Bab 04 Analisis Genetik

Pokok Bahasan: I Notasi Genetik Notasi Genetil< pada Prol<aryot • Notasi Cenetik pada Eukaryot I Analisis Genetik I Rekombinasi Genetik I Pemetaan Genetik I Pemetaan Delesi I Komplementasi GenetikTeknik Perkembangan biologi molekular tidak dapat dilepaskan dari peranan sistemanalisis analisis genetik. Sebelum s t r u k t u r molekul D N Aberhasll diuraikan olehgenetik W a t s o n dan Crick, fenomena biologis telah dipelajari melalui argumentasi genetik.konvensional Bahkan setelah struktur molekul D N A serta urutan basa D N Adapat ditentukan secara akurat, sistem analisis genetik masih sangat relevan u n t u k diterapkan. Banyak contoh studi biologi molekular yang selain melibatkan teknik-teknik mutakhir, juga memanfaatkan teknik analisis genetik konvensional. Sebagai contoh, untuk dapat melakukan isolasi suatu gen kadang-kadang harus didahului dengan melakukan mutasi secara acak. Mutasi tersebut dimaksudkan untuk mendapatkan strait) y a n g k e h i l a n g a n s i f a t ( f e n o t i p e ) t e r t e n t u y a n g e k s p r e s i n y a d i k e n d a l i k a n o l e h gen yang akan diisolasi. Mutan tersebut kemudian digunakan sebagai inang yang akan dikomplementasi dengan fragmen D N Ayang mengandung genyang akan diisolasi. Komplementasi yang dimaksudkan di sini adalah \" k e m a m p u a n \" suatu fragmen D N A u n t u k mengembalikan (merestorasi) sifat yang hilang karena perlakuan mutasi. Hal ini mungkin terjadi jika fragmen D N A tersebut mengandung gen yang identik dengan gen yang mengalami kerusakan pada jasad mutan, namun m a m p u memberikan sifat (fenotipe) yang normal. Komplementasi semacam ini d a p a t t e r j a d i j i k a g e n y a n g m e n g k o m p l e m e n t a s i b e r u p a g e n o t i p e a l a m i {wild type), atau berupa gen mutan namun mutasinya terjadi pada tempat yang berlainan dari yang terjadi pada g e n yang dikomplementasi. Jika m u t a n tersebut dapat d i - k o m p l e m e n t a s i d e n g a n f r a g m e n D N A y a n g d i i s o l a s i d a r i strain t i p e a l a m i n y a , maka isolasi g e nakan lebih m u d a h dilakukan. Dengan demikian analisis genetik, dalam hal ini komplementasi genetik, seringkali mempunyai peranan sangat besar dalam proses isolasi suatu gen.

Bab 4 Analisis Genetik 39Notasi GenetikDefinisi U n t u k menyatakan sifat-sifat suatu jasad diperlukan sistem penulisan (notasi)f e n o t i p e dan yang dapat dipahami secara luas sehingga tidak ada penafslran yang berbeda-bedagenotipe atas suatu jasad. Sistem notasi genetik merupakan suatu sistem yang digunakan untuk menyatakan sifat-slfat (genetik) jasad. Sifat-sifat suatu jasad dapat dibagi m e n j a d i d u a k e l o m p o k , y a i t u fenotipe dan genotipe. F e n o t i p e adalah sifat-sifat suatu jasad yang dapat diamati, misalnya bentuk dan ukuran sel, w a r n a daun, dan sebagainya. Genotipe adalah komposisi genetik suatu jasad. Genotipe pada dasar- nya merupakan sifat yang tetap selama kehidupan jasad d a nrelatif tidak akan berubah oleh faktor lingkungan, kecuali pada keadaan ekstrem. D i lain pihak, fenotipe dapat berubah selama kehidupan jasad oleh karena fenotipe merupakan resultan dari sifat-slfat genetik (genotipe) dan faktor-faktor lingkungan. \"Ketetapan\" {fixity) g e n o t i p e t i d a k s e l a l u b e r a r t i f e n o t i p e n y a j u g a t e t a p . D i s a m p i n g i t u , s a t u genotipe tunggal dapat dimanifestasikan dalam berbagai macam fenotipe, tergantung pada lingkungannya. Sebaliknya, satu fenotipe dapat dihasilkan oleh lebih dari satu set genotipe. Jasad p r o k a r y o t bersifat haploid, artinya hanya mempunyai satu set genotipe, m e s k i p u n k a d a n g - k a d a n g d a p a t b e r s