Bab 07 Replikasi Bahan Genetik

Pokok Bahasan:» Model Replikasi D N At Mekanisme Dasar Replikasi D N AI Komponen-komponen Penting dalam ReplikasiI Mekanisme Sintesis D N AI Peranan Primer dalam Sintesis D N AI Arah Replikasi D N AI Pemisahan UntaianD N AI Pembentukan Garpu ReplikasiI Inisiasi Replikasi D N A Inisiasi Replikasi pada Virus (PX174 • Inisiasi Replikasi pada Bakteriofag Mi3 dan C4 • Inisiasi Replikasi pada E. coli • Enzim yang Berperanan dalam Proses Inisiasi Replikasii Proses Pemanjangan (Polimerisasi) Molekul D N AI Koordinasi Polimerisasi D N A Lambat dan D N A AwalI Pembentukan Untaian Kontinu pada Bagian Untaian D N A LambatI Replikasi D N A pada Eukaryot Inisiasi Replikasi pada Eukaryot • Inisiasi Replikasi DNA SV40 • Inisiasi Replikasi pada KhamirI Terminasi Replikasi pada ProkaryotI Terminasi Replikasi pada EukaryotI Ketelitian Sistem ReplikasiI Replikasi D N A Untai-TunggalI Replikasi R N AI Replikasi RetrovirusBahan genetik yang ada pada setiap jasad akan mengalami proses perbanyakan sebagai salah satu tahapan sangat penting dalam proses p e r t u m b u h a n selatau perbanyakan partikel virus. Proses perbanyakan bahan genetik dikenal sebagaiproses replikasi. Studi awal mengenai proses perbanyakan bahan genetik dilakukanpada jasad yang genomnya berupa molekul D N A . Meskipun demikian, perludiingat bahwa pada jasad tertentu, khususnya kelompok virus tertentu, genomnyaberupa m o l e k u l R N A . G e n o m yang berupa molekul R N A ini juga akan direplikasimeskipun dengan melalui tahapan yang sedikit berbeda dibanding dengan replikasigenom yang berupa molekul D N A .

9 4 Biologi Molekular\ Perbedaan Replikasi bahan genetik dapat dikatakan sebagai proses yang mengawali\ mekanisme pertumbuhan sel, meskipun sebenarnya p e r t u m b u h a n merupakan suatu resultan banyak proses yang saling berkaitan satu sama lain. Selm e m p u n y a i mekanisme rinci replikasi r e p l i k a s i b a h a n g e n e t i k y a n g d i l e n g k a p l d e n g a n s i s t e m p e n y u n t i n g a n (editing) berbagai yang sangat akurat sehingga bahan genetik yang diturunkan kepada sel anakan organisme (progeny) m e m p u n y a i k o m p o s i s i y a n g s a n g a t I d e n t i k d e n g a n k o m p o s i s i b a h a n genetik sel induk. Replikasi bahan genetik diikuti oleh p e m b e n t u k a n sel-sel anakanLTE==- yang m e m b a w a duplikat bahan genetik hasil replikasi. O l e h karena itu, kesalahan dalam proses replikasi bahan genetik dapat mengaklbatkan perubahan pada sifat- sifat sel anakan. Mekanisme replikasi bahan genetik sangat kompleks dan melibatkan banyak protein yang masing-masing mempunyai peranan spesifik. Protein-protein yang terlibat di dalam proses replikasi bahan genetik dikode oleh gen-gen yang terdapat di dalam bahan genetik Itu sendiri. O l e h karena itu, adakaitan fungsional yang sangat erat dan tidak terpisahkan antara proses replikasi bahan genetik dengan proses ekspresi genetik dan metabolisme sel secara keseluruhan. Hambatan yang terjadi pada proses metabolisme, misalnya penghambatan produksi energi, dapat pula memengaruhi proses replikasi karena replikasi juga memerlukan pasokan energi. Secara u m u m , replikasi bahan genetik merupakan proses pengkopian rangkai- an molekul bahan genetik ( D N A atau R N A ) sehingga dihasilkan molekul anakan yang sangat identik. Meskipun konsep dasar replikasi antara struktur bahan genetik yang satu dengan lalnnya adalah serupa, namun diketahui ada banyak perbedaan dalam halmekanisme rinclnya. Sebagai contoh, bahan genetik yang berupa molekul R N A mempunyai mekanisme replikasi rinci yang berbeda dengan replikasi molekul D N A . Pada kelompok virus, misalnya, replikasi bahan genetiknya terjadi dl dalam selInang yang sebenarnya merupakan jasad hidup yang lain dari jasad virus itu sendiri. Hal ini dapat terjadi karena virus merupakan jasad parasit obligat. D i lain pihak, replikasi D N Apada p r o k a r y o t dan eukaryot terjadi di dalam sel jasad hidup yang bersangkutan. Selain itu perbedaan struktural m o l e k u l b a h a n g e n e t i k , m i s a l n y a a n t a r a D N A l i n g k a r (circular DNA) d e n g a n D N A l i n e a r , juga berimpllkasi pada perbedaan mekanisme replikasi.Model Replikasi DNAHipotesis Sebelum mekanisme replikasi D N A dapat dibuktikan secara eksperimental olehtentang M a t t h e w Meselson dan Franklin Stahl pada tahun 1958, ada tiga hipotesis yangmekanisme berkembang mengenai mekanisme replikasi D N A (Gambar 7.1). Hipotesis per-replikasi DNA tama dikenal sebagai model replikasi secara s e m i k o n s e r v a t i f seperti yang di- kemukakan oleh W a t s o n dan Crick. M e n u r u t hipotesis ini, setiap molekul untai- ganda D N A anakan terdiri atas satu untai-tunggal D N A induk dan satu untai- tunggal D N A hasil sintesis baru. Hipotesis kedua dikenal sebagai m o d e l replikasi secara konservatif. Menurut model konservatif, molekul D N A untai-ganda induk

B a b 7 R e p l i k a s i B a h a n G e n e t i k 95 D N A Induk D N A Turunan Generasi Pertama D N A Turunan Generasi KeduaSemikonservatif Konservatif Dispersif G a m b a r 7.1 I Tiga hipotesis m e n g e n a i replikasi D N A . tetap bergabung sedangkan kedua untaian D N A anakan terdiri atas m o l e k u l hasil sintesis baru. Hipotesis ketiga yaitu model replikasi secara dispersif menyatakan bahwa molekul D N A induk mengalami fragmentasi sehingga D N A anakan terdiri atas campuran molekul lama (berasal dari D N A induk) dan molekul hasil sintesis baru. Pada tahun 1 9 5 8 M a t t h e w Meselson dan Franklin Stahl berhasll menunjukkan secara empiris bahwa replikasi D N A berlangsung dengan mekanisme secara semikonservatif. Meselson dan Stahl melakukan eksperimen untuk mengetahui m e k a n i s m e r e p l i k a s i D N A d e n g a n m e n g g u n a k a n b a k t e r i Escherichia coli. P e r t a m a k a l i , b a k t e r i £. coli d i t u m b u h k a n d a l a m m e d i u m y a n g m e n g a n d u n g n i t r o g e n \"berat\" yaitu isotop ^^N selama beberapa generasi. Dengan cara demikian maka molekul D N A induk mempunyai label berupa isotop berat sehingga molekulnya mempunyai densitas yang lebih tinggi dibanding D N A normal. Sel-sel yang molekul DNA-nya sudah berlabel tersebut kemudian diplndahkan k edalam medium baru yang mengandung isotop nitrogen yang \"ringan\", yaitu ^''N. Pada selang w a k t u tertentu setelah diplndahkan k e m e d i u m baru, sampel sel dipanen dan D N A - n y a diisolasi. D N A hasil isolasi tersebut kemudian disentrifugasi dengan ultrasentrifugasi gradien CsCI untuk menentukan densitas molekul DNA-nya. Hasil pengukuran d e n s i t a s D N A y a n g d i i s o l a s i p a d a g e n e r a s i £. coli y a n g b e r b e d a m e n u n j u k k a n a d a perbedaan satu sama lain. Pada generasi pertama, semua D N A m e m p u n y a i densitas molekul hibrid, yaitu densitas yang dihasilkan oleh gabungan molekul D N A yang mengandung ^^N dan ^''N. Perlu diingat bahwa sebelum diplndahkan ke medium yang mengandung ^''N (yaitu generasi ke 0), kedua untaian D N A induk mengandung isotop ^^N. Pada generasi kedua, densitas molekul D N A terdiri atas dua kelompok yaitu yang mempunyai densitas molekul hibrid danyang mempunyai densitas lebih rendah dibanding dengan densitas molekul hibrid. Kelompok kedua tersebut

96 Biologi Molekular terdiri atas molekul D N A yang kedua untaiannya mengandung isotop N. Secara skematis eksperimen tersebut ditunjukkan pada Gambar 7.2. Hasil eksperimen Meselson dan Stahl tersebut dengan jelas menunjukkan bahwa molekul D N A anakan terdlrl atas satu untai D N A induk dan satu untai D N A hasil sintesis baru sehingga sesuai dengan m o d e l replikasi secara semi- konservatif. Hasil e k s p e r i m e n t e r s e b u t k e m u d i a n d i k o n f i r m a s i lagi dengan eksperimen kedua. Dalam eksperimen ini, molekul D N Ahibrid didenaturasi dengan pemanasan pada suhu 100°C, kemudian disentrifugasi dalam gradien CsCI. D N A yang sudah didenaturasi tersebut menghasilkan dua pita D N A yang terdiri atas untai-tunggal D N A yang mengandung ^^N dan untai-tunggal D N A yang mengandung ^''N. Berdasarkan atas eksperimen seperti yang dijelaskan di atas, dapat diambil kesimpulan bahwa replikasi D N A berlangsung secara semikonservatif. Meskipun demikian, bukti-bukti baru menunjukkan adanya penyimpangan dari teori replikasi semacam ini. Diketahui bahwa mekanisme replikasi D N A pada virus tertentu, misalnya virus 0X174, yang genomnya berupa D N A untai-tunggal, melibatkan tahapan proses replikasi D N A dengan mekanisme yang berbeda yaitu dengan model konservatif, meskipun hanya pada tahapan tertentu. Mekanisme Dasar Replikasi DNA Model replikasi D N A secara semikonservatif menunjukkan bahwa D N A anakan terdiri atas pasangan untaian D N A induk dan untaian D N A hasil sintesis baru. Model ini m e m b e r i k a n gambaran bahwa untaian D N A induk berperanan sebagai c e t a k a n (template) b a g i p e m b e n t u k a n u n t a i a n D N A b a r u . S e p e r t i d i k e t a h u i , molekul D N A untai-ganda terdiri atas dua untai molekul D N A yang berpasangan secara komplementer yaitu antara basa nukleotida A dengan T , dan antara C dengan G .Oleh karena itu, proses replikasi D N A harus diawali dengan pemutusan (denaturasi) ikatan antara untaian D N A yang satu dengan untaian komplementer- nya. Hal ini dimaksudkan agar masing-masing untaian D N A tersebut dapat ber- tindak sebagai cetakan, sebab proses pemasangan nukleotida-nukleotida baru dengan cetakannya akan terhalangi jika kedua untai i t umasih berada dalam keadaan berikatan. Dengan demikian, salah satu bagian yang sangat penting dalam proses replikasi D N A adalah denaturasi antara untaian D N A yang satu dengan untaian komplementernya. Denaturasi yang terjadi pada saat awal replikasi D N A adalah proses enzimatis. O l e h karena m o l e k u l D N A adalah b i o m o l e k u l yang sangat vital bagi jasad, maka denaturasi D N A terjadi secara parsial d a nbertahap. Denaturasi awal terjadi p a d a b a g i a n D N A y a n g d i k e n a l s e b a g a i o r i (origin of replication) a t a u titik awal replikasi. I k a t a n h i d r o g e n a n t a r a A - T d a n C - G a k a n t e r p u t u s d a n d i i k u t i d e n g a n pembukaan untaian D N A . Untaian D N A membuka membentuk struktur yang d i s e b u t s e b a g a i g a r p u replikasi (replication fork). G a r p u r e p l i k a s i a k a n b e r g e r a k sehingga molekul D N A induk membuka secara bertahap. Masing-masing untaian

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 97 Ringan ^'^\"'^ Berat Densitas D N A N. y 1 V Induk D- T T Generasi I Generasi II 3rS r^i rS rS ID Generasi IIIG a m b a r 7.2 I S k e m a e k s p e r i m e n M e s e l s o n d a n S t a h l . D a l a m e k s p e r i m e n t e r s e b u tM e s e l s o n d a n S t a h l m e n u m b u h k a n E . coli d a l a m m e d i u m y a n g m e n g a n d u n gisotop nitrogen ' ^ N sehingga D N A yang disintesis menjadi lebih \"berat\",k e m u d i a n bakteri diplndahkan dalam m e d i u m biasa yang m e n g a n d u n g ^ * Nyang lebih \"ringan\". Selanjutnya D N A diisolasi dan diultrasentrifugasim e n g g u n a k a n gradien cesium chloride (CsCI) u n t u k m e n e n t u k a n densitas D N A -nya. Setelah replikasi D N A yang pertama, satu pita D N A baru m u n c u l dengan\"kerapatan\" yang berada di antara D N A yang dilabel dengan ^^N (sehinggaD N A dupleks menjadi berat/berat [B/B]) dan di antara D N A dengan ^ * N ( D N A\"ringan (R)\" atau R/R). Hasil ini m e n u n j u k k a n b a h w a hipotesis replikasi secarakonservatif tidak m u n g k i n terjadi. Replikasi berikutnya m e n u n j u k k a n bahwareplikasi secara dispersif juga tidak m u n g k i n terjadi karena replikasi secaradispersif akan menghasilkan p r o d u k y a n g terdiri atas seperempat ^^N dan tigaperempat setelah dua kali replikasi dalam m e d i u m yang mengandung^^N.Sebaliknya, replikasi secara semikonservatif akan menghasilkan p r o d u k yangterdiri atas setengah B/R d a n setengah lagi sebagai R/R. D e n g a n kata lain,produk hibrid B/R pada replikasi yang pertama masing-masing akan terpisahmenjadi untaian B dan R yang akhirnya akan bertemu dengan pasangannyayang lebih ringan d a n menghasilkan nisbah (rasio) 1 : 1 D N A B/R terhadapR/R.

