JARINGANsiap untuk membelah. Peristiwa dinamis dapat pula dianalisis. Sel-sel dan jaringan hidup dapat dipertahankan dan dipelajariMisalnya, jika seseorang ingin mengetahui tempat protein di luar tubuh. Pada organisme yang kompleks, jaringan dandihasilkan di dalam sel, dan jalur yang diikuti di dalam selsebelum protein tersebut disekresikan, sejumlah hewan akandiberi suntikan asam amino radioaktif dan jaringan dikumpul-kan beberapa saat setelah penyuntikan. Autoradiograf darisediaan-sediaan, yang diambil pada waktu yang berbeda

10 / BABl L yi .;ABt -- *; t'.'Gambar 7-9' Autoradiografi. Autoradiograf merupakan sediaan jaringan dengan partikel (yang disebut bubuk perak) yang meng-indikasikan daerah sel dengan makromolekul spesifik yang disintesis sesaat sebelum fiksasi. Prekursor seperti nukleotida, asam aminoatau gula dengan isotop yang menggantikan atom spesifik diberikan ke jaringan dan setelah melalui periode penggabungan, jaringandifiksasi, diiris dan diletakkan pada kaca objek atau kisi-kisi TEM seperli biasa. Pemrosesan tersebut membuang semua prekursor yangterlabel dengan zat radioaktif, dan hanya menyisakan isotop pada makromolekul yang terfiksasi. Di suatu ruang gelap, kaca objek dilapisidengan selapis tipis zat kimiawi, seperti kaca objek pada film fotografik dan dikeringkan. Di sebuah kotak hitam, isotop pada makromolekulyang baru disintesis melepaskan radiasi yang memaparkan lapisan zat kimiawi fotografik yang tepat berdekatan dengan lokasi ,isotop'.Area kecll yang terpapar zat kimiawi pada lapisan fotografik diperlihatkan sebagai bubuk perak dengan 'melakukan, persiapan seolah-olahlapisan tersebut yangdisuntik dengan adalah film, B jam diikuti dengan pemeriksaan mikroskop. Gambar ini memperlihatkan kelenjar submandibula mencit yang 3H-fukosa sebelum disuntrkkan. Fukosa bergabung dengan oligosakarida dan hasilnya memperlhatkan lokasiglikoprotein yang baru disintesis yang mengandung gula tersebut. (a): 'Butiran perak' hrtam yang terlihat pada daerah granuja sekretorikdan duktus yang mengindikasikan lokasi glikoprotein. 1500x. (b): Jaringan yang sama yang disiapkan untuk autoradiografi TEM mem-perlihatkan butir perak dengan gambaran bergelung atau amorf yang berlokasi di granula tersebut (G) dan di lumen kelenjar (L). 7500x.(Gambar 1-9b, atas izin dari Ticiano G. Lima danA.Antonio Haddad, School of Medicine, Ribei16o preto, Brazil.)organ dibentuk oleh beberapa jenis se1. Sel-sel ini bermandikan disimpan dan dimetabolisme di dalam kompartemen spesifik sel tersebut menjadi sebuah pendekatan baru untuk memahamiplasma darah, vang mengandung ratr-lsan molekul yang ber- kompartemen-kompartemen ini, baik secara strukfural mau-beda-beda. Biakan se1 dan jaringan sangat menolong kita pun fisiologis. Teknik-teknik histologi laln yang dipakai untuk sel biakan sangat penting untuk memahami lokasi dan fungsimengisolasi efek sebr-rah molekul terhadap satu jenis sel atau mikrotubulus, mikrofilamen, dan komponen sitoskeleton lain-jaringan. Biakan sel dan jaringan juga memungkinkan peng- nya.amatan langsung terhadap perilaku sel hidup dengan APLIKASIMEDISmikroskop fase-kontras. Banyak eksperimen yang tidak dapatdilakukan pada he'lr.an hidup, dapat dilakukan secara in aitrLt. Biakan set digunakan secara luas untuk mempelajari Sel dan jaringan ditumbuhkan dalam larrtan kompleks