7. Penyakit Genetik dan Anak

290 T BAB 7 PENYAKIT GENETIK DAN ANAKGambar 7-43Fluorescence in situ hybridization (FISH). A. Nukleus inter-fase dari seorang pasien lelaki yang dicurigai mengidap trisomi 18. Digunakantiga probefluoresen yang berbeda dalam suatu \"FtSH coct<tail'-probe hijau melakukan hibridisasi dengan sentromer kromosom X (satusalinan), probe merah dengan sentromer kromosom Y (satu salinan), dan probe aqua ke sentromer kromosom 18 (tiga salinan). B,Sebuah sebaran metafase yang menggunakan dua probe fluoresen yang berlainan, satu berhibridisasi dengan regio kromosom 22q13(hijau) danyang lain dengan regio kromosom 22q11 .2 (merah).Terdapat dua sinyal 22q13. Satu dari dua kromosom tidak terwarnaidengan probe unluk22q11 .2,yang menunjukkan suatu mikrodelesi di regio ini. Delesi ini menghasilkan sindrom delesi 22q11.2 (sindromDiGeorge). (A dan B, Sumbangan Dr. Nancy R. Schneider dan Jeff Doolittle, Cytogenetics Laboratory University of Texas SouthwesternMedical Center, Dallas.) kering sudah dapat menyediakan DNA untuk DIAGNOSIS GEN LANGSUNG amplifikasi PCR. Victor McKusick, seorang ahli genetika terkenal,r Uji-uji berbasis-DNA tidak bergantung pada produk dengan tepat menyebut diagnosis gen langsung sebagai biopsi diagnostik terhadap genlm manusia. Diagno- gen yang mungkin diproduksi hanya di sel khusus sis semacam ini bergantung pada deteksi perubahan tertentu (misal, otak) atau ekspresi suatu gen mungkin baru terjadi pada usia lanjut. Karena kualitatif penting pada DNA. Terdapat dua variasi hampir semua sel normal di tubuh mengandung DNA yang sama pada gangguan herediter, setiap pada diagnosis gen langsung. sel pascazigot membawa gen mutan. Salah satu teknik bersandar pada kenyataan bahwa Kedua hal tersebut menimbulkan dampak besar sebagian mutasi mengubah atau menghancurkanuntuk diagnosis pranatal penyakit genetik, karena tempat restriksi (restriction slles) tertentu di DNA nor-sudah diperoleh jumlah sel yang memadai hanya dari mal (tempat restriksi adalah sekuens DNA pendek danbeberapa mililiter cairan amnion atau dari biopsi vilus spesifik yang dikenali oleh restriction enzymes, yangkorionyang dapat dilakukan sedini trimester pertama' memiliki kemampuan membelah DNA di tempat- Terdapat dua pendekatan berbeda untuk men-diagnosis molekular penyakit gen tunggal: deteksi tempat ini). Sebagai contoh, pada gen B-globin notmal,langsung mutasi dan deteksi tak-langsung yang terdapat tiga tempat yang dikenali oleh enzim restriksididasarkan pada keterkaitan (linkage) gen penyakit MsfII (Gbr. 7-44). Mutasi sabit yang menyebabkan ane- mia sel sabit (Bab 12) melibatkan suatu perubahan satudengan penanda-penanda pengganti di genom. Kedua pasangan basa (A + T) yang menghilangkan satu darimetode ini dijelaskan pada bagian berikut. tiga tempat MsfII. Apabila DNA dari seorang normal dicerna oleh MslII, dikenai elektroforesis pada sebuah

