Bab 02. Berbagai Metoda dalam Pengkajian Sel

Sel selain berukuran kecil juga rumit dalam organisasinya, sehingga berbagaikesulitan dihadapi para peneliti. Sebuah sel sulit diamari strukturnya,sulit diungkapkan komposisi molekulnya dan iebih sulit lagi masih harusmenj elaskan fungsi berbagai komponennya. Teknik-teknik percobaan yangtelah dikembangkan untuk mengkaji sel begitu beranekarag^mnya. Kekuatandan keterbatasan teknik-tekniktersebut sangatmenentukan konsep kita tentangsel. Sebagian besar kemajuan dilam biologi sel -termasuk hal yang menarikdalam masa-masa mutakhir ini -- telah meloncat ke pengetalan pemakasanmetode-metode baru. Untuk dapatbenarbenar memahami biologi sel, orangharus mengerti sesuatu dari teknik-teknik percobaanny^. Untuk memahami sel, pedu diketahui mengenai strukturnya, komponen-komponennya, fungsi atau kemampuan komponen-komponen sel dan prosesyang bedangsung semasa masih dalam masa kehidupannya. Apa yang telahdicapai pemahaman mengenai sel sampai saat ini merupakan kompilasi dariberbagai hasil pengam^t^n d^fam penelitian. Misalrya pemahaman tentangsintesis protein pada saat ini merupakan kumpulan dari berbagai carapengam t^n Di antara pengamatan dengan berbagai metode adalahMIKROSKOPISel yang betasal dari hewan, pada umumnya berukuran diameter 1,0 - 20Itm, ^t^,r kira-kira sepedima lebih kecil dari partikel yang terkecil yang masih 19

BIOLOGI SELdapat dilihat oleh mata telaniang kita. Tidaldah mengherankan ketika padaawal diketemukan mikro skop cahaya, jaringan hewan atau tumbuh-tumbuhanditemukan sebagai kelompok sel-sel. Penemuan kelompok sel-sel ini olehSchleiden dan Schwann dalam tahun 1835 diusulkan sebagai doktrin sel' Sel-sel hewan, bukan saja kecil tetapi iuga tidak berwatna dan iernih.Akibatnl'a pengungkapan detil struktuf halus dan organela sel pada akhirabad ke-19 dimungkinkan hanya dengan pengembangan berbagai teknikpewarnaan yang dapat memberikan kontras pada struktur komponen selagat dapat dilihat. Akhirnl'a, dengan perkembangan M.E. dalam awal tahun1940 dan teknik-teknik yang terkait dengan pengawetan dan pewarnaan sel,maka mulailah tampak kerumitan struktur dalam sel. Pada Bab Pendahuluantelah dikemukakan betapa kuatnya dayaurai M.E. iika dibandingkan denganmikroskop cahaya. Peningkatan daya urai tersebut tidak lain oleh karenaperbedaan panjang gelombang ^ntara cahaya tampak dan \"sinat elektton\" danresporr dari sel terhadap berbagai pewarnaan dafl perigawetan. Pada umumnya, tad.iasi dalir panjang gelombang tertentu tidak dapatuntuk menyelidiki detil struktur yang berukuran iauh lebih kecil dari panjanggelombangnya sendiri, dan hal inilah yang metupakan pembatasan mendasatdari semua mikroskop. Maka batas da:iJ' daya utai sebuah mikroskop cahayaditentukan oleh panjang gelombang cahaya tampak yang betkisar antara 0,4pm - 0,7 Ltm, tergantung pada warfl rry^. Dengan lstilah praktisnya: bakteridan mitokhondria yang mernpunyai lebar sekitar 500 nm (0,5 pm) metupakanobjek tetkecil yang masih dapat diamati dengan mikroskop cahaya secara ielas.Benda yang ukurannya lebih kecil dari objek tersebut akan tedihat kabur, karenaadanyaefek defraksi. Maka untuk cahaya tampak, batas daya urirada!ah},2trtm.Batas tersebut dicapai oleh pembuat mikroskop pada akhir abad ke-19. Isi sebuah sel sebagian (70%) terdiri atas air sehingga cahaya denganmudah menembusnya. Hil tersebut mengakibatkan bahwa sel segar yangdiamati dengan mikroskop cahay a biasa tidak akan terlthat Salah s^ttr c ta ag fdapat terlihat struktur yang tetdzpat dalam sel, yaitu dengan ialan memberiwarna dengan zatpewatna organik tertentu. Pada awal abad ke-19, kebutuhan akan mewatnai bahan-bahan tekstilmenyebabkan perkembangan industri kimia organik. Beberapa dar' zat

