Bab 16 Reaksi Antigen Dengan Antibodi In Vitro

REAKSI ANTIGEN DENGAN ANTIBODI IN VITRO Sujudi, Suharto, dan A. SoebandrioSalah satu sifat dari antibodi ialah kemampuan 6. Antibodi netralisasi:bereaksi secara khas dengan antigen yang menim-bulkannya. Dikenal beberapa jenis antibodi di menetralisir daya infeksi kuman atau virus.dalam istilah yang dipakai sehari-hari: Serologi adalah ilmu yang mempelajari reaksi ant^r^ antigen dengan antibodi di dalam serum.1.. Antitoksin: Reaksi serologi dapat dipakai untuk: antibodi terhadap toksin atau toksoid, de- ngan reaksi bersifat netralisasi atau menim- a. Menentukan antigen atau antibodi jika salah bulkan flokulasi. satu dari hal tersebut telah diketahui2. Aglutinin: b. Mengukur kadar atau titer. antibodi yang menggumpalkan sel (aglutinasi). Maka reaksi serologi dapat dipakai untuk Aglutinin bereaksi dengan antigen berben- menentukan jenis kuman yang diasingkan dari tuk partikel (suspensi) atau dengan antigen yang diadsorpsikan pada permukaan partikel penderita; menentukan golongan darah sebelum melakukan transfusi darah; memilih donor yang seperti sel darah merah,latex dan lain-lainnya' tepat pada transplantasi j aringan dan seterusnya.3. Presipitin: Reaksi presipitasi Bila antigen dalam bentuk larutan dicampur de- antibodi yang menimbulkan presipitasi (pe- ngan antiserum, maka akan terjadi presipitasi. ngendapan) dengan antigen berbentuk larutan. Bila disediakan sederetan tabung dengan antise- rum yang volumenya sama dan pada tabung-4. Lisin: tabung itu ditambahkan antigen dalam jumlah yang makin banyak, maka akan ditemukan pre- antibodi yang menyebabkan lisis sel. sipitasi pada tabung y^ng sudah cukup ditam-5. Opsonin: bahkan antigen. Bila setelah pengeraman tabung- tabung itu dipusing dan endapan dipisahkan dan antibodi yang setelah melekat pada kuman ditimbang, maka akan ditemukan bahwa di atau partikel lainnya, merangsang dan memu- dahkan fagositosis. 107

108 Buku Ajar Mikrobiologi Kedokterantabung-tabung pertama tidak terdapat endapan, Kekuatan yang mengikat antigen pada anrikemudian didapat endapan yang makin banyaksampai mencapai maksimum dan kemudian bodi:mulai berkurang lagi. Keterangannya adalah didalam tabung-tabung pertama masih terdapat 1,. Tenaga Coulomb:kelebihan antibodi, dan semua determinan anti- berdasar atas daya tarik antara benda dengangen akan terikat oleh molekul imunoglobulin. tegangan beftentangan, tenaganya berban-Presipitasi terjadi karena timbulnya anyaman ding terbalik dengan jarak pangkat dua.(anice) antara imunoglobulin dan antigen. Padatabung-tabung selanjutnya terdapat kelebihan 2. Ikatan H (Hydrogen bonding):antigen dan tidak dapat dibentuk anyaman yangsempurna sehingga presipitasi berkurang (libat terbentuknya ikatan dengan perantaraan HGambar 16.I dan 16.2). antar a bentuk-bentuk hidrofil seper-ti \" - \".; \"i{: !.. *i.i':r.-:irl yang relatil lemah dan reversibel.)-( *-It-*.H lI +)*(>----4 (a) IJ_Iot9-_. _J* II I t? ,---.{+--- (b){*,-**>*-(* (c)Gambar 16.1 Kemungkinan pembentukan kompleks antara suatu antigen ber-valensi .-0., $ dengan antibodi;nang bivalen. r-<(a) Kompleks dalam keadaan kelebihan antibodi. Semua determinan antigen terikat, presipitasi negatif.(b) Anyaman oleh antigen dan antibodi dibentuk bila perbandingan seimbang, presipitasi posirif.(c) Kompleks dalam keadaan kelebihan antigen, dengar, -r.r---\".\"- p\"rbrnding\"n, pr\"sipir\"ri krrr\"rrg.

