Bab 10 Sistem Transkripsi pada Eukaryot

Pokok Bahasan: I Organisasi Gen pada Eukaryot > Struktur Gen Kelas I > Struktur G e n Kelas II Struktur Promoter Gen Kelas II • Elemen E n h a n c e r dan S i l e n c e r • Gen Struktural Kelas II » Struktur Gen Kelas III I Struktur RNA Polimerase pada Eukaryot i Mekanisme Transkripsi pada Eukaryot Transkripsi Gen Kelas II • Transkripsi Cen Kelas I • Transkripsi Gen Kelas ill • Peranan Faktor TBP dalam Transkripsi I Pemrosesan Transkrip Pasca-Transkripsi Pemotongan dan Penyambungan RNA ( S p l i c i n g ^ • Mekanisme S p l i c i n g Prekursor mRNA Inti Sel • Mekanisme S p l i c i n g secara A u t o k a t a l i t i k • Mekanisme S p l i c i n g Prekursor tRNA • Poliadenilasi mRNA • Penambahan Tudung (Cap) pada mRNA • Pemrosesan rRNA dan tRNA • Penyuntingan RNA Se c a r a u m u m m e k a n i s m e dasar t r a n s k r i p s i p a d a e u k a r y o t s e r u p a d e n g a n yang terjadi pada prokaryot, yaitu memerlukan D N A cetakan, D N A polimerase, N T P (ribonukleotida), serta molekul protein regulator Transkripsi pada e u k a r y o t juga berlangsung dengan diawali proses inisiasi transkripsi, kemudian dilanjutkan dengan pemanjangan transkrip, dan berhenti pada saat D N A polimerase mencapai daerah terminator. Meskipun demikian, ada banyak perbedaan funda- mental antara sistem transkripsi prokaryot dengan transkripsi pada eukaryot. Dalam bagian ini akan dibahas rincian sistem transkripsi pada eukaryot.Organisasi Gen pada Eukaryot Berbeda halnya dari organisasi gen pada prokaryot yang pada umumnya bersifat polisistronik, gen-gen pada jasad eukaryot bersifat m o n o s i s t r o n i k , artinya satu transkrip yang dihasilkan hanya mengkode satu macam produk ekspresi. Pada j a s a d e u k a r y o t tidak d i k e n a l a d a n y a s i s t e m o p e r o n k a r e n a s a t u g e n s t r u k t u r a l dikendalikan oleh satu promoter. Gen-gen eukaryot tersebar pada beberapa k r o m o s o m . Hal ini berbeda dari organisasi gen prokaryot yang u m u m n y a hanya

' 16.8 Biologi Molekular Tiga l<elas terdapat dalam satu unit bahan genetik utama. Banyak gen eukaryot yang bagian\ gen p a d a strukturalnya berselang-seling antara sekuens yang mengkode suatu urutan spesifik (ekson) d a n s e k u e n s y a n g d d a k m e n g k o d e u r u t a n spesifik (intron). S e c a r a g e n e d s , eulfaryot jasad eukaryot yang paling sederhana mempunyai organisasi g e n yang lebih kompleks dibandingkan dengan prokaryot. Pada manusia, misalnya, gen yang b e r t a n g g u n g j a w a b t e r h a d a p p e m u n c u l a n p e n y a k i t g e n e t i k Duchenne muscular dystrophy b e r u k u r a n s e k i t a r 2 . 0 0 0 k b ( 2 j u t a p a s a n g a n b a s a ) . U k u r a n g e n s e m a c a m i n i s e r i b u k a l i l e b i h b e s a r d i b a n d i n g k a n d e n g a n u k u r a n g e n lacZ p a d a b a k t e r i Escherichia coli, d a n u k u r a n t e r s e b u t e k u i v a l e n d e n g a n s e t e n g a h g e n o m £. coli. Tidak seperti pada prokaryot, pada jasad eukaryot terdapat tiga macam R N A polimerase yang bertanggung jawab di dalam proses transkripsi tiga kelas g e n . P a d a e u k a r y o t d a p a t d i b e d a k a n d g a kelas g e n , y a i t u : ( 1 ) gen kelas I (ditranskripsi oleh R N Apolimerase I),meliputi gen-gen yang mengkode 1 8 S r R N A d a n 2 8 S r R N A , d a n 5 , 8 S r R N A , ( 2 ) gen kelas II ( d i t r a n s k r i p s i o l e h R N A polimerase II), melipud semua gen yang m e n g k o d e protein dan beberapa R N A b e r u k u r a n k e c i l y a n g t e r d a p a t d i d a l a m n u k l e u s , d a n ( 3 ) gen kelas III ( d i t r a n s k r i p s i oleh R N Apolimerase III), m e l i p u d gen-gen yang m e n g k o d e t R N A , SS r R N A , dan beberapa R N A kecil yang ada didalam nukleus. Perbedaan kelas gen tersebut mempunyai implikasi dalam hal struktur gen.Struktur Gen Kelas IDefinisi Gen kelas I mengkode rRNA yang digunakan untuk menyusun ribosom, yaitu 7 8 Sgen kelas I r R N A 28S rRNA, dan 5,8S rRNA. G e n i n i h a n y a d i t r a n s k r i p s i k a n t e t a p i d d a k ditranslasl karena produk ekspresi yang digunakan adalah molekul rRNA-nya.Struktur gen T r a n s k r i p s i g e n k e l a s I d i l a k u k a n o l e h R N A p o l i m e r a s e I. G e n y a n g m e n g k o d epengkode r R N A terdapat dalam jumlah kopi yang besar sehingga molekul r R N A adalahrRNA molekul R N Ayang paling banyak terdapat di dalam sel. Meskipun demikian, masing-masing kopi genmempunyai struktur yang sama. Gen yang mengkode r R N A b e r s i f a t s p e s i f i k u n t u k s u a t u s p e s i e s t e r t e n t u (species-specific), a r t i n y a sekuens p r o m o t e r g e n r R N A sangat bervariasi di antara spesies. G e n yang mengkode r R N A diekspresikan dalam laju yang sangat tinggi karena p r o d u k ekspresinya digunakan untuk menyusun ribosom yang merupakan komponen sangat penting dalam proses sintesis protein. Sintesis r R N A dalam jumlah tinggi dapat dicapai karena terdapat ratusan kopi gen berukuran 6-5 k byang mengkode satu p r e k u r s o r tunggal yang mengandung r R N A berukuran 18S; 5,8S; dan 28S. Sedap gen r R N A yang aktif dapat m e m b a w a 1 0 0 m o l e k u l R N A polimerase I. Struktur gen yang mengkode r R N A tersusun dalam bentuk unit-unit t r a n s k r i p s i y a n g b e r s a m b u n g a n (tandem) d a n t e r d a p a t d i d a l a m n u k l e o l u s . U n i t transkripsi yang satu dengan unit transkripsi yang lain dipisahkan oleh sekuens D N A p e m i s a h y a n g s e c a r a k e l i r u d i k a t a k a n s e b a g a i t i d a k d i t r a n s k r i p s i k a n (non- transcribed spacer, N T S ) . P a d a Xenopus, N T S s e b e n a r n y a j u g a d i t r a n s k r i p s i k a n

Bab 10 Sistem Transkripsi pada Eukaryot 1 6 9 meskipun produk transkripsinya berupa molekul R N A yang ddak stabil karena segera didegradasi. Pada gen kelas I terdapat dua m a c a m p r o m o t e r ,yaitu (1) promoter antara (spacer promoter), y a i t u s u a t u p r o m o t e r y a n g t e r l e t a k d i d a e r a h N T S , d a n ( 2 ) promoter utama. P r o m o t e r u t a m a b e r u k u r a n sekitar 4 5 pasangan basa dan terletak pada posisi - 3 5 dan + 9 .Hasll penelitian menunjukkan bahwa transkripsi berawal dari p r o m o t e r antara dan berakhir pada suatu daerah terminator yang terletak tepat di sebelah hulu p r o m o t e r utama. Hal ini nampaknya dimaksudkan untuk mengumpulkan molekul R N A polimerase I dalam jumlah banyak pada daerah p r o m o t e r u t a m a sebelum dilakukan inisiasi sesungguhnya dalam proses s i n t e s i s r R N A . P a d a Xenopus d i k e t a h u i b a h w a t r a n s k r i p s i b e r l a n j u t s a m p a i d a e r a h NTS. Akan tetapi molekul R N A yang dihasilkan pada daerah inibersifat tidak stabil karena akan segera didegradasi. Transkripsi daerah N T SIni akan berakhir pula pada daerah terminator yang terletak tepat di sebelah hulu p r o m o t e r utama. Terminator ini sebenarnya terletak tumpang-tindih dengan promoter utama d a n melipud suatu sekuens berulang sepanjang 1 8 p b (pasangan basa) y a n g b e r s a m b u n g a n (tandem repeat). P a d a m e n c i t , a d a p e r b e d a a n d e n g a n Xeno- pus d a l a m h a l t e r m i n a t o r n y a k a r e n a p a d a m e n c i t a d a t e r m i n a t o r s e s u n g g u h n y a yang t e r l e t a k sekitar 5 0 0 p b d i sebelah hilir (pada sisi 3') dari g e ns t r u k t u r a l sehingga nampaknya R N A polimerase I ddak berjalan melewad daerah N T S . Secara skematis, s t r u k t u r gen r R N A (gen kelas I) dilukiskan pada G a m b a r 1 0 . 1 . R N A polimerase 40S Sisi yang 408 Unit Transkripsi 1 menyebabkan Unit Transkripsi 2 R N A tidak stabil Promoter utama G a m b a r 10.1 I Struktur d a n organisasi gen kelas I .Struktur C e n Kelas IIDefinisi gen Gen kelas II meliputi semua gen yang mengkode segala macam protein. G e n k e l a sl<elas I I II d i t r a n s k r i p s i d e n g a n m e n g g u n a k a n R N A polimerase II. P a d a e u k a r y o t , s a t u gen s t r u k t u r a l kelas II diatur ekspresinya o l e h satu p r o m o t e r sehingga t r a n s k r i p

