Bab 05. Pembiakan Mikroorganisme

BABPembiakan Mikro organisrne Pembiakan adalah suatu proses memperbanyak organisme perbedaan muatan ini menyumbangkan energi bebas yangdengan menyediakan kondisi lingkungan yang cocok. Mikro-organisme yang sedang tumbuh, membuat replika dirinya dilepaskan saat proton memasuki sitoplasma dari bagian luarsendiri, dan memerlukan unsur-unsur yang terdapat dalam membran. Proses metabolik yang membentuk gaya protonkomposisi kimia tubuh mikroorganisme tersebut. Nutrien motif didiskusikan pada Bab 6. Energi bebas dapat digunakanharus menyediakan unsur-unsur tersebut dalam bentuk yang untuk pergerakan sel, untuk mempertahankan gradien iondapat dimetabolisme. Seiain itu, organisme juga memerlukan atau molekul antara kedua sisi membran, untuk menyintesis ikatan anhidrida dalam ATP, atau untuk gabungan tujuan-energi metabolik untuk menyintesis makromolekul danmempertahankan gradien kimia dasar di antara kedua sisi tujuan ini. Sebagai alternatif, sel-sel yang mendapatkanmembran organisme tersebut. Faktor-faktor yang harusdikontrol selama pertumbuhan meliputi nutrien, pH, suhu, sumber ATP dapat menggunakan energi ikatan anhidridaaerasi, konsentrasi garam, dan kekuatan ionik medium. dari ATP tersebut untuk membentuk gaya proton motif yang pada gilirannya dapat digunakan untuk pergerakan sei danKEBUTUHAN UNTUK PERTUMBUHAN untuk mempertahankan gradien kimia.Sebagian besar berat kering mikroorganisme merupakan Untuk tumbuh, suatu organisme memerlukan semuamateri organik yang mengandung unsur karbon, hidrogen, elemen yang terdapat dalam materi organiknya serta semuanitrogen, oksigen, fosfor, dan sulfur. Selain itu, ion anorganik, ion pelengkap yang dibutuhkan untuk proses yang berkaitanseperti kalium, natrium, besi, magnesium, kalsium, danklorida, diperlukan untuk memfasilitasi katalisis enzimatik dengan energi dan katalisis. Selain itu, harus terdapat sumberdan untuk mempertahankan gradien kimia antara kedua sisi energi agar suatu organisme dapat membentuk gaya protonmembran mikroorganisme tersebut. motif dan dapat melakukan sintesis makromolekul. Mikro- organisme memiliki kebutuhan nutrisi dan sumber energi Sebagian besar materi organik terdapat dalam makro- metabolik yang sangat beragam.molekul yang dibentuk melalui ikatan anhidrida antara blok(komponen) pembangun. Sintesis ikatan anhidrida me- SUMBER.SUMBER ENERGI METABOTIKmerlukan energi kimia yang disediakan oleh dua ikatanfosfodiester dalam ATP (adenosin trifosfat; lihat Bab 6). Tiga mekanisme utama untuk membentuk energi metabolikEnergi tambahan yang dibutuhkan untuk mempertahankan adalah fermentasi, respirasi, dan fotosintesis. Setidaknya salahkomposisi sitoplasma yang relatif konstan selama ber- satu mekanisme ini harus berjalan jika suatu organismelangsungnya peftumbuhan dalam lingkungan kimiaekstraseluler yang bervariasi diperoleh dari gaya proton sedang tumbuh.motif (proton motiveforce). Gaya proton motif adalah energi Fermentasipotensial yang dapat diperoleh dari proses berjalannya protonmelewati membran. Pada eukariota, membran ini mungkin Pembentukan ATP dalam fermentasi tidak digabung dalamsaja merupakan bagian mitokondria atau bagian kloroplas. proses pemindahan elektron. Fermentasi ditandai denganPada prokariota, membran tersebut adalah membran fosforilasi substrat, suatu proses enzimatik berupa sebuahsitoplasma milik sel. ikatan pirofosfat disumbangkannya secara langsung ke ADp Gaya proton motif adalah gradien elektrokimia yang (adenosin difosfat) oleh suatu zat metabolik antaramemiliki dua komponen: perbedaan pH (konsentrasi ion terfosforilasi. Zat antara terfosforilasi ini dibentuk denganhidrogen) dan perbedaan muatan ionik. Muatan pada bagian penataan-ulang metabolik substrat yang dapat difermentasi,luar membran lebih positif dari muatan di bagian dalam, dan seperti glukosa, laktosa, atau arginin. Karena fermentasi tidak disertai oleh perubahan dalam status oksidasi-reduksi substrat yang dapat difermentasi secara keseluruhan, komposisi dasar pr.oduk fermentasi pasti identik dengan komposisi substrat. Misalnya, fermentasi sebuah molekul glukosa (C6H,rOu) 66

BAB 5 * Pembiakan Mikroorganisme 67melalui jalur Embden-Meyerhof (lihat Bab 6) memberikan bentuk yang dapat diasimilasi. Naftalen, misalnya, dapathasilbersih duaikatan pirofosfat dalamAIP dan menghasilkan menyediakan semua karbon dan energi yang diperlukandua molekul asam laktat (C3H6O.). untuk respiratorik pertumbuhan heterotrofik, tetapi sangatRespirasi sedikit organisme yang memiliki jalur metabolik yang diperlukan untuk asimilasi naftalen. Glukosa, di sisi lain,Respirasi bersifat analog terhadap penggabungan prosesdependen-energi ke pelepasan muatan baterai. Reduksi kimia dapat menunjang pertumbuhan fermentatif atau respiratoriksuatu oksidan (akseptor elektron) melalui serangkaian karier banyak organisme. Substrat-substrat