Reaksi Antigen dengan Antibodi In Vitro 109Gambar 16.2 Pembentukan presipitat pada reaksi antigen-antibo di in vitro.3. Tenaga Van der Waals: Difusi ganda menurut Ouchterlony (double diffusion method) ditentukan oleh kekuatan-kekuatan tarik antara lapisan elektron yang meliputi dua Antigen dan antibodi dimasukkan di dalam dua susunan molekul. Kekuatannya berbanding lubang kecil di dalam agar sehingga kedua terbalik dengan jarak berpangkat 7. bahan itu akan berdifusi dan pada titik per- Reaksi presipitasi ju ga dapat dilakukan dengan temuan di mana terdapat perbandingan kon-mengalirkan secara pelan larutan antigen di sentrasi optimal akan terjadi presipitasi berupaataslarvtan antibodi sehingga terdapat dua lapis garis putih.dengan permukaan perremuan di antaranya. Bahan yang mengandung beberapa antigenOleh karenaterjadi difusi dari kedua bahan itu akan memberi reaksi dengan serum yang me-maka pada suatu tempat akan tercapai konsen- ngandung antibodi terhadap setiap antigen itutrasi optimal untuk rcrjadinya presipitasi dan dan karena adanya perbedaan kecepatan difusipresipitasi ini akan tampak sebagai cincin purih di dari antigen, akan membentuk beberapa garisdalam tabung. sesuai dengan antigen-antigen itu. Persamaan antigen di dalam dua larutan dapat diperlihat-Reaksi' presipitasi dalam gel kan dengan mereaksikan kedua antigen ituReaksi presipitasi juga dapat dilakukan di dalammedium yang semisolid yang disebut gel, misal- dengan saru antibodi. Garis tengah yangberga-nya yang lembek. bring secara teratur menunjukkan persamaan ^gar ;';:;:i:.:,r;.:::rrri\":rl.;:.;..::: i;:'t:;-,:. Antigen-antigen yang

110 Buku Ajar Mikrobiologi KedokteranAga Aga *'x*' /\";\ Aba Abc AbcGambar 16.3 Difusi ganda menurut Ouchterionymempunyai persamaan tidak lengkap mung- Reaksi aglutinasikin menunjukkan jalur (spur). Antigen-antigen Reaksi aglutinasi adalah reaksi antara antibodiyang sama sekali berlainan akan memberi dengan antigen yang terdapat di permukaan seldua garis yang saling menyilang (ihat Gambar sehingga dibentuk anyaman melalui ikatan silang16.3). antara sel-sel itu dengan perant^r^an antibodi.Difusi tunggal radial Reaksi aglutinasi dipakai untuk determinasi kuman dan untuk mengetahui tipe dari sel ter-Antibodi telah dicampurkan di dalam agar. Anti- tentu misalnya pada penentuan golongan darah.gen yang dimasukkan di dalam lubang akan ber- Reaksi aglutinasi dapat juga dipakai untuk pe-difusi dan bereaksi dengan antibodi memben- nentuan antibodi di dalam serum, bahkan titer-tuk lingkaran presipitasi putih. Diameter ling- nya; dengan memakai misalnya kuman yangkaran dapat dipakai sebagai ukuran konsentrasi sudah diketahui sebagai antigen.antigen, bila dibandingkan dengan larutan anti-gen yang diketahui konsentrasinya. Reaksi aglutinasi dapat dikerjakan secara makroskopik di dalam tabung-tabung aglutinasi,lmunoelektroforesis atau dikerjakan secara mikroskopik pada gelas alas dengan mencampurkan setetes antiserumPemeriksaan antigen dapat dilakukan dengan dengan setetes suspensi kuman dan diperiksa dengan mikroskop bila perlu. Carayangdisebutmemasukkan antigen di dalam lubang di agar belakangan juga disebut spot agglutination atau slide agglutination.dan kemudian menyalurkan arus listrik melaluiagar itu, yang mengakibatkan pemisahan dari Jenis aglutinasi H, O dan Viberbagai fraksi protein di dalam larutan antigen. Weil Felix (1917) menemukan bahwa antigenBila kemudian fraksi-fraksi ini direaksikan de- dari badan kuman Proteus (antigen O, antigen somatik) berlainan dengan antigen dari flagelngan antibodiyangdiketahui, maka fraksi yang (antigen H) dan hasil aglutinasinya jelas berbeda.sesuai akan menunjukkan presipitasi. Ada ber-bagai cara untuk mengerjakan imunoelektro- Antibodi H didapat dengan cara menyuntik-foresis, seperti: counter cltrrent electropboresis, kan kuman yang masih bergerak, dalam bentukrock et electrophoresis, truo-dimensional immunoe-lectr oph ore sls dan seb ag ainy a.