BAB 7 PENYAKIT GENETIK DAN ANAK ' 291Sekuens pengenalan 5 b7Mstll Pro Glu Glu cc T G A,.l GGAGHbA cc r * GAG Pro G l'T:lr Val Glu Gambar744 A I A Diagnosis gen langsungl Mstt lr Mstll deteksi mutasi sabit dengan 1.15 kb 1 I analisis Southern blot. .2kb Substitusi A -+ T pada kodonProbe cDNA ' A keenam gen po globin I Msfll menghasilkan alel p.. Substitusi Msf,l ntrlGt ini menghilangkan sebuah 1.35 kb H! H tempat pengenalan Mslll di DNA 1 15kb B-globin. Oleh karena itu, saat dicerna oleh Mstlldan diprobe dengan DNA komplementer (cDNA) yang sesuai, alel Bs menghasilkan fragmen 1,35-kb dan bukan fragmen normal 1,1 s-kb. Hb, hemoglobin. AS SS AA Normal Heterozigot Homozigol Analrsis Southern blotgel, dan dihibridisasikan dengaul pr obe DNA radioaktif Oligonukleotida spesifik-alel ini kemudian dapatyang spesifik untuk gen B-globin (hibridisasi Southernblot),maka terdeteksi sebuah pita 1,15 kb yang bereaksi digunakan sebagai probe berlabel rad.ioaktif dalam analisis Southern b/of . Oligonukleotida yang me-denganprobe. Pita semacam ini terbentuk dari fragmen ngandung sekuens gen normal akan berhibridisasi dengan DNA normal dan mutan, tetapi hibridisasi1,15-kb dari kedua kromosom normal. Di pihak lain, dengan DNA mutan tidak stabil karena terdapatanalisis serupa terhadap DNA dari sel pasien yanghomozigot untuk gen hemoglobin sel sabit (HbS) meng- ketidakcocokan pada satu pasanganbasa. Oleh karenahasilkan pembentukan sebuah fragmen yang lebih itu, di bawah kondisi hibridisasi yangketat, probe nor-besar (1,35 kb), karena hilangnya tempat MstII dari mal berlabel menghasilkan sinyal autoradiografik yangkedua kromosom. Pada heterozigot, kromosom norrnal kuat dengan DNA dari orang normal, tidak ada sinyalmenghasilkan sebuah pita 1,15 kb, sedangkan kromo- pada DNAyang diekstraksi dari pasien yanghomozigotsom yang membawa mutasi menghasilkan pita 1,35 untuk gen mutan, dan sinyal lemah dengan DNA dari seorang heterozigot. Pada probe yang mengandungkb. Oleh karena ilu, analisis Southern blof memperlihat, sekuens mutan, pola hibridisasinya menjadi terbalik.kan dua pita yang berukuran berbeda sehingga Tentu saja, heterozigot akan bereaksi dengan kedua probe karena memiliki satu gen normal dan satu genpembawa sifat heterozigot dapat terdeteksi. Apabila mutasi tidak mengubah tempat restriksi, mutan.dapat digunakan pendekatan lain yang didasarkan Analisis PCR. Teknik seperti hibridisasi Southernpada pemak aian oligonukleo tida sp esifik-alel (Gbr. 7 - blol memerlukan DNA genom dalam jumlah besar.45). Sebagai contoh, banyak kasus defisiensi o,-antitripsin disebabkan oleh sebuah perubahan G + A Sebaliknya, analisis PCR, yang melibatkan amplifikasipada gen a,-antitripsin, menghasilkan apa yang di- DNA secara eksponensial, memerlukan jumlah bahan awal yang jauh lebih sedikit. Analisis PCR sekarangsebut sebagai alel Z (Bab 13). Dibuat dua oligo- digunakan secara luas dalam diagnosis molekular.nukleotida, yang di bagian tengahnya mengandung Apabila digunakan RNA sebagai substrat, RNAbasa yang membedakan alel normal dan mutan.