metabolisme sel normal dan sel kanker serla pe-yang diketahui komposisinya (garam, asam amino, vitamin)yang ditambahkan dengan komponen serum atau faktor ngembangan obalobat baru. Teknik ini juga bermanfaat dalam meneliti parasit yang hanya tumbuh di dalam set,pertumbuhan yang spesifik. Dalam menyiapkan biakan dari seperti virus, mikoplasma, dan beberapa protozoa. padajaringan atau organ, sel-sel harus diuraikan terlebih dahulu peneliti an sitoge netik, pe netapan kariotipe m anusia (jumlahsecara mekanis atau enzimatis. Setelah diisolasi, sel dapat dan morfologi kromosom seseorang) terjadi melalui pem-dikembangbiakkan pada cawan Petri tempat sel tersebut biakan singkat sel darah atau fibroblas dan dengan me- meriksa kromosom selama pembelahan mitosis. Selainmelekat, yang biasanya berupa selapis sel (Gambar 1-5). Biakan itu, biakan sel berperan penting dalam teknik kontemporer biologi molekular dan teknologi DNA rekombinan.sel yang diisolasi dengan cara ini disebut biakan sel primer.Banyak jenis se1 yang pernah diisolasi dengan caia ini dari HISTOKIMIA & SITOKIMIAjaringan normal atau patologis dan sejak saat itu telah Istilah histokimia dan sitokimia terutama digunakan untuk menunjukkan metode penetapan lokasi strukfur sel dalamdipertahankan secara ln rilro karena sel-sel tersebut telah sediaan jaringan dengan menggunakan aktivitas enzimatikdipertahankan dan menghasilkan garis keturunan sel yang yang khas di strr-rktur tersebut. Untuk mempertahankanpermanen. Kebanyakan sel yang diperoleh dari jaringannormal memiliki batas rentang hidup yang terprogram secara enzim-enzim tersebut, prosedur histokimia biasanya diterap- kan pada jaringan yang tidak terfiksasi atau sedikit terfiksaii,genetik. Akan tetapi, perubahan'perubahan tertentll (beberapa yang sering dipotong pada suatu cryostat untuk menghindari efek simpang panas dan parafin terhadap aktivitas enzimatik.perubahan berhubungan denp;an onkogen; lihat Bab 3), dapatmenimbulkan imortalitas sel, yakni suatu proses yang disebuttransformasi, yang mirip dengan perubahan awal suatu selnormal menjadi sel kanker. Karena perbaikan teknologi biakan,kebanyakan jenis sel kini dapat dipertahankan di laboratorium.Semua prosedur dengan se1 dan jaringan hidup harusdilakukan di daerah yang steril dengan larutan dan alat yangsteril untuk menghindari kontaminasi oleh mikroorganisme. Seperti terlihat pada bab berikutnya, inkubasi sel hidup lnz,lfrc dengan berbagai macam senyawa fluoresen baru yang

IHISTOLOGI DAN METODE PENGKAJIANNYA 11Histokimia enzim biasanya bekerja sebagai berikut: (1) sediaan METODE DETEKSI DENGAN INTERAKSI SPESIFIK ANTARjaringan dicelupkan dalam larutan yang mengandung substrat MOLEKULenzim yang lokasinya akan ditentukan; (2) enzim tersebut Suatu molekul yang spesifik dalam sediaan iaringan dapatdibiarkan bekerja pada substratnya; (3) pada tahap ini atau diidentifikasi dengan menggunakan senyawa atau makro-pada tahap lebih lanjut, sediaan diberi senyawa penanda; (4) molekul terlabel yang secara spesifik berinteraksi dengan zatsenyawa ini bereaksi dengan suatu molekul yang terbentuk yang ingin diperiksa (Gambar 1-11). Senyawa yang akan ber-akibat kerja enzimatik pada substrat tersebut; (5) produk akhir interaksi dengan molekul tersebut harus diberi suatu labelreaksi tersebut, yang tidak larut dan tampak dengan mikroskopcahaya atau mikroskop elektron hanya jika dipulas atau padat .