yang dihasilkan bersifat monosistronik karena hanya m e m b a w a informasi u n t u ksatu m a c a m polipepdda atau p r o t e i n . P r o m o t e r gen kelas II dapat terdiri atase m p a t e l e m e n , y a i t u s e k u e n s p e m u l a i (initiator) y a n g t e r l e t a k p a d a d a e r a hi n i s i a s i t r a n s k r i p s i , e l e m e n hilir (downstream) y a n g t e r l e t a k d i s e b e l a h h l l i r d a r it i t i k a w a l t r a n s k r i p s i , kotak T A T A , d a n s u a t u e l e m e n hulu (upstream). M e s k i p u nd e m i k i a n , b a n y a k g e n y a n g tidak m e m p u n y a i s a l a h s a t u e l e m e n t e r s e b u t .S t r u k t u r Promoter Gen Kelas IIP r o m o t e r gen kelas II m e m p u n y a i s t r u k t u r yang m i r i p dengan p r o m o t e r p r o k a r y o tkarena ada daerah konsensus (kotak T A T A ) . Kotak T A T A pada p r o m o t e r genkelas II m e m p u n y a i sekuens konsensus yaitu: Tg2 A , , T , 3 A g j Ag3 A g j A j QAngka-angka dibelakang huruf tersebut menyatakan frekuensi nukleotida tersebutpada gen-gen yang telah dianalisis. K o t a k T A T A pada gen kelas II t e r l e t a k padap o s i s i - 2 5 , t e t a p i p a d a k h a m i r Sacctiaromyces cerevisiae p o s i s i n y a l e b i h b e r v a r i a s iyaitu antara - 3 0sampai - 1 2 0 dari titik awal transkripsi. Sekuens pada kotakT A T A m e n e n t u k a n titik Inisiasi transkripsi secara tepat. Penghilangan k o t a kT A T A p a d a g e n p - g l o b i n m e n y e b a b k a n p e n u r u n a n t r a n s k r i p s i s e c a r a in vitrosampai 2 0 kali lebih rendah. Pengubahan sekuens T A T A menjadi T A G A atauT A A A pada gen konalbumin menghilangkan transkripsi. Meskipun kotak T A T A m e m p u n y a i peranan sangat m e n e n t u k a n dalam inisiasit r a n s k r i p s i b e b e r a p a g e n , n a m u n a d a c u k u p b a n y a k g e n y a n g tidak m e m p u n y a ikotak T A T A . Pada beberapa gen, misalnya gen hipoxantin fosforibosll trans-ferase, fungsi kotak T A T A digantikan oleh urutan G C , yaitu G G G G C G G A G C ,yang terletak pada posisi - 3 3 . Gen-gen yang tidak mempunyai kotak T A T Ad a p a t d i k e l o m p o k k a n m e n j a d i d u a s u b k e l a s y a i t u : ( 1 ) g e n house-lceeping, y a i t ugen-gen yang diekspresikan secara konstitutif di dalam semua sel karena diperlukandalam metabolisme utama, dan (2) gen-gen yang diatur ekspresinya berdasarkanatas perkembangan jasad hidup, misalnya gen-gen h o m e o t i k yang mengaturperkembangan lalat buah atau gen-gen yang terlibat di dalam perkembangans i s t e m k e k e b a l a n p a d a m a m a l i a . B e b e r a p a g e n iiouse-i<eeping y a n g t i d a k m e m -p u n y a i k o t a k T A T A m i s a l n y a g e n y a n g m e n g k o d e adenine deaminase, timidilatsintetase, d a n ditiidrofolat reduktase, y a n g s e m u a n y a t e r l i b a t d a l a m b i o s i n t e s i snukleotida. Seringkali transkripsi gen-gen semacam ini menghasilkan transkripyang mempunyai ujung 5' yang beragam. Gen-gen semacam ini diekspresikanpada semua sel. Dalam proses transkripsi, kotak T A T A menentukan ketepatan awal prosest r a n s k r i p s i . P a d a g e n y a n g m e n g k o d e p r o t e i n h i s t o n p a d a sea urchin d i k e t a h u ibahwa delesi kotak T A T A menghilangkan spesifisitas inisiasi transkripsi, meskipuntidak m e n g u r a n g i e f i s i e n s i t r a n s k r i p s i s e c a r a n y a t a , s e h i n g g a t r a n s k r i p s i d i m u l a id a r i b e b e r a p a titik s e c a r a a c a k . T r a n s k r i p y a n g d i h a s i l k a n d a r i i n i s i a s i t r a n s k r i p s isecara acak tersebut setidak-tidaknya ada tiga macam. Hal ini m e m b e r i k a n gambar-an bahwa R N Apolimerase tidak dapat menemukan tempat yang tepat untuk

Bab 10 Sistem Transl<ripsi pada Eukaryot 171memulai transkripsi. Penelitian yang dilakukan oleh Max Birnsdel dan kawan-kawan pada sekitar tahun 1 9 8 0 tersebut kemudian dikonfirmasi oleh hasil penelidanChristophe Benolst dan Pierre Chambon yang menelid transkripsi pada virusSV40, khususnya pada promoter gen awal. Kedua penelidan tersebut membuktikanb a h w a kotak TATA diperlukan untuk menentukan posisi awal transkripsi, meskipuntidak menentukan efisiensi transkripsi. M e s k i p u n d e m i k i a n , p e n g h i l a n g a n k o t a k T A T Apada beberapa macam p r o m o t e r menghilangkan sama sekali proses transkripsi,misalnya pada g e n P-globin pada kellnci (yang sebenarnya mempunyai kotakCATA). Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa pada beberapa gen, keberadaankotak T A T A diperlukan untuk akdvitas promoter, sedangkan pada beberapa genyang lain, kotak T A T A hanya diperlukan untuk menentukan posisi awal yang tepatuntuk memulai transkripsi. Beberapa promoter gen pada khamir diketahuim e m p u n y a i b e b e r a p a k o t a k T A T A , m i s a l n y a g e n CYChADHl, d a n S U C 2 . K e b e r a d a a nkotak T A T A yang berjumlah lebih dari satu tersebut adahubungannya dengantitik awal sintesis m R N A yang juga dapat dimulai dari beberapa posisi. Selain kotak TATA, ada sekuens lain yang terletak di sebelah hulu dari T A T Ayang juga diperlukan dalam proses transkripsi, yaitu k o t a k GC yang terletakpada posisi sekitar —47 sampai - 6 1 dan antara - 8 0 sampai - 1 0 5 . Penghilanganatau mutasi kotak G C tersebut dapat menghilangkan akdvitas p r o m o t e r Sekuenspada kotak G C dapat terdiri atas urutan G G G C G G atau C C G C C C . Kotak G Cpada suatu p r o m o t e r dapat terdiri atas lebih dari satu, misalnya pada p r o m o t e rawal virus SV40 yang mempunyai enam kotak G C . Fungsi kotak G C ddaktergantung pada orientasinya sehingga meskipun urutannya dibalik masih dapatberfungsi untuk mensdmulasi transkripsi, tetapi letaknya tidak dapat diubah. Jikaletak kotak G C tersebut diplndahkan dari posisinya semula, maka fungslnya untukmemengaruhi transkripsi menjadi hilang. Selain kotak G C , pada posisi sekitar - 1 0 0 ada kotak lain yang disebutk o t a k CCAAT yang juga sangat pendng dalam mengawali transkripsi. KotakC C A A T t e r s e b u t b i a s a n y a d d a k d i t e m u k a n p a d a p r o m o t e r g e n iiouse-keepingyang tidak mempunyai kotak TATA. Mutasi pada kotak C C A A T dapat menyebabkanhilangnya aktivitas promoter. Kotak C C A A T diketahui mengikat protein faktort r a n s k r i p s i y a i t u CCAAT-binding transcription factor (CTF) d a n CCAAT-enhancer-bind-ing protein (CIEBP). Penelitian menunjukkan bahwa beberapa promoter pada khamir mempunyaisekuens yang terletak beberapa ratus nukleodda dari tidk awal transkripsi yangd i p e r l u k a n u n t u k t r a n s k r i p s i . S e k u e n s t e r s e b u t d i k e n a l s e b a g a i U A S (upstreamactivating sequences), m i s a l n y a U A S 1 d a n U A S 2 y a n g t e r l e t a k p a d a p o s i s i - 2 5 6d a n - 2 2 9 p a d a g e n s i t o k r o m o k s i d a s e (CYCl). S e k u e n s U A S t e r s e b u t d i k e t a h u imengikat suatu protein spesifik yang dapat memengaruhi transkripsi. Pada khamir,U A S ddak berfungsi jika terletak pada posisi sebelah hilir dari daerah g e nstruktural. Elemen U A S biasanya berukuran pendek, sekitar 10-30 pasanganbasa. Gen-gen yang diatur oleh sistem pengaturan yang sama biasanya mempunyaielemen U A Syang serupa, sedangkan gen-gen yang sistem pengaturannya ddakterkoordinasi mempunyai elemen U A Syang berbeda. UAS merupakan elemen