9 8 Biologi l\/lolel<ular D N A Induk yang sudah terpisah satu sama lain berfungsi sebagai cetakan u n t u k penempelan nukleotida-nukleotida yang akan menyusun molekul D N A baru. Nukleotida-nukleotida baru akan dipollmerisasi menjadi untaian D N A baru dengan urutan sesuai dengan urutan cetakan D N Akomplemennya. Basa nukleotida A dipasangkan dengan basa T yang ada pada cetakannya, sedangkan basa C d i - pasangkan dengan basa G . Oleh karena itu, untaian D N A baru yang terbentuk merupakan komplemen untaian D N A induk. Proses polimerisasi nukleotida terjadi pada kedua untaian D N A cetakan sehingga pada akhir satu kali putaran replikasi akan dihasilkan d u amolekul D N Abaru yang identik. Masing-masing molekul D N A untai-ganda yang terbentuk terdiri atas untai D N A induk dan untaiD N A baru hasll polimerisasi selama proses replikasi. Dalam putaran replikasi berikutnya akan terjadi proses yang serupa sehingga D N Aanakan menjadi D N A induk untuk replikasi berikutnya. Komponen-komponen Penting dalam Replikasi Replikasi bahan genetik ditentukan oleh beberapa k o m p o n e n utama yaitu: 1 . DNA cetakan, yaitu m o l e k u l D N A atau R N A yang akan direplikasi. 2. M o l e k u l deoksi ribonukleotida, y a i t u d A T P , d T T P , d C T P , dan d G T P D e o k s i r i b o n u k l e o t i d a t e r d i r i atas tiga k o m p o n e n y a i t u : (1) basa p u r i n a t a u p i r i m i d i n , (ii) gula 5-karbon (deoksiribosa), dan (iii) gugus fosfat. 3. E n z i m DNA polimerase, yaitu e n z i m u t a m a yang mengkatalisis proses p o l i m e r i s a s i n u k l e o t i d a m e n j a d i u n t a i a n D N A . P a d a b a k t e r i Escherichia coli t e r d a p a t tiga m a c a m D N A polimerase yaitu D N A polimerase I, D N A polimerase II, dan D N A polimerase III. Pada jasad e u k a r y o t terdapat lima m a c a m D N A polimerase yaitu D N A polimerase a , D N . A p o l i m e r a s e 8, D N A polimerase e, D N A polimerase p, dan D N Ap o l i m e r a s e y . 4. Enzim primase, yaitu e n z i m yang mengkatalisis sintesis p r i m e r u n t u k m e m u l a i r e p l i k a s i D N A . P a d a b a k t e r i E. coli k o m p l e k s e n z i m i n i d i s e b u t p r i m o s o m y a n g terdiri atas beberapa macam protein. 5. E n z i m p e m b u k a ikatan u n t a i a n D N A induk, yaitu e n z i m helikase dan e n z i m lain y a n g m e m b a n t u p r o s e s t e r s e b u t y a i t u e n z i m girase. 6. M o l e k u l protein yang menstabilkan untaian D N A yang sudah terbuka, yaitu p r o t e i n S S B (single strand binding protein). 7. E n z i m D N A ligase, y a i t u s u a t u e n z i m y a n g b e r f u n g s i u n t u k m e n y a m b u n g fragmen-fragmen DNA. Mekanisme Sintesis D N A Replikasi D N A berlangsung dalam beberapa tahap yaitu: (1) denaturasi (pemisahan) u n t a i a n D N A i n d u k , ( 2 ) p e n g - \" a w a l \" - a n (initiation, i n i s i a s i ) s i n t e s i s D N A ,

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 9 9(3) pemanjangan untaian D N A , ( 4 )llgasi f r a g m e n - f r a g m e n D N A , dan ( 5 ) peng-\" a k h l r \" - a n (termination, t e r m i n a s i ) s i n t e s i s D N A . Sintesis untaian D N A yang baru akan dimulai segera setelah kedua untaianD N A induk terpisah m e m b e n t u k garpu replikasi. Pemisahan kedua untaian D N Ai n d u k y a n g a k a n d i r e p l i k a s i d i l a k u k a n o l e h e n z i m D N A helikase. K e d u a u n t a i a nD N A induk digunakan sebagai cetakan untuk menyintesis D N Abaru. SintesisD N A b e r l a n g s u n g d e n g a n o r i e n t a s i S ' - P —> S ' - O H . O l e h k a r e n a a d a d u a u n t a i a nD N A cetakan yang orientasinya berlawanan, maka sintesis kedua untaianD N Ab a r u j u g a b e r l a n g s u n g d e n g a n o r o h geometris y a n g b e r l a w a n a n n a m u n s e m u a n y atetap dengan orientasi 5' 3'. Keadaan semacam inimenlmbulkan perbedaandalam halmekanisme sintesis antara kedua untaian D N A yang baru. Dalam proses replikasi, garpu replikasi akan membuka secara bertahapdimulai dari titik awal replikasi (ori) dan akan bergerak sepanjang D N A cetakansampai semua molekul D N A induk direplikasi. Seperti telah disinggung sebelumnya,kedua untaian D N A yang baru disintesis dengan arah geometris yang berlawanan.Salah satu untaian D N A disintesis dengan arah geometris yang searah denganpembukaan garpu replikasi, sedangkan untaian D N A yang lain disintesis dengana r a h y a n g b e r l a w a n a n . O l e h k a r e n a I t u , s i n t e s i s u n t a i a n D N A b a r u y a n g searahdengan pembukaan garpu replikasi a k a n d a p a t d i l a k u k a n t a n p a t e r p u t u s (sintesissecara kontinu). U n t a i a n D N A y a n g disintesis s e c a r a k o n t i n u s e m a c a m ini d i s e b u ts e b a g a i untaian D N A a w a l (leading strand). S e b a l i k n y a , s i n t e s i s u n t a i a n D N Ay a n g berlawanan arah geometrinya dengan arah pembukaan garpu replikasid i l a k u k a n s e c a r a t a h a p d e m i t a h a p (sintesis secara diskontinu). H a l ini t e r j a d ikarena proses polimerisasi pada untaian D N A ini hanya dapat dilakukan setelahD N A cetakannya membuka seiring dengan membukanya garpu replikasi. UntaianD N A yang disintesis secara l a m b a t s e m a c a m ini disebut untaian DNA lambat(lagging strand). S e c a r a u m u m d a p a t d i k a t a k a n b a h w a m e k a n i s m e r e p l i k a s i D N Aberlangsung secara semidiskontinu k a r e n a ada perbedaan m e k a n i s m e dalam prosessintesis kedua untaian D N A . Pada untaian D N A awal, p o l i m e r i s a s i D N A b e r l a n g s u n g secara k o n t i n usehingga molekul D N Abaru yang disintesis merupakan satu unit. Sebaliknya,pada untaian D N A lambat polimerisasi d i l a k u k a n f r a g m e n d e m i f r a g m e n . F r a g m e n -f r a g m e n D N A p e n d e k t e r s e b u t p a d a a k h i r n y a d i s a m b u n g (ligasi) d e n g a n e n z i mD N A ligase s e h i n g g a m e n j a d i u n i t y a n g u t u h . F r a g m e n - f r a g m e n D N A p e n d e kyang disintesis t e r s e b u t disebut sebagai fragmen Okazaki, o l e h k a r e n a f e n o m e n asintesis D N Asecara diskontinu tersebut pertama kali diungkapkan oleh ReijiOkazaki pada tahun 1968. Pembentukan fragmen-fragmen Okazaki tersebut dibuktikan dengan meng-gunakan m o d e l replikasi D N A bakteriofag T 4 . Dalam hal ini Okazaki menggunakanbakteriofag T 4 tipe alami m a u p u n m u t a n yang tidak m e n g k o d e enzim ligase. Sel£. coli y a n g d i i n f e k s i d e n g a n T 4 d i p e r l a k u k a n d e n g a n p u l s a - p u l s a p e n d e k ( d a l a mskala detik) senyawa berlabel yaitu ^H-timidin. D N A bakteriofag T 4yang disintesiskemudian diultrasentrifugasi pada gradien untuk mengetahui ukuran fragmenD N A yang terbentuk pada tiap-tiap perlakuan pulsa senyawa berlabel tersebut.

1 0 0 Biologi Molekular Hasll pada gradien menunjukkan bahwa dua detik setelah perlakuan telah diperoleh suatu fragmen D N A pendek berukuran sekitar 1.000-2.000 nukleotida. Fragmen- fragmen D N A yang pendek semacam ini terakumulasi dalam jumlah sangat besar jika digunakan bakteriofag T 4 yang mengalami mutasi pada gen D N A ligase.Contoh Soal 1. Sebutkan tiga hipotesis yang menjelaskan model replikasi D N A . jawaban: Tiga hipotesis mengenai replikasi D N A adalah: (1) hipotesis replikasi secara konservatif, (2) hipotesis replikasi secara semikonservatif, dan (3) hipotesis replikasi secara dispersif 2. Sebutkan beberapa tahapan dasar proses replikasi D N A . jawaban: Proses replikasi D N A berlangsung melalui beberapa tahapan dasar yaitu: (1) denaturasi untaian D N A induk, (2) inisiasi sintesis D N A , (3) pemanjangan untaian D N A , (4) ligasi fragmen-fragmen D N A y a n g d i s i n t e s i s s e c a r a l a m b a t {lagging strand) d a n , ( 5 ) t e r m i n a s i r e p l i k a s i . Peranan Primer dalam Sintesis DNA Polimerisasi D N A (replikasi D N A ) hanya dapat dimulai jika tersedia molekul p r i m e r , yaitu suatu molekul yang digunakan untuk mengawali proses polimerisasi untaian D N A . Molekul primer dapat berupa molekul D N A , RNA, atau bahkan protein spesifik. Hal ini berbeda dengan proses polimerisasi untaian R N A (proses t r a n s k r i p s i ) yang tidak memerlukan primer. Selain itu, polimerisasi D N A juga m u d a k m e m e r l u k a n c e t a k a n (template) y a n g d a p a t b e r u p a u n t a i a n D N A a t a u R N A . D a l a m p r o s e s r e p l i k a s i D N A s e c a r a in vivo, p r i m e r b e r u p a m o l e k u l R N A yang berukuran sekitar 1 0 - 1 2 nukleotida. Pada jasad eukaryot yang mempunyai k r o m o s o m berupa untaian D N A linear, fungsi p r i m e r yang digunakan untuk replikasi ujung k r o m o s o m diketahui dilakukan oleh suatu protein khusus. Dalam p r o s e s p o l i m e r i s a s i D N A s e c a r a in vitro, m i s a l n y a a m p l i f i k a s i D N A d e n g a n t e k n i k Polymerase Chain Reaction ( P C R ) , b i a s a n y a d i g u n a k a n m o l e k u l D N A sebagai primer. Fungsi primer adalah menyediakan ujung 3'-OH yang akan d i - gunakan untuk menempelkan molekul D N A pertama dalam proses polimerisasi. Bukti pertama yang menunjukkan bahwa replikasi D N A memerlukan primer berupa R N Aberasal dari penelitian mengenai replikasi bakteriofag M l 3 dengan m e n g g u n a k a n e k s t r a k s e l £. coli. D a r i p e n e l i d a n t e r s e b u t d i k e t a h u i b a h w a r e p l i k a s i M l 3 dihambat oleh antibiotik rifampicin, padahal antibiodk tersebut sebenarnya menghambat aktivitas enzim R N A polimerase, bukan D N A polimerase. Penjelasan d a r i f e n o m e n a t e r s e b u t a d a l a h b a h w a M l 3 m e n g g u n a k a n R N A p o l i m e r a s e £ coli untuk menyintesis primer R N A untuk proses sintesis D N A . Meskipun demikian, s e k a r a n g d i k e t a h u i b a h w a p a d a £ coli s i n t e s i s R N A p r i m e r t i d a k d i l a k u k a n o l e h

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 101R N A polimerase, melainkan suatu kompleks protein yang disebut primosomyang t e r d i r i atas e n z i m k h u s u s (primase) d a n beberapa p r o t e i n lain. Bukti lain tentang fungsi R N A sebagai primer dalam replikasi D N A adalahpenemuan bahwa enzim DNase tidak dapat menghancurkan fragmen Okazakisecara total. Degradasi fragmen Okazaki dengan enzim DNase ternyata meninggal-kan suatu fragmen pendek molekul R N Aberukuran sekitar 10-12 nukleotida.Bukti mengenai halinidikemukakan oleh T u n e k o Okazaki (istri Reiji Okazaki)d a n k a w a n - k a w a n p a d a t a h u n 1 9 8 5 . M e r e k a m e n g g u n a k a n m u t a n £. coli y a n gd d a k m e m p u n y a i aktivitas ribonuklease H atau aktivitas nuklease D N A p o l i m e r a s e I,atau kedua-duanya. Untuk dapat mengetahui ukuran R N A primer secara akurat,pertama kali mereka melakukan pelabelan hanya terhadap molekul R N A denganG T P yang dilabel dengan a-^^R Pelabelan dilakukan dengan menggunakan e n z i mg u a n i l i l t r a n s f e r a s e (capping enzyme) s e h i n g g a h a n y a R N A y a n g t e r l a b e l p a d aujung 5'. Selanjutnya bagian m o l e k u l D N A fragmen Okazaki didegradasi denganD N a s e dan fragmen yang terslsa dielektroforesis. Hasil autoradiografi menunjukkanada tiga macam pita yang berukuran 1 0 , 1 1 , dan 1 2nukleotida. Pita yang terlihattersebut merupakan molekul R N A karena pita tersebut tidak mengalami degradasio l e h p e r l a k u a n D N a s e . P i t a s e m a c a m i t u t i d a k d i p e r o l e h j i k a d i g u n a k a n £. collt i p e a l a m i (wild type) k a r e n a a k t i v i t a s n u k l e a s e y a n g a d a p a d a s e l m e n g h a n c u r k a nsebagian besar molekul primer sehingga tidak dapat dideteksi. S e t e l a h p r i m e r d i s i n t e s i s d a n m e n e m p e l (anneal) p a d a D N A c e t a k a n ,kemudian dilakukan sintesis D N Abaru. Molekul primer digunakan untukmenempelkan nukleotida pertama pada untaian D N A baru. Pada proses sintesisu n t a i a n D N A l a m b a t (lagging strand) d i p e r l u k a n l e b i h d a r i s a t u p r i m e r H a l i t udisebabkan sintesis D N A berlawanan arah dengan arah pembukaan garpu replikasisehingga terjadi sintesis secara diskontinu. Untaian D N Ayang baru disintesisdengan menggunakan D N A cetakan ( D N A \"induk\") sebagai acuan sehingga D N Abaru bersifat k o m p l e m e n t e r dengan cetakannya. Jika pada untaian D N A cetakanada nukleotida A misalnya, maka akan dlikatkan nukleotida T pada ujung 3'-OHprimer, sedang jika pada cetakan ada nukleotida C maka akan dlikatkannukleotida G . Demikian selanjutnya akan dilakukan pengikatan nukleotida-nukleotida pada ujung 3'-OH yang komplementer dengan cetakannya sehinggaterjadi pemanjangan untaian D N Abaru. Pada prokaryot, proses polimerisasiu n t a i a n D N A b a r u t e r s e b u t dikatallsis o l e h e n z i m D N A polimerase III. P a d auntaian D N A lambat, proses polimerisasi akan berlanjut sampai D N A polimeraseIII b e r t e m u d e n g a n u j u n g 5 ' - P R N A p r i m e r y a n g m e n e m p e l p a d a b a g i a n l a i n .Pada titik ini D N A polimerase III akan terdisosiasi dari D N A cetakan. R N A primer yang menjadi bagian fragmen Okazaki selanjutnya akan d i -d e g r a d a s i o l e h a k t i v i t a s e k s o n u k l e a s e 5'—> 3' y a n g a d a p a d a e n z i m D N A polimeraseI. B a g i a n R N A y a n g t e r d e g r a d a s i s e l a n j u t n y a d i i s i d e n g a n m o l e k u l D N A o l e ha k t i v i t a s p o l i m e r a s e 5'—> 3 ' y a n g d i m i l i k i o l e h D N A p o l i m e r a s e I. P a d a k e a d a a nini sebenarnya antara fragmen D N A yang satu dengan yang fragmen D N A yanga d a d i d e k a t n y a m a s i h a d a c e l a h a t a u t a k i k (nick). H a l i n i t e r j a d i k a r e n a b e l u mada ikatan fosfodiester antara ujung 3'-OH pada nukleotida terakhir yang disintesis