pertumbuhan haruselektron spesifik pada membran akan menghasilkan gaya disediakan pada kadar yang sesuai bagi galur mikroba yangproton motif di sepanjang membran bakteri. Reduktor (donor sedang tumbuh: Kadar yang menunjang pertumbuhan suatuelektron) dapat merupakan materi organik atau anorganik: organisme dapat menghambat pertumbuhan organismemisalnya, asam laktat berperan sebagai reduktor padasebagian organisme, dan gas hidrogen merupakan reduktor lainnya.bagi organisme-organisme lain. Gas oksigen (Or) seringdigunakan sebagai oksidator, tetapi terdapat oksidator Karbon dioksida diperlukan untuk sejumlah reaksialternatif yang digunakan oleh beberapa organisme, antara biosintesis. Banyak organisme respiratorik menghasilkanlain karbon dioksida (COr), sulfat (SO4': ), dan nitrat (NO. ). karbon dioksida dalam jumlah yang lebih dari cukup untuk memenuhi kebutuhan ini, tetapi banyak organisme lainFotosintesis memerlukan sumber karbon dioksida dalam mediumFotosintesis serupa dengan respirasi, dalam arti bahwa reduksi pertumbuhannya.suatu oksidan melalui serangkaian karier elektron spesifikmenghasiikan gaya proton motif. Perbedaan antara kedua Sumber Nitrogenproses ini adalah pada fotosintesis, reduktor, dan oksidator Nitrogen merupakan komponen penting protein, asamdibuat secara fotokimiawi dengan energi cahaya yang diserap nukleat, dan senyawa lain, membentuk sekitar 5%o berat keringoleh pigmen pada membran; karena itu, fotosintesis hanya suatu sel bakteri tipikal. Dinitrogen (Nr) anorganik sangatdapat berlanjut selama terdapat sumber energi cahaya. banyak dijumpai karena menl'usun 80% atmosfer bumi.Tanaman dan beberapa bakteri mampu mengubah energicahaya dalam jumlah yang banyak dengan menggunakan air Dinitrogen anorganik ini juga merupakan senyawa yangsebagai reduktor karbon dioksida. Oksigen dibentuk dalamproses ini, dan dihasilkan materi organik. Respirasi, proses sangat stabil, terutama karena diperlukan energi aktivasi yangoksidasi materi organik yang secara energi menguntungkanoleh suatu akseptor eiektron, seperti oksigen, dapat me- tinggi untuk memutus ikatan kovalen tiga nitrogen-nitrogen.nyediakan energi bagi organisme fotosintetik dalam kondisiketiadaan cahaya. Namun, nitrogen mungkin dipasok dalam beberapa bentuk yang berbeda, dan mikroorganisme memiliki kemampuanNUTRISI yang berbeda-beda dalam mengasimilasi nitrogen (TabelNutrien dalam medium pertumbuhan harus mengandung 5-l). Produk-akhir semua jalur asimilasi nitrogen adalah bentuk tereduksi maksimal unsur ini, amonia (NH.). Iikasemua unsur yang diperlukan untuk sintesis biologis tersedia NH., senyawa ini akan berdifusi masuk ke dalamorganisme-organisme baru. Dalam pembahasan berikut, sebagian besar bakteri melalui kanal transmembran, sebagainutrien diklasifikasikan menurut elemen yang tersedia pada bentuk gas NH., bukan sebagai bentuk ionik (NHn.).organisme tersebut. Kemampuan mengasimilasi N, dengan cara mereduksinyaSumber KarbonSeperti disebutkan di atas, tanaman dan sebagian bakteri menjadi NH. yang dikenal sebagai fiksasi nitrogen,mampu menggunakan energi fotosintetik untuk mereduksi merupakan sifat yang khas untuk prokariota, dan hanyakarbon dioksida dengan menggunakan air. Organisme- sedikit bakteri yang mampu memutus ikatan kovalen tigaorganisme ini termasuk dalam grup autotrof, makhluk yangtidak memerlukan nutrien organik untuk pertumbuhan. nitrogen-nitrogen. Proses ini (lihat Bab 6) memerlukanAutotrof lain adalah kemolitotrof, organisme yang meng-gunakan substrat anorganik, seperti hidrogen atau tiosulfat, sejumlah besar energi metabolik dan dinonaktifkan dengansebagai reduktor dan karbon dioksida sebagal sumber mudah oleh oksigen. Kemampuan untuk melakukan liksasikarbon. nitrogen ditemukan dalam bakteri yang jenisnya sangat beragam yang telah mengembangkan strategi biokimiawi . Heterotrcf memerlukan karbon organik untuk per-tumbuhan, dan karbon organik ini harus terdapat daiam yang berbeda-beda untuk melindungi enzim pengikat- nitrogen bakteri tersebut dari oksigen. Sebagian besar mikroorganisme dapat menggunakan NH. sebagai satu-satunya sumber nitrogen, dan banyak organisme memiliki kemampuan untuk membentuk NH, dari amina (R-NHr) ataudari asam amino (RCHNHTCOOH), umumnya di dalam sei. Produksi NH. dari deaminasi asam amino dinamakan amonifikasi. Amonia disisipkan ke dalam materi organik melalui jalur-jalur biokimiawi yang melibat- kan glutamat dan glutamin. Jalur-jalur ini dibicarakan dalam Bab 6. Banyak mikroorganisme memiliki kemampuan untuk mengasimilasi nitrat (NO, ) dan nitrit (NOr-) secara reduktif