7 2 Biologi Molekular pengatur yang sering dijumpai pada gen khamir dan penghilangan U A S biasanya akan menghilangkan sistem pengaturan transkripsi. Suatu gen dapat mempunyai l e b i h d a r i s a t u U A S , m i s a l n y a g e n CYCl p a d a k h a m i r y a n g d i p e r l u k a n u n t u k s i n y a l fisiologis yang berbeda. Dalam beberapa kasus, orientasi sekuens UAS yang tepat sangat pendng dalam aktivasi transkripsi. Sebagai contoh, U A S pada p r o m o t e r ADH2 p a d a k h a m i r d d a k a k a n b e r f u n g s i j i k a d i t e m p a t k a n d i b a g i a n i n t r o n p a d a sisi 3 ' d i sebelah hilir dari titik awal transkripsi. Berkebalikan dari sekuens UAS, gen tertentu pada khamir ada yang m e m - punyai sekuens yang justru menekan transkripsi. Sekuens tersebut dikenal sebagai silencer, m i s a l n y a s e k u e n s H M R E p a d a l o k u s g e n p e n e n t u t i p e k a w i n (mating type). S e k u e n s H M R E d i k e t a h u i d a p a t m e n u r u n k a n a k t i v i t a s p r o m o t e r m e s k i p u n terletak pada posisi sekitar 2,5 k bdari p r o m o t e r , baik disebelah hulu maupun hilir dari titik awal transkripsi. Sekuens semacam iniseringkali juga disebut s e b a g a i U R S (upstream repressing sequences). S i s i p e n e k a n t r a n s k r i p s i s e m a c a m i n i d a p a t b e r f u n g s i s e c a r a d u a a r a h (bidirectional) d a n t e r l e t a k p a d a d a e r a h y a n g bervariasi di sebelah hulu sekuens T A T A . Penekanan transkripsi oleh elemen semacam ini biasanya akan lebih efekdf jika elemen penekan transkripsi tersebut terletak di antara U A S d a n T A T A , daripada bila elemen tersebut terletak di sebelah hulu dari U A S .Contoh Soal 1. A p aperbedaan utama sistem transkripsi pada prokaryot dan eukaryot, khususnya dalam hal transkrip yang dihasilkan? Jawaban: Pada prokaryot, m R N A yang dihasilkan dapat berupa transkrip polisistronik, artinya dalam satu transkrip dapat terkandung lebih dari satu rangkaian kodon (sistron) untuk polipeptida yang berbeda. Sebaliknya, pada eukaryot, m R N A bersifat monosistronik, artinya satu m R N A hanya membawa satu macam rangkaian kodon untuk satu macam polipeptida. 2. Apa perbedaan utama gen struktural prokaryot dan eukaryot? Jawaban: Sebagian besar gen struktural prokaryot tidak mengandung intron, kecuali pada beberapa archaea tertentu, sedangkan pada eukaryot keberadaan intron merupakan halyang sering dijumpai, meskipun tidak semua gen eukaryot mengandung intron.Contoh E l e m e n Enhancer dan SilencerEnhancer Elemen pengatur lain yang terletak didaerah hulu adalah e n h a n c e r , yaitu suatu elemen pengatur transkripsi yang dapat bekerja tanpa tergantung pada orientasi, b a h k a n d a p a t b e k e r j a d i d a e r a h h i l i r s u a t u g e n . S a l a h s a t u c o n t o h entiancer adalah sekuens berulang sepanjang 7 2pbpada SV40 yang dapat memicu transkripsi gen globin beberapa ratus kati lipat, tanpa m e m p e r h a t i k a n orientasi sekuennya. Eniiancer s e r i n g d i j u m p a i p a d a b a n y a k g e n v i r u s d a n g e n - g e n s e l u l a r , m i s a l n y a

Bab 10 Sistem Transl<ripsi pada Eul<aryot 1 7 3 gen imunoglobulin, gen tirosln aminotransferase, d a n a n d t h r o m b i n III. Sekuens k o n s e n s u s p a d a enhancer y a n g d i k e t a h u i a d a l a h T G T G G A A T T A G . D a e r a h y a n g m e n g a n d u n g enhancer t e r l e t a k s a m p a i b e b e r a p a k b p (kilo base pairs) d a r i p r o - m o t e r . P e n e l i t i a n m e n u n j u k k a n b a h w a enhancer t e r s u s u n a t a s m o d u l - m o d u l y a n g l e b i h k e c i l . M o d u l p e n y u s u n d a e r a h enhancer t e r s u s u n a t a s s e k u e n s - s e k u e n s D N A b e r u k u r a n p e n d e k y a n g d i s e b u t enhanson yang merupakan unit-unit dasar s u a t u enhancer. S e c a r a s k e m a d s , o r g a n i s a s i s u a t u d a e r a h enhancer d i t u n j u k k a n pada Gambar 10.2. Daerah enhancer M o d u l enhancer M o d u l enhancer M o d u l enhancer CO—a Enhanson Enhanson Enhanson G a m b a r 1 0 . 2 I S t r u k t u r s u a t u d a e r a h enhancer. S u a t u u n i t e n h a n s o n d a p a t t e r d i r i atas satu k o p i sekuens (kiri), d u a kopi sekuens yang tersusun secara berurutan/ t a n d e m (tengah), atau tersusun atas d u a sekuens yang tidak identik (kanan). (Digambar lagi berdasarkan atas D y n a n , 1989.)Contoh Enhancer p a d a u m u m n y a d i j u m p a i p a d a d a e r a h h u l u d a r i d a e r a h p r o m o t e rsilencer yang dipengaruhinya. Meskipun demikian, adaperkecualian karena pada gen y^g ( y a n g m e n g k o d e i m u n o g l o b u l i n p a d a m e n c i t ) , e n h o n c e r - n y a t e r l e t a k di dalam gen strukturalnya. Hal inidiungkapkan oleh Susumu Tonegawa dan kawan-kawan p a d a t a h u n 1 9 8 3 . Enhancer d a n silencer m e r u p a k a n e l e m e n D N A y a n g d a p a t m e m e n g a r u h i t r a n s k r i p s i d e n g a n c a r a m e n s d m u l a s i (enhancer) a t a u m e n e k a n (s/7encer) suatu g e n d a n k e m a m p u a n n y a d d a k t e r g a n t u n g pada orientasinya. Enhancer d a p a t m e n s d m u l a s i e k s p r e s i s u a t u g e n m e l a l u i p r o t e i n y a n g m e l e k a t p a d a e l e m e n t e r s e b u t . Enhancer d a p a t b e k e r j a t a n p a t e r g a n t u n g p o s i s i a t a u o r i e n t a s i , a r t i n y a b a h w a j i k a l o k a s i o r i e n t a s i enhancer t e r s e b u t d i b a l i k m a k a s e k u e n s enhancer t e r s e b u t m a s i h t e t a p b e r f u n g s i u n t u k m e n s d m u l a s i e k s p r e s i s u a t u g e n . S e l a i n enhancer, e l e m e n p e n g a t u r l a i n y a n g d a p a t m e m e n g a r u h i e k s p r e s i s u a t u g e n a d a l a h silencer y a n g d a p a t m e n g h a m b a t e k s p r e s i s u a t u g e n . S a l a h s a t u c o n t o h silencer y a n g d i k e t a h u i a d a l a h p a d a s i s t e m p e n g a t u r a n d p e k a w i n (mating type) p a d a k h a m i r Saccharomyces cerevisiae. T i p e k a w i n p a d a k h a m i r i n i d i - t e n t u k a n o l e h t i g a l o k u s y a i t u MAT, idML, d a n H/V1R. MAT m e r u p a k a n l o k u s y a n g aktif, s e d a n g k a n H/VIL d a n H/V1R b e r s i f a t t i d a k aktif. K e t i d a k a k d f a n H/V1L dan H / V I R t e r s e b u t d i s e b a b k a n o l e h a d a n y a s u a t u s e k u e n s silencer y a n g t e r l e t a k kurang lebih satu k b p dari lokus tersebut. Bukd yang adamenunjukkan bahwa silencer d a p a t b e k e r j a k a r e n a e l e m e n i n i m e n y e b a b k a n k r o m a d n m e n g g u l u n g menjadi suatu bentuk yang terkondensasi sehingga ddak dapat diakses dan men- cegah terjadinya transkripsi pada gen-gen yang terletak di dekatnya.

S u a t u e l e m e n d a p a t b e r s i f a t s e b a g a i enhancer m a u p u n s e b a g a i silencer,tergantung pada protein yang menempel. H a linidapat dilihat misalnya padasistem h o r m o n tiroid. Elemen yang menentukan tanggapan h o r m o n droid akanb e r s i f a t s e b a g a i silencer j i k a r e s e p t o r h o r m o n d r o i d t e r i k a t p a d a e l e m e n t e r s e b u ttanpa bersama-sama dengan ligan-nya, yaitu h o r m o n droid. Sebaliknya, jika elementersebut berikatan dengan reseptor h o r m o n droid bersama-sama dengan h o r m o nt i r o i d , m a k a e l e m e n t e r s e b u t a k a n b e r f u n g s i s e b a g a i enhancer. B e b e r a p a p r o m o t e r g e n k e l a s I I j u g a m e m p u n y a i s e k u e n s l e s t a r i (conservedsequences) d i s e k i t a r d a e r a h d d k a w a l t r a n s k r i p s i y a n g d i p e r l u k a n u n t u k t r a n s k r i p s iy a n g o p t i m a l . S e k u e n s t e r s e b u t disebut sebagai inisiator yang m e m p u n y a i s e k u e n skonsensus PyPyANT/APyPy (Py adalah singkatan dari pirimidin [ C atau T], Na d a l a h b a s a n u k l e o t i d a a p a p u n , A a d a l a h titik a w a l t r a n s k r i p s i ) . S a l a h s a t uc o n t o h p r o m o t e r g e n y a n g m e m p u n y a i i n i s i a t o r a d a l a h late promoter p a d aadenovirus, dan gen yang mengkode deoksinukleotldil transferase terminal (genTdT) pada mamalia. Pada mencit, p r o m o t e r genT d Ttidak mempunyai kotakT A T A tetapi mempunyai sekuens inisiator sepanjang 1 7pasangan basa. Penambahankotak T A T A atau kotak G C yang berasal dari p r o m o t e r SV40 dapat meningkat-kan transkripsi dari sekuens inisiator. Hal ini menunjukkan bahwa sekuens inisiatorsendiri dapat berfungsi sebagai p r o m o t e r yang sangat sederhana yang dapatditingkatkan efisiensinya dengan elemen p r o m o t e r lain. Selain inisiator, seringkalij u g a d i t e m u k a n e l e m e n - e l e m e n y a n g t e r l e t a k d i d a e r a h h i l i r (downstream ele-ments) d a r i t i t i k a w a l t r a n s k r i p s i . S a m p a i s a a t i n i s e k u e n s k o n s e n s u s e l e m e n h l l l rsemacam inibelum diketahui secara pasti.Gen S t r u k t u r a l Kelas IIG e n kelas II bersifat m o n o s i s t r o n i k , artinya bagian strukturalnya hanya m e n g k o d esatu macam polipeptida. Oleh karena itu, pada eukaryot, satu bagian strukturalgen kelas II diatur o l e h satu p r o m o t e r . H a lini berbeda dari gen pada p r o k a r y o tyang bagian strukturalnya dapat mengkode lebih dari satu macam polipeptidayang ekspresinya diatur oleh satu p r o m o t e r yang sama. Pada bagian strukturalg e n k e l a s I I u m u m d i j u m p a i a d a n y a u r u t a n n u k l e o t i d a y a n g tidak a k a n d i t r a n s l a s ldalam b e n t u k u r u t a n asam a m i n o . Sekuens s e m a c a m ini disebut sebagai intron(intervening sequences). S e b a l i k n y a , u r u t a n n u k l e o t i d a p a d a b a g i a n s t r u k t u r a lyang ditranslasl m e n j a d i u r u t a n asam-asam a m i n o disebut sebagai ekson (berasald a r i k a t a expressed). U k u r a n i n t r o n s a n g a t b e r v a r i a s i a n t a r a s u a t u g e n d e n g a ngen lain. D a l a m proses ekspresi genetik, R N A polimerase II tidak dapat m e m -bedakan antara sekuens intron dan ekson sehingga dalam proses transkripsisemua sekuens g e nstruktural akan ditranskripsi menjadi transkrip primer.Transkrip ( m R N A ) yang mengandung sekuens intron selanjutnya akan diprosessehingga sekuens intron akan dihilangkan. Potongan-potongan ekson selanjutnyaa k a n d i g a b u n g k a n lagi d a l a m p r o s e s y a n g d i s e b u t s e b a g a i splicing s e h i n g g a d i h a s i l k a nm R N A y a n g s i a p d i t r a n s l a s l (mature transcript). D e n g a n d e m i k i a n u r u t a nnukleotida pada intron tidak akan ikut ditranslasl karena sudah dipotong daritranskrip primer.