292. BAB 7 PENYAKIT GENETIK DAN ANAKtersebut mula-mula ditranskripsikan terbalik untuk Analisis PCR juga sangat berguna apabiia mutasimemperoleh cDNA kemudian diamplifikasi dengan berupa delesi atau ekspansi. Seperti telah dibahas,PCR. Metode ini sering disingkat sebagai RT-PCR. beberapa penyakit seperti sindrom X rapuh, berkaitan Seperti metode diagnosis gen langsung lainnya, dengan pengulangan trinukleotida. Cambar 7-46sekuens gen normal harus diketahui. Untuk mendeteksi memperlihatkan bagaimana analisis PCR dapat di-gen mutan, dirancang dua primer yang berikatandengan ujung 3' dan 5' dari sekuens normal. Dengan gunakan untuk mendeteksi mutasi ini. Dua printer yangmenggunakan DNA polimerase yang sesuai dan siklus berikatan dengan suatu sekuens di ujung 5' gen FMR1,termal, DNA sasaran diperbanyak secara luar biasa, yang terkena oleh pengr-rlangan trinukieotida, diguna-menghasilkan jutaan salinan sekuens DNA antara duatempat primer. Apabila mutasi spesifik diketahui kan untuk memperbanyak sekuens antara. Karenamengenai snatu tempat restriksi, DNA yang telah di- terdapat perbedaan besar dalam jumlah pengulangan,amplifikasi tersebut dapat dicerna. Karena mutasi trkuran produk PCR yang diperoleh dari DNA orangmengenai suatu tempat restriksi, alel mutan dan alelnormal menghasilkan produk yang ukurannya normal dengan dari mereka yang mengalami pramutasiberbeda. Perbedaan ini akan tampak sebagai pita-pita jelas berbeda. Perbedaan ukuran ini terungkap olehyangberlainan pada elektroforesis gel agarosa' Apabila, perbedaan migrasi produk DNA amplifikasi pada gel.di pihak lain, sekuens gen normal diketahui, tetapi Mutasi lengkap tidak dapat dideteksi oleh analisis PCRsekuensi alel mutan tidak diketahui, DNA dari pasien karena segmen DNA yang terkena terlalu besar untuk analisis PCR konvensional. Pada kasus sernacam ini,yang telah diamplifikasi dapat disekuens denganmetode konvensional. Dengan membandingkan harus dilakukan analisis Southern b/of terhadap DNAsekuens gennormal, mutasi penyebab penyakit dapat genomik (lihat Gbr. 7-46).diketahui. Kini mulai tersedia berbagai teknologi berbasis-PCR yang menggunakan indikator fluorofor (fluorophore) untuk mendeteksi ada tidaknya mutasi secara \"renl' time\" (yaltu selama fase eksponensial amplifikasi*. Xbal 2.6 kb Hindlll STRUKTUR GEN-_-----E _L., J Normal (alel M) Mutan (alel Z) GAC GAC AAA Gambar 745 fuAA * Diagnosis gen langsung yang menggunakan suatu probe GAG AAC oligonukleotida dan analisis Soulh- HIBRIDISASI ern blot. A, Perubahan G + A A Probe oligonukleotida M (normal) mengubah alel cx,-antitripsin nor- ACCATCGACAACAAAGGGA mal (alel M) menjadi alelZ mutan. Kuat Perubahan ini melibatkan ekson V./V\\",tr\*,ft'-fv\/\Ln-/V\- gen o,-antitripsin, yang terletak Gen normal antara tempat restriksi untuk enzimXbal dan Hrndlll. B, Prinsip probe origonukr\"otidu 1 L\"t\"h analisis probe oligonukleotida. Dua Z \.. probe oligonukleotida sintetik, satu ^uat sesuai sekuensnya dengan alel Gen mutan /' normal (probe alel M) dan yang lain dengan alel mutan (probe alel L\"\"h Z), dijajarkan dengan gen normal prob\" no,.r\"r2 dan mutan, dan pola hibridisasi,*EEI,.-,IEHPROBE NORMAL PROBE Z dengan berbagai kombinasi ditunjukkan disebelah kanan. C,Normal HeteMroZzigot Homozigot Normal HeteMrozZio'ol Homozigot Hasil analisis Southern blot ZZ apabila DNA dari orang normal Mt\4 MM zz atau mereka yang heterozigot atau homozigot untuk alel Z mutan dicerna (dengan Xbal dan Hrndlll) dan diprobe dengan probe oligonukleotida normal (M)atau Z ANALISIS SOUTHERN BLOT