1 0 2 Biologi Molekular oleh D N A polimerase I dengan ujung 5'-P fragmen D N A yang ada didekatnya. T a k i k Ini s e l a n j u t n y a a k a n d i s a m b u n g (llgasi) o l e h a k t i v i t a s e n z i m D N A ligase dengan menggunakan N A D atau A T P sebagai sumber energi. Keadaan yang agak berbeda terjadi pada proses sintesis untaian D N A awal {leading strand). O l e h k a r e n a a r a h s i n t e s i s u n t a i a n D N A a w a l a d a l a h s e a r a h dengan arah pembukaan garpu replikasi, maka sintesis D N A berlangsung secara kontinu. Pada untaian D N A ini hanya diperlukan satu m o l e k u l p r i m e r yaitu pada titik awal replikasi. Selanjutnya untaian D N A baru disintesis dengan adanya aktivitas D N A polimerase III secara k o n t i n u tanpa a d ap e m b e n t u k a n fragmen Okazaki. Secara skematis mekanisme dasar replikasi D N A dapat diperhatikan pada Gambar 7.3. Studi telah menunjukkan bahwa diantara tiga enzim polimerase yang terlibat d a l a m r e p l i k a s i D N A p a d a s e l £. coli, h a n y a D N A p o l i m e r a s e I I I y a n g d i g u n a k a n untuk proses polimerisasi primer. D N Apolimerase I hanya digunakan untuk mengisi takik antara fragmen-fragmen Okazaki selain untuk proses reparasi D N A yang rusak. D N A p o l i m e r a s e II juga terlibat dalam proses reparasi D N A . Arah Replikasi DNA Pada model replikasi seperti yang dijelaskan diatas, replikasi berlangsung k e satu arah sehingga hanya ada satu untaian D N A awal dan satu untaian D N A lambat. Pada kenyataannya telah diketahui bahwa replikasi juga dapat berlangsung ke dua a r a h y a n g b e r l a w a n a n , y a i t u d i k e n a l s e b a g a i replikasi d u a a r a h (bidirectional replication). S e b a g i a n b e s a r s i s t e m r e p l i k a s i b a h a n g e n e t i k y a n g s u d a h d i k e t a h u i dilakukan dengan sistem replikasi dua arah. Dalam replikasi dua arah akan ter- bentuk dua garpu replikasi yang bergerak k e arah yang berlawanan. Pada kedua garpu replikasi tersebut juga terjadi sintesis D N A baru secara kontinu dan diskontinu sehingga adadua untaian D N A awal d a nd u a untaian lambat. Pada awalnya hanya diketahui bahwa replikasi D N A dimulai dengan terjadinya pembukaan untaian D N A untai-ganda pada tempat tertentu. Bagian D N A yang membuka tersebut semakin lama akan semakin besar sehingga membentuk s t r u k t u r s e r u p a g e l e m b u n g s e h i n g g a d i s e b u t s e b a g a i g e l e m b u n g replikasi (repli- cation bubble). P e m b e n t u k a n g e l e m b u n g r e p l i k a s i t e r s e b u t p e r t a m a k a l i d i u n g k a p k a n o l e h J o h n C a i r n s p a d a t a h u n 1 9 6 3 y a n g m e l a k u k a n p e l a b e l a n p a d a D N A £. coli d e n g a n p r e k u r s o r D N A r a d i o a k t i f . P e r l u d i i n g a t b a h w a g e n o m £. coli b e r u p a molekul D N A lingkanTerhadap D N A yang mengalami replikasi tersebut kemudian d i l a k u k a n a u t o r a d i o g r a f i s e h i n j ^ a d i p e r o l e h c i t r a (image) m e n g e n a i s t r u k t u r D N A yang mengalami replikasi. D N A yang mengalami replikasi tersebut mempunyai struktur yang spesifik yaitu menyerupai huruf 0 (theta) sehingga replikasinya dikenal sebagai mekanisme replikasi 6 . S e m a k i n l a m a g e l e m b u n g replikasi akan semakin besar sampai akhirnya terbentuk dua molekul. Studi yang dilakukan oleh John Cairns belum dapat menjelaskan apakah replikasi dilakukan hanya k e satu arah atau ke dua arah.

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 103G a m b a r 7.3 • S k e m a dasar proses replikasi D N A . P e r t a m a - t a m a , D N A u n t a i -g a n d a m e m b u k a s e h i n g g a m a s i n g - m a s i n g u n t a i a n d a p a t m e n j a d i c e t a k a n (tem-plate) u n t u k s i n t e s i s D N A b a r u . O r i e n t a s i s i n t e s i s D N A a d a l a h d a r i u j u n g 5 ' k eujung 3' sehingga untaian D N A baru disintesis k e arah y a n g berbeda (secarageometris). D N A yang satu disintesis searah dengan p e m b u k a a n garpu replikasi( d i s e b u t s e b a g a i u n t a i a n D N A a w a l a t a u leading strand, s e d a n g k a n u n t a i a n y a n glain disintesis dengan arah yang berlawanan dan disebut untaian D N A lambata t a u lagging strand). U n t a i a n D N A l a m b a t d i s i n t e s i s f r a g m e n d e m i f r a g m e n(disebut sebagai fragmen Okazaki) atau diskontinu, sedangkan untaian D N Aawal disintesis secara kontinu.

Bukti bahwa replikasi D N Adapat berlangsung k e d u aarah berasal daris t u d i p a d a b a k t e r i Bacillus subtilis o l e h E l i z a b e t h G y u r a s l t s d a n R . B. W a k e y a n gd i p u b l l k a s i k a n pada t a h u n 1 9 7 3 . G y u r a s l t s d a n W a k e m e n u m b u h k a n 6 . subt/7;sdalam jangka waktu pendek dengan menambahkan prekursor D N A radioaktifyang lemah dan kemudian diikuti dengan penambahan prekursor D N A radioaktifyang kuat dengan jangka w a k t u pendek pula. Hasil autoradiografi menunjukkancitra yang tidak seragam. Pada daerah yang dekat dengan kedua garpu replikasidalam gelembung replikasi terjadi penumpukan senyawa radioaktif yang kuat. Halini m e n u n j u k k a n bahwa kedua daerah tersebut merupakan daerah yang mengalamireplikasi pada w a k t u dilakukan pelabelan dengan senyawa radioaktif yang kuat.Dengan demikian dapat ditunjukkan bahwa replikasi berjalan k e dua arah yangberlawanan karena senyawa D N A radioaktif yang kuat tidak hanya mengumpulpada satu titik, melainkan pada dua daerah yang berlawanan. Penelitian selanjutnyad e n g a n m e n g g u n a k a n £ coli j u g a m e n u n j u k k a n h a s i l y a n g s e r u p a . Replikasi yang berjalan k edua arah tidak hanya terjadi pada jasad prokaryot,melainkan juga dapat diamati pada jasad eukaryot. H a l ini dibuktikan olehJ. H u b e r m a n d a n A . T s a i d e n g a n c a r a m e l a k u k a n p e l a b e l a n D N A y a n g m e n g a l a m ir e p l i k a s i p a d a l a l a t b u a h Drosophila melanogaster. E k s p e r i m e n d i l a k u k a n d e n g a np r i n s i p s e r u p a s e p e r t i y a n g d i l a k u k a n u n t u k e k s p e r i m e n p a d a 6 . subtilis y a i t udengan memberikan pulsa prekursor D N A radioaktif kuat diikuti dengan pulsaprekursor D N A radioaktif lemah. Selain i t ujuga dilakukan pemberian pulsaradioaktif yang berkebalikan, yaitu pulsa yang lemah terlebih dahulu kemudiandiikuti dengan pulsa yang kuat. Citra autoradiografi menunjukkan ada sepasangpita dengan pola penumpukan senyawa radioaktif yang sama, yaitu mengumpulpada bagian sebelah \"dalam\" dan meruncing pada bagian \"luar\". Bagian sebelah\"dalam\" adalah bagian kedua pita yang saling berdekatan. Pada bagian dalamterjadi penumpukan senyawa radioaktifyang kuat, sedangkan bagian luar kelihatanmeruncing karena terjadi p e n u m p u k a n senyawa radioaktif yang lemah. Jikaeksperimennya dibalik, yaitu pulsa radioaktif lemah dahulu kemudian diikuti denganpulsa radioaktif kuat, maka citra yang dihasilkan akan berkebalikan yaitu bagian\"dalam\" akan kelihatan meruncing. Hasil eksperimen ini juga m e m b u k t i k a n bahwar e p l i k a s i D N A p a d a e u k a r y o t b e r l a n g s u n g k e d u a a r a h (bidirectional). E k s p e r i m e n s e r u p a s e p e r t i y a n g d i l a k u k a n p a d a Drosophila j u g a d i l a k u k a npada sel embrionik hewan amfibi oleh H . G. Callan dankawan-kawan denganmenggunakan senyawa radioaktif kuat. Hasil autoradiografi menunjukkan citray a n g s e r a g a m , b e r b e d a d a r i c i t r a y a n g d i p e r o l e h p a d a e k s p e r i m e n d e n g a n Dro-sophila, y a i t u t i d a k a d a b a g i a n y a n g m e r u n c i n g . P i t a - p l t a y a n g t e r a m a t i p a d a c i t r aautoradiografi mempunyai ukuran yang seragam dan adapada banyak tempat.Hal ini m e m b e r i k a n indikasi bahwa replikasi terjadi pada banyak t e m p a t secarasimultan sehingga ada banyak or; pada replikasi D N A amfibi. Dengan cara demikianmaka replikasi D N A amfibi dapat berlangsung cepat karena dimulai pada banyaktempat. O l e h karena itu kemudian dikenal istilah r e p l i k o n , yaitu suatu molekulD N A y a n g d i r e p l i k a s i o l e h s a t u on, m e s k i p u n p a d a o r i t e r s e b u t a d a d u a g a r p ur e p l i k a s i y a n g b e r g e r a k k e d u a a r a h y a n g b e r l a w a n a n . D N A k r o m o s o m £ coli

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 105Contoh \ disebut satu replikon karena hanya m e m p u n y a i satu titik awal replikasi (ori), sebaliknya k r o m o s o m jasad e u k a r y o t m e r u p a k a n multireplikon k a r e n aMtu'ara/i mempunyai banyak ori. Hal ini diperlukan sebab ukuran k r o m o s o m eukaryot jauh l e b i h p a n j a n g d i b a n d i n g £ coli s e h i n g g a a k a n d i p e r l u k a n w a k t u s a n g a t l a m a u n t u k I melakukan replikasi jika hanya ada satu ori. —A Tidak semua bahan genetik direplikasi dengan sistem replikasi dua arah. Salah satu c o n t o h bahan g e n e t i k y a n g direplikasi dengan s i s t e m replikasi satu a r a h a d a l a h p l a s m i d c o l E I y a n g a d a p a d a b e b e r a p a strain £ coli. H a l i n i d i b u k t i k a n oleh Michael Lovett dengan menggunakan teknik mikroskopi elektron. Untuk mengetahui bahwa garpu replikasi hanya bergerak ke satu arah, maka pengamatan dilakukan pada periode w a k t u yang berbeda. Selain itu, molekul plasmid dipotong dengan enzim endonuklease restrlksi EcoRI yang hanya m e m o t o n g pada satu tempat sehingga molekul D N Amenjadi linear. Dengan mengamati posisi gelembung replikasi relatif terhadap ujung molekul maka dapat dibuktikan bahwa gelembung replikasi hanya bergerak k e satu arah. A r a h pergerakan garpu replikasi dapat diamati dengan menggunakan label autoradiografi. Perbedaan intensitas label menunjukkan apakah garpu replikasi bergerak k esatu arah atau k edua arah. Replikasi satu arah menyebabkan suatu label (misalnya dengan label autoradiografi 'ringan') diikuti oleh label lain yang lebih 'berat' hanya pada satu sisi autoradiograf. Sebaliknya, replikasi dua arah menghasilkan pola pelabelan seperti d i atas tetapi terjadi pada kedua sisi a u t o - r a d i o g r a f . P a d a r e p l i k a s i m o l e k u l D N A b e r b e n t u k l i n g k a r (circular), a k a n t e r b e n t u k garpu replikasi yang bergerak k edua arah sehingga membentuk struktur huruf e (theta). Posisi dan jumlah garpu replikasi akan m e m b e n t u k pola spesifik jika diamati dengan teknik elektroforesis. Analisis tersebut dilakukan dengan mengisolasi dan m e m o t o n g suatu molekul D N A yang tengah direplikasi dengan suatu enzim endonuklease restrlksi (enzim yang dapat m e m o t o n g D N A ) . Hasil pemotongan tersebut kemudian dielektroforesis dengan teknik elektroforesis dua dimensi ( 2 - D electrophoresis) d a n d i h i b r i d l s a s i d e n g a n s u a t u p e l a c a k (probe) r a d i o a k t i f . Dengan teknik elektroforesis ini, pertama kali molekul D N A dipisahkan ber- dasarkan atas massanya, selanjutnya dilanjutkan dengan pemisahan (separasi) berdasarkan bentuk molekul. Pola autoradiografi akan menunjukkan deviasi elektroforetik D N A dari struktur linear. Perbedaan bentuk garpu replikasi akan menghasilkan pola elektroforetik yang berbeda, seperti diperlihatkan secara skematis pada G a m b a r 7.4.Pemisahan Untaian DNA\ IVIacam-macam Seperti telah dijelaskan sebelumnya, replikasi D N A dimulai dengan proses pemisah- helikase an kedua untaian D N A induk yang akan direplikasi. Proses pemisahan ini dilakukan o l e h e n z i m helikase. D i d a l a m s e l £ coli d i k e t a h u i a d a e m p a t m a c a m D N A h e l i k a s e y a i t u helikase r e p , D N A helikase I, D N A helikase II, d a n protein DnaB.

Titik a w a l replikasi (ori) 1 I Pulsa radioaktif rendah ^::=^ Pulsa radioaktif rendah Pulsa radioaktif tinggi tt Titik awal pulsa radioaktif tinggiG a m b a r 7.4i S k e m a arah replikasi y a n g d i b u k t i k a n secara eksperimental m e n g -g u n a k a n radioaktif. (Diadaptasi dari Weaver, 2003.)Studi menunjukkan bahwa enzim helikase yang berperanan dalam pemisahanuntaian D N Aadalah p r o t e i n DnaB. H a l ini dibuktikan dengan menggunakanm u t a n £. coli y a n g p e k a t e r h a d a p s u h u . M u t a s i p e k a - s u h u (temperature-sensitive)p a d a g e n dnaB m e n y e b a b k a n t e r h e n t i n y a s i n t e s i s D N A p a d a £ coli j i k a s u h upertumbuhan dinaikkan sampai mencapai aras tertentu. Selain itu diketahui bahwaprotein D n a B juga bersifat sebagai ATPase. Eksperimen yang dilakukan oleh Jonathan LeBowitz dan Roger McMackenpada tahun 1986 menunjukkan bahwa D n a B mempunyai aktivitas helikase.H a lini ditunjukkan dengan menggunakan D N A sirkular bakteriofag M l 3 yang ditempelioleh suatu molekul D N A linear pendek yang sudah dilabel. K e dalam substratD N A tersebut kemudian ditambahkan protein D n a B d a n campuran i t u laludiinkubasi. Setelah itu dilakukan elektroforesis untuk melihat apakah terjadi pe-misahan antara D N A M l 3 dengan molekul D N A pendek yang ditempelkan. Hasllelektroforesis menunjukkan bahwa molekul D N Apendek tersebut kemudianmemisah sehingga mengalami migrasi secara lebih cepat pada gel elektroforesis