Bab 1 0 Sistem Transkripsi pada Eukaryot 1 7 5 I n t r o n tidak hanya t e r d a p a t pada s t r u k t u r g e n kelas II yang m e n g k o d e protein, melainkan juga terdapat pada gen kelas I (beberapa gen r R N A ) dan gen kelas III (beberapa g e n t R N A ) . Intron juga diketahui terdapat pada gen-gen mitokondria pada eukaryot dngkat rendah, pada kloroplas, bahkan juga terdapat p a d a s u a t u a r c h a e b a c t e r i a d a n s u a t u b a k t e r i o f a g y a n g m e n g i n f e k s i b a k t e r i £. coli. D i sebelah hilir g e n s t r u k t u r a l kelas II t e r d a p a t u r u t a n n u k l e o t i d a yang m e r u p a k a n sinyal poliadenilasi (polyadenylation signal) y a i t u A A T A A A . T r a n s k r i p ( m R N A ) e u k a r y o t y a n g s u d a h ' m a t a n g ' (mature mRNA) a k a n m e n g a l a m i p o l i a - denilasi, yaitu penambahan serangkaian nukleodda A pada ujung 3'. Secara skemads s t r u k t u r gen kelas II disajikan pada G a m b a r 10.3. Promoter Titik awal transkripsi if ATG Terminasi Kotak Kotak AATAAA CAAT TATA ii II I I I E K S O N 1 Intron EKSON 2 5' • A _ioo -30 Enhancer Terminasi penambahan poliA S i s i cap m R N A primer G a m b a r 10.3 I Struktur dan organisasi gen kelas II. Sampai saat inimekanisme pengakhiran transkripsi pada eukaryot masih belum jelas dipahami. Bukd-bukd yang ada menunjukkan bahwa pengakhiran transkripsi terjadi pada daerah beberapa ratus atau bahkan beberapa ribu nukleodda dari ujung 3'm R N A . Posisi ini kurang-lebih terletak pada 35 nukleodda di sebelah hilir dari sisi sinyal poliadenilasi ( A A U A A A ) . Sinyal khusus yang m e n a n d a i pengakhiran transkripsi pada eukaryot sampai saat ini belum diketahui secara j e l a s , k e c u a l i p a d a k h a m i r S . cerevisiae y a n g d i d u g a m e m p u n y a i s e k u e n s s i n y a l pengakhiran transkripsi berupa sekuens TAG...TAGT... (daerah kaya AT) ...TTT.^Struktur Cen KelasDefir)isi gen Gen kelas III mengkode tRNA, 5S rRNA, dan beberapa molekul RNA kecil yang adakelas III dalam nukleus. G e n k e l a s I I I d i t r a n s k r i p s i o l e h R N A polimerase III. S e b a g i a n besar gen kelas IIIt e r l e t a k dalam suatu k e l o m p o k a n dan berulang, misalnya gen

p e n g k o d e r R N A 5 S p a d a Xenopus laevis y a n g t e r d a p a t s e b a n y a k 2 0 . 0 0 0 k o p i p e rg e n o m haploid. G e n kelas III m e m p u n y a i s t r u k t u r yang unik karena berbeda daristruktur gen kelas I dan II, khususnya dalam hal letak bagian p r o m o t e r n y a . Padagen kelas I dan II, p r o m o t e r terletak pada daerah hulu dari bagian strukturalnya.S e b a l i k n y a , pada gen kelas III, promoter terletak pada bagian dalam (internal) genstrukturalnya. S e c a r a u m u m a d a d u a k e l o m p o k g e n k e l a s I I I y a i t u : ( 1 ) g e n k e l a sIII \"klasik\" y a n g m e m p u n y a i p r o m o t e r p a d a bagian d a l a m g e n s t r u k t u r a l nya, d a n(2) gen kelas III \"nonklasik\" y a n g p r o m o t e r n y a m i r i p d e n g a n gen kelas II, t e t a p imasih adap r o m o t e r yang terletak di bagian dalam gen struktural meskipunp r o m o t e r itu lemah sifatnya. Salah satu c o n t o h gen kelas III \"klasik\" adalah g e nyang mengkode r R N AS S p a d a X e n o p u s laevis. P r o m o t e r g e n i n i t e r l e t a k s e c a r a i n t e r n a l p a d a p o s i s i+45 d a n + 8 3sedangkan bagian struktural r R N A terbagi menjadi d u a bagian(bagian yang satu terletak pada posisi antara + 8 d a n +30, sedangkan bagiankedua terletak pada posisi antara +51 dan +72). Pada gen r R N A 5Sjuga terdapatdga daerah sensitif yang jika diubah akan mengurangi secara nyata fungsi pro-m o t e r . D a e r a h sensidf t e r s e b u t disebut sebagai: kotak A, elemen antara, dankotak C (ddak ada k o t a k B sebab k o t a k B d i t e m u k a n pada gen kelas III lain yangd d a k m e m p u n y a i kemiripan dengan p r o m o t e r gen r R N A 5S). G e n kelas III yangl a i n , y a i t u t R N A d a n R N A V A (virus-associated) a d e n o v i r u s , m e m p u n y a i k o t a k Ad a n kotak B. P e n g a k h i r a n t r a n s k r i p s i p a d a g e n 5 S d i l a k u k a n d e n g a n a d a n y arangkaian sekuens A di antara dua daerah yang kaya akan G C . Gen kelas III\"nonklasik\" yang mempunyai p r o m o t e r yang mirip denganp r o m o t e r gen kelas II adalah gen RNA 7SL (terlibat dalam proses pengenalansinyal peptida dalam proses sintesis protein yang disekresikan). Pada gen initerdapat suatu daerah pengapit pada sisi 5 'yang diperlukan u n t u k transkripsipada aras yang tinggi. Tanpa adanya daerah initranskripsi akan berkurang5 0 - 1 0 0 kali lipat. Fenomena inidiamati pertama kali oleh Elisabetta Ullu d a nAlan W e i n e r pada tahun 1985. Ullu dan W e i n e r berkesimpulan bahwa bagianpaling pendng dalam transkripsi g e n R N A7 S L terletak pada daerah hulu daribagian struktural sehingga mirip dengan p r o m o t e r pada gen kelas II. Meskipundemikian, penelidan juga menunjukkan bahwa gen R N A 7SL yang ddak mempunyaidaerah hulu tersebut masih dapat ditranskripsi sehingga memberikan gambaranbahwa gen ini juga m e m p u n y a i p r o m o t e r internal. Sebaliknya, pada gen RNA7SK ( R N A berukuran kecil yang terdapat pada nukleus tetapi tidak diketahuifungslnya) tidak ditemukan adanya p r o m o t e r internal sehingga g e n ini hanyamempunyai promoter eksternal. P r o m o t e r eksternal pada gen R N A 7 S Ktersebut diketahui juga mempunyaikotak T A T A yang diperlukan untuk transkripsi. Meskipun terdapat kotak T A T Ap a d a bagian p r o m o t e r n y a , g e n kelas III t e r s e b u t d i t r a n s k r i p s i o l e h R N A p o l i m e r a s eIII. G e n kelas III\"nonklasik\" yang lain, yaitu g e n R N A U 6 (yang terlibat dalamp r o s e s splicing R N A ) d a n g e n EBER2 ( p a d a v i r u s E p s t e i n - B a r r ) , j u g a m e m p u n y a iperilaku seperti g e n R N A 7 S K karena ditranskripsi oleh R N A polimerase IIImeskipun struktur p r o m o t e r n y a mirip dengan p r o m o t e r g e n kelas II.H a l ini