Reaksi Antigen dengan Antibodi In Vitro lllsuspensi kuman hidup atau dimatikan dan anti- ditemukan pada dua jenis kuman. Serum yanggen somatiknya dirusak dengan formalin, ke mengandung antibodi terhadap satu kuman mungkin memberikan reaksi aglutinasi dengandalam binatang percobaan. Ttter yang didapat kuman lain, sehingga disebut aglutinasi silang.biasanya tinggi karena antibodi-H mempunyai Reaksi silang akan mempersulit diagnosisafinitas tinggi terhadap flagel dan mudah menye- kuman dengan cara aglutinasi. Untuk mengatasibabkan bergerombolnya flagel. Pada manusia,titer yang tinggi menunjukkan adanyainfeksi atau ini diperlukan serum yang mengandung anti-pernah divaksinasi, tetapi tidak ada hubungan- bodi runggal terhadap salah satu antigen, disebutnya dengan derajat kekebalan karena antigen H serum monovalen, dan dengan berbagai macam serum monovalen kemudian dapat dibedakantidak berhubungan dengan virulensi. kuman yang satu terhadap lain karena setiap AntibodiO didapat den gan caramenyuntik- jenis kuman mempunyai kombinasi antigenkan kuman yang flagelnya telah dirusak dengan yang berlainan.mencampurkan alkohol dan dieram pada 37\"C Dalam beberapa hal reaksi silang dapat meng-selama 24-36 jam. Biasanya titer yang didapat untungkan, misalnya reaksi silang antara kumantidak begitu tinggi karena untuk aglutinasi sel Proteus dan Rickettsia. Bila pada seorang terda- pat antibodi terhadap Rickettsia maka serumnyakuman diperlukan lebih banyak molekui antibodi. akan menunjukkan aglutinasi dengan kuman Antibodi-Vi hanya terdapat pada kuman yang Proteus strain tertentu dan oleh karena pem- biakan Rickettsia untuk pembuatan antigen tidakbaru diasingkan dan terbatas pada Salmonella semudah pembiakan Proteus, maka pemerik-typhosd serta beberapa jenis Salmonella lainnyadan kuman enterik nonpatogen. Vi, kependekan saan aglutinasi dikerjakan dengan kuman inidari virulensi, pada mulanya dianggap sebagai (reaksi dari Weil-Felix).faktor penting untuk menentukan virulensi Hemaglutinasikuman, tetapi kemudian ternyata antigen Vitidak sepenting antigen O. Adanya antigen Vi Hemaglutinasi berarti aglutinasi sel darah merah. Ternyata dasar hemaglutinasi mungkin berlain-pada bagian luar permukaan sel kuman dapat an satu sama lain, dan dapat dijelaskan sebagai berikut:menghambat reaksi aglutinasi dengan serum yang a. Hemaglutinasi yang disebabkan oleh anti-mengandung antibodi-O. Antigen Vi dapat di- bodi terhadap antigen pada permukaan selhilangkan dengan cara pembiakan berulang kali. darah merah. Misalnya untuk menentukan golongan darah dapat dilakukan reaksiReaksi silang (cross reaction) pada reaksi hemaglutinasi. Juga pada beberapa penyakitaglutinasiPermukaan sel kuman mengandung beberapa macam antigen dan ada kemungkinan bahwa satu antigen , .yang serupa atag :hampir senrPa,