68 BAGIAN I N. Dasar-Dasar Mikrobiologidengan mengubah ion-ion tersebut menjadi NH,. Proses Sumber Mineraltersebut masing-masing dinamakan reduksi nitrateasimilatorik dan reduksi nitrite asimilatorik. )alur-jalur Berbagai mineral diperlukan untuk fungsi enzim. Ionuntuk asimilasi ini berbeda dari jalur yang digunakan untuk magnesium (Mg'.) dan ion ferrous (Fe':t) juga ditemr\"rkan dalam turunan porfirin: magnesium dalam molekul klorofil,disimilasi nitrat dan nitrit. lalur disimilatorik digunakan oleh dan besi sebagai bagian koenzim sitokrom dan peroksidase.organisme yang menggunakan ion-ion tersebut sebagai Mg2t dan Kt diperlukan untuk fungsi dan integritas ribosom. Meskipun tidak penting bagi bakteri gram-negatif, Ca2*akseptor elektron terminal dalam respirasi. Beberapa bakteri dibutuhkan sebagai unsur pokok dinding se1 organisme gram-autotrofik (misalnya, Nitrosomonas, Nitrobacter) mampu positif. Banyak organisme yang tinggal di laut memerlukanmengubah NH. menjadi gas N. dalam kondisi anaerobik; Nan untuk pertumbuhan. Saat membuat medium pembiakanproses ini dikenal sebagai denitrifikasi. Pemahaman kita sebagian besar mikroorganisme, perlu disediakan sumber-mengenai siklus nitrogen terus berkembang. Pada pertengahan sumber kalium, magnesium, kalsium, dan besi, biasanya1990-an, ditemukan reaksi anammox. Reaksi berupa bentuk ion (K*, Mg2-, Ca2*, dan Fe,*). Banyak mineral NH** + NO, ------> N, + 2H,O lain (misalnya, Mn2*, Moz*, Co2n, Cu2*, dan Zn,) juga diperlukan; mineral mineral ini sering dapat disediakanberupa amonia dioksidasi oleh nitrite, merupakan proseSmikrobia yang terjadi dalam air laut yang anoksik, dan dalam bentuk air mengalir atau sebagai kontaminan komposisi medium lain.merupakan jalur penting pengembalian nitrogen ke Ambilan besi yang membentuk hidroksida tak-larut padaatmosfer. pH netral, difasiiitasi dalam banyak bakteri dan jamur oleh produksi siderofor-senyawayang mengikat besi dan membuatTABEL 5-1 Sumber Nitrogen dalam Nutrisi transportasi besi sebagai kompleks terlarut. Siderofor iniMikroba mencakup hidroksamat (-CONHTOH) yang dinamakan sideramine, dan turunan katekol (misalnya, 2,3 dihidroksi-No.- +5 benzoilserin). Siderofor yang disandi plasmid memainkan +3Nq- 0 peranan penting dalam daya invasi beberapa bakteri patogenik ..l (lihat Bab 7). Mekanisme ambilan besi dependen-sideroforN2 dan -nonsiderofor oleh bakteri dibahas dalam Bab 9.NHo* -3 Faktor PertumbuhanR-NHr\"\"R, radikal orqanik. Faktor pertumbuhan adalah senyawa organik yang harus dimiliki sebuah sel agar dapat tumbuh, tetapi tidak dapatSumber Sulfur disintesis sendiri. Banyak mikroorganisme, jika disediakanSeperti nitrogen, sulfur merupakan komponen banyak nutrien-nutrien yang disebut di atas, mampu menyintesissubstansi sel organik. Sulfur membentuk bagian strukturbeberapa koenzim dan ditemukan dalam rantai samping semua blok pembangun untuk makromolekul (Gambar 5-l):sisteinil dan metionil pada protein. Sulfur dalam bentuk asam amino; purin, pirimidin, dan pentosa (prekursordasarnya, tidak dapat digunakan oleh tumbuhan maupun metabolik asam nr\"rkleat); karbohidrat tambahan (prekursorhewan. Namun, beberapa bakteri autotrofik dapat meng- polisakarida); dan asam lemak serta senyawa isoprenoid. Selain itu, organisme yang hidup bebas juga harus mampuoksidasinya menja.di sulfat (SOn'Z). Sebagian besar mikro-organisme dapat menggunakan sulfat sebagai sumber sulfur, menyintesis vitamin kompleks yang bekerja sebagai prekursordengan mereduksi sulfat menjadi hidrogen sulfida (H.S). koenzim.Sebagian mikroorganisme dapat mengasimilasi HrS secaralangsung dari medium pertumbuhan, tetapi senyawa ini dapat Setiap senyawa esensial ini disintesis melalui serangkaianbersifat toksik bagi banyak organisme. reaksi enzimatik yang berlainan; setiap enzim dihasilkan di bawah kendali suatu gen spesilik. Jika suatu organismeSumber Fosfor mengalami mutasi gen yang menyebabkan kegagalan fungsi salah satu enzim ini, rantai akan terputus dan produk akhirFosfat (POr3-) diperlukan sebagai komponen ATP, asam tidak diproduksi. Lalu, organisme harus memperoleh senyawanukleat, dan koenzim-koenzim seperti NAD, NADP, dan tersebut dari lingkungan: Senyawa ini telah menjadi faktorflavin. Selain itu, banyak metabolit, lipid (fosfolipid, lipid A), pertumbuhan bagi organisme tersebut. Jenis mutasi ini dapatkomponen dinding sel (asam teikoat), beberapa polisakarida diinduksi dengan mudah di laboratorium.kapsul, dan beberapa protein memiliki struktur terfbsforilasi.Fosfat selalu diasimilasi sebagai fosfat anorganik bebas (P,). Spesies mikroba yang berbeda memiliki kebutuhan faktor pertumbuhan yang sangat beragam. Senyawa yang menyusun faktor pertumbuhan tersebut ditemukan dan perlu bagi semua organisme; perbedaan dalam kebutuhan ini mencerminkan perbedaan dalam kemampuan sintesis. Beberapa spesies tidak memerlukan faktor pertumbuhan, sedangkan yang lain- seperti beberapa laktobasil-selama evolusi, telah kehilangan