B a b 1D S i s t e m Transl<ripsi p a d a E u k a r y o t 177 d a p a t t e r j a d i k a r e n a p r o t e i n y a n g t e r i k a t p a d a T A T A {TATA-binding protein, T P B ) juga diperlukan dalam transkripsi gen kelas III. Secara u m u m s t r u k t u r gen kelas III dapat dilihat pada G a m b a r 10.4. Elemen antara 5S r N A Kotak A Kotak C Kotak A Kotak B tRNA atau V A RNA G a m b a r 10.4 > Struktur d a n organisasi gen kelas III.Struktur RNA Polimerase pada EukaryotTiga m a c a m R N A polimerase yang mengkatalisis proses sintesis R N A (transkripsi) padaRNA polimerase e u k a r y o t a d a t i g a m a c a m , y a i t u R N A p o l i m e r a s e I, R N A p o l i m e r a s e II, d a npada eukaryot R N A polimerase III. K e d g a m a c a m e n z i m t e r s e b u t d i g u n a k a n d a l a m p r o s e s Perbedaan sintesis molekul R N A yang berbeda, seperti telah dijelaskan pada bagian fungsi k e t i g a sebelumnya. Secara enzimologis, ketiga enzim tersebut juga menunjukkan sifat- RNA sifat yang berbeda. R N A p o l i m e r a s e I, II, dan III masing-masing m e m p u n y a i b e r a tpolimerase molekul sebesar 6 3 0kDa, 567 kDa, dan 6 9 7kDa. Ketiga macam enzim i t u mempunyai banyak subunit yang masing-masing ukurannya bervariasi. Sebagai c o n t o h , R N A p o l i m e r a s e p a d a k h a m i r Saccharomyces cerevisiae m e m p u n y a i j u m l a h subunit masing-masing sebanyak 1 3 subunit ( R N A polimerase I), 1 2 subunit ( R N A polimerase II), dan 1 4 subunit ( R N A polimerase III). Perbedaan fungsi ketiga macam R N Apolimerase pada eukaryot diketahui dengan m e n g a m a t i pengaruh t o k s i n a-amanitin (yang dihasilkan o l e h j a m u r Amon/to phaloides d a n A. bisporigera) t e r h a d a p a k t i v i t a s m a s i n g - m a s i n g e n z i m d a l a m proses transkripsi. R N A polimerase I bersifat tahan sepenuhnya terhadap amanidn (akdvitasnya tidak terpengaruh meskipun diperlakukan dengan amanitin pada k o n s e n t r a s i 2 0 0p-g/ml), R N A p o l i m e r a s e II bersifat sangat peka (mengalami hambatan aktivitas pada konsentrasi amanitin < 0 , 1 |ig/ml), sedangkan R N A polimerase III bersifat cukup tahan dan baru akan mengalami hambatan aktivitas sebesar 5 0 % pada konsentrasi amanitin sebesar 2 0|ig/ml. Pada saat nukleus sel mencit diperlakukan dengan amanidn pada konsentrasi bervariasi, transkrip yang dihasilkan memberikan gambaran tentang molekul R N A polimerase yang menyintesis molekul R N Atertentu. Pada waktu nukleus diperlakukan dengan

178 Biologi Molekular amanitin pada konsentrasi yang m e n g h a m b a t aktivitas R N Apolimerase III, R N A yang dihambat sintesisnya adalah 5S r R N A dan prekursor 4,5S t R N A . Sebaliknya, fungsi R N A p o l i m e r a s e I d a n II d d a k m u d a h d i t e n t u k a n hanya dengan analisis m e n g g u n a k a n a m a n i d n s e h i n g g a h a r u s d i k o n f i r m a s i d e n g a n k a j l a n in vitro y a n g lain. Secara u m u m , perbedaan antara ketiga m a c a m R N A polimerase pada eukaryot ( k h a m i r Saccharomyces cerevisiae) d i s a j i k a n p a d a T a b e l l O . l . Tabel 10.1 > Perbedaan sifat antara R N A polimerase I , I I ,d a n III.Peranan RNA polimerase I RNA polimerase I I RNA polimerase III Transkripsi gen kelas 1 Transkripsi gen kelas I IBerat molekul menghasilkan 18S menghasilkan m R N A T r a n s k r i p s i g e n k e l a s 111Jumlah subunit r R N A , 5,8S r R N A , dan s n R N A menghasilkan tRNA,Aktivitas dan 28S r R N A (kecuali s n R N A U6) 5S r R N A , s n R N A U6, R N A 7SL, R N A 7SK,Tanggapan terhadap 630 k D a 567 k D a RNA VA,dan R N Aa-amanitin EBER2Lokasi dalam sel 13 12 697 k D a Aktif pada kekuatan Aktif pada kekuatan ionik rendah, ionik tinggi, lebih 14 distimulasi oleh M n ^ * aktif dengan adanya maupun Mg^* Mn^* daripadaM g ^ * Aktif pada kekuatan ionik dengan kisaran Sangat tahan Sangat rentan cukup lebar, cukup lebar, lebih aktif Nukleolus Nukleoplasma dengan adanyaM n ^ * Terhambat pada konsentrasi tinggi NukleoplasmaSubunit utanria\ Kedga macam R N A polimerase pada eukaryot mempunyai d u a subunitRNA j utama yang berukuran masing-masing 190 k D adan 135 k D a( R N A polimerasepolimerase I), 2 2 0 k D a dan 1 5 0 k D a ( R N A p o l i m e r a s e II), dan 1 6 0 k D a dan 1 2 8 k D a ( R N A polimerase III), ditambah beberapa subunit yang lebih kecil. S t r u k t u r semacam itu m e m p u n y a i kemiripan dengan s t r u k t u r subunit utama (core) R N A polimerase p a d a p r o k a r y o t y a n g t e r d i r i a t a s d u a s u b u n i t u t a m a (|3 d a n ( } ' ) y a n g b e r u k u r a n besar ditambah dengan dua subunit yang lebih kecil (a^). Penelidan lebih lanjut menunjukkan bahwa memang terdapat hubungan evolusioner antara subunit utama R N A polimerase pada prokaryot dengan subunit utama pada ketiga subunit R N A polimerase eukaryot. Di antara subunit pada kedga macam enzim tersebut ada beberapa subunit yang ada pada setiap macam R N A polimerase, yaitu subunit RPB5, RPB6, RPB8, R P B 1 0 , dan R P B 1 2 . G e n - g e n yang m e n g k o d e subunit R N A p o l i m e r a s e II pada k h a m i r Saccharomyces cerevisiae t e l a h b e r h a s i l d i k l o n d a n d i t e n t u k a n u r u t a n nukleoddanya. Masing-masing subunit dikode oleh satu gen tunggal yang tersebar pada sembilan k r o m o s o m yang berbeda (Tabel 10.2).

Bab 10 Sistem Transl<ripsi pada Eukaryot: 179 Tabel 10.2 k Lokasi g e npengkode subunit R N A polimerase I I pada khamir. Gen Lokasi pada Mobilitas enzim Massa protein kromosom pada SDS-PAGE aktual RPBl IV (kDa) berdasarkan RPB2 XV ukuran gen (kDa) RPB3 DC 220 RPB4 X 150 190 RPB5 n 45 140 RPB6 XVI 32 35 RPB7 IV atau X I I 27 25 RPB8 XV 23 25 RPB9 vn 17 18 RPBIO XV 14 19 RPBll XV 13 17 RPB12 VIII 10 14 13 8,3 (Sumber: Weaver, 2003.) 10 14 7,7Pengelompokan/ D i antara 1 2 s u b u n i t R N A p o l i m e r a s e II pada k h a m i r t e r s e b u t , 1 0 subunitsubunit RNA diketahui bersifat mutlak diperlukan untuk aktivitas polimerase, sedangkan 2polimerase I I subunit (yaitu RPB4 dan RPB9) diperlukan dalam keadaan tertentu. Delesi pada kesepuluh gen pengkode subunit yang mudak diperlukan dalam aktivitas polimerase t e r s e b u t b e r s i f a t m e m a d k a n {lethal) t e r h a d a p j a s a d n y a . S e c a r a u m u m , d a r i k e - 1 2 s u b u n i t R N A p o l i m e r a s e II p a d a S. cerevisiae t e r s e b u t d a p a t d i b e d a k a n b e b e r a p a k e l o m p o k yaitu: ( 1 ) subunit utama, ( 2 ) subunit umum, d a n ( 3 ) subunit tidak penting. S u b u n i t u t a m a , y a i t u R P B l , R P B 2 , d a n R P B 3 , m e r u p a k a n s u b u n i t yang mudak diperlukan untuk akdvitas enzim. Subunit R P B l juga merupakan subunit yang m e n y e b a b k a n kepekaan atau k e r e n t a n a n R N A polimerase II terhadap a-amanidn. Ketiga subunit tersebut masing-masing mempunyai kemiripan dengan s u b u n i t P, p', d a n a p a d a R N A p o l i m e r a s e £. coli. S u b u n i t u m u m , y a i t u R P B 5 , RPB6, RPB8, RPBl 0, dan RPBl 2, terdapat pada ketiga macam R N A polimerase sehingga diduga mempunyai peranan sangat pendng dalam proses transkripsi. Subunit ketiga, yaitu RPB4 dan RPB9, tidak secara mudak diperlukan untuk aktivitas enzim karena mutasi pada kedua genyang mengkode subunit tersebut tidak menyebabkan kemadan selpada suhu normal. Mutasi tersebut hanya bersifat memadkan jika sel ditumbuhkan pada suhu rendah atau tinggi. Subunit yang paling besar (RPBl) diketahui mempunyai fungsi dalam peng- ikatan D N Asedangkan RPB2 berperanan dalam pengikatan nukleodda dan RPB3 berfungsi dalam penyusunan enzim. Subunit yang paling besar mempunyai d o - m a i n p a d a u j u n g k a r b o k s i {carboxy-terminal domain, C T D ) y a n g t e r s u s u n a t a s perulangan urutan nukleodda dengan urutan konsensus Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro- Ser. U r u t a n semacam ini hanya terdapat pada R N A polimerase II. Pada k h a m i r