BAB2: BERBAGAI METODA PENGKAJIAN SELpewarna tersebut dapat mewarnai bahan-bahan biologik dan secata trdakdiduga sebelumnya tetny^t^ dapat mewarnai secata selektif bagian-bagiantertentu dari sel. i{ini terdapat sejumlah zat organlk yang dipakai untukmew-arnai jaringan. Zat watna hematoksiln misalnya mempunyai afinitasdengan molekul-molekul yang betmuatan listrik negatif, sehingga dapatmengungkapkan penyebaran DNA dan RNA dalam sel, walaupun molekul-molekul tersebut tidak dapat diperlihatkan strukturnva. Namun dasar kimiasebagian besar zat pewarna tidak diketahui. gerakan lengan mikrotorn jaringan tertanam dala*'t lllin atau resln pisau pita rangkaian sayatafi sayatan diletakkan dlatas kaca sediaqn untuk dipro$es dan diwamai lensa okuler fensa oby*ktif lensa kondensor mikroskop cahaya ;\"ln;\", 2-l.Teknik pengamatan jaringan/sel dengan mikroskop cahaya. a. Pembuatan sayatan. b. Sayatan jaringan pada gelas sediaan untuk diproses lebih lanjut. c. mikroskop cahaya

BIOLOGI SEL Sebelum diwarnai, sebagan besar jaringan biologik hatus difiksasi dahulu.Fiksasi ini akan membuat sel lebih dapat ditembus oleh zat pewarna, d)samping dipedukan untuk menstabilkan kedudukan molekul-molekul yangmembentuk struktur dalam sel. Fiksasi dan pewarnaan bukanlah satu-satunya tahapan dalam persiapanpembuatan sediaan jaingan agar dapat dilihat dengan mikroskop. Agarjanngan atau sel dapat dilalui sinar selama pengamatan dengan mikroskop,maka ketebalannya pedu cukup tipis. Lagipula ketebalan say^tan tergantungmaksud s^y^t^n. Agar pengamatan tidak memberikan citra tumpukan sel, makasebaiknya s^yatan setebal ukuran diameter sel (tidak lebih dari 10 pm). Untukmendapatka n janngan yang tipis, tidaklah mudah me fly^yati^itngan yang lunak.Penyayatan dengan mikrotom dilakukan setelah difiksasi. Untuk tahap-tahapfiksasi, s^y^t^n dan pewarnaan memedukan proses khusus seperti misal-reyauntuk memudahkan penyay^t^n jaringan, sebelumnya iaitngan direndamdalam suatu bahan yang mudah memadat, seperti plastik resin, paraf,n ataumalam lebah. Bahan-bahan tersebut harus dapat menginfiltrasi setiap bagSansel. Untuk memungkinkan infiltrasi bahan-bahan tetsebut, setelah jaringandifi ksasi ah y ang dikandungnya hatus dikeluarkan dahulu (dehidrasi). Tentu saia dengan berbagai pedakuan terhadap sel atau jaringan selamaproses pembuatan sediaan, sei atau iartngan akan menghadapi risikoterjadtnyaberbagai perubahan, baik secara kimiawi maupun struktural. Untukmengurangi hal-hal yang dapat mengubah penampilan sel atau laringantersebut, selain dilakukan petbaikan-perbaikan prosedur pembuatan sediaan,terdapat alternatif Iatn tanpa melakukan fiksasi tetapi masih memungkinkanpeny^y^t^niatingan. Alternatif pembuatan sediaan tanpa fiksasi, yaitu denganmembekukan jaingan dan disayat pada saat masih beku. Pembuatan sediaandengan melalui pembekuan ini mempunyai keuntungan bahwa jaringan masihdalam keadaan segar. W'alaupun demikian, di samping sulit pengeriaannya,terbentuknya kristal-kristal es sering dapat pula mengrrbah struktur sel. Para ahlt masih menc^tt cara lain untuk meningkatkan kualitas sediaan,yaitu dengan mengurangi pedakuan terhadap jatngan, di antarany^ t^np^melakukan pewarnaan. Hal ini dilakukan pada pengamatan iaringan hidupdengan menggunakan mikroskop fase kontras dan mikroskop interferensi.