BAB 5 .i. Pembiakan Mikroorganisme 69kemampuan untuk menyintesis sebanyak 30-40 senyawa masing-masing 0,1-1 mg/L; (5) faktor pertumbuhan: asamesensial, dan dengan demikian, memerlukan senyawa- amino, purin, dan pirimidin, masing-masing sekitar 50 mg/L' dan vitamin, masing-masing 0,1-l mg/L.senyawa tersebut dalam medium pembiakan. Untuk mempelajari metabolisme mikroba, biasanya perluFAKTOR TINGKUNGAN YANG disediakan sebuah medium yang sepenuhnya sintetik, danMEMENGARUHI PERTUMBU}IAN diketahui karakteristik dan konsentrasi setiap komponennya. jika tidak, jauh lebih mudah dan sederhana untuk meng-Medium pertumbuhan yang sesuai harus mengandung semua gunakan materi alami, seperti ekstrak ragi, materi hasil digestinutrien yang diperlukan oleh organisme yang akan dikuitur' protein, atau substansi yang serupa. Sebagian besar mikroba yang hidup bebas akan tumbuh baik pada ekstrak ragi; bentukdan faktor-faktor seperti pH, suhu, dan aerasi harus parasitik mungkin memerlukan substansi khusus yang hanyadikendalikan dengan cermat. Medium cair digur:rakan; ditemukan daiam darah atau dalam ekstrak jaringan hewan.medium ini dapat dibuat je1 untuk tujuan khusus dengan Meskipun demikian, terdapat juga mikroba parasitikmenambahkan agar atau jel silika. Agar, ekstrak polisakarida (misalnya, Treponema pallidum) yang tidak dapat di-suatu alga laut, secara khusus cocok untuk pembiakanmikroba karena sifatnya yang resisten terhadap kerja mikroba tumbuhkan in vitro atau yang hanya dapat tumbuh dalam sel-dan karena agar melarut pada suhu 100' C, tetapi tidak se1 eukariotik (misalnya, Chlamy dia trachomatis).membentuk jel hingga didinginkan di bawah 45\" C; sel-sel Untuk banyak organisme, suatu senyawa tunggaldapat disuspensikan dalam medium pada suhu 45\" C, (misalnya, asam amino) dapat berfungsi sebagai sumberkemudian medium dengan cepat didinginkan hingga menjadi energi, sumber karbon, dan sumber nitrogen; organisme lainjel tanpa merusak sel-sel tersebut. memerlukan senyawa yang berbeda untuk tiap-tiap nutrien.Nutrien jika materi alami pada medium nonsintetik tidak me-Pada halaman-halaman sebelumnya, telah dipaparkan fungsi ngandung nutrien tertentu dalam jumlah yang cukup, nutrientiap nutrien dan diberikan daftar substansi yang cocok. Secara ini harus dilengkapi.umum, hal-hal berikut harus disediakan: (1) donor danakseptor hidrogen : sekitar 2 glL; (2) sumber karbon: sekitar Konsentrasi lon Hidrogen (pH)I glL; (3) sumber nitrogen: sekitar 1 g/L;(4) mineral: sulfur Sebagian besar organisme memiliki kisaran pH optimal yang cukup sempit. pH optimal harus ditentukan secara empirisdan fosfor, masing-masing sekitar 50 mg/L, dan unsur renik, untuktiap-tiap spesies. Sebagian besar organisme (neutralofil) tumbuh paling baik pada pH 6,0-8,0, meskipun beberapaBlok pembangun HzQ Makromolekul Persen Berat Kering dalam Sel Tipikal Asam amino HrQ Asam nukleat Mononukleotida L , polisakarida Monosakarida HlO' 6 + Prekursor isoprenoid !r;Q Asam lemakGAMBAR 5-1 Sintesis makromolekul. Polimerisasi blok pembangun menjadi makromolekul terutama dicapai dengan pembentukanikatan anhidrida. Pembentukan asam lemak dari asetat memerlukan beberapa tahap reduksi biokimiawi dengan menggunakan donorhidroEen organik (D.H,).

70 BAGIAN I * Dasar-Dasar Mikrobiologijenis (asidofil) memiliki pH optimal hingga serendah 3,0, dan Bab 4) ; dingin yang ekstrem juga membunuh mikroorganisme,yang lainnya (alkalifil) memiliki pH optimal hingga setinggi meskipun tidak dapat digunakan secara aman untuk sterilisasi. Bakteri juga memperlihatkan fenomena yang disebut syok 10,5. dingin (cold shock): terbunuhnya se1 oleh pendinginan suhu yang cepat-bukan lambat. Misglnya, pendinginan cepat Mikroorganisme mengatur pH internalnya terhadap Escherichia coll dari suhu 37'C menjadi 5'C dapat membunuh 90% sel. Sejumlah senyawa melindungi sel dari syok dinginkisaran nilai pH eksternal dengan memompa proton keluar atau pembekuan; gliserol dan dimetil sulfoksida merupakanatau masuk sel tersebut. Asidofil mempertahankan pH senyawa yang paling sering digunakan.internal sekitar 6,5 pada kisaran pH eksternal 1,0-5,0; Aerasineutralofil mempertahankan pH internal sekitar 7,5 pada Peran oksigen sebagai akseptor hidrogen dibahas dalam Babkisaran pH eksternal 5,5-8,5; dan alkalihl mempertahankan 6. Banyak organisme merupakan aerob obligat, secara spesifikpH internal sekitar 9,5 pada kisaran pH eksternal 9,0-11,0. memerlukan oksigen sebagai akseptor hidrogen, beberapapH internal dikendalikan oleh serangkaian sistem transpor merupakan organisme fakultatif, mampu hidup secara aerobikproton di dalam membran sitoplasma yang mencakup pompa atau anaerobik, dan yang lainnya adalah anaerob obligat,proton primer bertenaga-ATP dan penukar Na*/Ht. Suatu memerlukan substansi selain oksigen sebagai akseptorsistem pertukaran K*/Ht juga telah dikemukakan berperan hidrogen dan peka terhadap pembatasan oksigen.pada regulasi pH internal dalam neutralofil. Produk-sampingan alami metabolisme aerobik adalahSuhu senyawa reaktif, hydrogen peroxide (HrOr) dan superoksida (O, ). Iika