$ tuelektrory akan mengendap di tempat yang mengandung tF: ,qfrenzim. Sewaktu kita mengamati sediaan demikian dengan tmikroskop, kita akan melihat sel-sel (atau organel) yang iditutupi oleh zat warna atau zat padat-elektron. Beberapa contoh enzim yang dapat dideteksi secara {i,histokimiawi adalah sebagai berikut: #if' trd Fosfatase mengurai ikatan antara gugus Iosfatase dan Ii sresidu alkohol dari molekul yang terfosforilasi. Hasil reaksifosfatase, yang tidak larut dan berwarna, umumnya berupa * &plumbum fosfat atau plumbum sulfida. Fosfatase alkali, yang s 9beraktivitas maksimum pada pH alkali dan fosfatase asam F *'r #dapat dideteksi (Gambar 1-10). s Dehidrogenase melepaskan satu hidrogen dari satusubstrat dan memindahkannya ke substrat yang lain. Sepertifosfatase, dehidrogenase berperan penting pada berbagaiproses metabolik. Dehidrogenase dideteksi secara histokimiawidengan menginkubasi sediaan jaringan yang tidak difiksasidalam larutan substrat yang mengandung suatu molekul yangmenerima hidrogen dan mengendap sebagai senyawa ber-warna yang tidak larut. Mitokondria dapat secara spesifikdiidentifikasi dengan metode ini karena dehidrogenase me-rupakan enzim kunci pada siklus asam sitrat (Krebs) di organel ini. Peroksidase, yang terdapat dalam beberapa jenis sel, meningkatkan oksidasi substrat tertentu dengan pemindahan ion hidrogen ke hidrogen peroksida, yang membentuk molekul air. Dengan cara ini, sediaan jaringan yang difiksasi secara memadai, diinkubasi dalam suatu larutan yang mengandunghidrogen peroksida dan 3,3'-diaminoazobenzidin (DAB). Dengan adanya peroksidase, senyawa terakhir ini dioksidasi, yang menghasilkan endapan coklat, padat-elektron, dan tidaklarut, yang memr-rngkinkan PenetaPan lokasi aktivitasperoksidase dengan mikroskop cahaya dan mikroskop elektron. Pulasan peroksidase dalam sel-sel darah putih penting untuk mendiagnosis leukemia tertentu. Karena peroksidase sangat aktif dan dapat menghasilkan cukup banyak endapan tak-larut dalam waktu singkaf peroksidase juga digunakan secara luas untuk apiikasi praktis penting lainnya: memberi protein senyawa lain, yang akan dijabarkan di bagian berikut.'':*qill$gl rfg0l$ ,.'. 'r ., \". t 'i'l r', ' Gambar 1-10. Histokimiawi enzim. (a): Mikrograf potonganBanyak prosedur histokimia sering dipakai dalam melintang tubulus ginjal yang diproses secara histokimiawi dengandiagnosis laboratorium, seperii reaksi pruss/a Perl untuk metode Gomori untuk fosfatase alkali memperlihatkan tingginyabesi (digunakan untuk mendeteksi penyakit penimbunanbesi hemokromatosis dan, hemosiderosis), reaksi PAS- aktivitas enzim tersebut pada permukaan apikal sel di lumen tubulus tersebut (panah). (b): Gambaran TEM dari sel ginjalam i I a se d a n b i ru al ci a n u ntu k gl ikoge n dan gl i kosa m i n ogl i kan(untuk mendeteksi glikogenosis dan mukopolisakaridosis), dengan lokasi fosfatase asam yang ditentukan secara histokimiawidan reaksi untuk lipid dan sfingolipid (untuk mendeteksi di tiga lisosom (Ly) di dekat inti (N). Maieri gelap di dalam struktursfingolipidosis). tersebut adalah plumbum fosfat yang mengendap di tempat dengan aktivitas fosfatase asam. 25.000x. (Gambar 1-10b, atas izin dari Eduardo Katchburian, Department of Morphology, Federal University of S5o Paulo, Brazil.)