BAB2: BERBAGAI METODA PENGKAJIAN SELDasar dari kedua cara pengamatan tersebut yaitu adanya perubahan fasegelombang cahaya oleh jaringan yang dilalui. Bayangan yang ted-ihat darijaingan segar/hidup tersebut menunjukkan struktur dalam sel lebih jelasdan berwarna tanpa zat pew^tna. Masih terdapat jenis mikroskop cahayalainyang tidak memedukan pew^rna n jatingan, seperti misalnya mikroskoppolarisasi, dan rnikroskop medan gelap. gelornbang ,dalam fase gelombang sel yang .di luar fase tidak.diwarnailAl {BtGambar 2 - 2. Bagan pencahayaan mikroskop pada sel jaringan.(A)Sel yang diwarnai sangat mengurangi amplitudo cahaya yang melintasi.(B)Cahaya yang melintasi sel yang tidak diwarnai, mengalami perubahan amplitudo yang besar, tetapi struktur dalam sel mengubah fase gelombang cahaya sehingga menimbulkan kontras (berlaku pada mikroskop kontras fase dan mikroskop interferens).Mikro skop cahay y untuk menga m^tt say laringanmemberikan bayang^an^n2gddiimguennaskiaonnal, sehingg c t^ ^t^n pengamatan inidapat menghamb^t pemahamzn morfologi objek yang dihadapi. Kinitelah diciptakan jenis mikroskop yang dapat mengatasi kelemahantetsebut, sehingga mikroskop tersebut dapat membedkan gambaran3 dimensional. Mikroskop tersebut dinamakan mikroskop konfokalyang menggun kan sinar laser sebagai sumber cahay^. Kedalaman fokus pada mikoskop c h^ya biasa secara rcI^ttfp^njang, lebihJebih apabtTa digunakan lensa objekif yang lemah

BIOLOGI sELpembesarannya. Lagppula mikroskop cahaya biasa menggonakanberkas besar yang menyinari sediaan. Hal ini berari bah'wa sediaanyang diamai akan tetcakup oleh fokus tersebut sec r^ simultan,sehingga terbentuklahbayangan 2 dimensionai saling tumpang tindihdan sedraan yang merupakznbenda betbentuk 3 dimensional'Untuk mengatasi kelemahan mikroskop caltaya biasa tersebut,mikro skop konfokal duancang terb entuk bay angan 3 dimensional. ^gatPada mikroskop konfokal hanya sebidang tipis dati sediaan yangte\angkau oleh fokusnya pada s^tu sa^t. Hal in didasarkan pada 2prinsip, yiltu:1) sediaan mendapat pencahayaan oleh sebetkas kecil sinardan 2) bzyangan yang dibentuk harus melewati lubang kecil. Dengandemikian l<tta hznya memperoleh sebuah bayzngan vang berasal datrbidang tipis yang terjangkau fokus dari sediaan saiayangdapat mencapaidetektor.Jika adabayangznyangbensal dari bidang di atas atau dibawahbidang foku s, idak akan mencapai detektor karcna teft^han. I(e adaan iniakan menghasilkan bayangan yang lebih taiam daipadabayang nyangdibentuk oleh miktoskop cahaya biasa. (ihat gambat 2-3) (A} Gtvt ] ici i- lei i$t lol :;i L:J !-*-\"rrBlubangkrnfokal Gambar 2-3.Bagan mekanisme pencahayaan mikroskop konfokal denganmenggunakan sinar laser