Peranan Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 1 0 7p r o t e i n SSB dibanding dengan D N A M l 3. E k s p e r i m e n t e r s e b u t m e n u n j u k k a n b a h w a aktivitas protein DnaB telah menyebabkan terpisahnya molekul D N Apendek yang di- t e m p e l k a n pada D N A M l 3. D e n g a n kata lain, p r o t e i n D n a B m e m p u n y a i aktivitas helikase. Selain helikase, enzim lain yang juga berperanan dalam pemisahan untaian D N A adalah e n z i m D N A girase. D N A girase adalah salah s a t u e n z i m topoiso- merase, yaitu suatu e n z i m yang dapat m e n g u b a h t o p o l o g i m o l e k u l D N A . Per- ubahan topologi tersebut dilakukan dengan cara memutuskan ikatan hidrogen p a d a s a l a h s a t u a t a u k e d u a u n t a i a n D N A s e c a r a s e m e n t a r a (transient). D N A girase (topoisomerase II) adalah enzim yang dapat menghilangkan pilinan positif (atau dengan kata lain menlmbulkan pilinan negatif) yang terbentuk sewaktu terjadi replikasi D N A (yaitu sewaktu garpu replikasi bergerak maju). Oleh karena Itu, D N A girase akan m e n e m p e l pada D N A pada daerah didepan garpu replikasi. Peranan D N A girase dalam replikasi D N A dibuktikan dengan menggunakan a n t i b i o t i k y a n g d a p a t m e n g h a m b a t a k t i v i t a s e n z i m i n i y a i t u k o u m e r m i s i n (cou- mermycin), a s a m n a l i d i k s a t (nalidixic acid), a s a m o k s o l i n a t (oxolinic acid), d a n n o v o - b i o s l n (novobiocin). P e n a m b a h a n a n t i b i o t i k s e m a c a m i n i k e d a l a m k u l t u r b a k t e r i yang sedang t u m b u h menyebabkan penghambatan sintesis D N A . D i samping itu b u k t i j u g a m u n c u l d a r i s t u d i d e n g a n m e n g g u n a k a n m u t a n £. coli. J i k a D N A g i r a s e d i i s o l a s i d a r i s e l t i p e a l a m i d a n d a r i s e l m u t a n £. coli d a n d i u j i p e n g i k a t a n n y a dengan antibiotik maka hanya enzim dari sel tipe alami yang dapat berikatan dengan antibiotik tersebut. Selain enzim helikase d a n D N Agirase, protein lain yang terlibat dalam p e m i s a h a n u n t a i a n D N A i n d u k a d a l a h p r o t e i n S S B (single-strand binding pro- tein). P e r a n a n p r o t e i n S S B a d a l a h u n t u k m e n j a g a a g a r b a g i a n D N A y a n g s u d a h terpisah t i d a k b e r i k a t a n lagi sehingga dapat digunakan sebagai cetakan. P r o t e i n S S B p a d a £. coli d i k o d e o l e h g e n ssb, p a d a b a k t e r i o f a g T 4 d i k e n a l s e b a g a i p r o t e i n g p 3 2 (gene produa 32), s e d a n g k a n p a d a b a k t e r i o f a g M l 3 d i s e b u t gp5. P r o t e i n - protein tersebut mempunyai sifat kooperatif, artinya pengikatan satu molekul p r o t e i n p a d a u n t a i - t u n g g a l D N A a k a n m e n i n g k a t k a n k e k u a t a n i k a t (affinity) m o l e k u l yang lain beberapa ribu kali. Masing-masing jenis protein tersebut m e m p u n y a i sifat ikatan yang berbeda. Protein gp32 berikatan sebagai rantaian m o n o m e r , p r o t e i n g p 5 s e b a g a i r a n t a i a n d i m e r , s e d a n g k a n p r o t e i n S S B p a d a £. coli b e r i k a t a n sebagai tetramer. Beberapa sifat dasar protein SSB dapat dilihat pada Tabel 7.1.^Pembentukan Garpu Replikasi Sebelum replikasi dimulai, D N A akan mengalami perubahan struktural yang me- mungkinkan dimulainya proses sintesis untaian D N A yang baru. Setelah untaian D N A dipisahkan dandibuka dengan aktivitas beberapa enzim, selanjutnya ter- bentuklah struktur garpu replikasi. Bagian D N A yang sedang direplikasi m e m - bentuk garpu replikasi yang akan dijaga tetap dalam keadaan terbuka oleh aktivitas protein SSB. G a r p u replikasi akan bergerak seiring berlangsungnya sintesis untaian

1 0 8 Biologi Molekular Tabel 7.1I Sifat-sifat protein SSB pada prokaryot.Sifat gp32 (T4) gp5 (M13) SSB (E. coldPengikatan Ya Ya Ya• D N A>R N A Ya Ya Ya• untai-tunggal > 10 4 8-16 untai-ganda menstimulasi replikasi menghambat sintesis menstimulasi replikasi• banyaknya nukleotida dan rekombinasi untaian D N A dan reparasi D N A yang terikat per yang komplementer 800 monomer 75.000 270Fungsi biologis 19,4 75,6 Dimer Tetramer Jumlah per sel 10.000 Jumlah per garpu 170 replikasi 33,5 Massa alami (kDa) Monomer Bentuk alami(Sumber: Weaver, 2003.)D N A baru, baik untaian D N A awal maupun untaian D N Alambat. Untaian D N Abaru akan m e m b e n t u k ikatan hidrogen dengan untaian D N Ainduk sehinggaterbentuk dua untaian D N A . Pada garpu replikasi tersebut ditempelkan molekulprimer yang akan mengawali proses sintesis D N A baru.Inisiasi Replikasi D N A Inisiasi (peng-\"awal\"-an) replikasi D N A adalah proses permulaan sintesis untaian D N A yang sebelumnya didahului oleh sintesis m o l e k u l p r i m e r Proses inisiasi berlangsung dengan mekanisme yang berbeda antara suatu jasad dengan jasad y a n g l a i n . P a d a b a k t e r i £. coli, s i n t e s i s p r i m e r d i k a t a l l s i s o l e h k o m p l e k s p r o t e i n yang disebut p r i m o s o m . P r i m o s o m terdiri atas enzim p r i m a s e / D n a G (berperanan dalam sintesis molekul primer), protein PriA, PriB, PriC, DnaT, DnaB, dan DnaC. P a d a £ coli d i k e t a h u i a d a d u a t i p e a t a u s i s t e m r e a k s i i n i s i a s i , y a i t u ( 1 ) s i s t e m O X , d a n ( 2 ) s i s t e m oriC. S i s t e m O X a d a l a h s i s t e m i n i s i a s i r e p l i k a s i D N A v i r u s O X I 7 4 , s e d a n g k a n s i s t e m oriC a d a l a h s i s t e m i n i s i a s i y a n g m e l i b a t k a n o r i p a d a £ coll.Inisiasi Replikasi p a d a Virus 0 X 1 7 4Pada replikasi D N A O X I 74, kompleks p r i m o s o m terkumpul pada suatu titiky a n g d i s e b u t s e b a g a i primosome assembly site ( p a s ) . D a e r a h pas i n i d i k e n a l i o l e hprotein PriA yang mempunyai aktivitas ganda, yaitu sebagai helikase dan dapatmenyingkirkan SSB. Kemampuan ganda PriA semacam ini bersifat unik karenahanya diperlukan dalam sistem inisiasi O X .Protein PriA, PriB, d a n PriC tidakd i p e r l u k a n d a l a m i n i s i a s i r e p l i k a s i D N A d e n g a n s i s t e m oriC.

Bab 7 Replikasi Bahan Genebk 109 Diketahui bahwa pada replikasi D N A O X I 74, peranan protein DnaB sangatpenting d a ntidak dapat digantikan, sementara protein-protein lalnnya dapatdihilangkan. Hal ini dibuktikan oleh Kornberg dan kawan-kawan yang menunjukkanbahwa D N A untai-tunggal O X I 74 dapat direplikasi menjadi untai-ganda hanyaoleh d u a m a c a m protein, yaitu h o l o e n z i m D N A polimerase III d a n proteinDnaB. A k a n tetapi, jika terdapat protein SSB,maka u n t u k inisiasi replikasi d i -perlukan protein-protein lalnnya yaitu DnaC, DnaT, PriA, PriB, dan PriC. Pro-tein D n a B merupakan k o m p o n e n sentral pada inisiasi replikasi dengan sistemO X m a u p u n s i s t e m oriC d a n a k a n m e m b e n t u k s u a t u k o m p l e k s d e n g a n D n a C .K o m p l e k s p r i m o s o m O X I 7 4 t e r b e n t u k d e n g a n d i a w a l i o l e h p e n g e n a l a n s i s i pasoleh PriA. Protein PriB dan PriC juga melekat pada daerah pos pada awal prosesinisiasi. Berikutnya, D n a B dan D n a C m e m b e n t u k suatu kompleks, dengan dibantuoleh ATP. Kompleks ini bersama-sama dengan D n a T m e m b e n t u k preprimosom.Akhirnya, primase melekat pada preprimosom dan membentuk primosom. P r i m o s o m O X I 74 dapat berpindah dari satu titik ke titik lain selama prosesreplikasi dan dapat menyintesis primer berulang-ulang sewaktu bergerak sepanjangD N A virus yang terbuka. H a l ini berbeda dengan sifat primase (atau R N Apolimerase), yang digunakan untuk sintesis primer, karena primase hanya meng-inisiasi sintesis D N A pada satu titik yaitu titik awal replikasi (ori). Primase adalah enzim yang sesungguhnya melakukan proses pengawalanreaksi atau inisiasi replikasi D N A . Enzim ini, baik pada sistem O X m a u p u n sistemoriC, d i k o d e o l e h g e n dnaG. P r i m a s e m e r u p a k a n p o l i p e p t i d a t u n g g a l d e n g a nukuran 6 0kDa. Enzim ini pada dasarnya adalah R N A polimerase yang digunakansecara khusus untuk menyintesis R N A primer yang diperlukan dalam replikasiD N A . Primase m e m b e n t u k asosiasi sementara dengan p r i m o s o m dan diaktifkanoleh protein D n a B untuk menginisiasi sintesis primer. Ukuran primer berkisarantara 15-50 nukleotida. Primase menyintesis primer dengan urutan nukleotidaawal berupa (ppp)AG yaitu pada cetakan yang berupa urutan 5'-GTC-3'.Inisiasi Replikasi p a d a Bakteriofag M l 3 dan G4Berbeda dengan yang terjadi pada virus lain, pada bakteriofag M l 3 sintesis primertidak dilakukan oleh primase melainkan oleh enzim R N A polimerase sel inang-n y a . H a l i n i d i k e t a h u i d a l a m e k s p e r i m e n y a n g m e l i b a t k a n p e n g g u n a a n rifampicindan inhibitor R N A polimerase lalnnya yang ternyata menyebabkan penghambat-an replikasi D N A bakteriofag M l 3. Sebaliknya pada bakteriofag yang lain yaituG4, diketahui bahwa sintesis primer dilakukan oleh primase yang dikode olehg e n dnaG. Bakteriofag G 4 menggunakan primase yang sama seperti yang digunakanoleh O X I 74 tetapi tanpa menggunakan protein lain seperti yang digunakan olehO X I 74. Hal ini ditunjukkan oleh Kornberg dan kawan-kawan, pada tahun 1975,yang membuktikan bahwa D N A bakteriofag G 4untai-tunggal dapat diubah menjadiu n t a i - g a n d a s e c a r a in vitro. P r o t e i n - p r o t e i n y a n g d i p e r l u k a n u n t u k m e n g u b a h u n t a i -tunggal menjadi untai-ganda tersebut adalah D N A polimerase III h o l o e n z i m ,protein SSB, danprimase. Penelitian selanjutnya oleh Kornberg dan kawan-

kawan menunjukkan bahwa ukuran primer yang disintesis adalah sekitar 26-29nukleotida. primer tersebut mempunyai potensi untuk m e m b e n t u k struktur 'jepitr a m b u t ' (hair pin).Inisiasi Replikasi p a d a E. coliR e p l i k a s i D N A £ coli j u g a d i l n l s l a s i d e n g a n p e m b e n t u k a n p r i m o s o m t e t a p i d e n g a no r g a n i s a s i y a n g b e r b e d a d a r i p r i m o s o m O X I 7 4 . P a d a D N A £ coli, r e p l i k a s id i m u l a i p a d a s u a t u t i t i k y a n g d i s e b u t oriC. T i t i k a w a l r e p l i k a s i i n i t e r s u s u n a t a s245 pasang basa yang mengandung urutan nukleotida T T A T C C A C A sebanyake m p a t k a l i . U r u t a n i n i l a h y a n g m e r u p a k a n t e m p a t p e l e k a t a n p r o t e i n dnaA ( D n a A )yang berperanan dalam p e m b u k a a n untaian ganda D N A pada or/C dan seringkalidisebut sebagai kotak d n a A . Inisiasi replikasi p a d a or/'C d i l a k u k a n o l e h e n a m m a c a m p r o t e i n y a i t u : D n a A ,DnaB, DnaC, H U , girase, d a nSSB. Pada awalnya, D n a A melekat pada urutankonsensus sepanjang 9 pasang basa. Setelah D n a A melekat pada daerah ini makaselanjutnya protein tersebut melakukan pembukaan D N Apada suatu urutanp a s a n g - b e r u l a n g (tandem repeats) s e p a n j a n g 1 3 p a s a n g b a s a s e h i n g g a t e r b e n t u kk o m p l e k s t e r b u k a (open complex). S e t e l a h t e r b e n t u k k o m p l e k s t e r b u k a m a k akemudian terjadi pelekatan protein DnaB. Dalam halini, protein D n a A secaralangsung memengaruhi pelekatan DnaB pada D N A . Protein DnaA dan D n a Cakan berikatan m e m b e n t u k suatu agregat berukuran sekitar 4 8 0kDa. DnaBm e m p u n y a i a k t i v i t a s helikase y a n g m e l a k u k a n p r o s e s p e n g u r a i a n (unwinding)lilitan D N Ayaitu dengan jalan menyingkirkan DnaA. D n a A sendiri berperandalam membuka ikatan antar-untaian D N A sehingga membentuk kompleksterbuka. Meskipun R N Apolimerase tidak digunakan untuk membuat primer,n a m u n e n z i m Ini berperan dalam menyintesis m o l e k u l R N A pendek yang dapatm e m b e n t u k s t r u k t u r R-loop. D i d u g a p e m b e n t u k a n R - / o o p i n i b e r s a m a - s a m adengan aktivitas protein HU akan menyebabkan ketidakstabilan struktur heliksD N A sehingga D N A membuka menjadi kompleks terbuka. Protein H U sendirimampu melakukan pembengkokan struktur D N A sehingga menyebabkanperubahan struktural pada D N A . Selain D n a A d a n DnaB, juga diperlukan d u a macam protein lain untukp r o s e s p e n g u r a i a n l i l i t a n D N A y a i t u girase d a n p r o t e i n S S B (single-strand bind-ing). G i r a s e b e r f u n g s i u n t u k m e m u t a r u n t a i a n D N A s e h i n g g a k e d u a u n t a i a nD N A mengalami rotasi satu sama lain. Hal ini perlu dilakukan untuk mengurangiterjadinya ketegangan pilinan molekul D N A . Setelah molekul D N A mulai terbukamaka protein SSB menempel pada untaian D N Ayang sudah menjadi untai-tunggal sehingga menjadi stabil dan tidak m e n u t u p lagi. A k h i r n y a , aktivitas D n a Ba k a n m e n s t i m u l a s i p e n g i k a t a n p r i m a s e ( p r o t e i n dnaG) u n t u k m e m b e n t u k s t r u k t u rlengkap p r i m o s o m sehingga proses inisiasi dapat dilakukan. P r i m o s o m tetap berada pada replisom (unit D N A yang mengalami replikasi)selama proses pemanjangan D N A dan mempunyai dua fungsi. Fungsi p r i m o s o madalah: (1) melakukan inisiasi secara berulang-ulang dalam sintesis fragmen Okazakiy a i t u p a d a u n t a i a n D N A l a m b a t (lagging strand), (2) p r o t e i n D n a B b e r f u n g s i

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 1 1 1 sebagai helikase yang menguralkan D N A untuk digunakan sebagai cetakan balk b a g i u n t a i a n D N A a w a l (leading strand) m a u p u n u n t a i a n D N A l a m b a t . U n t u k m e l a k u k a n h a l I n i m a k a D n a B a k a n b e r g e r a k d e n g a n a r a h 5 ' —> 3 ' p a d a c e t a k a n untaian D N A lambat, yaitu dengan arah yang sama dengan arah yang ditempuh oleh pergerakan garpu replikasi. Dengan cara demikian maka p r i m o s o m akan terikat pada untaian D N A lambat karena primosom diperlukan untuk menyintesis fragmen Okazaki. E n z i m y a n g B e r p e r a n a n dalam Proses Inisiasi Replikasi Proses Inisiasi replikasi D N A pada p r o k a r y o t melibatkan aktivitas beberapa enzim yang masing-masing mempunyai fungsi khusus (Tabel 7.2).T a b e l 7.2I E n z i m /p r o t e i n y a n g b e r p e r a n a n d a l a m inisiasi replikasi D N A p a d a p r o k a r y o t . Nama Peranan Ukuran Jumlah/sel Gen (dalton) dnaADnaA Membuka untaian D N A 20 dnaB secara lokal 330.000 20 dnaCHelikase M e m b u k a lilitan D N A 29.000 50 dnaT(DnaB) 66.000 200 ssbDnaC Bekerja bersama dengan 76.000 DnaBDnaTSSB Preprinting Menjaga agar D N A yang sudah terbuka tidak tertutup lagiPriA Mengenali tempat 82.000 50 priA pembentukan primer (pas), m e n y i n g k i r k a n S S BDnaG Menyintesis R N A primer 60.000 75 dnaGHU M e m b e n g k o k k a n m o l e k u l D N A untuk proses pembukaan untaian D N A^ Proses Pemanjangan (Polimerisasi) Molekul D N A ^ Sintesis primer adalah awal proses replikasi D N Ayang sesungguhnya. Proses s i n t e s i s D N A p a d a £. coli d a n p e m a n j a n g a n n y a ( p o l i m e r i s a s i ) d i l a k u k a n o l e h e n z i m D N A p o l i m e r a s e III ( h o l o e n z i m ) . E n z i m i n i t e r d i r i a t a s 1 0 s u b u n i t y a n g m e m b e n t u k 3 s a t u a n s u b u n i t (subassemblies), y a i t u : ( 1 ) inti katalitik (catalytic core), (2) Pol III', d a n ( 3 ) k o m p l e k s y ( A T P a s e ) . D a f t a r r i n c i s u b u n i t D N A p o l i m e r a s e III ( h o l o e n z i m ) d a n f u n g s l n y a m a s i n g - m a s i n g d a p a t d i l i h a t p a d a T a b e l 7.3.