BAB 7 PENYAKIT GENETIK DAN ANAI< T 293 Regio Sekuens pengkode DNA). Teknologi ini secara bermakna mengurangi CGCPengulanlan untuk gen FMRI waktu yang diperlukan untuk mendeteksi mutasiNormal dengan menyingkirkan tahap pencernaan restriksi danPramubsi elektroforesis yang digunakan pada pemeriksaan PCRMutasi penuh konvensional. Saiah satu contoh analisis mutasi hlqh- tWoughptLt adalah moleculsr bencon technology. Mo-Tempat pengenalan EcoR I W - tJ'g5r* lecttlar beacon adalah probe oligonukleotida\Ar\;f9ii fluoresen berbentuk jepit rambut yang hanya ber- Probe\n. fluoresensi setelal-r berhibridisasi dengan sekuens - - sasaran (DNA zuild-type). Apabila terdapat ketidak- -Normal Pramutasi Mutasi cocokan DNA akibat mutasi, bidak terjadi pembenlukan - pasangan dan tidak timbr\"il fluoresensi.-Normal Pramutasi Mutasi penuh ANALISIS KETERKAITAN Penuh PCR Diagnosis gen langsung hanya mungkin dilakukan Southern blot apabila gen mutan dan padanan normalnya telah diketahui dan diklona serta sekuens nukleotida kedua-Gambar 746 nya diketahui. Pada beberapa penyakit yang memiliki dasar genetik, termasuk beberapa penyakit umr.rm, di-Penerapan diagnostik Southern blotdan reaksi rantai polimerase agnosis gen langsung tidak dapat diiakukan, karena(PCR) pada sindrom X rapuh. Dengan PCR, perbedaan dalam ukuran sekllens gen terkait tidak diketahui atau penyakit bersifat multifaktor (poligen) dan br.rkan disebabkanpengulangan CGG antara orang normal dan pramutasi oleh satu gen tertentrl. Pada kasus semacam ini, harusmenghasilkan produk yang ukuran dan mobilitasnya berbeda. Pada digunakan penanda pengganti di genom, yang jugamutasi penuh/lengkap, regio antara primerlerlalu besar untuk dikenal sebagai lokus penanda (mnrker /oci), untukdiamplifikasi dengan PCR konvensional. Pada analisis Southernb/of, DNA dipotong oleh enzim yang mengapit regio pengulangan mengetahui lokasi regio kromosom yang bersangkutanCGG dan kemudian diprobe dengan DNA yang berikatan dengan dengan penyakit, berdasarkan keterkaitan penandabagian gen yang terkena. Satu pita keciltampak pada laki-laki nor- tersebut dengan satlr atau lebih gen yang diperkirakanmal, pita dengan berat molekul lebih besarditemukan pada laki-laki berkaitan dengan penyakit. An ttlisis ket erlcnitnn (littlc-dengan pramutasi, dan pita yang sangat besar (biasanya difus)pada yang mengalami mutasi penuh. nge nnalysis) adalah penilaian terhadap loki-rs penanda pada anggota keluarga yang memperlihatkar penyakit atau sifat tertentu, didasarkan pada asumsi bahwa lokus penanda yang terletak sangat dekat dengan alel penyakit diwariskan secara turlrn- 0.8 kb 6.8 kb,.v,lu'vr-@i rilii'rl:lil'iiiliilil?lrlllati':iilllrlllr v;-tvr.vAgA\#-,'ov,r GambarT-47,+ + d;;a\"j- llustrasi skematik prinsip yang mendasari analisis re stri ctia n Analisis Southern 7.6 kb frag me nt Ie n gth poly morph ism blot AB AB dalam diagnosis penyakit Orang tua Orang tua genetik. (pembawa sifat) (pembawa sifat) BB BB AA AB Alel normal 7.6 kb Terkena Terkena Normal Pembawa Alel mutan 6.8 kb 7.6 kb 6.8 kb