i f a t d i p l o i d s e b a g i a n {partial diploid). S e b a l i k n y a , jasad eukaryot dapat bersifat haploid atau diploid (mempunyai sepasang genodpe yang identik meskipun tidak berarti sama persis). Bahkan pada keadaan tertentu suatu jasad eukaryot dapat bersifat poliploid. O l e h karena itu, ada perbedaan dalam halnotasi genetik antara jasad p r o k a r y o t dengan jasad eukaryot.Cara penulisan Notasi G e n e t i k p a d a Prokaryotnotasi genetikprokaryot Seperti telah dikemukakan, adaperbedaan pengertian antara fenotipe dengan genotipe. Oleh karena Itu, sistem notasi untuk fenotipe berbeda dari sistem notasi untuk genotipe. Pada jasad prokaryot, fenotipe ditulis dengan huruf tegak, misalnya Leu yang berarti jasad dapat menyintesis asam a m i n o leusin. Perlu diperhatikan bahwa simbol fenotipe terdiri atas tiga huruf, huruf pertama ditulis d e n g a n h u r u f k a p i t a l , d a n h u r u f n y a d i t u l i s t e g a k . S e b a l i k n y a , j i k a tidak dapat menyintesis asam a m i n o leusin m a k a fenotipenya ditulis sebagai Leu\" (perhatikan t a n d a m i n u s y a n g d i t u l i s s e b a g a i h u r u f k e c i l d l a t a s [ s u p e r s k r i p , superscript]). Jasad p r o k a r y o t yang m a m p u menyintesis asam a m i n o leusin berarti m e m - punyai g e n leusin yang fungsional. Genotipe jasad semacam ini ditulis sebagai leu*. P e r l u d i p e r h a t i k a n b a h w a genotipe jasad prokaryot ditulis dengan tiga huruf kecil miring. J i k a g e n n y a f u n g s i o n a l m a k a d i t a m b a h d e n g a n s i m b o l + ( p o s i t i f ) y a n g ditulis sebagai superskrip, sedangkan jika gennya tidak fungsional maka ditambah dengan simbol - (minus) meskipun kadang-kadang simbol minus tidak ditulis. O l e h k a r e n a i t u jasad yang f e n o t i p e n y a Leu\", m a k a g e n o t l p e n y a ditulis sebagai /eu\" ( a t a u c u k u p d i t u l i s s e b a g a i leu t a n p a t a n d a m i n u s ) . Telah diketahui bahwa banyak sifat biokimia jasad yang ekspresinya d i - kendalikan oleh lebih dari satu gen. U n t u k membedakan gen-gen yang me- ngendalikan satu sifat biokimia yang sama (misalnya kemampuan sintesis leusin).

maka genotipenya ditulis dengan menambahkan huruf kapital miring di belakangs i m b o l g e n . C o n t o h n y a a d a l a h leuA, leuB, leuC d a n s e t e r u s n y a . J i k a j a s a d p r o k a r y o tb e r a d a d a l a m k e a d a a n diploid sebagian m a k a g e n o t i p e n y a d i t u l i s , m i s a l n y a , s e b a g a ileu*lleuA, y a n g b e r a r t i j a s a d n y a m e m p u n y a i f e n o t i p e Leu*, k a r e n a g e n leuA t i d a kf u n g s i o n a l , n a m u n m e m p u n y a i k o m p l e m e n g e n leu* y a n g f u n g s i o n a l . B e b e r a p a g e n d i k e t a h u i m e n g e n d a l i k a n s i f a t k e p e k a a n (sensitivity) a t a uk e t a h a n a n (resistance) t e r h a d a p a n t l b l o t i k t e r t e n t u . F e n o t i p e j a s a d p r o k a r y o tyang peka terhadap antiblotik, misalnya amplsllln ( A m p ) , ditulis sebagai Amp-s,sedangkan yang tahan terhadap amplsllln ditulis sebagai Amp-r. Genotipenyad i t u l i s s e b a g a i amp-s ( p e k a t e r h a d a p a m p l s l l l n ) , a t a u a m p - r ( t a h a n t e r h a d a pamplsllln). Perlu diperhatikan bahwa huruf s dan r tidak ditulis sebagai superskrip. Seringkali mutasi pada gen tertentu terjadi pada baglan-baglan yang berbeda.Mutan-mutan yang diisolasi pada w a k t u yang berbeda biasanya diberl n o m o ru r u t , m i s a l n y a m u t a s i - m u t a s i p a d a g e n l e u s i n A ( l e u A ) d i b e r l n o m o r leuA-12,leuA-53 d a n s e t e r u s n y a .Notasi G e n e t i k p a d a