terdapat besi, kedua spesies ini dapat membentukSpesies mikroba yang berbeda memiliki kisaran suhu optimal radikal hidroksil (.OH), yang dapat merusak makromolekuluntuk pertumbuhan yang sangat beragam: Bentuk psikrofilik biologis apa pun:tumbuh paling baik pada suhu rendah (15-20'C); bentuk Optimummesofilik tumbuh paling baik pada suhu 30-37'C; dan ,tsebagian besar bentuk termofilik tumbuh paling baik padasuhu 50-60'C. Beberapa organisme merupakan hiper- ttermofilik dan dapat tumbuh pada suhu yang melebihi suhutitik didih air, yang terdapat di bawah tekanan tinggi di bagian .:zlaut yang dalam. Sebagian besar organisme merupakanmesofilik; 30\" C merupakan suhu optimal untuk banyak Io.lspesies yang hidup-bebas, dan suhu tubuh pejamu adalah 1/T fK)suhu optimal untuk simbion hewan berdarah-panas. GAMBAR 5-2 BentukumumkurvaArrheniusuntukpertumbuhan Batas atas kisaran suhu yang ditoleransi oleh tiap spesies bakteri. (Direproduksi atas izin dari lngraham JL: Growth ofberkorelasi baik dengan keseluruhan stabilitas suhu protein psychrophilic bacteria, .J Bacteriol J uly 76(1):75-80,1 958.)spesies tersebut, seperti yang diukur dalam ekstrak sel.Mikroorganisme memiliki suatu sifat yang sama denganhewan dan tumbuhan, yaitu dalam bentuk respons syok-panas (heat-shock response), sintesis sementara serangkaian\"protein syok-panas (heat-shock protein)\" saat organismetersebut terpajan peningkatan mendadak suhu yang melebihisuhu optimal untuk pertumbuhan. Protein-protein initampaknya memiliki sifat resistensi terhadap panas yang unik,dan mampu menstabilkan protein sensitif-panas di dalamsel. Hubungan antara laju pertumbuhan dan suhu untuksetiap mikroorganisme terlihat daiam bentukkurva Arrheniusyang khas (Gambar 5-2). Arrhenius menunjukkan bahwalogaritma kecepatan setiap reaksi kimia (1og k) merupakanfungsi liniar yang berbanding terbalik dengan suhu (1/T);hubungan ini dapat diperkirakan karena pertumbuhan selmerupakan hasil serangkaian reaksi kimia. Gambar 5-2menunjukkan teori tersebut pada kisaran suhu normal dan diluar normal bagi spesies tertentu; log k menurun secara linearsebanding dengan 1/7. Namun, di bawah dan di atas kisarannormal, log k turun dengan cepat sehingga ditetapkan suhumaksimum dan minimum. Selain efek mikroorganisme pada laju pertumbuhan, suhuekstrem akan membunuh mikroorganisme tersebut. Panasyang ekstrem digunakan untuk mensterilkan sediaan (lihat

BAB 5 * Pembiakan Mikroorganisme 7l Or- + HrO, --F_e3-*''/-F-e-'-* --- O, + OH 1'OH Kekuatan lonik & Tekanan Osmotik Banyak aerob dan anaerob aerotoleran dilindungi dari Dalam derajat yang lebih kecil, faktor-faktor seperti tekanan osmotik dan konsentrasi garam mungkin harus dikendalikan.produk-produk reaktif ini karena adanya superoksida Untuk sebagian besar organisme, sifat medium yang lazim sudah memuaskan, tetapi untuk bentuk organisme laut dandismutase, suatu enzim yang mengatalisis reaksi organisme yang telah beradaptasi untuk bertumbuh dalam 20, +2H* ------> O, + HrO, larutan gula pekat, sebagai contoh, faktor-faktor ini harusdan karena adanya katalase, enzim yang mengatalisis reaksi diperhatikan. Organisme yang memerlukan garam dalam konsentrasi tinggi dihenal sebagai halofilik; organisme yang 2HrO, --------> 2HrO + O, memerlukan tekanan osmotik tinggi disebut osmofilik. Beberapa organisme fermentatif (misalnya, Lactobacillus Sebagian besar bakteri mampu menoleransi tekananplantarum) bersifat aerotoleran, tetapi tidak mengandung osmotik eksternal dan kekuatan ionik dalam kisaran yangkatalase atau superoksida dismutase. Oksigen tidak direduksi luas berkat kemampuan bakteri tersebut dalam mengatur osmolalitas dan konsentrasi ion internal. Osmolalitas diatursehingga HrO, dan O, tidak diproduksi. Semua anaerob dengan transpor aktif ion K* ke dalam sel; kekuatan ionik internal dipertahankan konstan dengan mengimbangisejati tidak memiliki superoksida dismutase dan katalase. ekskresi poliamina putresin organik yang bermuatan positif.Beberapa organisme anaerobik (misalnya, Peptococcus Karena putresin membawa beberapa muatan positif peranaerobius) memiliki toleransi yang sangat kuat terhadap molekulnya, penurunan tajam kekuatan ionik dapat diperolehoksigen,berkatkemampuan organismetersebutmenghasilkan, hanya dengan menurunkan sedikit kekuatan osmotik.dalam kadar tinggi, suatu enzim (NADH oksidase) yangmereduksi oksigen menjadi air menurut reaksi METODE PEMBIAKAN NADH +H* + Yz Or+ NAD. + HrC-) Dua masalah akan dibicarakan: pemilihan medium yang cocok dan isolasi organisme bakteri dalam kultur murni. Hidrogen peroksida mempunyai banyak efek toksikdengan cara merusak DNA. Mutan yang kurang memiliki Mediummekanisme perbaikan DNA sangat sensitif terhadap hidrogenperoksida; pro duk gen r e c A yang fungsinya dalam rekombinasi Teknik yang digunakan dan jenis medium yang dipilih ber-dan perbaikan genetik, telah dibuktikan lebih