12 / BAB1 (ilJ /oGA )IB Phalloidin adalah suatu senyawa yang diekstraksi dari /-\ sejenis jamur (Amnnita phnlloldes) dan berinteraksi kuat dengan 1:1 aktin. Karena umumnya diberi label pewarna, phalloidin biasanya digunakan untuk memperlihatkan filamen aktin sel. ((- (4u^=Y)) l) -> Protein A diperoleh dari Staphylococcus fiureus dan terikatJ pada daerah Fc molekul imunoglobulin (antibodi). fadi, protein Ayang sudah diberi label dapat digunakan untuk menentukan lokasi antibodi alami atau antibodi yang terikat pada struktur sel. Lectin adalah protein atau glikoprotein yang terutama berasal dari biji tumbuh-tumbuhan dan terikat pada karbo, hidrat dengan afinitas dan spesifisitas besar. Berbagai lectin terikat pada gula spesifik atau pada deretan residu gula. Lectinlectin tersebut terikat pada glikoproteiry proteoglikan dan glikolipid dan banyak dipakai untuk menandai molekul membran yang mengandung deretan residu gula yang spesifik. Gambar 1-17. Pelabelan dengan interaksi spesifik yang ber- lmunohistokimiaafinitas-tinggi. Senyawa atau makromolekul yang mempunyai afinitas spesifik terhadap sel atau makromolekul tertentu dapat Suatu interaksi yang sangat spesifik antar molekul adalah diberi suatu label dan digunakan untuk mengenali komponen ter- interaksi yang terjadi di antara antigen dan antibodinya. Oleh sebut dan menentukan lokasinya di sel dan jaringan. (1) MolekulA sebab itu, metode yang menggunakan antibodi berlabel ter- mempunyai afinitas kuat dan spesifik terhadap bagian molekul B. nyata sangat berguna untuk memperlihatkan dan menenfukanContoh makromolekul yang berinteraksi semacam itu adalah letak protein spesifik, dan tidak hanya protein dengan aktivitasantibodi yang mengenali antigen spesifik, biasanya protein, atau enzimatik yang dapat diperlihatkan oleh metode histokimia.suatu segmen DNA untai tunggal yang bersifat komplementer se- Tubuh memiliki sel yang mampu membedakan molekulnyacara spesifik menurut sekuens dengan molekul RNA di sel. Molekul sendiri (selfl dari molekul asing. Bila terpajan dengan molekulAjuga dapat berupa senyawa kecil seperti phalloidin, yang secaraspesifik mengikat filamen aktin, atau suatu protein seperti ,protein asing-disebut antigen-tubuh dapat berespons denganAyang mengikatsemua imunoglobulin. (2) BilaAdicampurdenganB, A akan terikat pada bagian B yang dikenalinya. (3) Molekul A menghasilkan antibodi yang bereaksi secara spesifik dan ier_dapat diberi suatu label yang dapat diperlihatkan dengan mikroskop ikat pada antigen sehingga membantu menyingkirkan zat asing. Antibodi adalah protein dari famili imunoglobulincahaya atau mikroskop elektron. Label tersebut dapat berupasebuah senyawa fluoresen, sebuah enzim seperti peroksidase, pada glikoprotein, yang dihasilkan limfosit.partikel padafelektron, atau suatu radioisotop. (4) Jika molekul Bterdapat di dalam sel atau matriks ekstrasel yang diinkubasi Pada imunohistokimia, sediaan jaringan (atau sel dalamdengan molekulAberlabel, molekul B dapatdideteksi dan lokasinya biakan) yang diduga mengandung protein tertentu, diinkubasi dalam larutan yang mengandung antibodi terhadap proteinditentukan dengan memvisualisasikan molekul A yang terikat tersebut. Antibodi terikat secara spesifik pada protein, yang lokasinya kemudian dapat dilihat dengan mikroskop .u-huyipadanya. atau mikroskop elektrory bergantung pada jenis senyawa yang digunakan untuk memberi label antibodi tersebut. Antibodiyang dapat dideteksi di bawah mikroskop cahaya atau elektron. umumnya dilabel dengan senyawa fluoresensi, dengan perok_Label yang paling banyak dipakai adalah senyawa fluoresensi sidase atau fosfatase alkali untuk pendeteksian histokimiawi,(yang dapat dilihat dengan mikroskop fluoresensi atau laser),atom radioaktif (yang dapat dideteksi dengan autoradiografi), atau dengan partikel emas yang padat-elektron.molekul peroksidase atau atau enzim lain (yang dapat di- Salah satu syarat terpenting unfuk imunositokimia adalahdeteksi dengan histokimia), dan partikel logam (biasanya tersedianya antibodi terhadap protein yang akan dideteksi.emas), yang dapat diamati dengan mikroskop cahaya danmikroskop elektron. Metode pemeriksaan tersebut dapat di- Artinya, protein itu sebelumnya harus telah dimurnikangunakan unfuk mendeteksi dan menenfukan lokasi gula, dengan menggunakan cara biomikiawi atau molekular se-protein dan asam nukleat yang spesifik. hingga antibodi untuk protein tersebut dapat dihasilkan. Contoh molekul yang berinteraksi secara spesifik dengan Untuk menghasilkan antibodi terhadap protein r dari spesiesmolekul lain antara lain: hewan tertenfu (misalnya, mencit atau manusia), protein ter- sebut pertama-tama harus diisolasi dan kemudian disuntikkan ke dalam seekor hewan dari spesies lain (misalnya, kelinci atau kambing). Jika sekuens asam amino protein tersebut cukup berbeda bagi hewan ini untuk dikenali sebagai benda asing- artinya, sebagai suatu antigen-hewan itu akan menghasilkan antibodi terhadap protein tersebut. Beberapa kelompok (klon) limfosit dari hewan yang di_ suntik dengan protein r dapat mengenali berbagai bagian protein r dan setiap klon menghasilkan sebuah antibodi terhadap bagian tersebut. Antibodi-antibodi ini dikumpulkan dari plasma hewan dan membentuk campuran antibodi poliklonal; setiap antibodi ini mampu mengikat regio yang berbeda di protein x. Akan tetapi, protein r dapat disuntikkan ke dalam seekor mencit dan beberapa hari kemudian, limfosit-limfosit yang ter_ aktivasi diisolasi dan menaruhnya ke dalam medium biakan.