BAB2: BERBAGAI METODA PENGKAJIAN SEL Berikut pengaturan penc^h^ya n yang biasa dijumpai pada mikroskopkonfokal pada umumnya.1) Pencahayaan diperoleh dari sinar laser2) Berkas cahaya yang kecil pedu digerakkan pada permukaan sediaan (scannin! agar dapat mengamati seluruh permukaannya3) Komponen yang merupakan objek pengamatan pedu dilabel dengan bahan berpendar (fluoresens)4) Cahaya yang dipanrulkan oleh sediaan tersebut membentuk bayangan yang dipetlukan5) Bavangan yang melewau lubang kecil ditangkap oleh detektor untuk selanjutnya diubah menjadi sinyal yang ditetuskan ke monitot. Bayanganyang dibentuk dari pantulanpada sediaan yang tedetak padabidang fokus tipis dapat disatukan dengan bayangan dari bidang fokus lainyang kemudian direkonstruksi melalui program komputer menjadi bayangan3 dimensional. Untuk mengatasi keterbat^s^n d^ya Dritmikroskop cahaya,maka digunakansinar elektron yang panjanggelombangnya ja:uh lebih pendek dalam pembuatanmikroskop dengan sistem baru. Panjang gelombang sinar elektron akan makinmemendek, jika kecepatan bergeraknya makin cepat. Pada sebuah N[.E. denganvoltase percepatan sebesar 100.000 Volt akan menghasilkan paniang gelombangsinar elekuon sebesar 0,004 nm. Apabila dihitung daya urainya. maka M.E.bersangkutan akan memberikan angka sebesar 0,002 nm. Pethitungan ini denganmempertimbangkan adanya aberasi \"lensa\" elektron jauh lebih besar daripadaaberasi lensa kaca pada mikroskop cahaya. Pada kenyata^nnya, sebagian besarM.E. modern baru mencapai daya uu sebesat 9,1 nm. Lebih lanjut adanyamasalah-masalah dalam pemrosesan akan sediaan self janngan, kontras dankerusakan karena radiasi akan membatasi pula daya urit untuk pengamatansediaan biologik sampai sekitar 2 nm Q}A). \Talaupun demikian, M.E. masihtetap 100 kali lebih baik daya utatnya darrpada mikroskop cahaya. Secara garis besar cara kerja mikroskop cahaya dan M.E. transmisi(Transmission Electron Microscope = TEM) tidak jauh berbeda, hanyaukuran mikroskop elektron jauh lebih besar, lagi pulabayanganyang diperolehditerima padalayar monitor yang berpendat, sehingga tidak dilihat langsung.

BIOLOGI SEL fi\"l', Gambar 2 - 4. Mikroskop Elektron Sumber sinar elektron adalah filamen katode yang memanc rka'fl elektronpada puncak tabung setinggi sekitar 2 m. Untuk mendapatkan sinar elektronyang lurus, maka tabung yang dilalui harus dalam keadaan hampa udara. MakaM.E. dilengkapi dengan pompa yang harus dijalankan sebelum pemakaian.Elektron yang dipancarkan dipercepat dengan adanya anode yang kemudiandilalukan melalui lubang kecil sehingga sinar elektron membentuk berkasdalam tabung hampa udara. Yang bertindak sebagai lensa dalam M.E., yaitu kumparan magnetik yangdipasang sepanjang tabung seperti pada mikroskop cahaya yang juga dikenallensa kondensor, lensa objektif dan lensa okuler atau lensa proyektor. Gambar2-7 menyajlkan perbandingan jalannya sinar pada M.E. dan mikroskop cahayadalam bentuk bagan. Sinar elektron yang melalui sediaan yang akan diamati, sebagiandipancarkan sesuai kondisi kepadatan m^teri^l pada setiap bagan dari sediaanjarrngan, sedangkan sebagian lain dipusatkan untuk membentuk bayanganpada layar monitor atau film potret. Oleh karena sinar yang dipancarkan