penting di- gantung pada sifat penelitian. Secara umum, dapat dijumpaibandingkan katalase ataupun superoksida dismutase dalam tiga situasi: (1) Peneliti mungkin perlu menumbuhkanmelindungi sel-sel E. coli Ierhadap toksisitas hidrogen sekumpulan sei dari spesies tertentu yang dimilikinya; (2)peroksida. peneliti mungkin perlu menentukan jumlah dan jenis organisme yang terdapat dalam suatu materi; atau (3) peneliti Penyediaan udara ke kultur aerob merupakan masalah mungkin ingin mengisolasi mikroorganisme jenis tertentu dari sumber alami.teknis utama. Wadah biasanya diputar/diaduk secara mekanisuntuk memasukkan oksigen ke dalam medium, atau udara A. Menumbuhkan sel-sel dari spesies tertentudidorong paksa ke dalam medium dengan memberikan Mikroorganisme yang diobservasi melalui pemeriksaantekanan. Difusi oksigen sering merupakan faktor pembatas mikroskopis yang terbukti tumbuh di lingkungan alamidalam menumbuhkan bakteri aerobik; saat konsentrasi se14-5 x 10e/ml dicapai, laju difusi oksigen ke dalam sel secara ternyata dapat sangat sulit tumbuh pada kultur murni dalamtegas membatasi laju pertumbuhan lebih lanjut. medium artifisial. Beberapa bentuk parasitik, misalnya, belum Anaerob obligat, di sisi lain, memberikan masalah berupa pernah berhasil dibiakkan di luar tubuh pejamu. Namun,pengeluaran oksigen. Tersedia banyak metode untuk secara umum, medium yang cocok dapat disiapkan denganmengeluarkan oksigen: Agen reduksi, seperti sodium mereproduksi kondisi yang ditemukan dalam lingkungantioglikolat, dapat ditambahkan ke kultur cair; tabung agar alami organisme tersebut secara cermat. pH, suhu, dan aerasidapat disegel dengan selapis petrolatum dan parafin; wadah mudah diduplikasi; nutrien merupakan masalah utama.kultur dapat ditempatkan dalam suatu kontainer yang Kontribusi yang diberikan oleh lingkungan hidup merupakandilengkapi dengan mekanisme untuk mengeluarkan oksigen hal yang penting dan sulit untuk dianalisis; suatu parasitsecara kimiawi atau melalui evakuasi; atau organisme dapat mungkin memerlukan ekstrak jaringan pejamu, dan suatu organisme hidup-bebas mungkin memerlukan substansi yangditangani dalam glov e-bor anaerobik. diekskresikan oieh mikroorganisme lain yang berkaitan dengannya di alam. Mungkin diperlukan percobaan yang cukup banyak untuk menentukan kebutuhan organisme, dan keberhasilan bergantung pada kemampuan menyediakan sumber yang cocok untuk setiap kategori nutrien yang

72 BAGIAN I {. Dasar-Dasar Mikrobiologidicantumkan di awal bab ini. Pembiakan parasit obligat, sudah merupakan lingkungan pengayaan bagi jenis organisme tersebut. seperti klamidia, dibahas dalamBab 27. Kultur pengayaan, dengan demikian, merupakanB. Pemeriksaan mikrobiologis bahan alami prosedur yang menggunakan medium yang dipersiapkanSuatu bahan alami mungkin mengandung banyak lingkungan- sedemikian rupa untuk menduplikasi lingkungan alamimikro yang beragam, masing^masing menyediakan habitat (\"habitat\") mikroorganisme yang diinginkan, atau denganbagi spesies yang berbeda. Inokulasi sampel bahan tersebut kata lain melakukan seleksi untuk memperoleh mikro-dalam serangkaian kondisi tertentu akan memungkinkan organisme terpilih. Sebuah prinsip penting dalam seleksisuatu grup organisme yang terpilih untuk membentuk koloni, semacam ini adalah: Organisme yang dipilih akan menjadi jenis organisme yang dipenuhi kebutuhan nutrisinya secaratetapi menyebabkan banyak jenis organisme lain gagal minimal. Azotobakter, misalnya, tumbuh paling baik dalam medium yang mengandung nitrogen organik, tetapi kebutuhandiidentifikasi. Karena alasan ini, lazim dilakukan penanaman minimalnya adalah tersedianya Nr; jadi, azotobakter dipilih dengan menggunakan medium yang mengandung N, sebagaisampel bahan menggunakan sebanyak mungkin medium dan sumber nitrogen tunggal. lika ditambahkan nitrogen organikkondisi inkubasi selama masih dapat diaplikasikan. Enam ke dalam medium, kondisi kultur tidak lagi mendukunghingga delapan kondisi kultur yang berbeda merupakan azotobakter secara spesifik, tetapi mendukung jenis organismejumlah yang layak jika Anda ingin menemukan sebagian yang memiliki kebutuhan minimum, berupa tersedianyabesar bentuk organisme yang ada di bahan tersebut. nitrogen organik. Karena setiap jenis organisme harus mendapatkankesempatan untuk tumbuh, digunakan medium padat dan Saat mencari jenis organisme tertentu dalam bahan alami,dihindarkan kumpulan koloni yang terlalu padat. Jika hal penanaman organisme yang diperoleh pada medium di-tersebut tidak dilakukan, kompetisi akan menyebabkan ferensial, jika tersedia, merupakan tindakan yang me-sebagian jenis organisme gagal membentuk koloni. nguntungkan. Medium diferensial adalah medium yang akanC. lsolasi mikroorganisme jenis tertentu menyebabkan koloni suatu jenis organisme memperlihatkanfika ditangani dengan tepat, sedikit sampel tanah akan tampilan yang