180 Biologi Molekular terdapat sekitar 2 6 perulangan sedangkan pada mamalia terdapat sekitar 5 0 perulangan urutan asam amino semacam ini. C T D diketahui berperanan dalam proses inisiasi reaksl poiimerasi. Subunit R P B l dapat mengalami fosforilasi pada residu serin atau t h r e o n i n . Enzim R N A p o l i m e r a s e II yang m e n g a l a m i fosforilasi pada subunitnya dinamakan llo, sedangkan yang tidak mengalami fosforilasi disebut' ^ i ^ ^ j — l l a . D i k e t a h u i b a h w a di dalam sel t e r d a p a t dua b e n t u k R N A p o l i m e r a s e II karenaBentuk-bentuk adanya perbedaan dalam fosforilasi subunit R P B l , yaitu ada bentuk RNARNA polimerase IIO d a n R N A polimerase IIA, s e d a n g k a n b e n t u k n o n f i s i o l o g i s n y apolimerase I I disebut R N A polimerase MB. B e n t u k lla dapat diubah menjadi b e n t u k lib denganUs-\"^ — - A cara menghilangkan C T Dmenggunakan enzim protease. Bukti-bukd menunjukkan bahwa bentuk IIA (ddak mengalami fosforilasi) adalah bentuk R N A polimerase II y a n g p e r t a m a kali m e n e m p e l p a d a p r o m o t e r , s e d a n g k a n b e n t u k I I O (yang mengalami fosforilasi pada C T D )adalah bentuk yang melakukan proses p e - manjangan transkrip. Hal Ini m e m b e r i k a n gambaran bahwa perubahan status dari proses inisiasi menjadi proses pemanjangan transkrip diikuti oleh proses fosforilasi CTD.Mekanisme Transkripsi pada EukaryotIVIacam-macam Secara umum, mekanisme transkripsi pada eukaryot serupa dengan yang terjadifaktor pada prokaryot. Proses transkripsi diawali (diinisiasi) oleh proses penempelantranskripsi faktor-faktor transkripsi dan kompleks enzim R N A polimerase pada daerah p r o m o t e r . B e r b e d a h a l n y a d e n g a n y a n g t e r j a d i p a d a p r o k a r y o t , RNA polimerase eukaryot tidak menempel secara langsung pada DNA di daeraii promoter, m e - lainkan melalui p e r a n t a r a a n p r o t e i n - p r o t e i n lain yang disebut sebagai faktor t r a n s k r i p s i (transcription factor, T F ) . F a k t o r t r a n s k r i p s i d i b e d a k a n m e n j a d i d u a kelompok, yaitu: ( 1 ) faktor transkripsi u m u m , dan (2) faktor transkripsi yang khusus untuk suatu gen. Faktor transkripsi u m u m mengarahkan R N A polimerase ke promoter. Penempelan R N A polimerase pada p r o m o t e r oleh faktor transkripsi u m u m h a n y a m e n g h a s i l k a n t r a n s k r i p s i p a d a a r a s d a s a r (basal level). P e n g a t u r a n transkripsi yang lebih spesifik dilakukan oleh faktor transkripsi yang khusus untuk suatu gen. Meskipun demikian, proses penempelan tersebut sangat vital bagi keberlangsungan proses transkripsi. Setelah faktor-faktor transkripsi u m u m dan R N A polimerase menempel pada promoter, selanjutnya akan terjadi pembentukan k o m p l e k s p r o m o t e r t e r b u k a (open promoter complex). T r a n s k r i p s i d i m u l a i p a d a d t i k a w a l t r a n s k r i p s i (RNA initiation site, R I S ) y a n g t e r l e t a k b e b e r a p a n u k l e o t i d a sebelum urutan kodon awal A T G . Seperti telah dijelaskan sebelumnya, pada eukaryot terdapat dga kelas gen, yaitu gen kelas I, kelas II, dan kelas III yang masing-masing dikatallsis o l e h R N A polimerase dan faktor transkripsi yang berbeda. Dalam bagian ini akan dibicarakan t e n t a n g m e k a n i s m e t r a n s k r i p s i gen kelas II t e r l e b i h d a h u l u m e n g i n g a t i n f o r m a s i mengenai hal ini jauh lebih ekstensif dibandingkan dengan sistem transkripsi gen kelas I d a n III.

Bab 10 Sistem Transkripsi pada Eukaryot 181Transkripsi Gen Kelas UTranskripsi g e n kelas II dilakukan o l e h R N A p o l i m e r a s e II yang dibantu o l e hbeberapa faktor transkripsi u m u m . Penyusunan kompleks faktor transkripsi u m u md a n R N A p o l i m e r a s e II pada d a e r a h p r o m o t e r m e m b e n t u k k o m p l e k s pra-inisiasiyang akan segera mengawali transkripsi jika ada nukleodda. Ikatan semacam inim e m b u a t daerah p r o m o t e r menjadi t e r b u k a sehingga R N A p o l i m e r a s e II dapatmembaca urutan D N Apada cetakan. Faktor transkripsi u m u m yang berperandalam mengarahkan R N A polimerase II k ep r o m o t e r adalah TFIIA, TFIIB, TFIID,TFIIE, TFIIF, TFIIH, dan TFIIJ. F a k t o r - f a k t o r transkripsi t e r s e b u t akan m e n e m p e lke daerah p r o m o t e r secara bertahap sebelum akhirnya terbentuk kompleks pra-inisiasi. Penempelan faktor transkripsi tersebut terjadi dengan urutan: (1) pertama-tama TFIID m e n e m p e l pada bagian kotak T A T A pada p r o m o t e r , yang dibantuoleh faktor TFIIA sehingga m e m b e n t u k kompleks D A , (2) kemudian diikud olehpenempelan TFIIB, (3) TFIIF selanjutnya menempel diikuti oleh penempelan R N Apolimerase II,(4)akhirnya faktor TFIIE akan menempel diikud oleh TFIIH danTFIIJ. K o m p l e k s pra-inisiasi yang t e r b e n t u k disebut sebagai kompleks DABPolFEH.D e n g a n d e m i k i a n d a p a t d i p a h a m i b a h w a R N A polimerase II pada eukaryot tidakmeriempel secara langsung pada D N A di daerah promoter melainkan melaluiperantaraan faktor transkripsi. T F I I D a d a l a h f a k t o r t r a n s k r i p s i p e r t a m a y a n gsecara langsung berikatan dengan kotak T A T A sehingga penempelan faktortranskripsi iniakan mengarahkan faktor-faktor transkripsi yang lain d a n R N Ap o l i m e r a s e I I u n t u k m e n g e n a l i d a e r a h p r o m o t e r . P e r c o b a a n s e c a r a in vitromenunjukkan bahwa jika TFIID ddak ada, maka ddak akan terbentuk kompleksp r a - i n i s i a s i , m e s k i p u n f a k t o r - f a k t o r t r a n s k r i p s i y a n g l a i n d i t a m b a h k a n . S e c a r a invitro j u g a t e l a h d i b u k d k a n b a h w a T F I I D d a p a t m e n e m p e l p a d a k o t a k T A T Asecara independen tanpa dibantu oleh TFIIA, sehingga disimpulkan bahwa perananT F I I A a d a l a h m e n i n g k a t k a n d a y a i k a t {affinity) T F I I D t e r h a d a p k o t a k T A T A . P a d aw a k t u kompleks pra-inisiasi sudah terbentuk, R N A polimerase bersama-sama denganTFIIH menutupi daerah p r o m o t e r mulai dari posisi - 3 4 sampai +17. Skemapembentukan kompleks pra-inisiasi dapat dilihat pada Gambar 10.5. Faktor transkripsi TFIID sebenarnya merupakan kompleks protein yangt e r d i r i a t a s b e b e r a p a m a c a m p r o t e i n , y a i t u protein pengikat kotak T A T A (TATA-box binding protein, T B P ) , d a n 8 - 1 0 T A F (TBP-associated factors, f a k t o rtranskripsi yang terkait dengan TBP). Pada g e n kelas II, protein-proteinT A Fd i s e b u t sebagai T A F , , k a r e n a pada gen kelas I dan gen kelas III t e r d a p a t k e l o m p o kprotein T A F yang lain yaitu T A F , (kelas I) d a nT A F m (kelas III). P r o t e i n yangmelekat langsung pada kotak T A T A sebenarnya hanya protein TBP, sedangkanprotein yang lain dalam kompleks T F I I D berikatan melalui ikatan protein denganprotein. T B P juga terlibat dalam proses pembentukan kompleks pra-inisiasi dalamekspresi g e n kelas I dan g e n kelas III. Setelah t e r b e n t u k k o m p l e k s pra-inisiasi, R N A p o l i m e r a s e II siap u n t u k m e -lakukan proses transkripsi jika adanukleotida. Faktor transkripsi yang pentingu n t u k mengawali (Inisiasi) proses transkripsi adalah T B R TFIIB, TFIIF, dan R N Apolimerase II. Tanpa adanya TFIIE d a n TFIIH, sebenarnya sudah dapat terjadi

182 Biologi Molel<ular TATA Titik awal transkripsi ^^^^^ TATA •oTFIIETFIIH TATA Transkripsi dimulaiG a m b a r 10.5 • P e m b e n t u k a n k o m p l e k s p r a - i i t i s i a s i t r a n s k r i p s i p a d a e u k a r y o t .