BAB2: BERBAGAI METODA PENGKAJIAN SELhilang tidak membentuk bayangan, sehingga daenh yang padat pada sediaanmenunjukkan daerah yang kurang dilalui arus sinar elektton. sediaan jaringan yang akan dtamai dengan M.E,. transmisi juga harusdisayat tipis seperti halnya sediaan untuk mikroskop cahaya, bahkan jauhlebih tipis. Sediaan yangakandiamati diletakkan pada tempat yang merupakanany^m^n kasa logam halus. Pada M.E. jenis lain yang disebut Scanning Electron Microscope (SEA,D,sinar elekton tidak menembus jarngan,melainkan dipancarkan kembali olehpermukaan sediaan dengan sudut yang berbeda rergantung dari strukturpermukaan laingan. Sinat elektron yang dipancarkan kembali tersebutbarulah mencapai monitor membentuk t>ayangan. para peneliti mendapatkeuntungan dari sistem sEM, karena memperoleh bayangan 3 dimensi.Dengan memberikan gambann kontur permukaan jaitngan atau strukturpermukaan komponen dalam sel, maka sediaan untuk SEM tidak memedukansayat^n jatingan. I{ontras bayangan yang diperoleh pada M.E,. transmisiCEN! tergantung pada jumlah atom yang ada pada sediaan jarrngan. Lensa kondensor Kisi tembaga Kumparan dengan 3 seksi listrik lensa Pemegang objektif spesimen lensa Tabung antara Jendela kaca lensa projektor Gambar 2-5. layat 6lmJalannya lintasan elektron pada TEM (Transmision Electron Microscope) Kamera

BIOLOGI SEL Gambar 26. Lintasan elektron pada SEM (Scanning Electron Microscope) l,r.i1::! Gambar 2-7.Perbandingan lintasan cahaya pada mikroskop cahaya dan mikroskop elekron

BAB2: BERBAGAI METODA PENGKAJIAN SELBIAKAN SELSebagian besar. pengamatan dengan mikroskop menggonakan sedtaan yangtelah drawetkan, bukan iaringan/sel yang masih hidup. Pengamatan dengancara miktoskopi belumlah cukup untuk mengkaii sifat-sifat ataukemampvansebuah sel, sehingga pefigamatarr dengat car.a ritktoskopi mempunyaiketerbat^s rt karena idak dapat mengungkapkan haL-hal ataru Proses y^ngbedangsung semasa selmasih hidup. Apabrladiberikan kondisi yang se suai,kebanyakan sel hewan dan tumbuh-tumbuhan selama dalam biakan iaingan dapat benahan hidup, membelahdtri bahkat dapat menanjald<an cki-ciir diferensiasinya. Dengan cata 'rnimungkin dapat mengamaa efek sesuaflr bahan, faktot pertumbuhan, hotmonataa jerttsbahanlain, terhadap perilaku sel apabtla dttambahkan atau dtambtldari medium biakan. Demikian pula dafbiakan sel orang dapat nemperolehpopulasi sel tertentu yang homogen untuk twiuan anahsis biol<rmiawi ataumengkaji nteraksi satu ienis sel dengan jenis sel lain. Percobaan dalambiakaniainganini umumnya dtkatakan sebagaipercobaan in uitro. Teknik bial<an sel belum dikuasai bagi semua ienis sel, olehkarcna seaapjenis memerlukan kondisi danbahan makanan yangberbeda, termasuk satuatau lebih faktor pertwmbuhan. Walaupun sebag1an besar sel hewan matisetelah membelah beniangkah namun jenis sel yang dapat dtpertahankmtdalam waktu idak ter/rttngg , sarrg iarang dapat muncul secara sPontanselarnapembiakan;sel-seljenisinidinamakansebagir\"trahse|'(n///ine).I{[on-klon diturunkan dai sebuah sel induk (sel punca) tunggal yang dtpetoleh dari\"tr h sel\", Dai teknk biakan sel dapat diperoleh sel hibrid yarrg merupal<an hasl'pefizrlran afltafa dua jenis sel yatg berbeda cii-ciinya. Sel hibrid banyak dtgarakan uotuk pengkai ian ataapun pemb:uatan antibodi monoklonal.FRAKSINASI SEL DAN ISINYAKalau denganmikroskopi kita dapat mengatalan secan pasrletak dan susunan organela atau molekul teftefittt dalam sebuah sel tanpa informasi stfuktuf molekalnya, maka untuk meflgetahut lebih dalam tefltaflg stfuktuf molekul