EukaryotSeperti halnya pada prokaryot, fenotipe pada jasad eukaryot ditulis dengan huruftegak ditambah dengan simbol + atau - yang ditulis sebagai superskrip. Sebagaicontoh, fenotipe jasad yang m a m p u menyintesis asam amino leusin ditulis sebagaiLeu*, sebaliknya y a n g t i d a k m a m p u m e n y i n t e s i s ditulis sebagai Leu\". A k a n t e t a p inotasi genotipe p a d a j a s a d e u k a r y o t b e r b e d a d a r i n o t a s i p a d a j a s a d p r o k a r y o t . J i k ap a d a p r o k a r y o t , n o t a s i g e n o t i p e d i t u l i s d e n g a n h u r u f k e c i l m i r i n g (italic), m i s a l n y aleu, k e m u d i a n d i t a m b a h d e n g a n s i m b o l + a t a u - , m a k a n o t a s i g e n o t i p e p a d aeukaryot ada3 macam:1. Lokus atau alel dominan ditulis dengan huruf kapital miring misalnya L E U .2 . L o k u s a t a u a l e l r e s e s i f d i t u l i s d e n g a n h u r u f b u k a n k a p i t a l , m i r i n g , m i s a l n y a leu.3 . A l e l t i p e a l a m i (wild type) d i t u l i s d e n g a n h u r u f k a p i t a l , m i r i n g d i t a m b a h d e n g a n s i m b o l + s u p e r s k r i p , m i s a l n y a LEU*. Jika lokus-lokus pada prokaryot yang mengendalikan satu sifat biokimia yangsama dibedakan dengan menambahkan huruf kapital di belakang simbol gen,m i s a l n y a leuA, m a k a l o k u s p a d a e u k a r y o t d i b e d a k a n d e n g a n m e n a m b a h k a n a n g k a ,m i s a l n y a LEU2, LEU3, d a n s e t e r u s n y a . A l e l p a d a e u k a r y o t d i b e d a k a n d e n g a nmemberikan n o m o r di belakang n o m o r lokus dengan dipisahkan oleh garls,m i s a l n y a Ieu2-12, Ieu2-14, d a n s e t e r u s n y a . M e s k i p u n d e m i k i a n , n o m o r a l e lseringkali bersifat spesifik, tergantung laboratorium yang mengembangkan ataum e n g i s o l a s i strain t e r s e b u t . O l e h k a r e n a I t u d u a I s o l a t y a n g b e r b e d a y a n g b e r a s a ldari laboratorium yang berbeda dapat m e m p u n y a i n o m o r alel yang sama. Sebagaic o n t o h , i s o l a t y a n g m e m p u n y a i s i m b o l a l e l y a n g s a m a , m i s a l n y a Ieu2-1, y a n gberasal dari laboratorium berbeda ada kemungkinan merupakan mutan yangberbeda sifatnya.

Bab 4 Analisis Genatik 41 Meskipun ada sistem notasi yang spesifik u n t u k membedakan alel dominan atau resesif, n a m u n sifat dominan atau resesif hanya dapat diketahui jika alel t e r s e b u t b e r p a s a n g a n , m i s a l n y a k a r e n a d i s l l a n g k a n . M i s a l k a n a l e l - a l e l LEUZ*, Ieu2- 12, leu2-52 m e m b e r i k a n p r o d u k g e n b e r t u r u t - t u r u t s e b e s a r 1 0 0 % , 5 0 % , d a n 1 0 % . A l e l Ieu2-12 d a p a t d i a n g g a p r e s e s i f j i k a b e r p a s a n g a n d e n g a n a l e l LEU2* (Ieu2-12/ LEU2*) k a r e n a p r o d u k d a r i a l e l LEU2* a d a l a h 1 0 0 % s e d a n g k a n p r o d u k a l e l Ieu2-12 h a n y a 5 0 % . S e b a l i k n y a , a l e l Ieu2-12 d a p a t d i a n g g a p d o m i n a n j i k a b e r p a s a n g a n d e n g a n a l e l leu2-52, (Ieu2- 12lleu2-52) k a r e n a p r o d u k Ieu2- 7 2 a d a l a h s e b e s a r 5 0 % s e d a n g k a n p r o d u k a l e l leu2-5-2 h a n y a 1 0 % . L o k u s p a d a e u k a r y o t d i b e d a k a n s a t u l a m a l a i n d e n g a n a n g k a ( m i s a l n y a LEU2). A k a n t e t a p i a d a p e r k e c u a l i a n , y a i t u k e l o m p o k a n g e n ( g e n e cluster), g r u p komplementasi, atau domain suatu gen yang m e m p u n y a i sifat berbeda, dibedakan dengan menambahkan huruf kapital di belakang n o m o r lokus. Sebagai contoh, HIS4A, HIS4B, HIS4C m e n u n j u k k a n t i g a d a e r a h