HISTOLOGI DAN METODE PENGKAJIANNYA I 13 Antibodi berlabel primer tidak berlabel Antigen Potongan jaringan ' Kaca obiek-Langsung Tidak langsungGambar 7-72. pemeriksaan imunositokimia. lmunositokimia (atau imunohistokimia) dapat dilakukan secara langsung (direk) atautidak langsung (indirek). pemeriksaan imunositokimia direk menggunakan suaiu antibodi yang dibuat terhadap protein jaringan yangingin diperiksa dan dilekatkan secara langsung dengan suatu label seperti senyawa fluoresen atau peroksidase. Ketika diletakkan denganpolongun jaringan pada suatu kaca objek, antibodi yang terlabel tersebut berikatan secara spesifik dengan protein (antigen) dan dapaidiperlihatkan dengan metode yang sesuai. Teknik imunositokimia indirek yang lebih sering dipakai menggunakan dua antibodi yangberbeda. Suatu antibodi primer dibuat terhadap protein (antigen) yang ingin diperiksa dan pertamatama diberikan pada potonganjaringan untuk mengikat antigen spesifiknya. Kemudian, antibodi sekunderyang terlabel diperoleh, yang (1) dibentuk pada spesiesvertebra lain terhadap protein imunoglobulin (antibodi) dari spesies yang membentuk antibodi primer dan (2) lalu dilabel dengan suatusenyawa fluoresen atau peroksidase. Bila antibodi sekunder terlabel diberikan pada sediaan jaringan, antibodi tersebut secara spesifikmengikat antibodi primer, yang secara tidak langsung melabeli protein yang diinginkan pada kaca objek. Karena lebih dari satu antibodisekunder dapat mengikat setiap molekul antibodi primer, pelabelan protein yang diinginkan diperkuat oleh metode indirekPertumbuhan dan aktivitas sel-sel lni dapat dipertahankan untuk antibodi sekunder. Terdapat metode tak-langsung lain- nya yang memakai molekul Perartara lain, seperti teknikdalam waktu yang tidak terbatas dengan menggabungkan sel biotin-avidin.tersebut dengan sel tumor limfositik unfuk membentuk sei Contoh imunohistokimia tak-langsung diperlihatkan padahibridoma. Berbagai klon limfosit akan menghasilkan berbagai Gambar 1.-13, yang, memperlihatkan Penggunaan metodeantibodi terhadap berbagai bagian protein r. Setiap klon dapat pelabel dengan sel dalam biakan atau setelah Pemotongandipisahkan dan dibiak terplsah sehingga dapat diperoleh untuk pemeriksaan mikroskop cahaya dan TEM.antibodi yang berbeda-beda terhadap protein x secara terpisah'Setiap antibodi ini adalah antibodi monoklonal. Keuntungan APLIKASIMEDISdari penggunaan antibodi monoklonal ketimbang antibodipoliklonal adalah, bahwa antibodi monoklonal dapat diseleksi lmunositokimia telah berperan pentinq dalam penelitiandengan sangat spesifik dan terikat kuat pada protein yang biologi sel dan kemaiuan prosedur diagnostik medis. Tabel 1-1 memperlihatkan beberapa aplikasi rutin prosedurakan dideteksi sehingga jumlah ikatan nonspesifik pada tmunositokimilwi da.Lam Oral<t1k klinis : .;protein lain yang serupa menjadi lebih sedikit. Pada metode imunositokimia langsung, antibodi (baik Teknik Hibridisasimonoklonal maupun poliklonal)harus diberi label yang sesuai' Tantangan utama dalam biologi sel modern adalah memahamiSediaan jaringan diinkubasi dengan antibodi untuk beberapa kerja sel secara molekular. Tujuan ini memerlukan teknik yangwaktu sehingga antibodi tersebut berinteraksi dengan dan dapat menganalisls molekul yang terlibat dalam prosesterikat pada protein x. Sediaan tersebut kemudian dibilas informasi yang dihantarkan dari DNAmenuju protein' Banyak teknik yang bekerja