Bab 1 0 Sistem Transkripsi pada Eukaryot 183transkripsi namun tidak sempurna (abortif). Pembentukan transkrip yang ddaksempurna tersebut menandakan telah terbentuknya kompleks inisiasi t e r m a s u kterjadinya pembukaan D N A secara lokal dan pembentukan ikatan fosfodiesterpertama. Dalam halinifaktor TFIIE dan TFIIH tidak diperlukan dalam prosesi n i s i a s i m e l a i n k a n d i p e r l u k a n d a l a m p r o s e s p e l e p a s a n d a r i p r o m o t e r (promoterclearance) y a n g m e n a n d a i d i m u l a i n y a t r a n s k r i p s i ( p e m a n j a n g a n t r a n s k r i p ) s e c a r aaktif. Pelepasan dari p r o m o t e r tersebut dikatallsis oleh aktivitas D N A helikaseyang dimiliki oleh TFIIH sehingga menyebabkan terbukanya D N A pada daerahp r o m o t e r . H a l ini diduga dilakukan dengan cara m e m u n t i r D N A di daerah hilirdari bagian yang berikatan dengan faktor transkripsi yang lain sehingga t e r b e n t u kgelembung transkripsi. Pembentukan gelembung transkripsi memungkinkan R N Apolimerase untuk memulai transkripsi dan bergerak k e arah hilir sepanjang 1 0 -12 nukleodda. Pergerakan R N A polimerase tersebut dibantu oleh aktivitas TFIIHyang menyebabkan pemanjangan gelembung transkripsi. Faktor TFIIH mempunyai banyak peranan, salah satunya adalah dalam prosesfosforilasi R N Ap o l i m e r a s e II menjadi b e n t u k IIO. T F I I H diketahui m e m p u n y a iakdvitas kinase C T D . Bentuk R N A polimerase I I O inilah yang selanjutnya m e -lakukan proses pemanjangan transkrip. Fosforilasi terjadi pada asam-asam aminopada bagian C T D yang ada pada subunit R N A p o l i m e r a s e II yang paling besar.D e n g a n d e m i k i a n d a p a t d i k a t a k a n b a h w a proses fosforilasi RNA polimerase II/n/7oh y o n g memicu perubahan status RNA polimerase II dari keadaan pra-inisiasimenjadi inisiasi dan selanjutnya terjadi pemanjangan transkrip. F o s f o r i l a s i p a d aR N A p o l i m e r a s e II m e n y e b a b k a n terjadinya p e r u b a h a n k o n f o r m a s i k o m p l e k sinisiasi menjadi bentuk yang siap u n t u k melakukan pemanjangan transkrip.Pemanjangan transkrip tersebut dapat terjadi karena fosforilasi R N A polimeraseII m e n y e b a b k a n i k a t a n a n t a r a C T D d e n g a n T B P m e n j a d i l e m a h . D e n g a n a d a n y an u k l e o t i d a m a k a k o m p l e k s p e m a n j a n g a n (elongation complex) d a p a t m e n e r u s k a nproses pemanjangan transkrip (RNA). Proses pemanjangan transkrip distimulasi oleh suatu faktor yang disebutTFIIS. Faktor ini pertama kali diketemukan oleh Reinberg dan Roeder padatahun 1987 dalam sel HeLa. Faktor TFIIS ini diketahui merupakan homologf a k t o r s e r u p a y a i t u S l l y a n g t e r d a p a t d i d a l a m s e l t u m o r ascite y a n g d i k e t e m u k a noleh Naori. Faktor TFIIS diketahui dapat memengaruhi proses pemanjangantranskrip tetapi ddak berperan dalam proses inisiasi transkripsi. Faktor TFIISdapat mensdmulasi pemanjangan transkrip dengan cara membatasi jeda dalamproses poiimerasi R N A oleh R N A polimerase. Diketahui bahwa akdvitas R N Apolimerase dalam proses transkripsi ddak selalu dalam keadaan tetap, kadang-kadang terjadi jeda dalam proses transkripsi pada suatu daerah yang disebut sisij e d a (pausing s / t e ) . T F I I S d i k e t a h u i m e n g u r a n g i w a k t u j e d a s e m a c a m i n i s e h i n g g adapat meningkatkan pemanjangan transkrip. Ada hal yang menarik bahwa salahsatu faktor inisiasi, yaitu TFIIF, juga dapat memengaruhi proses pemanjangantranskrip meskipun dengan cara yang berbeda dari TFIIS. Faktor TFIIS diketahuidapat m e m e n g a r u h i jeda proses transkripsi pada sisi D N A yang c u k u p panjangsedangkan TFIIF mengurangi w a k t u jeda pada daerah D N A yang acak.

184 Biologi Molekular P r o s e s p e m a n j a n g a n t r a n s k r i p akan berjalan sampai R N A p o l i m e r a s e II mencapai daerah terminator. Pada dasarnya proses pemanjangan transkrip ber- langsung seperti proses yang terjadi pada sistem prokaryot seperti telah dijelaskan pada bagian sebelumnya. Terminasi transkripsi dapat terjadi karena adanya akdvitas fosfatase yang spesifik u n t u k C T D sehingga m e n g e m b a l i k a n R N A p o l i m e r a s e II menjadi bentuk yang ddak mengalami fosforilasi. Dalam keadaan ddak mengalami fosforilasi, R N A p o l i m e r a s e II d a p a t d i g u n a k a n lagi d a l a m p r o s e s t r a n s k r i p s i b e r i k u t n y a . D e n g a n d e m i k i a n R N A p o l i m e r a s e II dapat digunakan secara b e r u l a n g - u l a n g d a l a m p r o s e s t r a n s k r i p s i g e n k e l a s II. H a l i n i d i s e b u t s e b a g a i RNA polymerase cycling.Peranan Transkripsi Gen Kelas If a k t o r SL1Peranan T r a n s k r i p s i gen kelas I d i l a k u k a n o l e h R N A p o l i m e r a s e I. P r o s e s t r a n s k r i p s i genf a k t o r UBF kelas I juga dimulai dengan pembentukan kompleks pra-inisiasi yang dilakukan o l e h R N A p o l i m e r a s e I d a n d u a f a k t o r t r a n s k r i p s i , y a i t u S L 1 d a n U B F {upstream- binding factor). S L 1 p e r t a m a k a l i d i i s o l a s i d a r i s e l H e L a d a n m a m p u m e n g a t u r terjadinya inisiasi transkripsi pada g e n manusia secara akurat. SL1 m e r u p a k a n faktor transkripsi yang mempunyai spesifisitas untuk suatu spesies, artinya dapat membedakan antara p r o m o t e r gen pada manusia dan p r o m o t e r pada gen mencit. Faktor SL1 diketahui berperanan dalam penyusunan kompleks pra-inisiasi R N A p o l i m e r a s e I. S p e s i f i s i t a s S L 1 t e r h a d a p s u a t u p r o m o t e r d i b a n t u o l e h e l e m e n p r o m o t e r u t a m a ( c o r e promoter element). R o b e r t T j i a n d a n k a v ^ a n - k ? - a n menunjukkan bahwa p r o m o t e r r R N A hibrid yang tersusun atas elemen pro- m o t e r utama yang berasal dari manusia dan daerah pengendali hulu yang berasal dari mencit dapat mendorong terjadinya transkripsi oleh R N A polimerase I dan faktor transkripsi SL1 yang berasal dari manusia. Sebaliknya, jika elemen pro- m o t e r utama berasal dari mencit dan daerah pengendali hulu berasal dari manusia, maka tidak terjadi transkripsi meskipun ada R N A polimerase I dan faktor transkripsi SL1 yang berasal dari manusia. H a linimenunjukkan bahwa elemen promoter utama mempunyai peranan yang sangat penting dalam interaksinya dengan faktor transkripsi SL1. Faktor SL1 merupakan suatu kompleks protein y a n g t e r s u s u n a t a s T B P {TATA-box binding protein) d a n d g a m o l e k u l T A F ( T A T A - b o x associated protein). S L 1 s e c a r a s e n d i r i a n m a m p u m e n s t i m u l a s i t r a n s k r i p s i p a d a a r a s d a s a r {basal level). Transkripsi gen kelas I dimulai dari daerah promoter antara dan berakhir pada sisi sebelah hulu p r o m o t e r u t a m a (lihat G a m b a r 10.1). Hal ini dimaksudkan u n t u k m e n g a n t a r k a n m o l e k u l R N A polimerase I dalam j u m l a h besar k e sisi inisiasi. Secara rinci, m e k a n i s m e inisiasi transkripsi g e n kelas I sampai saat ini belum diketahui secara jelas. Selain faktor S L l ,inisiasi transkripsi g e n kelas I juga m e m e r l u k a n faktor transkripsi UBF. Faktor U B F inilah yang menempel pada daerah p r o m o t e r gen r R N A secara langsung dan b u k a n n y a R N A p o l i m e r a s e I. R o b e r t T j i a n dan k a w a n - kawan menemukan bahwa faktor U B Fjuga dapat menstimulasi transkripsi g e n r R N A s e c a r a in vitro. U B F d a n S L l d i k e t a h u i b e r l n t e r a k s l d a l a m m e n s d m u l a s i

Bab 10 Sistem Transkripsi pada Eukaryot 1 8 5 A aktivitas p r o m o t e r gen r R N A melalui daerah pengendali sebelah hulu. Penelitian lebih lanjut menunjukkan bahv/a faktor S L l yang berasal dari manusia tidak berikatan langsung pada D N A , sedangkan S L l yang berasal dari mencit dapat menempel pada p r o m o t e r g e n r R N A mencit. Selain i t u juga diketahui bahwa faktor transkripsi S L l yang berasal dari manusia hanya aktif terhadap p r o m o t e r manusia, sedangkan S L l mencit juga hanya aktif terhadap p r o m o t e r mencit. Sebaliknya, faktor transkripsi UBF yang berasal dari manusia dapat menggantikan fungsi U B Fdari mencit, dan sebaliknya. Transkripsi Gen Kelas HIM a c a m dan Transkripsi gen kelas III(gen t R N A dan 5 Sr R N A ) dilakukan oleh R N A polimeraseperanan faktor III d i b a n t u o l e h s e k e l o m p o k p r o t e i n yang dikenal sebagai f a k t o r t r a n s k r i p s i TFIIItranskripsi TFIII yang meliputi TFIIIA, TFIIIB, dan TFIIIC serta protein TBP. Penelitian menunjuk-Ciri p r o t e i n kan bahwa sintesis t R N A dapat dilakukan tanpa menggunakan TFIIIA, melainkanzinc-finger cukup dengan TFIIIB dan TFIIIC. Sebaliknya, sintesis SS r R N A memerlukan TFIIIA, TFIIIB, d a n TFIIIC. Dalam sintesis SS r R N A , TFIIIA merupakan faktor pertama yang mengenali d a nmelekat pada p r o m o t e r gen 5S r R N A . Sejauh ini proses rinci transkripsi gen kelas IIImasih m e r u p a k a n hipotesis yang rangkaiannya kurang lebih sebagai berikut. Pertama-tama, faktor TFIIIC m e n e m p e l pada kotak A d a n kotak B yang adapada p r o m o t e r internal (pada g e nSS r R N A , TFIIIC akan menempel bersamaan dengan TFIIIA). Penempelan TFIIIC tersebut mendorong penempelan TFIIIB dan T B Ppada daerah sebelah hulu dari titik awal transkripsi. Selanjutnya, R N A polimerase III m e n e m p e l pada daerah awal transkripsid a n siap m e m u l a i proses transkripsi. Pada saat transkripsi dimulai, R N A polimerase III diduga m e n y e b a b k a n T F I I I C t e r l e p a s dari i k a t a n n y a d e n g a n k o t a k A d a n kotak B pada daerah p r o m o t e r internal, sementara TFIIIB tetap berada di t e m p a t n y a u n t u k m e m u l a i r a n g k a i a n p r o s e s t r a n s k r i p s i b e r i k u t n y a . S e c a r a in vitro, k o m p l e k s i k a t a n T F I I I A , T F I I I B , T F I I I C , d a n R N A p o l i m e r a s e I I I t e r s e b u t dapat m e n d u k u n g proses transkripsi sampai kurang lebih 4 0 kali. Selama rangkaian proses tersebut, R N A polimerase IIIakan berdisosiasi dan berasosiasi kembali k edalam kompleks protein setiap kali terjadi proses transkripsi. Sejauh i n i d i k e t a h u i b a h w a t e r m i n a s i t r a n s k r i p s i g e n k e l a s I I I p a d a Xenopus t e r j a d i pada suatu daerah tertentu dantidak melibatkan protein khusus. TFIIIA adalah suatu protein yang melekat pada D N Ad a n mempunyai s t r u k t u r y a n g d i s e b u t s e b a g a i z'mc-finger. P r o t e i n zinc-finger d i c i r i k a n o l e h suatu inti a t o m zinc yang mengikat d u aasam amino sistein d a nd u a asam a m i n o h i s t i d i n , m e s k i p u n b e b e r a p a p r o t e i n zinc-finger y a n g l a i n a d a y a n g h a n y a mengikat empat asam sistein dan tidak ada histidin. Faktor TFIIIA tersusun atas s e m b i l a n s t r u k t u r zinc-finger d a l a m s a t u b a r i s d a n s t r u k t u r i n i d i d u g a m e n y i s i p k e d a l a m s t r u k t u r major groove p a d a D N A d a e r a h p r o m o t e r i n t e r n a l g e n 5 S r R N A . Skema pembentukan kompleks pra-inisiasi pada g e n kelas III dapat dilihat pada Gambar 10.6.