p a d a l o k u s HIS4 y a n g m e n g k o d e tiga domain pada satu rantai polipeptida tunggal yang menentukan tiga langkah a k t i v i t a s e n z i m a t l k y a n g b e r b e d a . P a d a k h a m i r Saccharomyces cerevisiae, a l e l y a n g m e n u n j u k k a n l o k u s tipe-kav»/in (mating type) j u g a d i b e r l s i m b o l d e n g a n h u r u f , b u k a n a n g k a , m i s a l n y a MATa, dan MATa. G r u p k o m p l e m e n t a s i l o k u s MATa d i t u l i s : MATa 7, d a n MATa 2. Agak berlainan dari notasi pada prokaryot, sifat ketahanan atau kepekaan terhadap antibiotik pada eukaryot diberl tambahan simbol R (ketahanan) atau S (kepekaan) yang biasanya ditulis sebagai huruf kecil di atas. Misalnya, gen yang m e n e n t u k a n k e t a h a n a n a t a u k e p e k a a n t e r h a d a p a n t i b l o t i k k a n a v a n i n s u l f a t (can 7 ) ditulis: con^7, C A N \" 7. Selain dari apa yang sudah dijelaskan di atas, ada notasi khusus yaitu untuk m e n y a t a k a n d e l e s i ( d i b e r l s i m b o l A ) , d a n p e n y i s i p a n (insertion) y a n g d i b e r l s i m b o l : : (double colon). S e b a g a i c o n t o h , his3-Al ( d e l e s i p a d a g e n his3), cycl::URA3 ( p e n y i s i p a n g e n L / R A J p a d a g e n e y e 7; p a d a k e a d a a n I n i g e n URA3 b e r s i f a t d o m i n a n s e d a n g k a n g e n eye 7 b e r s i f a t r e s e s i f a t a u r u s a k ) .Analisis GenetikPrinsip-prinsip Dalam sejarah perkembangan ilmu genetika, Gregor Mendel dikenal sebagaiMendel orang pertama yang memperkenalkan suatu sistem sederhana untuk menganalisis ] sifat-sifat genetik suatu jasad hidup. Prinsip yang digunakan oleh Mendel cukup s e d e r h a n a y a i t u d e n g a n m e m b u a t p e r s i l a n g a n a n t a r b u n g a Pisum sativum y a n g m e m p u n y a i fenotipe berbeda-beda. W a r n a bunga d a n kenampakan biji yang muncul dari hasil persilangan tersebut kemudian dijadikan dasar u n t u k melakukan analisis matematik. Melalui eksperimen yang dilakukannya, Mendel kemudian mengajukan konsep mengenai prinsip segregasi. Prinsip Ini pada dasarnya mengatakan bahwa hanya satu alel dari suatu gen yang diturunkan dari sel induk ke sel keturunannya. Prinsip kedua yang dikemukakan oleh M e n d e l adalah prinsip p e m i s a h a n d a n p e n g e l o m p o k a n s e c a r a b e b a s (independent assortment). P r i n s i p

42 Biologi Molekular ini pada dasarnya menyatakan bahwa segregasi suatu pasangan sifat berlangsung secara independen satu sama lain. Prinsip-prinsip yang dikemukakan oleh Mendel kemudian dipergunakan sebagai dasar analisis genetik pada jasad-jasad hidup yang lain, misalnya untuk mengetahui a d a a t a u t i d a k n y a t a u t a n g e n ( g e n e linkage) a n t a r a g e n - g e n p a d a j a s a d r e n i k . Perlu dipahami bahwa hukum Mendel yang kedua, yaitu pengelompokan secara bebas, hanya berlaku untuk lokus-lokus yang terletak pada k r o m o s o m bukan- h o m o l o g . Seringkali didapatkan penyimpangan dari h u k u m Mendel pada hasil persilangan suatu jasad karena adanya efek tautan gen. Meskipun demikian, prinsip- prinsip seperti yang dikemukakan oleh Mendel masih dapat diterapkan sebagai dasar analisis genetik.Rekombinasi GenetikDefinisi Rekombinasi genetik adalah suatu proses penggabungan dua lokus genetik yangreltombinasi ada pada d u ak r o m o s o m yang berbeda k e dalam satu k r o m o s o m yang sama.genetilf Studi genetika klasik banyak b e r t u m p u pada analisis rekombinasi genetik d a n terbukti telah melahirkan banyak teori dasar yang sangat penting. Meskipun s e k a r a n g a n a l i s i s g e n e t i k t e l a h b a n y a k d i l a k u k a n p a d a a r a s (level) m o l