294 . BAB 7 PENYAKIT GENETIK DAN ANAKtemurnn. Seiring dengan waktu, kita dapat men- morfisme nrikleotida tunggal (single nucleotide poltldefinisikan suatu \"haplotipe penyakit\" berdasarkan morphivn, SNP). SNP ditemukan di sepanjang genom (misal, di ekson dan intron serta sekuens regulator);suatu panel lokus penanda yang semllanya tersebar secara teknis, RFLP juga dapat dianggap sebagai sala1r satu jenis SNP. SNP berfr,rngsi baik sebagai patokarnLrercle.katan dengan alel vang diduga menyebabkan fisik di dalam genom malrpr\"rn sebagai penanda genetik yang pewarisannya dapat diteh-rsuri dari orang tua kepenyakit. Akhirnya, analisis keterkaitan memper- anak. Karena prevalensinva di selurnh genom danmudah penentr-ran lokasi darr pengklonan alel penyakit. stabilitas relatifnya, SNP dapat digunakan dalamLokus penanda yang digunakan dalam analisis keter- analisis keterkaitan untnk mengidentifikasi haplotipe yang berkaitan dengan penyakit sehingga gen pe-kaitan adalahvariasi dalam sekuens DNA yang dikenal nyebab penyakit dapat ditemrrkan dan ditentukan letaknya. Dalam dekade terakhir, SNP menjadi pe-sebagai polimorfisme dan terjadi secara a1ami. Poli- nanda genetik pilihan untuk meneliti sifat genetik yang kompleks. Studi populasi mendapatkan adanya keter-morfisme DNA terjadi dengan frekuensi sekitar satu kaitan antara SNP spesifik dengan penl,akit rntiltifaktor seperti hipertensi, penyakit jantung, atar-r diabetes.nukleotida dalam setiap rentang 300 sampai 1000 Sebagai contoh, polin'rorfisme tertentu di dalam gen nngiotensinotcn dilaporkarn berkaitan dengan varirsipasangan basa. Dua tipe umum variasi pasangan basa pada tekanan darah istirahat dan predisp-rosisi n.rer.rg- idap hipertensi. Saat ini sedang dilakukan r.rpaya r-rntr,rkl-re f ttr-rn gga memetakan semlra SNP pada genom r-uanlrsi;r, y.rnggthns t r i c t i o r o gm e n I en p o It1 m o rph i sm mtrngkin dapat memfasilitasi pembuatan \" SllP t:hip\" untuk menentukan profii risiko genetik seseorang.dan polimorfisme nukleotida tunggal-akan dibahas lndikasi untuk Analisis Genetikpada bagian ini. Pad a pembahasan sebelumnya, dijelaskan sebagianPolimorfisme DNA tertentn dapat menghilangkan dari beragam teknik yang saat ini tersedia r-rntuk diag- nosis penyakit genetik. Agar metode ini dapat digr.rna-atar-r menciptakan tempat pengenalan ttntttk enzimrestriksi, sehingga panjang fragmen DNA yang kan dengan benar, perlu diketahr\"ti siapa sajcr vangdihasilkan setelah digesti berubah. Istilah restriction memerlukan uji genetik. Secara umum, uji genetik dapat dibagi menjadi analisis pranatal dan pascanatal. Ujifrngment length polymorphi:^la (RFLP) mengaclr tersebr,rt mungkin berupa sitogenetika konrrensional, FISH, diagnosis molekular, atalt kombinasi berbagaikepada variasi panjang fragmen antara individr\"r yang teknik tersebtrt.terjadi akibat polimorfisrne sekltens DNA. Dengan Annlisis genetik pronntnl seyogianya ditawarkan kepada semlla pasien yang berisiko merniliki anakmenggunakan proba DNA yang sesttai yang ber- dengan kelainan sitogenetik. Analisis ini dapat dilaktr- kan pada sel yang diambil melalui amniosentesis, padahibrid isasi dengan sekttens di dekat tempa t polimorfik, bahan biopsi vilus korion, atau pada darah tali