112 Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran timbul antibodi terhadap sel darah merah atau serum yang mengandung antibodi terhadap golongan O yang dapat bereaksi pada suhu sel darah merah kambing, jadi suatu indikator rendah, disebut aglutinasi dingin. berupa .:'*::r j.:':,:-'t\",.i ji':.b. Hemaglutinasi yang disebabkan oleh virus r',; atau Rickettsia. Reaksi ini disebabkan karena pada permukaan sel darah merah terdapat Tahap-tahap reaksi pengikatan komplemen reseptor khas untuk virus atau Rickettsia. adalah sebagai berikut: Pada reaksi ini antibodi tidak mempunyai Tahap 1 : - Dicampurkan antigen dengan anti- peranan, bahkan antibodi dapat mengham- bodi. Salah satu dari kedua bahan bat reaksi ini dalam suatu percobaan yang ini telah diketahui. Bila ingin me- :- .disebut reaksi hambatan hemaglutinasi: . ngetahui adanya antibodi maka di-c. Hemaglutinasi di mana sel darah merah hanya pakai antigen yang diketahui, dan berfungsi sebagai pembawa antigen. Sel darah sebaliknya. merah binatang tertentu dapat dilapiskan - Ditambahkan komplemen. dengan antigen setelah permukaannya di- ubah sifatnya dengan asam tannin atau kro- Bila antibodi sesuai dengan anrigen mium klorida. Setelah antigen menempel pada permukaan sel darah merah, antigen ini dan membentuk kompleks, maka dapat ditentukan dengan serum yang sesuai. Keuntungan dari reaksi ini adalah memudah- komplemen akan terikat; bila kom- kan melihat hasil reaksi karena dilakirkan dengan partikel-partikel yang besar. Reaksi pleks antigen-antibodi tidak ter- ini juga disebut bentuk, maka komplemen masihReaksi pengikatan komplemen(com plement fixation test) bebas di dalam larutan.Komplemen dapat melekat pada kompleksantigen-antibodi, dan bila antigen tidak berupa Tahap 2: - Ditambahkan sel darah merah dansel maka pengikatan komplemen ini tidak dapatdilihat begitu saja. Untuk membuktikan adanya antibodinya sebagaipengikatan komplemen diperlukan suatu indi- indikator untuk mengetahui apa-kator yang terdiri dari campuran suspensi sel kah masih ada komplemen bebas didarah merah kambing dan larutan .:,;:,:::...,, dalam larutan. Pada pembacaan akan terlihat: Reaksi positif: tidak ada hemolisis karena komplemen telah terikat pada kompleks antigen-antibodi yang sesuai. Reaksi negatif: hemolisis karena komplemen tidak terikat bila antigen tidak sesuai dengan antibodi dan tidak dibentuk kompleks.

Reaksi Antigen dengan Antibodi In Vitro 113 Yang harus diperhatikan pada reaksi peng- d. Kontrol terhadap antigen.ikatan komplemen adalah Juga terhadap antigen diperiksa kemung-^. Serum yang diperiksa harus dipanaskan da- kinan adanya sifat anti-komplemen. Cara pemeriksaa nnya jugadengan tabung kontrol hulu pada suhu 56oC selama 30 menit, untuk yang berisi antigen tanpa diberi antibodinya. membuat inaktif komplemennya. Anti-komplemen akan menghasilkan hemo- lisis negatif yang akan terbaca pada perco-b. Kekuatan komplemen harus diukur dengan baan sebagai positif yang salah. Efek ini dapat dihilangkan dengan pengenceran antigen. titrasi terhadap sel indikator. Satu unit kom- plemen ialah jumlah komplemen terkecil Reaksi pengikatan komplemen banyak dipa- yang dapat menyebabkan hemolisis total kai pada pemeriksaan serologi sehari-hari untuk pada standard sensitized cells padawaktu dan berbagai penyakit, seperti pemeriksaan \Tasser- suhu tertentu (juga disebut exd.ct unit). Kol- mann untuk membantu diagnosis penyakit sifilis, mer menyebut jumlah komplemen pada pemeriksaan adanya antigen Australia yang di- tabung sesudah tercapai end-point titrasi se- hubungkan dengan virus hepatitis, dan pemerik- bagai satu fwll unit. Untuk pekerjaan sehari- saan auto-antibody terhadap antigen sel tubuh. hari dianjurkan memakai duafull unitberda- sarkan pengalaman. Titrasi komplemen dila- lmunofluoresensi kukan pada hari yang sama dengan dilakukan- nya reaksi pengikatan komplemen karena Zat w arna yang berfluoresensi, seperti fluoresein komplemen tidak dapat disimpan lama karena dan rodamin, dapat digabungkan pada antibodi titernya akan berubah dari hari ke hari. tanpa mempengaruhi sifatnya yang khas. Kom-c. Kontrol terhadap serum penderita. pleks antibodi dengan z tw^rnaini akan tetap me- Beberapa serum mempunyai sifat anti-kom- ngikat antigen dan bila dilihat dengan mikroskop plemen, yang berarti membuat inaktif kom- ultraviolet akan tampak fluoresensi. Ada beberapa plemen, yang sebabnyatidak diketahui dan cara untuk melakukan pewarnaan fluoresensi: sering ditemukan pada serum yang telah di- simpan agak lama. Sifat ini diperiksa dengan I. Fluoresensi langsung (direct test) tidak menambahkan antigen pada tabung Antibodi digabungkan dengan zat warna ber- kontrol sehingga tabung itu harus menun- fluoresensi (fluorokrom) dan konjugat ini jukkan hemolisis lengkap. Bila ada faktor dipakai untuk mendeteksi antigen. Misalnya pada sediaan mikroskopik lendir hapus teng- anti-komplemen, hemolisis tidak terjadi dan gorok ingin diketahui adarya kuman pneu- pada reaksi sesungguhnya hasilnya akan mokokus, maka sediaan tadi diwarnai dengan sama dan dibaca positif.