e k u l a r , n a m u n prinsip dasar analisis rekombinasi genetik masih sering dipergunakan u n t u k mengungkap mekanisme molekular pada genetika jasad hidup. Dengan mengawlnkan jasad-jasad mutan yang berbeda sifatnya, misalnya, dapat dilakukan analisis mengenal dasar-dasar molekular suatu sifat atau fenotipe yang nampak pada suatu jasad. Dengan mengamati hasil persilangan antara dua jasad maka dapat diketahui apakah dua atau lebih gen berada pada k r o m o s o m yang sama atau tidak. Gen-gen yang terletak pada k r o m o s o m yang berbeda akan terdistribusi k edalam gamet secara independen, tanpa tergantung satu sama lain. Hal ini dapat dijelaskan dengan skema berikut ini. Misalkan kita m e m p u n y a i dua j a s a d y a n g m e m p u n y a i g e n o t i p e AaBb d a n aabb y a n g d i k a w i n k a n . Induk: AaBb X aabb Gamet: AB ab Ab ah aB ab ab ab Keturunan Fl: 114 AaBb 114 Aabb 114 aaBb 114 aabb Dengan demikian akan diperoleh keturunan FT dengan perbandingan 1 : 1 : 1 : 1 . Sebaliknya, gen-gen yang terletak pada satu k r o m o s o m akan cenderung untuk berada pada kombinasi seperti pada induknya. Misalkan kita mempunyai

Bab 4 Analisis Genetik d u a j a s a d y a n g m e m p u n y a i g e n o t i p e ABlab d a n ab/ab ( g e n y a n g t e r l e t a k d i sebelah kiri garls miring, misalnya AB, berada pada satu k r o m o s o m sedangkan g e n d i s e b e l a h k a n a n g a r l s m i r i n g y a i t u ab t e r l e t a k p a d a k r o m o s o m h o m o l o g n y a ) . Induk: ABlab X ablab Gamet: AB ab ab Keturunan Fl: 111 AB/ab 111 ablab Penyimpangan dari perbandingan 1 : 1 : 1 : 1 yang cukup besar dapat menjadi petunjuk tentang kemungkinan adanya tautan gen. Dalam segi prakteknya, kita dapat melakukan analisis genetik semacam ini untuk mengetahui misalnya apakah dua sifat atau fenotipe yang dimiliki oleh jasad tersebut ditentukan oleh dua gen yang terletak pada k r o m o s o m yang sama atau tidak. Misalkan kita mempunyai jasad induk yang m a m p u menyintesis asam amino leusin (LEU) d a n arglnln (ARG), sedangkan induk yang lain tidak m a m p u m e n y i n t e s i s k e d u a m a c a m a s a m a m i n o t e r s e b u t (leu, arg). J i k a d a r i h a s i l p e r k a w i n a n kedua induk tersebut diperoleh keturunan F l yang mempunyai fenotipe dengan perbandingan: 7 LEU ARG : 1 LEU arg : 1 leu ARG : 1 leu arg m a k a d a p a t d i k e t a h u i b a h w a g e n LEU d a n ARG t e r l e t a k p a d a k r o m o s o m y a n g berbeda. Sebaliknya jika keturunan F l yang diperoleh mempunyai perbandingan: 7 L E U ARG : 1 leu arg m a k a d a p a t d i d u g a b a h w a g e n LEU d a n ARG t e r l e t a k p a d a k r o m o s o m y a n g sama karena adanya efek tautan gen. Meskipun demikian, gen-gen yang bertaut tidak selalu berada bersama-sama dalam proses rekombinasi karena k r o m a t i d - k r o m a t i d h o m o l o g d a p a t m e l a k u k a n p e r t u k a r a n g e n e t i k (chiasma) a n t a r a b a g l a n - b a g l a n k r o m a t i d d a l a m p r o s e s p i n d a h s i l a n g (crossing-over). Prinsip rekombinasi genetik semacam ini mempunyai peranan penting dalam analisis genetik suatu jasad karena dapat menjadi petunjuk mengenal komposisi maupun konfigurasi gen-gen di dalam k r o m o s o m .Contoh Soal ii1. Apa yang dimaksud dengan fenotipe dan genotipe?Javmban:Fenotipe adalah sifat-sifat suatu jasad yang dapat diamati, misalnya bentuk dan ukuran sel, warnadaun, dan sebagainya. Genotipe adalah komposisi genetik suatu jasad.2. Apa yang dimaksud dengan rekombinasi genetik?Jawaban:Rekombinasi genetik adalah suatu proses penggabungan dua lokus genetik, yang ada pada duak r o m o s o m yang berbeda, ke dalam satu k r o m o s o m yang sama.