pusat\" Beberapa indikasi penting adalah sebagai berikut:dapat terdeteksi fragmen DNA yang panjangnya r lbu yang berusia lanjut (>34 tahtrn), karena risikoberbeda-beda dengan analisis Southern b/of. Walatrpr-rn trisomi meningkatbiasanya terbatas pada regio genom yang tidak meng- r Orang tua yang merupakan pembawa sifal sr-ratr.rkode (noncodlng), RFLP ternyata sangat bermanfaat translokasi timbal-balik seimbang, translokasidalam diagnosis genetik karena keterkaitannya dengan robertsonian, atau inversi (pada kasus ini gamet mungkin menjadi tidak seimbang sehingga ke-gen penyebab penyakit. Gambar 7-47 nernperlihatkan turunan berisiko mengidap ganggllan kromosom)prinsip analisis RFLP. Pada contoh tentang per-ryakit r Orang tua yang pernah memiliki anak denganresesif autosomal ini, kedua orang br,ra adalah pembawa kelainan kromosomsifat heterozigot dan anak-anaknya normal, pembawa r Orang tua yang merupakan pembawa sifat darisifat, atau pasien. Pada contoh, kromosom normal (A) suatu gangguan genetik terkait-X (untnk menentu- kan jenis kelamin janin)memiliki dua tempat resfriksi, terpisah 7 ,6kb, sedang- Anstisis genetik pasconotol biasanya dilakukankan kromosom B, yang mengalrdtrng gen mtl tan, pada iimfosit darah perifer. Indikasinya adalah sebagai berikut:memiliki polimorfilme sekuensi DNA yang menyebab-kan terbentuknya tempat restriksi tambahan (ketiga)untuk enzim vang sama. Perhatikan bahwa tempatrestriksi tambahan tidak terbentuk karena mutasi.Apabila DNA dari orang tersebr-rt dicerna denganenzim restriksi yang sesllai dan diprobe denganfragmen DNA hasil klona yang berhibridisasi dengansuatu rangkaian sekttens yang terletak antara tempat-tempat restriksi, krornosom norm al akan men ghasilkanpita 7,6-kb, sedangkan kromosom lain (yang me-ngandung gen mutan) menghasilkan pita 6,8-kb yanglebih kecil. Oieh karena itu, pada analisis Southernblotakan terlihat dua pita. Dengan teknik ini, anggotakeluarga yang mewarisi kedua kromosom nonnal dapatdibedakan dari mereka yang heterozigot atau homo-zigot untuk gen mtttan. RFLP bermanfaat dalam diag-nosis antenatal antara lain CF, penyakit Huntington,dan penyakit ginjal polikistik dewasa. Jelaslah bahwaapabila gen suatu penyakit teiah berhasil diidentifikasidan diklona maka metode yang lebih disukai adalahdiagnosis gen langsung. Jenis kedua polimorfisme, yang lebih seringditemukan daripada RFLP, dikenal sebagai poli-



296 T BAB 7 PENYAKIT GENETIK DAN ANAK telbaru tentang kriteria diagnostik konsensus dan Wolfsdorf ]I, et al: Glycogen storage diseases. Endocrinol klasifikasi neuroblastoma serta tumor neuroblastik Metab Clin North Am 28:801, 1999. (Pembahasan men- lainnya.) dalam tentang penyakit penimbunan glikogen.)Smyth CM, Bremmer WJ: Klinefelter syndrome. Arch In- Worlitzsch D, et al: Effects of reduced mucus oxygen con- tern Med 158:1309, 1998. (Pembahasan yang sangat baik centrations in airway Pseudomonas infections of cystic tentang gambaran klinis.) fibrosis patients. J Clin Invest1.09:317,2002. (Makalah ini menyajikan pemahaman baru mengenai patogenesisUsdin K, Grabczyk F: DNA repeat expansions and human infeksi Pseudomonas pada CF.) disease. Cel1 Mol Life Sci 57:91'4,2000. (Ulasan terinci mengenai berbagai gangguan pengulangan trinukleotida yang saat ini diketahui.)