ll4 Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran antibodi terhadap polisakarida pneumoko- larutan antibodi terhadap polisakarida yang kus yang dilabel dengan fluorescein-isotbio- dilabel sehingga sel limfosit yang mengikat cyandte. Bila positif, maka dengan mikros- polisakarida karena membuat antibodi ter- kop ultraviolet dapat dilihat kuman pneu- hadapny a akan tamp ak berfl uoresensi. mokokus berfl uoresensi. Rad io-i mmunoassay (RlA)2. Fluoresensi tidak langsung (indirect test) Antigen direaksikan dahulu dengan antibodi Mula-mula dibuat kurva standar dengan anrigen untuk kemudian diwarnai dengan konjugat dan antibodi yang diketahui. Untuk mengetahui terdiri dari antiimunoglobulin dan fluoro- kadar antibodi, antibodi tersebut dicampurkan krom. Misalnya pada percobaan di atas, sedia- dengan antigen berlabel yang jumlahnya diketa- an hapus tenggorok direaksikan dahulu de- hui. Kemudian antigen yang bebas dipisahkan ngan serum kelinci yang mengandung anti dari antigen yang terikat pada antibodi, kekuatan bodi terhadap kuman pneumokokus. Sete- lah dicuci, sediaan diwarnai dengan anti-Ig radioaktif antigen yang terikat pada antibodi di kelinci yang dilabel dengan fluoresein. Hasil- ukur dan hasilnya dimasukkan pada kurva stan- nya di bawah mikroskop ultraviolet akan dar. Dari hasil tersebut akan diketahui kadar anti bodi. Dengan cara yang sama dapat diketahui tampak kuman pneumokokus berfl uoresensi. kadar antigen, yaitu dengan mereaksikannya de- Teknik ini mempuny ai beb er apakeuntungan ngan antibodi berlabel yang kadarnya diketahui. karena selain memberikan fluoresensi yang lebih terang, cukup disediakan satu macam Teknik-teknik lain konjugat antilg kelinci yangdapat memberi A. Menggunakan enzim seperti fosfatase dan fluoreser,rsi pada berbagai macam antibodi kelinci terhadap macam-macam kuman. peroksidase untuk melabel antibodi.3. Teknik sandwich Dasar teknik ini sama'dengan pewarnaan Misalkan kita ingin melihat berapa banyak sel limfosit yang membuat antibodi terhadap imunofluoresensi. Bedanya, sebagai label di- polisakarida kuman pneumokokus. Dibuat sediaan sel limfosit dan difiksasi dengan gunakan enzim. Untuk dapat melihat hasil etanol. Kemudian disiram dengan larutan reaksi digunakan substrar dari enzim ter- yang mengandung polisakarida pneumo- sebut. Hasilnya dapat dilihat dengan mikros- kokus, dibiarkan sebentar dan kemudian kop cahaya biasa. dicuci untuk menghilangkan zat yang tidak B. Menggunakan label feritin. menempel pada limfosit. Setelah itu diberi Teknik ini terutama digunakan untuk mi- kroskop elektron. C. Enzyme Linked Immunosorbmr Asay @LISA). Dapat digunakan untuk mendeteksi baik antigen maupun antibodi dari suatu larutan.

Reaksi Antigen dengan Antibodi In Vitro 115Misalnya: - Substrat ditambahka n yang akan di- Antigen dilekatkan padazatpadat (plas- degradasi oleh enzim. tik), lalu dicuci. - Teliti perubahan warna substrat, sesuai-Tdaumngbaanhtibkoadni cyaanirgahnoymaonloggd, eidruagmamkaenngan- dengan jumlah antibodi di dalam cair- an uji' lalu cuci.- Antiimunoglobulin yang dilabel ditam- bahkan, biarkan bereaksi kemudian cuci.