44 Biologi Molekular 3. Jelaskan secara singkat prinsip Mendel yang digunakan dalam analisis genetik. jawaban: Prinsip Mendel yang pertama adalah prinsip segregasi, yaitu bahwa hanya satu alel dari suatu gen yang diturunkan dari sel induk k eselketurunannya. Prinsip Mendel kedua adalah prinsip pemisahan dan pengelompokan secara bebas, yaitu bahwa segregasi suatu pasangan sifat berlangsung secara Independen satu sama lain.Pemetaan Genetik A s p e k lain yang sangat penting dalam analisis genetik adalah pemetaan genetik.Fungsi Pemetaan genetik merupakan suatu cara untuk menentukan urutan gen-gen dipemetaangenetilf dalam suatu k r o m o s o m . Selain itu, pemetaan genetik juga digunakan untukAspek-aspel<utama menentukan jarak relatif antara suatu gen dengan gen yang lain. Dalam pemetaanpemetaangenetik genetik, jarak a n t a r a l o k u s - l o k u s yang b e r e k o m b i n a s i akan m e n e n t u k a n frekuensi rekombinasi. Frekuensi r e k o m b i n a s i bersifat p r o p o r s i o n a l t e r h a d a p jarak, asalkan kedua lokus tidak terletak terlalu berdekatan satu sama lain. O l e h karena Itu, besarnya frekuensi rekombinasi dapat digunakan untuk menentukan urutan gen- gen dalam k r o m o s o m . Dalam pemetaan genetik ada dua aspek utama yaitu: ( 1 )penentuan urutan linear lokus-lokus dalam k r o m o s o m , dan (2)penentuan jarak relatif antarlokus. Dengan menghltung frekuensi rekombinasi antara dua lokus, kita dapat mengetahui jarak relatif antara kedua lokus tersebut yaitu 1% rekombinasi sama dengan 1 ( s a t u ) satuan p e t a (map unit) a t a u 1 ( s a t u ) centimorgan (cM). O l e h k a r e n a I t u dua genyang berekombinasi dengan frekuensi 3 %dikatakan berjarak 3 satuan peta (centimorgan). Salah satu contoh prinsip penentuan urutan g e n dalam k r o m o s o m dlberlkan di bawah ini. Misalkan ada tiga gen yang belum diketahui urutannya satu sama lain yaitu gen A , g e n B, dan g e nC . Misalkan diketahui frekuensi rekombinasi antara A - B = 1 2%, B-C = 7%, dan A - C = 5%. Kemungkinan 7 : G e n A t e r l e t a k d l t e n g a h 12 Oleh karena jarak B-C sebenarnya adalah 7, maka kemungkinan A terletak di tengah tidak dapat diterima.

Kemungkinan 2: G e n B t e r l e t a k d l t e n g a h Bab 4 Analisis Genetik 45A 12 B B 7CA 5COleh karena jarak A - C sebenarnya adalah 5, maka kemungkinan B terletak dltengah tidak dapat diterima.Kemungkinan 3: G e n C t e r l e t a k d i t e n g a h 7 BA 5 CCA 12 BJarak antara A - B sesuai dengan keadaan sebenarnya sehingga kemungkinan inidapat diterima. Oleh karena itu urutan gen-nya adalah A-C-B. Pemetaan g e n dengan prinsip seperti dijelaskan dl atas dapat dilakukandengan persilangan antara jasad-jasad yang mempunyai genotipe berbeda. Per-silangan dilakukan beberapa kali dengan menggunakan acuan d u a g e n sebagaip e n a n d a (marker genes) h a s l l p e r s i l a n g a n n y a , m i s a l n y a a n t a r a A d a n B , A d a n C ,serta B dan C. Dengan melihat hasll persilangannya akan dapat dihitung frekuensirekombinasi antara gen-gen penanda tersebut. Mengingat frekuensi rekombinasibersifat proporsional terhadap jarak relatif antargen maka urutan gen-gen denganprinsip seperti diatas dapat ditentukan.Meskipun prinsip diatas dapat digunakanu n t u k m e n e n t u k a n jarak relatif a n t a r g e n , n a m u n jarak fisik s e s u n g g u h n y a a n t a r g e ntidak mempunyai keterkaitan langsung dengan jarak antargen yang ditentukanberdasarkan atas frekuensi rekombinasinya. Sebaliknya, urutan linear gen yangsatu dengan g e nlain yang ditentukan dengan prinsip pemetaan genetik sepertid l a t a s a k a n i d e n t i k d e n g a n p e t a f i s i k (piiysical map) s e s u n g g u h n y a . - «U>*«»..A^C5. . V«i«iS«»a^.Prinsip rekombinasi genetik dapat juga digunakan untuk memetakan mutasi delesiyang terjadi pada suatu jasad. Hal Ini dapat dilakukan dengan melakukan persilanganantara suatu m u t a n yang (diduga) m e m p u n y a i delesi dengan m u t a n lain yangm e n g a l a m i m u t a s i t i t i k (point mutation). H a s l l p e r s i l a n g a n k e d u a m u t a n t e r s e b u tt i d a k a k a n m e n g h a s i l k a n k e t u r u n a n y a n g b e r s i f a t a l a m i (wild type) j i k a d e l e s iyang terjadi mencakup bagian g e n yang mengalami mutasi titik. U n t u k lebihjelasnya dapat dilihat pada Gambar 4.1.