khas. Sebagai contoh, koloni E. coli mem- perlihatkan kilauan berwarna-warni yang khas pada agarmenghasilkan jenis organisme yang berbeda untuk tiaplingkungan-mikro yang ada. Dengan demikian, untuk tanah yang mengandung pewarna eosin dan biru metilen (agaryang subur (lembap, memiliki aerasi baik, kaya akan mineral EMB). Agar EMB yang mengandung satu jenis gula dalam kadar tinggi juga akan menyebabkan organisme yang mem-dan materi organik), dapat diisolasi ratusan, bahkan ribuan, fermentasi gula tersebut untuk membentuk koloni berwarna kemerahan. Medium diferensiai digunakan untuk tujuanjenis organisme. Hal tersebut dilakukan dengan memilih seperti mengidentifikasi adanya bakteri enterik dalam air atausesuai jenis yang diinginkan. Sebagai contoh, satu gram tanah susu, dan mengidentifikasi patogen spesifik dalam spesimendiinokulasi ke dalam wadah berisi medium cair yang telah klinis.dibuat khusus dengan tujuan menunjang pertumbuhan salahsatu jenis organisme, misalnya bakteri aerobik pengikat- Tabel 5-2 mencantumkan contoh-contoh kondisi kultur pengayaan dan jenis bakteri yang akan diperbanyak. Namun,nitrogen (azotobakter). Dalam kasus ini, medium tidak meskipun telah diberikan upaya terbaik, banyak lingkungan mengandung bakteri yang bukan hasil kultur dalam jumlahmengandung nitrogen daiam bentuk terikat dan diinkubasi besar.secara aerobik. Iika sel-sel azotobakter terdapat di dalamtanah, sel-sel tersebut akan tumbuh dengan baik dalam lsolasi Mikroorganisme dalam Kultur Murnimedium ini; bentuk organisme yang tidak mampu memfi ksasi Untuk mempelajari sifat-sifat suatu organisme, penanganannitrogen hanya akan tumbuh hingga batas ketersediaan organisme tersebut harus dilakukan dalam kultur murni, yang bebas dari semua jenis organisme lain. Untuk melakukannitrogen-terikat yang masuk ke dalam medium akibat ini, sebuah sel harus diisolasi dari semua sel lain dan ditanam dengan cara sedemikian rupa sehingga turunan kolektifnyakontaminasi diiri tanah. Dengan demikian, saat kuitur telah juga tetap terisolasi. Tersedia beberapa metode.tumbuh sempurna, persentase azotobakter yang terdapatdalam poprrlasi total akan meningkat tajam; karena itu, A. Penanaman ke lempengmetode ini disebut \"kultur pengayaan.\" (\"enrichment culturel')Pemindahan sampei dari kultur ini ke medium segar akan Tidak seperti sel-sel dalam medium cair, sel-sel di atau disemakin memperbanyak azotobakter; setelah beberapa dalam medium yang berbentuk jel bersifat tidak bergerak.pemindahan serial, kultur dapat ditanam pada medium Dengan demikian, jika cukup sedikit sel yang ditempatkan dipengaya yang dipadatkan dan koloni azotobakter diisolasi. atau di dalam medium sel, masing-masing sel akan tumbuh membentuk koloni terisolasi. Agen pembuat jel yang ideal Medium cair digunakan untuk memungkinkan kompetisi untuk sebagian besar medium mikrobiologis adalah agar,terjadi sehingga terjadi seleksi secara optimal, bahkan jikajenis organisme yang diinginkan hanya diwakili oleh beberapasel dalam populasi jutaan organisme. Keuntungan dapat di-peroleh dengan \"pengayaan alamiahl' (\" natural enrichment.\")Sebagai contoh, dalam mencari bakteri pengoksidasi kerosen,dipilih tanah yang mengandung minyak karena tanah ini

BAB 5 i PembiakanMikroorganisme 73TABEL 5-2 Beberapa Kultur PengayaanCO, Aerobik atau anaerobik Gelap Tldak adaAIkohol, asam lemak, dan lain'lain TerangGlukosa Anaerobik Gelap Sianobakteri Udara Gelap Tidak ada Anaerobik Gelap Azotobakter Udara Gelap Clostrid i u n pa steu r i o nu m Azotobakter iffiilllir.''.l.-ifi Gelap Tidak ada Gelap Nitrosomonas il r;'f.rll/l Terang Alga hijau dan sianobakteri Gelap Pereduksi sulfat atau karbonat ' Gelap Aerob Gelap Organisme pefermentasi Anaerobik Gelap Aerob Aerobik Aarobik atau anaerobikAlkohol, asam lemak\" dan lainlain Anaerobik AerobikGlukosa Anaerobik AerobikCatatan: Konstituen semua medium: Mg5Oo, KrHPOo, FeCl,, CaClr, CaCOr, dan unsur renik. 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL ffi ffi ffi tffiq ffi it ?l Hd 9 mL H2O sdl #.il bffi (pengen\"ceran $#l & ntl $ffi k.si Fffi sffiii 1 0_') ffi f& &ffi B&i Fg{ Sampel ['#! ti' ;s{ a sli Fffi$ [$f$fi-; $&i FH} F# \&tg,*rs' FqBw} EM 9 ml- H2O 9 mL H2O r,ry; (pengeryceran (pengenceran 9 mL H2O 1 0-r) 1 0-4) (pengenceran 10-2) Campur dengan agar 1,0 mL /t,o ^t hangat dan tuang IGAMBAR 5-3 Teknik inokulasi-tuang. Sampel asli diencerkan beberapa kali untuk menjarangkan populasi secukupnya. Sampel yangpaling encer kemudian dicampur dengan agar hangat dan dituang ke dalam cawan-cawan Petri. Sel-sel yang diisolasi tumbuh membentukkoloni dan digunakan untuk memperoleh kultur murni. Koloni di permukaan berbentuk sirkuler, koloni di bawah permukaan berbentuklentikuler (seperti lensa). (Direproduksi atas izin dari Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein's Microbiology, Tlhedition, McGraw-Hill, 2008.)