T a b e l 7 . 3 I K o m p o s i s i s u b u n i t D N A p o l i m e r a s e I I I ( h o l o e n z i m ) p a d a E. coli.Subunit Massa molekular (kDa) Fungsia 129,9 D N A polimerasee 27,5 E k s o n u k l e a s e 3 ' -> 5'e 8,6 Menstimulasi eksonukleasee 71,1 M e m b u a t d i m e r i n t i {core),T mengikat kompleks y 47,5 Mengikat A T PY 38,7 T e r i k a t p a d a (35 36,9 Terikat pada y dan 85' 16,6 Terikat pada SSBX 15,2 Terikat pada %dan yV 40,6 Penjepit enzim pada D N AP(Sumber: Weaver, 2003.)S a t u a n s u b u n i t inti katalitik t e r s u s u n a t a s s u b u n i t [ a , e , d a n 0 ] y a n gb e r p e r a n a n s e b a g a i u n i t u t a m a y a n g m e l a k u k a n s i n t e s i s D N A . S a t u a n s u b u n i t PolIII' t e r s u s u n atas 2 (dua) inti k a t a l i t i k d i t a m b a h dengan s u b u n i t T dan b e r p e r a n a ndalam meningkatkan prosesivitas kompleks holoenzim, sedangkan satuan subunitkompleks y tersusun atas subunit [y, 5 , 5', danp].Ketiga satuan subunitt e r s e b u t a k a n m e m b e n t u k D N A p o l i m e r a s e I I I h o l o e n z i m . D a l a m k e a d a a n invitro, h o l o e n z i m t e r s e b u t d a p a t m e l a k u k a n p o l i m e r i s a s i n u k l e o t i d a d e n g a nk e c e p a t a n 7 0 0 n u k l e o t i d a p e r d e t i k , s e d a n g k a n g a r p u r e p l i k a s i £. coli b e r g e r a kdengan kecepatan 1.000 nukleotida p e rdetlk. Sebaliknya, D N Apolimerase I danII t i d a k b e r u p a s t r u k t u r h o l o e n z i m d a n k e c e p a t a n r e p l i k a s i D N A - n y a j a u h l e b i hlambat dibandingkan dengan D N A polimerase III holoenzim.P a d a £. coli, p r o s e s p e m a n j a n g a n / p o l l m e r i s a s i D N A d i l a k u k a n o l e h k o m p l e k sD N A polimerase IIIholoenzim, sedangkan pada e u k a r y o t dilakukan oleh D N Apolimerase a dan 6 yang masing-masing melakukan polimerisasi untaian D N Al a m b a t d a n u n t a i a n D N A a w a l . P a d a s i s t e m £. coli a d a s i s t e m k o o r d i n a s i d a l a mhal sintesis untaian D N A lambat dan untaian D N A awal oleh D N A polimeraseIII h o l o e n z i m m e s k i p u n a r a h g e o m e t r i s n y a b e r b e d a .P r i m o s o m akan bergerak sepanjang untaian D N A induk dengan arah 5'—>3'sehingga arah pergerakannya berlawanan dengan arah pemanjangan untaian D N Alambat. Perlu diingat bahwa sintesis untaian D N Aawal danproses pemanjangan-nya dilakukan secara kontinu searah dengan pergerakan garpu replikasi sehinggatidak adapersoalan mekanis. H a liniberbeda dengan sintesis d a n polimerisasiD N A lambat yang harus dilakukan secara bertahap sambil menunggu terbukanyagarpu replikasi. Setelah garpu replikasi m e m b u k a , yaitu dalam proses inisiasi, danbergerak maju maka adabagian beruntai-tunggal didepan p r i m o s o m . P r i m o s o mselanjutnya akan bergerak, searah dengan pergerakan garpu replikasi, untukmelakukan sintesis dan polimerisasi D N A lambat dengan menggunakan cetakanD N A yang sudah terbuka dalam keadaan untai-tunggal tersebut. Dengan demikianmaka arah pergerakan p r i m o s o m searah dengan pergerakan garpu replikasi tetapi

B a b 7 R e p l i k a s i B a h a n G e n e t i k 113 berlawanan dengan arah polimerisasi untaian D N A lambat. Mekanisme semacam Ini m e n l m b u l k a n kompllkasi g e o m e t r i s karena polimerisasi D N A awal dilakukan searah dengan arah gerakan garpu replikasi, sedangkan arah polimerisasi D N A lambat dilakukan dengan arah yang berlawanan dengan arah polimerisasi D N A awal. Persoalan semacam Ini diatasi dengan suatu sistem koordinasi yang elegan tanpa harus menggunakan dua kompleks D N A polimerase.Koordinasi Poiimerasi DNA Lambat dan DNA Awal Meskipun belum adabuktl empiris yang kuat, namun sistem koordinasi sintesis untaian D N Aawal d a nD N A lambat dapat dijelaskan sebagai berikut. Seperti telah dijelaskan sebelumnya, kompleks D N A polimerase holoenzim terdiri atas beberapa satuan subunit, antara lain adalah Inti katalitik. Pada saat terjadi replikasi, Inti katalldk akan melekat pada kedua untaian D N A cetakan. Pada w a k t u kompleks D N A polimerase III bergerak sepanjang D N A induk maka terjadi sintesis D N A awal. Secara periodik, p r i m o s o m akan melakukan sintesis fragmen Okazaki (fragmen D N A lambat). Untuk mengatasi persoalan perbedaan arah geometris sintesis D N A awal dan D N A lambat, maka untaian D N A induk yang digunakan sebagai cetakan untuk D N A lambat ditarik sedemikian rupa m e m b e n t u k lengkung- a n (loop) k e a r a h p e r g e r a k a n k o m p l e k s D N A p o l i m e r a s e I I I . M o l e k u l p r o t e i n DnaB (helikase) yang terletak di depan kompleks D N Apolimerase holoenzim akan membuka ikatan antara kedua untaian D N A cetakan dan bergerak 'ke depan'. Dengan cara demikian maka k o m p l e k s D N A polimerase III dapat menjangkau kedua cetakan D N A dan melakukan sintesis D N A awal dan D N A lambat secara simultan. Skema koordinasi sintesis kedua untaian D N A tersebut dapat dilihat pada Gambar 7.5. Pada replikon O X I 74, molekul protein PriA (bagian dari kompleks p r i m o s o m yang menyintesis primer untuk D N A lambat), bergerak berlawanan arah dengan arah pergerakan garpu replikasi sekaligus menyingkirkan protein SSB. Seperti diketahui protein SSBberfungsi untuk menjaga agar untaian D N A cetakan (induk) yang sudah terbuka tidak menutup kembali. Oleh karena Itu pada waktu garpu replikasi bergerak maju, maka PriA akan bergerak k e arah yang berlawanan untuk menyingkirkan SSB sehingga proses pemanjangan D N A lambat tidak ter- g a n g g u . S e b a l i k n y a , p a d a r e p l i k o n o r / C ( p a d a £. coli), p r o t e i n P r i A t i d a k d i p e r l u k a n sehingga peranannya dilakukan oleh protein D n a B sekaligus. Secara sederhana koordinasi sintesis D N A awal dan D N A lambat dapat dijelaskan sebagai berikut:Koordinasi 1 . D n a B ( h e l i k a s e ) , y a n g b e r f u n g s i u n t u k m e m b u k a i k a t a n D N A , b e r g e r a k searaiisintesis l<edua dengan arah sintesis untaian DNA awal. S e t e l a h D N A d i b u k a m a k a p r o t e i n S S Bf r a g m e n DNA menempel pada D N A . 2. Masing-masing inti katalitik D N A polimerase III akan terikat pada kedua untaian D N Ainduk (cetakan) d a nmenyintesis baik D N Aawal maupun D N A lambat.

1 1 4 Biologi Molekular Topoisomerase Arah gerakan garpu replikasi Fragmen Okazaki Protein SSB D N A polimerase I Protein penguat LigaseUntaian D N A awal Protein penjepit(leading strand) (clamp protein) Untaian D N A lambat (lagging strand)G a m b a r 7.5 I K o o r d i n a s i sintesis D N A k e a r a h b e r l a w a n a n . U n t u k m e n g a t a s ipersoalan arah (geometris) sintesis D N A y a n g berlawanan, m a k a D N A cetakany a n g d i g u n a k a n u n t u k s i n t e s i s D N A l a m b a t (lagging strand) d i l i p a t s e d e m i k i a nrupa sehingga pada daerah y a n g berikatan dengan D N A polimerase, sintesisD N A pada kedua cetakan berlangsung k earah (geometris) yang sama.3. K o m p l e k s p r i m o s o m akan m e n a r i k untaian D N A induk yang digunakansebagai cetakan untuk sintesis D N Alambat k e arah yang sesuai dengan arahpergerakan D n a B (helikase), sekaligus menyintesis primer4. Salah satu inti katalitik D N A p o l i m e r a s e III a k a n menyintesis f r a g m e n O k a z a k i .5. Pada w a k t u garpu replikasi bergerak maju (searah dengan pergerakan sintesisD N A a w a l ) , m a k a protein PriA ( s a / a h satu komponen primosom) akan bergerakberlawanan arah dari arah gerakan garpu replikasi, s e k a l i g u s m e n y i n g k i r k a n S S B .

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 115 6. D N A p o l i m e r a s e III akan m e m p e r p a n j a n g D N A l a m b a t yang sedang disintesis sampai bertemu dengan ujung 5' dari fragmen Okazaki yang sudah disintesis sebelumnya, kemudian D N A cetakan dilepaskan. Dengan model semacam ini maka dapat dijelaskan mekanisme replikasi oleh satu kompleks D N A polimerase pada kedua untaian D N A yang berlangsung k e arah yang berbeda. Pada untaian D N A awal, sintesis D N A berlangsung secara kontinu dari satu titik awal replikasi sampai k e ujung D N A . Sebaliknya, pada untaian D N A lambat, sintesis D N A berlangsung tahap demi tahap. H a l ini mungkin melibatkan proses pendauran subunit D N A polimerase tertentu, misalnya proses disosiasi d a nreasosiasi antara kompleks ^ d a ninti katalitik. Holoenzim digunakan secara efisien. D i dalam selbakteri yang sedang t u m b u h cepat terdapat sekitar 1 0 kopi holoenzim. U k u r a n g e n o m £. coli s e k i t a r 4 , 6 M b ( 4 , 6 j u t a p a s a n g a n b a s a ) . U n t u k melakukan replikasi genom diperlukan enzim D N Apolimerase dengan kemampuan replikasi yang tinggi tanpa terdisosiasi dari cetakan (disebut sebagai prosesivitas). I n t i k a t a l i t i k D N A p o l i m e r a s e s e n d i r i s e c a r a in vitro m e r u p a k a n polimerase yang proseslvitasnya rendah, yaitu hanya mampu menambahkan 1 0 n u k l e o t i d a k e m u d i a n t e r d i s o s i a s i . S e b a l i k n y a , d i d a l a m s e l (in vivo) g a r p u r e p l i k a s i bergerak dengan laju sekitar 1.000 nukleotida per detik. Kemampuan replikasi in vivo s e m a c a m i n i d i t e n t u k a n o l e h a d a n y a \"jepit g e s e r \" (sliding clamp) y a n g digunakan untuk tetap menempel pada cetakan selama proses replikasi. Jepitan s e m a c a m i n i d i l a k u k a n o l e h s u b u n i t p. A g a r s u b u n i t P d a p a t m e m b e n t u k k o m p l e k s preinisiasi (yaitu inti katalitik dan cetakan D N A ) , diperlukan beberapa subunit l a i n y a i t u k o m p l e k s y ( t e r d i r i a t a s s u b u n i t y , 5 , 6 ' , %, d a n i|/) y a n g b e r f u n g s i s e b a g a i p e n e m p e l j e p i t a n (clamp loader). P a n j a n g f r a g m e n O k a z a k i s e k i t a r 1 - 2 k b s e h i n g g a u n t u k r e p l i k a s i g e n o m £. coli d i l a k u k a n s e k i t a r 2 . 0 0 0 k a l i p r o s e s i n i s i a s i s i n t e s i s D N A ( p r i m i n g ) . D e n g a n d e m i k i a n m a k a d i p e r l u k a n p u l a s e k i t a r 2 . 0 0 0 j e p i t g e s e r . O l e h k a r e n a s e l £. coli h a n y a m a m p u m e m b a w a s e k i t a r 3 0 0 d i m e r s u b u n i t P, m a k a h a r u s a d a p r o s e s p e n d a u r - u l a n g a n (recycle) s u b u n i t p. H a l s e m a c a m i n i a k a n t e r j a d i j i k a a d a proses disosiasi subunit P dari cetakan D N A . Dengan demikian subunit p akan bergabung dengan inti katalitik selama proses sintesis D N A agar inti katalitik tersebut tidak terdisosiasi dari cetakan. Setelah itu, subunit P terdisosiasi dari cetakan d a nbergerak k e bagian D N Ayang lain serta bergabung dengan inti katalitik yang lain sehingga dapat dilakukan sintesis fragmen Okazaki baru.Pembentukan Untaian Kontinu pada Bagian Untaian DNALambat Seperti telah dikemukakan, salah satu untaian D N A disintesis secara diskontinu yaitu dengan membuat fragmen-fragmen D N A pendek. D iantara fragmen-fragmen Okazaki tersebut sebelumnya terdapat molekul primer berupa RNA. Molekul