berdasarkan hibridisasi. Hibridisasiuntuk menghilangkan antibodi yang tidak berikatary diproses adalah penggabungan dua untai tunggal asam nukleat (DNAdengan metode yang sesuai dan diperiksa dengan mikroskop dengan DNA, RNA dengan RNA atau RNA dengan DNA)untuk mempelajari lokasi atau aspek lain protein x (Gambar yang saling mengenal bila untaian tersebut bersifat komple- menter. Semakin banyak kemiripan sekuensnya, semakin 1-12). mudah untai komplementer membentuk molekul untaian- ganda'hibrid'. Jadi, hibridisasi memungkinkan pengenalan Metode imunositokimia tak-langsung lebih sensitif, tetapi sekuens DNA atau RNA yang spesifik. Hal tersebut biasanya terlaksana dengan asam nukleat dalam larutan, tetapi hibri-membutuhkan dua antibodi dan langkah-langkah tambahan'Alih-alih melabel antibodi (primer) yang spesifik untuk protein disasi juga terjadi ketika larutan asam nukleat diberikan secara langsung pada sediaan sel dan jaringan, suatu prosedur yangx, label yang dapat terdeteksi dikonjugasikan dengan suatu disebut hibridisasi in situ (ISH, in sittt hybridization). antibodi sekunder yang terbentuk di suatu spesies 'asing'yangberbeda terhadap suatu golongan antibodi (antibodi primer Teknik tersebut ideal (1) untuk menetapkan apakah sebuah tercakup dalam golongan tersebut). Contohnya, antibodi sel memiliki urutan DNA yang khas (seperti gen atau bagian primer yang terbentuk oleh limfosit mencit (seperti kebanyakan dari gen), (2) untuk mengidentifikasi sel yang mengandung antibodi monoklonal) secara spesifik berikatan dengan anti- mRNAyangspesifik (dengan genterkaityangditranskripsikan), bodi kelinci anti-mencit. Pendeteksian imunositokimia tak-langsung diawali dengan menginkubasi potongan iaringan manusia yang diyakini mengandung protein x dengan antibodi anti-r mencit' Setelah dibilas, sediaan jaringan diinkubasi dengan antibodi kambing atau domba terhadap antibodi mencit. Antibodi sekunder ini akan mengenali antibodi kelinci yang telah mengenali protein r (Gambar 1-12). Protein x kemudian dapat dideteksi dengan teknik mikroskopik yang sesuai untuk label yang digunakan

14 / BAB1 Tabel 1-1. Sejumlah besar kondisi patologis didiagnosis dengan menentukan lokasi penanda spesifik penyakit dengan menggunakan antibodi terhadap antigen pada pemulasan im u noh istokim ia. Hormon protein dan Tumor epitel asal polipeptida Tumor endokrin penghasil Aniigen karsinoembrionik hormon polipeptida atau protein (cEA) Tumor kelenjal terutama dari saluran cerna dan payudara Reseptor hormon steroid Tumor sel duktus payudara Antigen yang dihasilkan oleh virus lnfeksi virus spesifik-. 'u 'f atau (3) untuk menetapkan lokasi sebuah gen dalam kromosom yang spesifik. DNA dan RNA dalam sel harus didenaturasi ilF ,,#'' dengan panas atau dengan agen denaturasi terlebih dahulu ,. .- irl t \"'& agar terpisah menjadi untai tunggal. Kedua untai tersebut kini siap mengalami hibridisasi dengan segmen DNA atau RNA ta ,.'\" $ ;' untai-tunggal (yang disebr_rtprob e) yangbersifat komplementer untuk sekuens yang ingin dideteksi. probe tersebut dapat qqr tr'r' i' diperoleh melalui kloning, dengan amplifikasi pCR dari ;rf @, =l sekuens sasaran, atau melalui sintesis, bila sekuens yang di- k kehendaki tersebut pendek. probeharus diberi label, biurur-ryu f'*fsi\".,l.d*. dengan isotop radioaktif (yang lokasinya dapat ditentukan \" j€'-al, melalui autoradiografi) atau dimodifikasi oleh suatu senyawa ''-f:,E?.lg{i .'r\"1{f4J kecil seperti digoksigenin (yang dapat diidentifikasi dengan Tq --.'