46 Biologi Molekular b+ e+ a+ b+ c+ d+ e+ a+ Mutan delesi Jasad yang mengalami mutasi titik pada gen c Tidak ada keturunan yang bersifat alami G a m b a r 4 . 1 ft P e r s i l a n g a n a n t a r a m u t a n d e l e s i d e n g a n j a s a d y a n g m e n g a l a m i mutasi titik tidak akan menghasilkan keturunan yang bersifat alami karena mutasi pada g e n c tidak dapat dikomplementasi oleh m u t a n delesi. D e n g a n d e m i k i a n d a p a t d i k e t a h u i b a h w a delesi terjadi p a d a b a g i a n y a n g m e n c a k u p g e n c. U n t u k mengetahui apakah delesi juga mencakup bagian gen d maka harus dilakukan persilangan dengan jasad yang mengalami mutasi titik pada g e n d. Dengan prinsip yang sama akan diketahui bahwa hasil persilangannya tidak akan bersifat alami karena mutasi pada gen d tidak dapat dikomplementasi.Komplementasi GenetikManfaat Sebelum menjelaskan fenomena komplementasi genetik terlebih dahulu akankomplementasi diberikan c o n t o h mengenai hasll persilangan antara d u a jasad yang mengalamigenetik mutasi pada gen yang berbeda. Misalkan jasad eukaryot haploid A yang mempunyai f e n o t i p e His* Leu\" Met* d i k a w i n k a n d e n g a n jasad e u k a r y o t h a p l o i d B yang m e m p u n y a i f e n o t i p e His\" Leu* Met*. J i k a k e t u r u n a n ( d i p l o i d ) hasll p e r s i l a n g a n t e r s e b u t m e m p u n y a i f e n o t i p e His* Leu* Met* m a k a d a p a t d i s i m p u l k a n b a h w a m u t a s i g e n p a d a j a s a d A ( l e u ) d a p a t dikomplementasi o l e h g e n t i p e a l a m i p a d a jasad B (LEU) sehingga f e n o t i p e yang m u n c u l pada k e t u r u n a n n y a bersifat seperti t i p e a l a m i (Leu*). S e b a l i k n y a , m u t a s i g e n p a d a j a s a d B (his) d i k o m p l e m e n t a s i o l e h g e n t i p e a l a m i j a s a d A (H/S) s e h i n g g a k e t u r u n a n n y a b e r s i f a t s e p e r t i t i p e a l a m i (His*). C o n t o h di atas menunjukkan bahwa mutasi pada suatu gen yang dimiliki oleh suatu jasad dapat \"tertutupi\" oleh g e nyang identik yang berasal dari jasad lain yang tidak mengalami mutasi. Dalam halInisifat alami yang muncul pada k e t u r u n a n n y a , m i s a l n y a His*, t i d a k d i t e n t u k a n o l e h g e n his ( m u t a n ) p a d a j a s a d B m e l a i n k a n d i s e b a b k a n o l e h e k s p r e s i g e n HIS ( f u n g s i o n a l ) y a n g b e r a s a l d a r i j a s a d A . D e n g a n k a t a l a i n , g e n HIS y a n g f u n g s i o n a l d a p a t m e n g k o m p l e m e n t a s i m u t a s i p a d a g e n his. Prinsip komplementasi genetik m e m p u n y a i arti sangat penting dalam analisis genetik konvensional, misalnya untuk menentukan apakah dua mutasi bersifat alellk atau tidak. D isamping itu, dalam biologi molekular, m e t o d e komplementasi genetik masih sering digunakan, misalnya untuk membantu dalam mengisolasi