BIOLOGI SEt bersangkutan diFedukan analisis kimia. Untuk anal-isis kimia tersebut struktur komponen sel pedu dipecah-pecah dan dipisahkan. Tetapi teknik anarisis kimia demikianbiasanya mengaburkan letak molekul sebenarnya dalam sel bersangkutan. untuk mengurangi dampak yang merugikan dari pemecahan sel ini, para alit biologi telah mengembangkan suatu teknik pemecahan sel secata tetkendalt agar masih dapat dilacak mengenai masing-masing lokasi strukturnya. Untuk maksud tersebut, sel-sel atau komponen-komponennya yang berbeda-beda dipisahkan sebelum dianalisis secara biokimia. dinding sent*fus bahan yang le.endapkan uttrasentrifus r\".rooflTlirt\"inln partiket datam set Biasanya sel yang dipisahkan berasal dar. jaringan embrio atau jatinyangmerupakan bahan awal untuk pemurnian jenis-jenis sel tertentu. Populasimurni jenis sel tertentu atau\"trah sel\" yang dibiakkan secara homogen dapatdianalisis secara biokimiawi dengan cara memecahkan sel-sel tersebut dandipisahkan (fraksinasi) dengan ultrasentrifugasi lebih dahulu. Ekstrak selyang telah dipecahkan dalam beberapa hal bermanfaat dalam sistem bebassel untuk menganalisis proses-proses dalam sel yang sangat rumit, misalnyabagaimana proses sintesis protein dan repJikasi DNA bedangsung. proteinyang dikandung dalam ekstak sel yang jumlahnya lebih banyak dapat segeradimurnikan dengan kromatografi kolum. Dengan adanya perkembangan

BAB2: BERBAGAI METODA PENGKAJIAN SELberbagai jenis matriks untuk kromatografi, memungkinkan orang dapatmemisahkan protein-protein yang mempunyai aktivitas biologik, berdasarkanberat molekul, muatan listrik masing-masing rnolekul protein, atau afrritasnyadengan moleki Iain. *unp*nsi ;ar{nganS€ruTR lFtlGASl K€gE FA\"FA r.,l R€f'r*AS.{ 6ndapen r|l*ngfinduns: eel r*t*lr\" inti, eit*st**iet*n sUPSR$*ATA,{.* Dt ,AR NSHG}TT{ KH*SPATAh} SSBANG e$da,Fsfi nna. ngandu*g: mitc- hlrondrria, l&roEorn pe.rokelsem* SUFgRNATAN nIPL}TAR $ENGAN l+tKETNFATAh,I TING6{1,.-'.f endapanme- ngandtrns rnikro-Ihf::.q.:.,i-#..,'+.;-J som, ctern va$ikel kecil.SUFERIiIATAN SIFUTAR SENCANKSEHFATAFI sA,!{G$,T Tll-{GGi endapan me- ngandung rib*r- *6rn, vifus, d&ftr rrrakre malelrult::ff;t#denganBagan yang menunjukkan sentrifugasi kecepatan yang meningkat,se-hingga partikel-partikel dapat dipisahkan berdasarkan berat komponen yang difraksinasi. Dalam pemurnian yang khas, bahan ekstrak sel dituangkan dalam kolum-kolum agar mengahr dalam kolum. Fraksi yang mengandung bahan yangdimaksud pada gilirannya dimasukkan dalam kolum berikutnya. Apabilaprotein telah dimurnikan dan diperoleh secara homogen, urutan asam-