1 1 6 Biologi Molekular primer tersebut selanjutnya didegradasi oleh aktivitas eksonuklease 5' 3' yang dimiliki oleh D N Apolimerase I, sekaligus dilakukan sintesis D N A u n t u k mengisi celah yang ada yaitu yang terjadi antara ujung 5'-P dengan ujung 3'-OH. Pada tahap ini, antara suatu fragmen Okazaki dengan fragmen yang lain masih a d a t a k i k (nick) s e h i n g g a b e l u m s e p e n u h n y a t e r s a m b u n g . A g a r f r a g m e n - f r a g m e n Okazaki tersebut tersambung secara kontinu, maka takik tersebut akan d i - sambung oleh enzim DNA ligase. Proses penyambungan tersebut melibatkan dua macam tahapan dengan melibatkan kompleks enzim-AMP. A M P yang ada pada kompleks enzim akan melekat pada ujung 5'-P suatu takik, kemudian dibentuk ikatan fosfodiester dengan ujung 3'-OH.Replikasi DNA pada EukaryotLima m a c a m Sistem replikasi D N A pada eukaryot menunjukkan beberapa perbedaan d i -DNA bandingkan dengan replikasi pada prokaryot, yaitu antara lain dalam hal macampolimerase D N A p o l i m e r a s e y a n g t e r l i b a t . J i k a p a d a £. coW h a n y a a d a 3 ( t i g a ) m a c a m D N Aeukaryot polimerase, maka pada eukaryot ada5 (lima) macam D N Apolimerase (Tabel 7.4). Tabel 7.4I M a c a m d a n k e m u n g k i n a n p e r a n a n D N A polimerase eukaryot. Enzim Peranan D N A polimerase a Mengawali replikasi pada kedua untaian D N A polimerase 8 Pemanjangan kedua untaian D N A p o l i m e r a s e (3 Reparasi D N A D N A polimerase e Reparasi D N A D N A polimerase y Replikasi D N A mitokondria (Sumber: Weaver, 2003.) D N A polimerase a mempunyai aktivitas primase yang berperanan penting dalam sintesis fragmen Okazaki. Sebaliknya, D N A polimerase 5 diduga berperanan sebagai enzim yang m e m b u a t D N A awal karena enzim Ini m e m p u n y a i prosesivitas yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan D N A polimerase a . Sebenarnya, prosesivitas D N A polimerase 5 disebabkan oleh adanya protein lain yang dikenal s e b a g a i p r o l i f e r a t i n g cell nuclear a n t i g e n ( P C N A ) . P C N A b e r a s o s i a s i d e n g a n D N A polimerase y d a n meningkatkan proseslvitasnya menjadi 4 0 kali lipat. Peningkatan prosesivitas ini dilakukan dengan cara menjepit D N Apolimerase 5 pada D N Acetakan sehingga tidak mudah terdisosiasi. D N A polimerase P tidak mempunyai prosesivitas sama sekali sehingga diduga hanya berperanan dalam proses reparasi D N A .D N A polimerase y terdapat di dalam mitokondria sehingga diduga berperanan dalam replikasi D N A mitokondria.

B a b 7 R e p l i k a s i B a h a n G e n e t i k 117 Inisiasi Replikasi p a d a Eukaryot Salah satu ciri inisiasi replikasi D N A pada e u k a r y o t yaitu a d abanyak titik awal replikasi (ori). H a l inidapat dipahami mengingat ukuran g e n o m jasad e u k a r y o t jauh lebih besar dibanding dengan genom prokaryot sehingga diperlukan lebih banyak ori untuk mempercepat replikasi. Selain itu juga diketahui bahwa per- gerakan garpu replikasi pada eukaryot lebih lambat dibanding pada prokaryot. Untuk m e m p e r m u d a h studi, maka replikasi D N A eukaryot pada awalnya dipelajari dengan menggunakan model replikasi D N Avirus yang menyerang eukaryot, misalnya virus SV40. Virus SV40 adalah virus yang menyerang monyet, sehingga replikasi D N A SV40 menggambarkan proses replikasi D N A pada eukaryot. Inisiasi Replikasi DNA SV40 Pada tahun 1972, kelompok peneliti N o r m a n Salzman dan Daniel Nathans berhasil mengidentifikasi ori pada D N A SV40. Mereka menunjukkan bahwa replikasi pada S V 4 0 b e r l a n g s u n g k e d u a a r a h (bidirectional). H a l I n i d i b u k t i k a n d e n g a n c a r a melakukan pemotongan D N A menggunakan enzim endonuklease restrlksi EcoRI dan kemudian mengamati hasil p e m o t o n g a n n y a dengan m i k r o s k o p elektron. Pada a w a l p r o s e s r e p l i k a s i h a n y a t e r l i h a t s a t u g e l e m b u n g r e p l i k a s i (replication bub- ble). P a d a w a k t u e k s p e r i m e n d i t e r u s k a n a k h i r n y a d a p a t d i l i h a t b a h w a g e l e m b u n g replikasi tersebut bergerak k e dua arah. Sekuens minimal ori pada D N A SV40 terdiri atas sekuens sepanjang 6 4 pb (pasangan basa) yang meliputi: ( 1 ) empat pentamer (5'-GAGGC-3'), (2) suatu palindrom yang terdiri atas 1 5 pb yang merupakan bagian paling awal yang terbuka pada saat terjadi replikasi, dan (3) suatu sekuens yang terdiri atas 1 7 pb yang hanya berupa pasangan A - T . Bagian pentamer merupakan bagian tempat pelekatan a n t i g e n T berukuran besar yang tidak lain merupakan produk ekspresi gen virus bagian awal. Jika antigen T tersebut melekat pada bagian ori, maka aktivitas helikase yang dimilikinya akan m e m b u k a lilitan D N A dan menyiapkan proses sintesis primer. Primase pada eukaryot terasosiasi dengan D N A polimerase a yang sekaligus juga berfungsi sebagai primase pada replikasi D N A SV40.ARS sebagai \ Inisiasi Replikasi p a d a Khamirtempat awalrepliliasi P o l a r e p l i k a s i p a d a k h a m i r Saccharomyces cerevisiae s e r u p a d e n g a n p o l a r e p l i k a s i pada jasad eukaryot multiselular. Jarak antara suatu tItIk awal replikasi (ori) yang aktif dengan titik awal replikasi yang lain berkisar sekitar 4 0 kb. Pada g e n o m S. cerevisiae t e r d a p a t s e k u e n s y a n g b e r e p l i k a s i s e c a r a i n d e p e n d e n d a n d i k e n a l s e b a g a i e l e m e n A R S (autonomously replicating sequence). E l e m e n t e r s e b u t pertama kali diketemukan oleh Hsiao dan Carbon pada tahun 1 9 7 9 dan oleh R. W . D a v i s b e s e r t a k a w a n - k a w a n n y a p a d a t a h u n y a n g s a m a . P e m b u k t l a n b a h w a A R S merupakan t e m p a t awal replikasi pertama kali dipublikasikan oleh Bonita Brewer dan Walton Fangman pada tahun 1987. Selanjutnya Marahrens dan Stillman pada tahun 1992 mengemukakan bahwa ARS terdiri atas 4 elemen penting yang mereka namakan A , B 1 , B2, dan B3. Elemen A terdiri atas 1 5 pb dan mengan- dung 11 pb sekuens konsensus, yaitu 5'-(T/A)TTTA(T/C)(A/G)TTT(T/A)-3'.

Keempat elemen tersebut sudah cukup untuk digunakan sebagai ARS, meskipunsekuens di antara keempat elemen tersebut digantl. Akan tetapi, jika seluruh 1 5pb pada e l e m e n A t e r s e b u t diganti dengan 1 1 p b sekuens konsensus saja, makahal ini akan m e n u r u n k a n stabilitas D N A . Dengan demikian dapat disimpulkanbahwa empat nukleotida yang lain pada ke-15 pbelemen A tersebut juga pentinguntuk aktlvltasnya sebagai A R S . Salah satu teknik untuk memetakan titik awal replikasi pada eukaryot adalahdengan analisis elektroforetik fragmen D N A yang sedang mengalami replikasiseperti yang dilakukan oleh Brewer dan Fangman. Brewer dan Fangman meng-konstruksi plasmid 2|im yang mengandung elemen ARS1 sebagai satu-satunyatitik awal replikasi. Plasmid tersebut kemudian direplikasikan di dalam sel khamirdan selanjutnya fragmen-fragmen antara hasil replikasi p u n diisolasi. Fragmenhasil replikasi tersebut kemudian dipotong dengan enzim endonuklease restrlksidan dielektroforesis pada gel dimensi tunggal. Pada elektroforesis gel satu dimensi,fragmen-fragmen D N A terpisah sesuai dengan ukurannya. Selanjutnya, dilakukane l e k t r o f o r e s i s g e l d u a d i m e n s i d a n a k h i r n y a d i l a k u k a n t e k n i k S o u t h e r n blottinguntuk memindahkan fragmen-fragmen D N Ake suatu membran. Fragmen D N Ay a n g a d a p a d a m e m b r a n k e m u d i a n d i d e t e k s i d e n g a n s u a t u p e l a c a k D N A (DNAprobe) y a n g s p e s i f i k . H a s i l a n a l i s i s m e n u n j u k k a n b a h w a f r a g m e n - f r a g m e n h a s i lreplikasi mempunyai pola yang spesifik. Secara skematis pola migrasi fragmenhasil replikasi dapat ditunjukkan pada G a m b a r 7.6. Pola migrasi tersebut menunjukkan bahwa molekul D N A yang replikasinyaberlangsung ke satu arah (panel A ) menghasilkan fragmen-fragmen yang terdiriatas satu garpu replikasi yang semakin lama semakin besar ukurannya. Jika d l -misalkan ukuran molekul D N A yang mengalami replikasi adalah 1 kb, maka polamigrasi fragmen-fragmen tersebut dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada w a k t ugarpu replikasi masih kecil ukurannya, maka pola migrasi D N A - n y a seperti polamigrasi berukuran 1 kb. Pada w a k t u garpu replikasi mencapai bagian setengahmolekul D N A , maka D N A bermigrasi dengan pola seperti pola D N A berukuran1,5 kb. Pada gel 2 dimensi fragmen D N A semacam ini nampak pada titik palingatas lengkung. Demikian seterusnya, sehingga pada w a k t u garpu replikasi sudahmencapai ukuran terbesar, maka molekul D N A menunjukkan pola migrasi sepertimolekul D N Adengan ukuran 2 kb. Jika molekul D N A mengalami replikasi melalui pembentukan gelembungreplikasi yang bergerak k edua arah (panel B), maka pola migrasinya berbeda daripola migrasi D N Adengan garpu replikasi yang bergerak k e satu arah. Panel Cmemberikan gambaran mengenai pola migrasi molekul D N A dengan garpu replikasiyang berawal dari titik berbeda danakhirnya bertemu di suatu titik. Panel Dmenunjukkan pola yang terjadi jika gelembung replikasi terletak pada titik asimetris. Seperti halnya pada p r o k a r y o t , setelah dilakukan inisiasi pada proses replikasiD N A eukaryot, maka selanjutnya dilakukan polimerisasi. Pada keadaan normal,gen hanya direplikasikan satu kali setiap fase S (sintesis), beberapa gen direplikasi-kan pada awal fase S sedangkan yang lainnya pada akhir fase S. G e n - g e n yangditranskripsikan secara aktif akan direplikasikan pada awal fase S, sedangkan

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik I J S j t A B <B e n t u k Y g a n d a D Sederhana Gelembung Asimetrik —o—2 kb 2 kb 2 kb 2 kb 1 kb 1 kb 1 kb 1 kb Dimensi pertama G a m b a r 7 . 6 I P o l a m i g r a s i D N A h a s i l r e p l i k a s i p a d a g e l 2 D (two dimension gel electrophoresis). ( D i a d a p t a s i d a r i W e a v e r , 2 0 0 3 . ) k r o m o s o m X y a n g tidak a k t i f p a d a m a m a l i a b e t i n a d i r e p l i k a s i k a n p a d a a k h i r fase S. Oleh karena k r o m o s o m eukaryot jauh lebih besar dibanding dengan D N A prokaryot, maka replikasi k r o m o s o m eukaryot dilakukan dengan membaginya menjadi banyak replikon invidual. Hal penting yang perlu diketahui adalah bahv^a av^^al f a s e S d i t a n d a i d e n g a n a k t i v a s i r e p l i k o n p e r t a m a . S e l a n j u t n y a , inisiasi r e p l i k a s i terjadi pada replikon-replikon yang lain. Replikasi D N Aeukaryot berlangsung jauh lebih lambat dibanding dengan replikasi D N A prokaryot. Selain itu, ukuran masing-masing replikon eukaryot lebih kecil dibanding dengan ukuran replikon prokaryot (Tabel 7.5). Pada jasad eukaryot terdapat gen-gen yang jumlah kopinya banyak, yang d i k e n a l s e b a g a i g e n - g e n y a n g b e r u l a n g (repeated genes), m i s a l n y a g e n y a n g m e n g - kode sintesis r R N A . Hasil analisis f o t o m i k r o s k o p elektron d a nanalisis auto- radiografi menunjukkan bahwa gen-gen berulang semacam itu mempunyai satu titik a w a l r e p l i k a s i s p e s i f i k tiap u l a n g a n g e n . T i t i k a w a l r e p l i k a s i t e r s e b u t t e r l e t a k p a d a d a e r a h y a n g m e m i s a h k a n (spacer region) u l a n g a n g e n y a n g s a t u d e n g a n u l a n g a n g e n l a i n y a n g t i d a k d i t r a n s k r i p s i ( y a i t u d a e r a h spacer DNA).

120 Biologi Molekular T a b e l 7.5 1 U k u r a n r e p l i k o n p a d a b e b e r a p a j a s a d h i d u p .Organisme Jumlah Panjang rata-rata Kecepatan gerak garpu replikon replikon (kb) replikasi (pb/menit)B a k t e r i {£. coli) 1 4.200 50.000 500 40 3.600Khamir{Saccliaromyccs cerevisiae) 3.500 40 2.600Lalat buah 15.000 200 500{Drosophila melanogaster) 25.000 150 2.200 35.000 300 Tidak diketahuiK a t a k {Xenopus laevis)M e n c i t {Mus musculus)T u m b u h a n {Vicia faba)Pb: pasangan basa, kb: kilo basa (1.000 pb).(Sumber: Lewin, 1994.)T e r m i n a s i Replii<asi pacda P r o k a r y o t Setelah dilakukan inisiasi d a npolimerisasi, akhirnya proses replikasi D N A akan diakhiri dengan proses terminasi atau pengakhiran replikasi. Pada prokaryot, replikasi genom berbentuk lingkar akan berakhir pada waktu kedua garpu replikasi b e r t e m u p a d a s u a t u t i t i k . T i t i k t e m p a t p e n g a k h i r a n r e p l i k a s i d i s e b u t sisi terminasi. P a d a £ coli, s i s i t e r m i n a s i d i c i r i k a n o l e h s u a t u u r u t a n b a s a D N A s e p a n j a n g 2 3 p b y a n g b e r i k a t a n d e n g a n s u a t u p r o t e i n s p e s i f i k y a n g d i s e b u t p r o t e i n T u s (ter- minus utilization substance). P a d a £. coli a d a e n a m s i s i t e r m i n a s i y a i t u T e r A , TerB, TerC, TerD, TerE, d a n TerF ( G a m b a r 7 . 7 ) . U r u t a n k o n s e n s u s s i s i t e r m i n a s i adalah sebagai berikut: A A T T A G T A T G T T G T A A C T A A A N T . U r u t a n basa D N A tersebut diperlukan untuk menghentikan garpu replikasi yang mendekati daerah tersebut dari ujung 5'. O l e h karena itu diperlukan sepasang u r u t a n semacam itu untuk menghentikan gerakan garpu replikasi dari d u aarah yang berlawanan. Urutan basa D N A tersebut tersusun sedemikian rupa sehingga pada w a k t u garpu replikasi melewati sekuens ter yang pertama, maka garpu replikasi tersebut akan ditahan di sekuens kedua. Sekuens ter berikatan dengan protein T u ssehingga menghentikan aktivitas enzim helikase. Garpu replikasi akan berhenti pada saat melewati protein T u s y a n g m e l e k a t p a d a s e k u e n s ter. O l e h k a r e n a i t u , j i k a s a l a h s a t u g a r p u r e p l i k a s i bergerak lebih cepat dari yang lain, maka garpu replikasi tersebut akan berhenti pada sekuens ter dan terjebak di sana untuk menunggu kedatangan garpu replikasi dari sisi yang lain. G a r p u replikasi akan b e r h e n t i sejenak pada sisi t e r m i n a s i sebelum menyelesaikan proses replikasi. Dengan cara demikian maka untaian D N A baru hasil replikasi masih tetap akan terjerat satu sama lain. Kedua untaian D N A baru hasil replikasi tersebut harus diuraikan sebelum terjadi penggandaan sel. Jika pengu-aian D N A tersebut tidak dapat berlangsung karena suatu hal, maka keduanya tidak dapat diturunkan kepada sel-sel anakannya sehingga siklus sel akan mengalami kegagalan. Kegagalan tersebut dapat mengaklbatkan kematiansel.