.a\"B\f' cara imunositokimia). Suatu larutan yang mengandung probe .rI :i 9! dituangkan di atas spesimen untuk waktu iertentu yang diperlukan untuk hibridisasi. Setelah kelebihan probe yanf tidak terikat dibilas, lokasi probe yang terhibridisasi akan tampak dari labelnya (Gambar 1-14). MASALAH PAX}A PEhIG KAJ I.&T{ $EDIAAN .'ARINGAI{ Hal penting yang perlu diingat selama mempelajari dan meng_ interpretasi sediaan jaringan yang terpulas di bawah mikroskop adalah bahwa sediaan mikroskop merupakan hasil akhir daii sederetan proses yang berawal dengan pengumpulan jaringan dan berakhir dengan penempatan kaca penutup pada kaca objek. Beberapa tahapan prosedur ini dapat mengubah bentuk jaringary dan menghasilkan kelainan struktural ringan yang disebut artifak. Struktur yang terlihat r\".u.u -ik.orkopi,Gambar 1-73. Sel dan jaringan yang dipulas oleh metode substrat peroksidase DAB. Metode tersebut memperlihatkanimunohistokimia. Metode imunohistokimia untuk menentukan struktur yang mengandung lisosom dalam makrofag yang tersebarlokasi protein yang spesifik di sel dapat diterapkan pada persiapan dan kumpulan sel Paneth. Nukleus dipulas-balik dengan hema_ toksilin. (c): lrisan sel asini pankreas pada sediaan TEM yang di_TEM atau mikroskop cahaya, dengan menggunakan berbagai inkubasi dengan antibodi terhadap antibodi amilase dan kemudian dengan protein A yang dilekatkan dengan partikel emas. protein Alabel. {a): Sebuah sel desidua mencit yang ditumbuhkan secara invitroyang dipulas untuk memperlihatkan jalinan filamen intermediat memiliki afinitas yang tinggi terhadap molekul antibodi dandi seluruh sitoplasma. Antibodi primer terhadap protein desmin, gambaran yang dihasilkan mengungkapkan keberadaan amilaseyang membentuk filamen intermediat tersebut, dan antibodi dengan parlikel emas yang tampak sebagai titik-titik hitam di atassekunder yang terlabel dengan FITC digunakan dengan teknik granula sekretorik yang matang dan granula yang sedang terbentuk (kiri). Dengan spesifitas untuk molekul imunoglobulin, protein Aimunofluoresensi indirek. Nukleus terpulas-balik yang berwarna yang terlabel dapat digunakan untuk menentukan lokasi antibodibiru muda dengan DAPI. (b): Sediaan usus halus yang dipulas primer. (Gambar 1-13c, atas izin dari Moise Bendayan, Departmentdengan suatu antibodi terhadap enzim lisosom. Antibodi sekunder of Pathology and Cell Biology, University of Montreal.)yang dilabel dengan peroksidase lalu diberikan dan timbul warnacoklat terlokalisir yang dihasilkan secara histokimiawi dengan

HISTOLOGI DAN METODE PENGKAJIANNYA I 15\+. ll '.-*,e1s ,fr'' ,:: ,n,1 'P1 4;'j r to\"' r1*i-\"\+\"r w #i ' *dIL 4*.S.!r a :3: *, 'Gambar 1-14. Sel yang dipulas dengan hibridisasi in situ' ooo0 oHibridisasi ln sltu memperlihatkan bahwa banyak sel epitel dalam oirisan kutil genital ini mengandung papilomavirus manusia (HPV), tIrI oyang menyebabkan kondisi proliferasi jinak ini. lrisan tersebut di-inkubasi dalam suatu larutan yang mengandung suatu probe cDNAyang dilabel dengan digoksigenin untuk DNA HPV. Probe tersebutlalu divisualisasikan oleh metode imunohistokimia direk denganmenggunakan antibodi yang dilabel dengan peroksidase terhadapdogoksigenin. Prosedur tersebut hanya memberi pulasan warnacoklat pada sel-sel yang mengandung HPV. 400x. Pulasan balikH&E. (Atas izin dari Jose E. Levi, Virology