BIOLOGI SELasam am7flo yang men''usunnya bar,iah dapat dipastikan melalui analisisberikutnya.ruo,l&**l grdt*ltrdengan 2 subunlty' adnisguiOltlkdearv{g€lk-aci)hen eubuniltunggal nrolakul prottln @\"w ry**El,g;ffi R('f f'K&a,aAFj,\"PotlAl(RlLp6i#{J .1, t, wl */ l-, gWd#rawltqWtl*arfa,c -sr*rrk mcdifura Gambal 2-10.Bagan azas kerja elektroforesis 5DS-PAGE. Molekul-molekul dipisahkan berdasarkan Berat Molekul melalui lapisan tipis gel poliakrilamid' Untuk menentukao vf:utafl ^sam atnino dari suatu molekul ptoteinterteflts,mula-mula molekul yangbesar dipecah metiadt molekul lebih kecilsebagai polipeptida yarrglrtrtaifi as^m atninofiya ditentukan melalui prosedurotomatis yang sangat peka.Biasanya pfotein memputrryai mrtatafl listrik sebagar hastl peniunlahanmv^tat:- listrik asam-asarn ^mifio yaflg meflWsululya. Apabrla medan listrik molekul-molekul protein tersebutdikenakan pad ^ svat:ulaflutanptoteitl,maka mwatat,berat molekul dan bentukakan mtgtasi yang anhnyatefgaotultg P ada

BAB2: BERBAGAI METODA PENGKAJIAN SEL molekul protein tersebut. can iru adalah dasar dari teknik pemisahan molekul yang dikenal sebagai elektrofotesis. Dalam pertengah an tahsn 19 60, dikembangkan suatu modifi kasi elektroforesis yang menggunakan bahan poliakrilamid sebagai medium. Teknik ini dikenal sebagai SDS-PAGE (sodiun DodeEl sulfate-Pofuacrykmide Ge/ Elekrrophoruis). pada Gambat 2-10 dtsaltkanbagan proses elektroforesis yang dimaksud. TEKNIK DNA REKOMBINAN Molekul DNA merupakan molekul ya''gterdapat dalam sel yang paling sulit dianalisis oleh pan ahli biokimia dalam awal 1970. Namun Lctnt keadaannya sudah jauh berubah, karena molekul DNA merupakan molekul yangpahng mudah dianalisis. Pada masa sekarang sangat mungkin memotong molekulDNA dengan enzim pada daerah yang dikehendaki, yang selanjutnyamemperolehnya dalam jumlah hampir ttdak terbatas dan menentukan urutannukleotidnya dalam waktu sangat singkat. Teknologi DNA rekombinan telah memberikan svafi) c ta pendekatartyang sangat kuat untuk mem ahami pengaturan ekspre si gena pada sel ekariotiky^ng saflgat rumit. Dengan menggunakan metode hibridisasi asam nukleat,orang dapat.mendeteksi molekul mRNA dengan cara mereaksikan molekulDNA pasangannya (hibddisasi) yang telah dimiliki sebelumnya. selanjutnyamolekul mRNA diisolasi dan ditranslasikan menjadi molekul protein dalamsuatu sistem tanpa sel secara in vitro. Sebaliknya, pada dasatnya sangat mungkinkita bekerja mundur mulai dad protein yang hendak kita analisis untukmengetahui pola genany^ yangberfungsi sebagai sandi molekul tersebut. Penterapan teknologi DNA rekombtnan dapat sangat jauh dan ruas.Bakteri dan sel ngp dapat drekayasa agar dapat menghasilkan protein mamaltadalam jumlah ddak terbatas, sehingga mudah dianalisis struktur dan fungsiprotein tersebut ataa pemakatan protein tersebut untuk vaksin atau obat-obatan dalam lapangan kedokteran. Rekayasa menggunakan bakteri dimulaidengan menyisipkan penggal DNA yang telah diketahui urutafl nukleotidanyauntuk pola molekul protein tertenru daiam DNA sel bakteri, sehingga bakteritersebut akan memproduksi protein yangl<ttainginkan. Teknologi ini dikenaldengan nama rekayasa genetik.