Bab 4 Analisis Genetik 47suatu gen. Kita dapat melakukan isolasi suatu g e n yang Informasi mengenalstruktur fisiknya sama sekall belum diketahui dengan cara m e m b u a t mutanterlebih dahulu. Misalnya untuk mengisolasi gen yang menentukan kemampuansintesis asam a m i n o leusin pada suatu bakteri. Pertama kali dibuat terlebihd a h u l u m u t a n y a n g tidak mampu m e n y i n t e s i s l e u s i n . M u t a s i d a p a t d i l a k u k a ndengan berbagai cara. Mutan Ini nantinya akan digunakan sebagai inang yanga k a n dikomplementasi o l e h f r a g m e n D N A y a n g d i i s o l a s i d a r i j a s a d y a n g mampumenghasilkan leusin. Fragmen D N A diisolasi dari jasad yang m a m p u menyintesis leusin denganharapan sebagian dari fragmen D N Atersebut mengandung gen (fungsional)yang menentukan sintesis leusin. Fragmen D N A tersebut kemudian disambungkanke dalam suatu D N A vektor, misalnya plasmid, yang digunakan dalam teknikrekayasa genetik. D N A v e k t o r beserta fragmen D N A yang diisolasi tersebutkemudian dimasukkan k e dalam mutan yang tidak mampu menyintesis asamamino leusin dengan teknik transformasi. Mutan yang ditransformasi denganfragmen D N A yang (kemungkinan) mengandung gen leusin tersebut kemudiand i t u m b u h k a n d a l a m m e d i u m a g a r y a n g tidak m e n g a n d u n g a s a m a m i n o l e u s i n .Jika fragmen D N A yang masuk k e dalam selm u t a n tersebut tidak mengandunggen leusin yang fungsional, maka sel tersebut tidak akan t u m b u h dalam m e d i u myang tidak mengandung leusin. Sebaliknya, jika ada fragmen D N A yangmengandung gen leusin masuk k e dalam sel mutan, maka sel mutan tersebutdapat t u m b u h pada m e d i u m yang tidak mengandung leusin. Hal ini dikarenakanmutasi gen leusin pada jasad mutan dapat dikomplementasi oleh fragmen D N Ayang mengandung gen leusin yang fungsional dari jasad lain. O l e h karena itu,pengisolaslan gen leusin tersebut dapat dilakukan dengan melakukan pemilihan(skrinlng) terhadap sel-sel yang m a m p u t u m b u h pada m e d i u m yang tidakmengandung leusin. Fragmen D N Ayang sebelumnya telah ditransformasikannantinya dapat diisolasi lagi dari sel-sel yang m a m p u t u m b u h d a l a m m e d i u mtersebut. Fragmen D N A tersebut kemungkinan mengandung gen leusin yangfungsional karena dapat mengkomplementasi mutasi pada sel Inangnya. Dengan berkembangnya teknik biologi molekular, kini dimungklnkan untukmelakukan komplementasi mutasi pada jasad-jasad hidup yang hubungan k e -k e r a b a t a n n y a j a u h . S e b a g a i c o n t o h , m u t a s i p a d a g e n l e u s i n p a d a k h a m i r Saccha-romyces cerevisiae d a p a t d i k o m p l e m e n t a s i d e n g a n g e n l e u s i n f u n g s i o n a l y a n gb e r a s a l d a r i b a k t e r i Escherichia coli. Beberapa prinsip analisis genetik seperti dijelaskan di atas tidak hanyaberperanan untuk menjelaskan fenomena genetik secara konvensional, namunjuga sangat berguna di dalam analisis molekular. O l e h karena itu, teknik-teknikgenetika konvensional, meskipun sebagian mulai ditlnggalkan, masih relevan untukdikuasai. Dalam beberapa hal seringkali teknik analisis genetik masih digunakandalam kajlan awal analisis molekular jasad hidup.

48 Biologi MolekularSoal-soal^- —---^ * -•--1 . Jelaskan hubungan antara pemunculan suatu fenotipe dengan genotipe yang dimiliki oleh suatu jasad hidup.2. Jelaskan apa aplikasi penting prinsip rekombinasi dalam analisis genetik.3. D u a macam mikrobia mempunyai genotipe sebagai berikut:a. galE, recA, A (lac-proAB), amp-rh his3-A I leu2-3, ura3-52, trp 1-289, CAN\"Jelaskan kedua mikrobia tersebut termasuk dalam kelompok jasad apa.