74 BAGIAN I * Dasar-Dasar MikrobioiogiCatatan: Metode ini hanya bekerja jika alatpenanam (biasanya suatu loop penginokulasi)disterilkan ulang setelah tiap-tiap langkah 1-4.i\rj ,'d&.. #w*.ffi. il .+ff:i=q, - ,{!#//,&1,iMv''\,, f ii\f. |tu I 12A Langkah-langkah dalam Teknik lnokulasi GoresGAMBAR 5-4 Teknik inokulasi-gores. A: Pola goresan yang khas. B: Contoh lempeng yang telah digores. (Direproduksi atas izin dariKathy Park Talaro.)suatu polisakarida yang bersifat asam yang diekstraksi dari digoreskan, metode ini sama andalnya dan lebih cepatjenis alga merah tertentu. Suspensi 7,5-2o/o dalam air melarutpada suhu 100'C, membentuk larutan jernih yang berubah dibandingkan metode inokulasi-tuang.menjadi jel pada suhu 45\" C. Dengan demikian, suatu larutan Pada teknik inokulasi sebar, suatu volume suspensiagar steril dapat didinginkan hingga suhu 50\" C, ditambahkan mikroba encer yang sedikit yang mengandung kira-kira 30-bakteri atau sel-sel mikroba lain, kemudian larutan dengan 300 sel dipindahkan ke bagian tengah iempeng agar, kemudiancepat didinginkan hingga suhu di bawah 45\"C untukmembuat disebar secara merata pada permukaan agar dengan meng-jel. (Meskipun sebagian besar sel sel mikroba mati pada suhu gunakan batang kaca bengkok yang steril. Sel-sei yang terdispersi berkembang menjadi koloni-koloni yang terisolasi.50\" C, perjalanan-waktu proses kematian tersebut berlangsung Karena jumlah koloni harus sama dengan jumlah organisme viabel dalam sebuah sampel, teknik inokulasi sebar dapatcukup lambat sehingga prosedur ini mungkin untuk digunakan untuk menghitung populasi mikroba.dilakukan; lihat Gambar 4-3). Setelah dibentuk menjadi jel,agar tidak akan mencair lagi hingga dipanaskan melebihi 80\" B. PengenceranC sehingga setiap suhu yang sesuai untuk inkubasi kulturmikroba tertentu dapat diaplikasikan berikutnya. Pada Metode yang kurang dapat diandalkan adalah dilusi ekstinsi.metode inokulasi-tuang, suatu suspensi sel-sel dicampur Suspensi diencerkan secara serial, dan sampel setiap hasil pengenceran ditanam. lika hanya beberapa sampel dari suatudengan agar yang dicairkan pada suhu 50'C, kemudian hasil pengenceran memperlihatkan pertumbuhan, dianggap bahwa beberapa koloninya dibentuk oleh sel-sel tunggal.dituang ke cawan Petri. Setelah agar memadat, sel-sel menjadi Metode ini tidak digunakan, kecuali metode lempeng tidak mungkin dilakukan karena alasan tertentu. Sifat yang tidaktidak bergerak di dalam agar dan tumbuh membentuk koloni.lika suspensi sel ini cukup encer, koloni akan terpisah dengan menguntungkan dari metode ini adalah hanya dapat di-baik sehingga masing-masing koloni sangat mungkin berasaldari sel tunggal (Gambar 5-3). Namun, untuk memastikan hal gunakan untuk mengisolasi jenis organisme yang dominantersebut, perlu diambil sebuah koloni yang merupakan jenis dalam suatu populasi campuran.yang diinginkan, kemudian koloni tadi disuspensikan dalam PERTANYAAN UTANGANair, dan diinokulasi ulang. Pengulangan prosedur ini beberapakali akan memastikan diperolehnya kultur murni. 1. Sebagian besar mikroorganisme patogenik terhadap Sebagai alternatif, suspensi asli dapat digoreskan ke manusia tumbuh paling baik di laboratorium jika kulturlempeng agar dengan loop kawat (teknik inokulasi-gores). diinkubasi pada suhuDengan berlanjutnya penggoresan, semakin sedikit sel yang (A) 1s-20, Ctertinggal pada loop, dan pada akhirnya, /oop mungkin (B) 20-30\" Cmenanamkan sel-sel tunggal pada agar (Gambar 5-4). (c) o-37. cSelanjutnya, lempeng diinkubasi, dan setiap koloni yang (D) 38-s0\" C (E) 50-ss\" cterisolasi-baik diambil, disuspensi ulang dalam air, dandigoreskan lagi ke agar. |ika suatu suspensi (dan bukan hanyasedikit hasil pertumbuhan dari sebuah koloni atau lereng)

BAB 5 * Pembiakan Mikroorganisme 752. Proses pembentukan ATP oleh mikroorganisme selama (A) Garam anorganik (B) Sumber sulfur fermentasi glukosa ditandai dengan (C) Faktor pertumbuhan (D) Sumber energi (A) Penggabungan produksi ATP dengan transfer (E) Sumber nitrogen elektron Jawaban 1c (B) Denitrifikasi 2.D (C) Reduksi oksigen 3.8 (D) Fosforilasi substrat 4.4 (E) Respirasianaerobik 5.CJ. Di antara pilihan berikut, tekr:rik dan medium kultur apa REFERENSI yang akan menghasilkan jumlah spesies mikroba ter- Adams MW: Enzymes and proteins from organisms that grow banyak dalam suatu sampel tanah? near or above 100 degrees C. Annu Rev Med 7993;47:627. IPMID: 82571.11) (A) Kultur pengayaan (enrichment culture) . (B) Lempeng dengan medium selektif Koch AL: Microbial physiology and ecology of slow growth. Microbial Molec Biol Rev 1997;61:305. IPMID: 92931841 (C) Lempeng dengan medium diferensial (D) Tabung dengan kaldu nutrien Lederberg I (editor): Encyclopedia of Microbiology, 4 vols. (E) Sejumlah medium dan kondisi inkubasi yang ber- Academic Press, 1992. beda Maier RM, Pepper IL, Gerba CP: Environmental Microbiology.4. Poiimerisasi blok pembangun. (misalnya, asam amino) Academic Press, i992. menjadi makromolekul (misalnya, protein) terutama di- Marzlut GA: Regulation of sulfur and nitrogen metabolism in capai melalui filamentary fungi. Annu Rev Microbiol 1993;42:89. Pelczar MJ ]r, Chan ECS, Krieg NR: Microbiology: Concepts and (A) Dehidrasi (B) Reduksi Appli cations. McGraw-Hill, 1 993. (C) Oksidasi (D) Asimilasi Schloss PD, Handelsman J: Status of the rnicrobial census. (E) Hidrolisis5. Suatu galur E. coli mengalami mutasi sehingga tidak Microbial Molec Biol Rev 2004;68:686. dapat lagi tumbuh dalam medium spesifik yang mengandung glukosa, garam-garam mineral, dan amonium klorida. Namun, galur tersebut dapat tumbuh di dalam medium ini jika ditambahkan methionine. Meihionine disebut sebagai