B a b 7 R e p l i k a s i B a h a n G e n e t i k 121 Monomer TusG a m b a r 7 . 7 I S t r u k t u r t e r m i n a t o r r e p l i k a s i D N A p a d a Escherichia coli.(Sumber: Weaver, 2003.) Pada saat menjelang akhir replikasi, kedua untai-ganda D N A hasll replikasi masih saling berlilitan sebagai dua cincin yang disebut sebagai catenane. Kedua c i n c i n D N A y a n g b e r l i l i t a n t e r s e b u t h a r u s d i u r a i k a n ( p r o s e s decatenatJor)) s e h i n g g a dapat diberikan kepada sel-sel anakannya. Jika proses penguraian lilitan tersebut t e r j a d i s e b e l u m p r o s e s r e p a r a s i D N A , m a k a h a n y a d i p e r l u k a n s a t u t a k i k (nick) pada D N A untuk menguralkan lilitan tersebut. Proses semacam ini m e m e r l u k a n a k t i v i t a s e n z i m t o p o i s o m e r a s e i. A k a n t e t a p i , j i k a p r o s e s p e n g u r a i a n l i l i t a n t e r j a d i setelah ada proses reparasi D N A , maka diperlukan pemotongan pada kedua untaian D N A u n t u k menguralkan lilitan. Dalam proses semacam ini diperlukan a k t i v i t a s e n z i m t o p o i s o m e r a s e IV. P e r l u d i k e t a h u i b a h w a p a d a £ coli d a n Salmo- nella typtiimurium t e r d a p a t e m p a t m a c a m t o p o i s o m e r a s e , y a i t u t o p o i s o m e r a s e l-IY Bukti bahwa proses penguraian tersebut memerlukan enzim topoisomerase IV diberikan oleh Nicholas Cozzarelli yang melakukan eksperimen menggunakan b e b e r a p a m u t a n Salmonella typiiimurium. M u t a s i p a d a g e n p o r C d a n p o r E d i k e t a h u i t i d a k m a m p u m e l a k u k a n p r o s e s p e n g u r a i a n l i l i t a n D N A . G e n parC d a n parE adalah gen-gen yang mengkode subunit topoisomerase IV. Enzim topoisomerase I V j u g a d i p e r l u k a n p a d a p r o s e s p e n g u r a i a n l i l i t a n D N A p a d a £ coli. M u t a s i p a d a gen topoisomerase I Vbersifat letal dan bakteri yang mad menunjukkan k r o m o s o m yang tidak terpisah secara sempurna.Terminasi Replikasi pada Eukaryot Salah satu ciri g e n o m jasad eukaryot adalah strukturnya yang linear Struktur semacam ini berbeda dengan struktur genom pada prokaryot yang sebagian

122 Biologi IVIolekular besar berupa D N A lingkar. Perbedaan s t r u k t u r semacam Ini m e m p u n y a i Implikasi dalam hal proses terminasi replikasi. Pada molekul D N A prokaryot yang berbentuk lingkar, terminasi replikasi akan terjadi jika kedua garpu replikasi yang bergerak ke arah yang berbeda b e r t e m u pada sisi terminasi. Pada e u k a r y o t keadaannya menjadi lain karena s t r u k t u r genomnya linear sehingga ada kompllkasi terminasi replikasi pada ujung-ujung k r o m o s o m . Seperti diketahui, replikasi D N A hanya akan berlangsung jika ada primer. Primer tersebut pada akhirnya akan didegradasi dan bagian yang kosong (gap) akan diisi lagi dengan proses sintesis baru. Pada p r o k a r y o t , proses pengislan bagian k o s o n g t e r s e b u t dilakukan oleh D N A polimerase I. Persoalan k e m u d i a n muncul jika kita membicarakan terminasi replikasi pada eukaryot, khususnya yang berkaitan dengan replikasi pada ujung k r o m o s o m ( t e l o m e r ) . Jika primer yang terletak di ujung k r o m o s o m didegradasi, maka tidak dapat dilakukan pengisian bagian kosong bekas t e m p a t penempelan primer tersebut. Dengan demikian, jika proses terminasi replikasi pada eukaryot mengikuti pola yang ada pada prokaryot, maka lama kelamaan akan terjadi pemendekan k r o m o s o m karena sintesis D N A tidak dapat berlangsung dengan arah 3 ' ^ 5'. Hal ini dapat dijelaskan dengan gambaran skematis sebagai berikut (Gambar 7.8). 5' . 3' 3' 5' Primer dihilangkan Celah 5' •3' -5'\ Telomerase Celah dan replikasi G a m b a r 7.8 > S k e m a r e p l i k a s i t e l o m e r y a n g m e n y e b a b k a n p e m e n d e k a n k r o m o s o m . telomer Jika ujung k r o m o s o m direplikasi dengan mekanisme seperti k r o m o s o m d i bagian tengah, m a k a lama-kelamaan akan terjadi pemendekan k r o m o s o m karena primer yang berupa R N A suatu ketika akan dihilangkan. Akibatnya, pada ujung k r o m o s o m ada celah yang tidak dapat direplikasi lagi karena celah tersebut terletak p a d a u j u n g 5',p a d a h a l replikasi selalu b e r l a n g s u n g dari u j u n g 5' k e u j u n g 3'. Persoalan replikasi t e l o m e r tersebut dapat diatasi dengan mekanisme yang berbeda dari m e k a n i s m e replikasi biasa. Elizabeth Blackburn dan k a w a n - k a w a n menunjukkan bahwa replikasi telomer dilakukan dengan menggunakan aktivitas enzim t e l o m e r a s e . Diketahui bahwa t e l o m e r jasad eukaryot tersusun atas urutan nukleotida spesifik yang berbeda antara organisme yang satu dengan organisme

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 1 2 3 l a i n . P a d a p r o t o z o a Tetrahymena, s e k u e n s t e l o m e r a d a l a h T T G G G G / A A C C C C , sedangkan pada vertebrata, termasuk manusia, sekuensnya adalah T T A G G G / A A T C C C . Spesifisitas sekuens tersebut ditentukan oleh telomerase dan suatu molekul R N Akecll yang adapada kompleks telomerase. Molekul R N A kecll tersebut digunakan sebagai cetakan u n t u k sintesis telomer. T e l o m e r a s e akan menambahkan banyak sekuens spesifik seperti dl atas pada ujung k r o m o s o m sehingga sekuens tersebut dapat digunakan sebagai primer dalam sintesis telomer. Dengan cara demikian maka tidak akan ada persoalan dengan pemendekan ujung k r o m o s o m . K a l a u p u n s e k u e n s speslfik t e r s e b u t hilang m a k a dapat digantikan lagi oleh aktivitas t e l o m e r a s e b e r i k u t n y a karena sekuens t e r s e b u t bukan sekuens asli kromosom. Telomerase adalah suatu ribonukleoprotein yang mengandung R N A d a n subunit protein. G e n yang mengkode sekuens R N A (159 nukleotida) pada t e l o m e r a s e p a d a Tetrahymena t e l a h b e r h a s i l d i k l o n d a n m e n g a n d u n g u r u t a n C A A C C C C A A . U r u t a n inilah yang berfungsi sebagai cetakan u n t u k m e n a m b a h k a n sekuens T T G G G secara berulang pada telomer. Secara skematis proses pe- n a m b a h a n s e k u e n s s p e s i f i k p a d a t e l o m e r Tetrahymena d i s a j i k a n p a d a G a m b a r 7.9.Ketelitian Sistem Replikasi Replikasi adalah suatu mekanisme yang berlangsung dl dalam selyang dilakukan untuk proses perbanyakan sel. Agar tidak terjadi perbedaan komposisi genetik antara sel induk dengan sel anakannya, maka proses replikasi harus dilakukan s e t e l i t i m u n g k i n . K e t e l i t i a n (fidelity) p r o s e s r e p l i k a s i a k a n m e m b e r i k a n j a m l n a n bahwa bahan genetik yang diturunkan k e selanakan dapat terjaga integritasnya. T i n g k a t k e s a l a h a n p r o s e s r e p l i k a s i p a d a b a k t e r i £ coli d i p e r k i r a k a n h a n y a m e n c a p a i 1 (satu) pasangan basa tiap satu miliar (10') pasangan basa, atau sekitar satu kesalahan p e r1.000 sel per generasi. Ketelitian proses replikasi ditentukan oleh aktivitas D N A polimerase III ( d a n D N A p o l i m e r a s e I ) y a n g m e m p u n y a i s i s t e m k o r e k s i p e m b a c a a n (proof- reading). D N A p o l i m e r a s e I I I a k a n m e n y e l e k s i n u k l e o t i d a y a n g d i s a m b u n g k a n dengan ujung 3'-OH pada primer atau basa yang sudah disambungkan sebelumnya. M o l e k u l D N A y a n g b e r p a s a n g a n s e c a r a k e l i r u (mismatched) p a d a u j u n g 3 ' - O H suatu primer, tidak akan efektif sebagai cetakan. Jika ada suatu kekellruan semacam ini m a k a aktivitas e k s o n u k l e a s e 3'—>5' yang ada pada s u b u n i t D N A p o l i m e r a s e III a k a n m e m o t o n g n u k l e o t i d a y a n g salah pasang t e r s e b u t .Replikasi DNA Untai-Tunggal Mekanisme replikasi D N A seperti yang diuraikan di atas adalah mekanisme pada molekul D N A beruntai-ganda. D i alam diketahui ada jasad yang mempunyai g e n o m b e r u p a m o l e k u l D N A u n t a i - t u n g g a l (single-stranded), b a h k a n b e r u p a molekul R N A . Pada bagian iniakan dibicarakan mengenai mekanisme replikasi

1 2 4 Biologi IVIolekular . C C C C A A C C C C A A C C C : - 5 ' / ^'^AACCCCAAC^^'^'' -GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG-3' Pemanjangan Sintesis primtir G a m b a r 7 . 9 • S k e m a r e p l i k a s i u j u n g k r o m o s o m Tetrahymena y a n g d i l a k u k a n d e n g a n m e n g g u n a k a n telomerase. (Diadaptasi dari Weaver, 2003.) D N A beruntai-tunggal. Jasad yang mempunyai g e n o m berupa D N A untai-tunggal adalah kelompok virus tertentu, misalnya O X I 74. Virus O X I 74 adalah virus yang menginfeksi bakteri (sehingga disebut sebagai b a k t e r i o f a g ) . Virus ini merupakan salah satu virus berukuran paling kecil d a n mempunyai bentuk ikosahedral. Genomnya berupa molekul D N A untai-tunggal berbentuk lingkar yang tersusun atas 5.386 nukleotida. G e n o m virus ini hanya m e n g k o d e 1 1 p r o t e i n , t e t a p i m e n g a n d u n g g e n - g e n y a n g t u m p a n g - t i n d i h (overlap- ping genes). S e b a g a i c o n t o h , g e n A * t e r d a p a t d i d a l a m g e n A , d a n g e n E t e r d a p a t

B a b 7 R e p l i k a s i B a h a n G e n e t i k 125di d a l a m g e n D . G e n o m v i r u s ini s u d a h d i t e n t u k a n u r u t a n n u k l e o t i d a n y a o l e h F.Sanger pada tahun 1977. Replikasi g e n o m virus ini sangat tergantung pada sistemr e p l i k a s i s e l i n a n g n y a y a i t u b a k t e r i £. coli. I n i s i a s i r e p l i k a s i D N A v i r u s O X I 7 4 i n isudah disinggung di bagian sebelumnya dalam babini. P a d a w a k t u v i r u s i n i m e n g i n f e k s i £. coli, D N A - n y a a k a n d i i n j e k s l k a n k edalam selinang. Molekul D N A yang dilnjeksikan tersebut disimbolkan denganuntaian positif (+). Untaian ( + ) inilah yang mengandung informasi genetik virustersebut. Sekitar 20-30 m e n i t setelah D N A virus diinjekslkan k edalam sel inang,p r o t e i n A * y a n g d i k o d e d i d a l a m g e n o m v i r u s d i s i n t e s i s d i d a l a m s e l £. coli.Protein A *tersebut akan menghambat sintesis D N A di dalam sel inang. Untaian(+) iniakan menjadi cetakan dalam proses replikasi D N A virus sehingga akandihasilkan untaian komplemennya, yaitu untaian negatif (-). Untaian (-) tersebutselanjutnya akan menjadi cetakan untuk menghasilkan untaian (+). Secara u m u m ,replikasi D N A O X I 74 dilakukan melalui tiga tahapan, yaitu:1. Pengubahan D N A untai-tunggal menjadi bentuk dupleks yang dapat digunakanu n t u k r e p l i k a s i {duplex replicative form, R F ) y a n g m e n g a n d u n g u n t a i a n ( + ) d a nu n t a i a n ( - ) . M o l e k u l ini d i s e b u t sebagai molekul induk RF.Tahapan ini d i l a k u k a nseperti pada mekanisme sintesis untaian D N A lambat.2 . P e r b a n y a k a n R F m e l a l u i m e k a n i s m e replikasi l i n g k a r a n - b e r p u t a r {rolling-circle replication) s e h i n g g a d i h a s i l k a n t u r u n a n R F .3. Sintesis untaian ( + ) dengan menggunakan untaian ( 1 ) pada R F melaluimekanisme replikasi lingkaran-berputar, sehingga dihasilkan molekul untai-tunggal.Tahap 1: Pembentukan molekul induk RFSetelah D N A virus, dalam bentuk untaian (+), diinjekslkan k e dalam sel inang,kemudian dilakukan pelekatan protein SSB pada D N A virus, diikuti oleh pembukaanlilitan oleh enzim D N A girase yang ada pada sel Inang. Proses ini selanjutnyad i i k u d d e n g a n p e n g i k a t a n p r o t e i n n, n', d a n n\", s e r t a p r o t e i n /, D n a B , d a n D n a C .Enzim primase kemudian melekat sehingga terbentuk primosom. Dengan adanyah i d r o l i s i s A T P y a n g d i k a t a l l s i s o l e h n', p r i m o s o m k e m u d i a n b e r g e r a k d e n g a n a r a h5' 3'serta m e m b e n t u k R N A primer. Inisiasi p e m b e n t u k a n p r i m e r berlangsungsecara acak. Dengan adanya p r i m e r maka D N Apolimerase III yang a d a padaInang akan melakukan perpanjangan sintesis D N A dengan m e m b e n t u k fragmenOkazaki. Celah-celah di antara fragmen-fragmen Okazaki tersebut diisi olehaktivitas D N A polimerase I yang sekaligus menghilangkan p r i m e r Fragmen-fragmenyang t e r b e n t u k selanjutnya diligasi dengan menggunakan aktivitas D N A ligase.Untaian ( - )dan ( + )selanjutnya dililitkan satu sama lain oleh D N A girase sehinggaterbentuk molekul R F dupleks.Tahap 2: Pembentukan turunan RFD N A helikase dan protein SSBberikatan dengan molekul R F dupleks sehinggamolekul tersebut menjadi terbuka. Aktivitas protein g p Aselanjutnya membuattakik pada untaian D N A ( + ) .D N A polimerase III kemudian m e n a m b a h k a n