Lab, lnstitute of TropicalMedicine, University of S5o Paulo, Brazil.)dapat berbeda dari struktur yang dijumpai saat struktur ter- Osebut masih hidup. Gambar 7-75. lnterpretasi struktur 3'dimensi pada irisan Salah satu distorsi tersebut adalah pengerutan yang di- jaringan 2-dimensi. Struktur 3-dimensi hanya tampak memilikitimbulkan oleh bahan fiksasi, oleh etanol, dan oleh panas yang dua dimensi pada irisan tipis. (a): lrisan melalui tonjolan bundardiperlukan untuk pemendaman parafin. Akibat pengerutan pada suatu saluran menghasilkan gambaran lingkaran besar dan kecil. (b): Sebuah irisan melalui sebuah saluran yang berkelok-adalah timbulnya ruang artifisial di antara sel-sel dan unsur kelok memperlihatkan sejumlah besar irisan bundar atau oval keciljaringan lain. Penyebab lain timbulnya ruang artifisial adalah secara terpisah. Pada pengamatan pertama, kita mungkin sulithilangnya molekul, seperti lipid, giikogen atau zat dengan mengenali bahwa gambaran tersebut mewakili suatu saluran ber-berat molekul rendah, yang tidak cukup kuat ditahan dalam kelok, tetapi kemampuan intepretasi tersebut perlu dikembangkan dalam memahami sediaan histologi. (c): lrisan struktur bundarjaringan oleh bahan fiksasi atau terbuang bersama cairan saat dapat merupakan bagian dari suatu struktur sferis atau silinder.proses pengeringan dan penjernihan.'Patahan' ringan pada lrisan tambahan atau struktur serupa yang berdekatan membantusediaan juga terlihat sebagai ruang besar di jaringan. mengungkapkan suatu gambaran yang lebih lengkap. Artilak lain dapat meliputi pengeriputan sediaan (yang mungkinkan pengamatan sebuah sel dengan segenap organeldapat disalah-artikan dengan struktur linear seperti kapiler dan zat yang terkandung di dalam sel, yang dikelilingidarah) dan endapan pemulas (yang dapat dikacaukan denganstruktur sel seperti granul sitoplasma). Mahasiswa harus me- komponen matriks ekstrasel. Akhirnya, bila sebuah jaringan tiga-dimensi diiris menjadinyadari adanya artifak dan mamPu mengenalinya. sediaan yang sangat tipis, sediaan tersebut tampaknya hanya Hal lain yang perlu diingat dalam mempelajari sediaan memiliki dua dimensi: panjang dan lebar. Ketika memeriksahistologis adalah ketidakmungkinan memulas semua unsur suatu sediaan di bawah mikroskop, kita harus selalu ingatjaringan pada satu sediaan saja. Dengan mikroskop cahaya,beberapa preparat yang dipulas dengan metode yang berbeda-beda perlu diperiksa agar kita memperoleh gambaran tentangkomposisi dan struktur sebuah jaringan. Sebaliknya, TEM me-

16 / BABlbahwa sesuatu dapat hilang di depan atau di belakang sediaan bidang irisan. Suatu saluran tunggal yang berkelok akantersebut karena banyak struktur jaringan yang lebih tebal terlihat secara histologis berupa sejumlah striktur melingkar.daripada sediaan tersebut. Strukfur bundar yang terlihat secaramikroskopis dapat berupa irisan melalui strukfur sferis atau Untuk memahami arsitektur sebuah orgarL seseorangsilinder dan saluran dengan irisan melintang terlihat seperti sering kali harus mempelajari sediaan-sediaan dengan bidan[cincin (Gambar 1-15). Juga, karena struktur dalam suatu irisan yang berbeda-beda. pemeriksaan sejumlah sediaaijaringan memiliki orientasi yang berbeda-beda, gambaran paralel (sediaan serial) dan rekonstruksi gambaran tiga_ dimensi dapat menambah pemahamur, ,rrJfu organ ataudua-dimensinya akan bervariasi, yang bergantung pada organisme yang kompleks.