BIOLOGI 5ELPELACAKAN MOLEKUL SELULARHampir semua sifat-sifat yang dimiliki sebuah molekul baik sifat fisik, kimia,ataupun sifat biologi -- pada dasarnya dapat dipakai sebagai suatu sarana untukmendeteksi molekul tersebut. Di dalam pengkajian biologi sel, seringkalimolekul-molekul dideteksi melalui aktivitas biokrmianya.Dalam buku ini akandiungkapkan selintas metode deteksi atau pelacakan dengan menggunakanradio-isotop dan antibodi. Cara-cara ini akan mampu mendeteksi secarakhas molekul-molekul dalam campvran y ang kompleks. Cara int sangat pekaapabia dalam kondisi optimal, sehingga dalam sebuah sampel dapat dideteksimolekul yang jumlahnya kurang dari 1000. Setiap molekul dalam sel dapat dilabel dengan cara menyisipkan satu ataulebih atom tadioaktif (sebagai penanda) dalam molekul tersebut. Atom-atomradioaktif ini selalu memancatkan radiasi, sehingga keberadaannya dapatterdeteksi oleh pancaran radiasinya. Atom-atom radioaktif ini tidak stabilkarena selalu memancarkan radiasinya. Dengan demikian molekul yang dilabeldapat dtlacak. Di antara sebegitu banyak aplikasi radio-isotop dalam biologisel, analisis lintasan metabolisme dan penentuan lokasi molekul-molekultertentu dalam sebuah sel dengan cara otoradiografibanyak dilakukan. Hewan vertebr^ta mampu menghasilkan jutaan molekul antibodi yangberbeda kemampuannya mengikat secara khas di bag1an tertentu dari suatumolekul. Apabila tetsedia antibodi anti-protein tertentu dalam komponensel, maka antibodi spesifik tersebut dapat dimanfaatkan dalam pelacakankomponen sel. Antibodi sudah dianggap merupakan afat yang cukup pekauntuk mendeteksi dan menentukan lokasi molekul-molekul yang khas. Setiapjenis molekul antibodi tersebut dinamakan antibodi monoklonal katenadihasilkan oleh sebuah klon sel limfosit dan mempunyai spesifisitas tunggal.Antibodi monoklonal ini sebagai pengganti penggunaan radioisotop dapatdimanfaatkan untuk menentukan lokalisasi molekul protein yang meniadiobyek peng^matafl. Antibodi monoklonal dapat diperoleh dengan melaluibiakan sel hibridoma.

BAB2: BERBAGAI METODA PENGKAJIAN SELRANGKUMANUntuk mengungkapkan seluk beluk sel, baik mengenai struktut komponen-komponennya,,maupun aspek kinerja dan proses biokimianya tidak cukupmelalui pengam^t^n mikroskopik dengan alat yang mempunyai daya urityang besar, riamun masih diperlukan berbagai metode lain. Metode tersebutdi antaranya dengan fraksinasi sel, elektoforesis dengan modifikasinya,khromatografi, DNA rekombinan dan biakan sel.DAFTAR PUSTAKABradbuty, S. An Introduction to the Optic Microscope 2nd ed. Oxford: Oxford University. 1 989.Cleveland, D.W. et a/. Pepide rnapping by Jimited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis. J. Biol Chem 252. 1102-1106,1977.Freshney, R. Ian, Introduction, dalam: Culture of Animal Cells, a manual of basic technique. 2\"d ed. Alan R. Liss. Inc., New York, 1-4,1988.Junqueira, Luiz Cados dan Carneiro, Jose. Basic Histology, text and atlas. International edition, (11'h ed.) McGraw-Hill, New York. 2005.Pease, D.C; Potter, K.R. Electon microscopy and ultramicrotomy. J.Cell Biol 91.2875 - 292 S. 1981.Ross, Michael H and Pawlina \)Tojciech. Methods, dalam Histology, A text and atlas with correlated cell and molecular biology. 5d ed, Lippincott S7i-lliams and Wilkins ,1-12,2003.Sommerville, J.; Scheer, U. (ed$. Electron Microscopy in Molecular Biology: A Practical Approach. Oxford: Oxford I.R.L. 1987.Zertike, F. How I discovered phase contrast. Science 121.345 - 349,30. 1955.