126 Biologi Molekular nukleotida-nukleotida pada ujung 3'takik tersebut dengan menggunakan untaian (-) sebagai cetakan sehingga ujung untaian D N A( + )induk akan terdesak. Pada saat ini dilakukan sintesis untaian D N A (+)yang baru dengan mekanisme sintesis secara k o n t i n u . Untaian D N A ( + ) induk akhirnya akan lepas dan menggulung lagi. D N A g p A selanjutnya akan m e m b u a t t a k i k lagi pada untaian D N A ( + ) b a r u sekaligus menyambung untaian D N A (+) yang terlepas dengan m e m b e n t u k ikatan fosfodiester D N A (+)induk yang terlepas tersebut selanjutnya akan digunakan lagi sebagai cetakan u n t u k m e m b e n t u k untaian D N A ( - ) seperti yang dilakukan pada tahap 1 . Sampai tahap ini dilakukan replikasi R Fsampai kurang lebih 3 5 kali. Pengubahan R F induk menjadi turunan R F memerlukan waktu sekitar 2 0 menit. Tahap 3 : Sintesis untaian D N A (+) Tahapan ini dilakukan dilakukan untuk m e m b e n t u k untaian (+)saja dengan meng- gunakan untaian ( - ) sebagai cetakan dengan mekanisme replikasi lingkaran ber- putar. Pada tahap ini sintesis D N A dilakukan secara kontinu. Protein g p A yang masih melekat pada dupleks kembali membuat takik pada untaian D N A (+). Enzim D N A helikase selanjutnya terikat pada untaian D N A (-) pada takik tersebut. Bersama-sama dengan p r i m o s o m dan protein SSB, helikase m e m b u k a D N A pada waktu p r i m o s o m melakukan sintesis primer yang dimulai pada ujung 3' untaian D N A (-). D N A polimerase IIIkemudian melakukan polimerisasi m o l e k u l primer. Untaian D N A (+) yang lama pada dupleks kemudian didesak k e luar dengan mekanisme lingkaran berputar. Secara simultan, protein selubung virus, yang dihasilkan dengan menggunakan sistem sintesis protein sel inang, dilekatkan pada molekul D N A yang terlepas tersebut sehingga untaian D N A(+)yang terlepas t e r s e b u t tidak dapat digunakan lagi sebagai cetakan u n t u k sintesis untaian D N A (1). Akhirnya protein g p Am e m o t o n g untaian D N A yang terlepas tersebut pada titik awal replikasi. Kemudian dilakukan penutupan lingkaran D N A dengan membuat ikatan fosfodiester. Pada tahapan akhir Iniditambahkan lebih banyak lagi p r o t e i n selubung pada untaian D N A ( + ) sehingga t e r b e n t u k partikel virus baru. Secara skematis, mekanisme replikasi untaian D N A tunggal virus 0 X 1 7 4 dapat dilihat pada Gambar 7.10. Replikasi RNA Beberapa virus diketahui mempunyai genom berupa molekul RNA, misalnya v i r u s T M V (tobacco mosaic virus). T M V a d a l a h v i r u s y a n g m e n y e r a n g t a n a m a n tembakau. G e n o m virus ini berupa m o l e k u l R N Auntai-tunggal yang terdiri atas 6.390 nukleotida yang membawa informasi genetik dalam struktur empat gen. G e n o m virus T M V dikemas dalam selubung protein yang terdiri atas 2.130 subunit Identik. Masing-masing subunit protein mengikat tiga nukleotida R N A d a n m e n y u s u n s t r u k t u r h e l i k s p u t a r - k a n a n (right-handed helix). Replikasi R N A T M V m e m e r l u k a n cetakan dan suatu enzim RNA polimerase y a n g dikendalikan o l e h R N A (RNA-directed RNA polymerase), a t a u y a n g s e r i n g

B a b 7 R e p l i k a s i B a h a n G e n e t i k 1^7 7 Penghilangan Untaian negatif .RF anakan Sintesis diskontinu Untaian positif untaian negatif 3' 5' Protein selubungRF anakan Sintesis selubung * protein virus Replikasi berputar Pengemasan menjadi virionG a m b a r 7.10 > S k e m a replikasi bakteriofag OX174. (Diadaptasi dari Paolella, 1997.)dikenal sebagai r e p l i k a s e . Sintesis R N A virus selalu berorientasi 5' 3', sepertihalnya sintesis D N A , dan dimulai pada ujung 3' m o l e k u l cetakan. Berbeda halnyadengan sistem replikasi D N A , sistem replikasi R N A T M V tidak mempunyaimekanisme reparasi sehingga virus T M V m e m p u n y a i laju mutasi yang tinggi. Replikasi R N A T M V dimulai dengan proses infeksi sel inang (daun tembakau)oleh virus T M V . R N A virus yang masuk ke dalam sel inang selanjutnya ditranslasl

128 Biologi Molekular sehingga menghasilkan beberapa kopi enzim replikase dan protein selubung. Replikase kemudian melakukan sintesis untaian komplementer (untaian negatif (-)) dengan menggunakan untaian R N A induk (untaian + ) sebagai cetakan. Sintesis untaian baru (untaian - ) dilakukan pada ujung 3' molekul cetakan sehingga arah s i n t e s i s a d a l a h d a r i u j u n g 5 ' —> 3 ' . B e r b e d a d a r i s i s t e m r e p l i k a s i D N A , d a l a m proses replikasi R N A tersebut tidak terbentuk molekul dupleks R N A . Untaian (-) baru yang terbentuk kemudian digunakan oleh replikase sebagai cetakan untuk proses sintesis untaian (+). Sintesis ini juga dimulai pada ujung 3' untaian (-) sehingga arah sintesis untaian (+) juga dari 5 ' 3'. Untaian (+) yang t e r b e n t u k tersebut mempunyai urutan nukleotida yang identik dengan urutan nukleotida R N A virus yang p e r t a m a kali menginfeksi sel inang. Selanjutnya, p r o t e i n selubung yang disintesis pada saat terjadi translasi R N A virus, akan mengenali bagian untaian R N A (+)tertentu. Protein selubung membentuk struktur yang disebut sebagai piringan protein. Pada w a k t u ujung 3' R N A diperpanjang, pirlngan pro- tein ditambahkan pada bagian R N A yang melipat. Dengan semakin banyak piringan protein ditambahkan, maka ujung 5' R N A akan ditarik k earah protein selubung. Dengan mekanisme demikian maka akan terbentuk partikel virus yang berupa susunan heliks protein yang mengelilingi genom R N A . Secara skematis, mekanisme replikasi R N A T M V dapat dilihat pada Gambar 7.11.G a m b a r 7 . 1 1 I M e k a n i s m e r e p l i k a s i v i r u s R N A T M V (tobacco mosaic virus).(Diadaptasi dari Paolella, 1997.)

Bab 7 Replikasi Bahan Genetik 1 2 9Replikasi RetrovirusLangkah- Dalam kasus T M V , R N Adireplikasi secara langsung menggunakan enzim R N Alangkah polimerase yang dikendalikan oleh R N A . Selain T M V , virus lain yang genomnyareplikasi RNA j u g a b e r u p a R N A a d a l a h k e l o m p o k r e t r o v i r u s , m i s a l n y a v i r u s H I V {human immuno-HIV deficiency w ' r u s ) . V i r u s H I V a d a l a h v i r u s p e n y e b a b A I D S {acquired immunodeficiency syndrome).V\rus i n i m e m p u n y a i g e n o m b e r u p a R N A l i n e a r , u n t a i - t u n g g a l . S e b e n a r n y a setiap partikel HIV mempunyai dua molekul R N A identik yang terikat satu sama lain pada ujung 5' oleh suatu molekul t R N A . Berbeda dari replikasi R N A pada T M V , replikasi R N A pada virus HIV dilakukan dengan mengubah terlebih dahulu m o l e k u l R N At e r s e b u t m e n j a d i D N A o l e h enzim D N A polimerase yang dikendalikan oleh R N A {RNA-directed DNA polymerase), a t a u y a n g l e b i h s e r i n g d i k e n a l s e b a g a i e n z i m t r a n s k r i p t a s e balik ( r e v e r s e trancriptase). G e n o m v i r u s H I V t e r s u s u n a t a s t i g a g e n y a i t u g e n gag ( m e n g k o d e p r o t e i n s t r u k t u r a l ) , g e n env ( m e n g k o d e p r o t e i n s e l u b u n g ) , d a n g e n pal ( m e n g k o d e e n z i m transkriptase balik d a n e n z i m integrase). Selain i t u , ada s e k i t a r e n a m g e n lain yang fungslnya belum diketahui secara jelas. Enzim transkriptase balik melakukan sintesis D N A dengan menggunakan g e n o m R N A sebagai cetakan. Replikasi R N A virus H I Vdilakukan dengan melewati enam langkah: 1. Penempelan virus pada reseptor yang adapada limfosit CD4. 2. Molekul D N A untai-tunggal kemudian disintesis dengan menggunakan molekul R N A sebagai cetakan. Sintesis D N A untai-tunggal inidilakukan oleh enzim transkriptase balik. Enzim yang sama kemudian mengubah molekul D N A untai- tunggal menjadi molekul untai-ganda linear 3. M o l e k u l D N A untai-ganda yang t e r b e n t u k k e m u d i a n diintegrasikan k e dalam k r o m o s o m s e l inang o l e h aktivitas e n z i m integrase. D a l a m keadaan d e m i k i a n v i r u s d i s e b u t sebagai provirus k a r e n a g e n o m v i r u s H I V adalah R N A , b u k a n DNA. 4. Setelah D N A untai-ganda diintegrasikan, selanjutnya dilakukan sintesis R N A virus dengan menggunakan aktivitas R N A polimerase yang dimiliki oleh sel inang. Sintesis R N A virus dilakukan dengan menggunakan cetakan D N A provirus. R N A virus yang disintesis berfungsi sebagai sumber informasi untuk sintesis protein struktural virus dan enzim sekaligus sebagai g e n o m virus. 5. G e n o m R N A virus selanjutnya dibungkus o l e h p r o t e i n selubung yang terdiri a t a s d u a l a p i s a n y a i t u p r o t e i n u t a m a ( c o r e protein) d a n p r o t e i n ' c a n g k a n g ' {shell protein). 6. Partikel virus yang t e r b e n t u k selanjutnya m e n e m b u s m e m b r a n plasma sel inang sehingga memperoleh selubung lemak. Sintesis D N Auntai-ganda dilakukan di dalam sitoplasma sel inang. D N A untai-ganda kemudian ditransportasikan k edalam nukleus sehingga terjadi integrasi dengan k r o m o s o m selinang. Sintesis R N A virus juga terjadi di dalam nukleus. R N A virus kemudian diangkut ke dalam sitoplasma untuk digunakan dalam proses

sintesis protein virus. Enzim D N A polimerase yang dikendalikan oleh R N Amempunyai tiga macam aktivitas, yaitu:1. Aktivitas D N A polimerase yang dikendalikan oleh RNA.Aktlvltas ini diguna-kan untuk sintesis D N A dari cetakan R N A .2. Aktivitas D N Apolimerase yang dikendalikan oleh D N A , yang digunakanuntuk sintesis D N A untai-ganda.3. Ribonuklease H, yaitu aktivitas yang diperlukan u n t u k degradasi p r i m e r yangdigunakan dalam proses sintesis D N A . Dalam hal ini, yang digunakan sebagaiprimer adalah molekul t R N A sel inang yang terikat pada genom virus. Padaw a k t u sintesis D N A sudah dimulai dan p r i m e r tidak diperlukan lagi m a k a aktivitasribonuklease akan mendegradasi molekul t R N A primer. Secara skematis, mekanisme replikasi R N Apada retrovirus dapat dilihatpada Gambar 7.12. Dari uralan-uralan diatas dapat diperoleh gambaran mengenal kompleksitasproses replikasi bahan genetik pada jasad hidup. Replikasi bahan genedk merupakansuatu mekanisme yang harus dilalui oleh suatu jasad untuk dapat memperbanyakd i r i . P e r l u d i p a h a m i b a h w a mekanisme replikasi batian genetik memerlukan banyakprotein dan enzim. P r o t e i n d a n e n z i m m e r u p a k a n p r o d u k e k s p r e s i g e n - g e n y a n gada pada genom jasad dengan melalui mekanisme transkripsi dan translasi. Olehkarena itu, replikasi bahan genetik hanya akan berlangsung jika ada prosestranskripsi dan translasi. Dalam hal replikasi bahan genetik jasad prokaryot daneukaryot, semua protein dan enzim yang diperlukan untuk replikasi D N A dikodeoleh gen-gen yang ada pada genomnya. Dengan demikian transkripsi dan translasidilakukan terhadap gen-gen yang ada pada g e n o m jasad yang bersangkutan. Se-baliknya, pada virus, tidak semua protein atau enzim yang diperlukan untukreplikasi bahan genetik dikode oleh genom virus tersebut. Sebagai contoh, dalamkasus replikasi bahan genetik retrovirus, diperlukan aktivitas R N A polimerasesel inang u n t u k sintesis R N A virus. R N A polimerase tersebut dikode oleh genyang ada pada g e n o m sel Inang, bukan pada g e n o m virus. Proses replikasi bahan genetik bersama-sama dengan proses transkripsi dantranslasi merupakan rangkaian proses yang pada akhirnya akan bermuara padapertumbuhan dan perbanyakan jasad hidup.

B a b 7 R e p l i k a s i B a h a n G e n e t i k 131LTR Partikel virus R N A untai-tunggal LTR Provirus M a s u k ke sel inang, selubung dilepaskan, transkripsi balik LTR U D N A untai-ganda M a s u k k enukleus dan berintegrasi dengan D N A sel inang D N A sel inang L T R D N A sel i n a n g Transkripsi R N A untai-tunggal Penyelubungan (RNA virus anakan) Nukleokapsid M e m b r a n sel inang Partikel virusG a m b a r 7.12 » S k e m a m e k a n i s m e replikasi R N A retrovirus. M e k a n i s m e replikasiR N A semacam ini dilakukan dengan terlebih dahulu mengubah R N A untai-tunggal menjadi D N A untai-ganda dengan menggunakan enzim transkriptaseb a l i k (reverse transcriptase). H a l i n i b e r b e d a d a r i m e k a n i s m e r e p l i k a s i R N A p a d aT M V yang direplikasi secara langsung dari R N A menjadi R N A . (Diadaptasi dariPaolella, 1997.)

132 Biologi Molekular Soal-soal1. Sebutkan beberapa komponen utama yang diperlukan dalam proses replikasi.2 Gambarkan secara skematis mekanisme dasar replikasi D N A .3. A p a y a n g d i m a k s u d d e n g a n u n t a i a n D N A a w a l (teading-strand) d a n u n t a i a n D N A l a m b a t {lagging-strand).4. J e l a s k a n p e r a n a n D N A p o l i m e r a s e I d a n D N A p o l i m e r a s e I I I d a l a m p r o s e s r e p l i k a s i D N A .5. G a m b a r k a n s e c a r a s k e m a t i s m e k a n i s m e r e p l i k a s i u j u n g D N A l i n e a r , m i s a l n y a p a d a Tetrahymena. E n z i m apa yang berperanan dalam replikasi semacam ini?