186 B i o l o g i M o l e k u l a r Kotak A Kotak BG a m b a r 10.6 •P e m b e n t u k a n k o m p l e k s pra-inisiasi p a d a g e n kelas III. (Diadaptasidari Weaver, 2003.)Peranan F a k t o r TBP dalam TranskripsiFaktor TBP merupakan protein universal yang diperlukan dalam transkripsi genkelas I, kelas II, m a u p u n kelas III, t e r m a s u k gen kelas II yang tidak m e m p u n y a ikotak TATA. Selain itu, penelidan menunjukkan bahwa T B P juga ditemukan dalamsel jasad hidup dari k e l o m p o k yang lain yaitu A r c h a e a . Archaea adalah jasadhidup dari kerajaan tersendiri yang ddak mempunyai indsel danberbeda dariprokaryot dan eukaryot, meskipun banyak bukd yang menunjukkan kemlrlpannyadengan eukaryot. Pada tahun 1994, Stephen Jackson menemukan bahwa di dalams a l a h s a t u a n g g o t a a r c h a e a , y a i t u Pyrococcus woesei, t e r d a p a t s u a t u p r o t e i n y a n gsecara struktural d a n fungsional mirip dengan T B P pada eukaryot. Selain itu,protein yang mirip dengan TFIIB juga ditemukan pada kelompok archaea.

Bab 1 0 Sistem Transl<ripsi pada Eul<aryot 1 8 7 Meskipun pada awalnya TBP diduga merupakan protein yang hanya dapat m e n e m p e l p a d a d a e r a h T A T A ( o l e h k a r e n a i t u d i s e b u t s e b a g a i TATA-box binding protein), n a m u n b e b e r a p a b u k t i m e n u n j u k k a n b a h w a g e n - g e n y a n g t i d a k m e m p u n y a i kotak T A T A juga m e m e r l u k a n T B P dalam proses transkripsinya. Pada gen kelas I, T B P m e l e k a t p a d a d a e r a h e l e m e n I n t i ( c o r e element) p r o m o t e r b e r s a m a - s a m a d e n g a n S L l . P a d a g e n k e l a s I I y a n g tidak m e m p u n y a i k o t a k T A T A , T B P m e l e k a t bersama-sama dengan TFIID, sedangkan TFIID berikatan dengan protein Spl yang m e l e k a t p a d a k o t a k G C . G e n k e l a s III j u g a tidak m e m p u n y a i k o t a k T A T A s e h i n g g a TBP berikatan dengan TFIIIB yang menempel pada daerah sebelah hulu dari titik a w a l t r a n s k r i p s i . S k e m a i k a t a n T B P p a d a g e n - g e n y a n g tidak m e m p u n y a i k o t a k T A T A disajikan dalam Gambar 10.7. TAF,[250 TAF[,250 TAF|[250 T A T A Elemen inisiator Elemen inisiator GC Gambar 10.71 Skema ikatan antara TBP dengan promoter yang tidak mempunyai kotak TATA.Pemrosesan Transkrip Pasca-Transkripsi\ Proses-proses Pada prokaryot, proses transkripsi dan translasi berlangsung hampir secara\ d a l a m fase serentak, artinya bahwa sebelum transkripsi selesai dilakukan, translasi sudah d a p a t d i m u l a i . H a l i n i d a p a t t e r j a d i k a r e n a p a d a p r o k a r y o t tidak a d a h a m b a t a n pasca- struktural selkarena semua komponen transkripsi dan translasi terletak pada trar)skripsi ruangan sitoplasma yang sama. Sebaliknya, pada eukaryot, transkripsi berlangsung di dalam nukleus sedangkan translasi berlangsung di dalam sitoplasma. Dengan demikian translasi baru dapat dijalankan jika proses transkripsi sudah selesai d i l a k u k a n . Jeda w a k t u s e m a c a m ini d i s e b u t sebagai fase pasca-transkripsi. Pada fase ini terjadi beberapa proses yang unik pada eukaryot, antara lain: (1) p e - m o t o n g a n d a n p e n y a m b u n g a n R N A (RNA splicing), (2) poliadenilasi ( p e n a m b a h a n g u g u s p o l i - A p a d a u j u n g 3 ' m R N A ) , ( 3 ) p e n a m b a h a n t u d u n g (cap) p a d a u j u n g 5 ' m R N A , dan (4) penyuntingan m R N A . P e m o t o n g a n dan P e n y a m b u n g a n RNA (Splicing) Seperti telah dikemukakan sebelumnya, pada jasad eukaryot banyak terdapat gen y a n g o r g a n l s a s l n y a t e r s u s u n a t a s e k s o n d a n intron, m e s k i p u n tidak s e m u a g e n

188 Biologi Molekular\ Definisi eukaryot mempunyai intron. Pada awalnya, gen yang terdiri atas ekson dan intron \ spiking d i t r a n s k r i p s i m e n g h a s i l k a n p r e - m R N A ( t r a n s k r i p p r i m e r , primary trariscript) k a r e n a masih mengandung sekuens intron. Pada tahapan selanjutnya intron akan dipotong dari p r e - m R N A dan ekson-ekson yang adaselanjutnya disambung menjadi m R N A y a n g ' m a t a n g ' (mature mRNA). P r o s e s p e m o t o n g a n i n t r o n d a n p e n y a m b u n g a n k e m b a l i e k s o n - e k s o n d i s e b u t s e b a g a i p r o s e s p e n y a m b u n g a n R N A ( R N A splic- ing).Transkrip m R N A yang sudah matang inilah yang selanjutnya akan ditranslasl. Secara skematis tahapan dasar pemrosesan m R N A pada eukaryot dapat dilihat pada Gambar 10.8. Intron 1 Gen Ekson 3 Transkrip primer Ekson 1 Splicing Transkrip matang Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3 G a m b a r 1 0 . 8 I S k e m a d a s a r p r o s e s splicing m R N A p a d a n u k l e u s . ( D i a d a p t a s i d a r i Weaver, 2003.) P r o s e s splicing R N A a d a l a h p r o s e s y a n g s a n g a t a k u r a t . A k u r a s i p r o s e s p e - motongan danpenyambungan ditentukan oleh suatu urutan nukleodda yang d i k e n a l s e b a g a i splicing signals. S e j a u h i n i u r u t a n n u k l e o t i d a l e s t a r i y a n g d i t e m u k a n pada beberapa intron yang berbeda yang diketahui adalah dua nukleotida pada ujung intron, yaitu Intron ekson-GU AG-ekson Selain urutan tersebut juga ada urutan konsensus pada bagian pertemuan antara ekson dengan intron. Pada gen-gen yang adadalam nukleus, urutan konsensusnya adalah sebagai berikut:

Bab 10 Sistem Transl<ripsi pada Eukaryot 189Ekson Intron Ekson^64 G73 G,oo A,g U ,63 6Py74-87 N C,,A,OQG'100 NAngka-angka menunjukkan persentase frekuensi nukleotida pada dap posisi, jikaangkanya 100 berard basa tersebut selalu berada pada posisi tersebut. N dan P ymenyatakan nukleodda apa pun atau basa pirimidin yang mungkin ada pada posisitersebut. U r u t a n nukleodda pada bagian p e r t e m u a n ekson-intron tersebut berbedauntuk g e n t R N A d a ngen struktural pada mitokondria d a n kloroplas karenaadanya perbedaan dalam hal mekanisme pemotongan-penyambungan RNA-nya.P a d a g e n - g e n y a n g a d a d a l a m n u k l e u s h a n y a a d a u r u t a n n u k l e o d d a l e s t a r i (con-served) y a n g p e n d e k , y a i t u T A C T A A C , y a n g t e r l e t a k s e k i t a r 3 0 p a s a n g a n b a s ad i s e b e l a h h u l u d a r i s i s i 3 ' p e n y a m b u n g a n . R e s i d u adenine p a d a p o s i s i k e e n a mkotak T A C T A A C adalah residu yang lestari dan mempunyai peranan sangat pendngdalam proses pemotongan-penyambungan intron-ekson. Secara u m u m dapatdisebutkan bahwa sekuens intron pada gen-gen dalam nukleus bersifat acak,kecuali sekuens dinukleotida G T dan A C serta kotak T A C T A A C . Intron padagen-gen mitokondria dan kloroplas juga mempunyai sekuens lestari tetapi berbedadari yang a d a pada gen-gen dalam inti sel. Sekuens konsensus pada daerahperbatasan antara ekson-intron pada prekursor m R N A khamir telah diketahuidengan urutan sebagai berikut: 5' - G U A U G U - intron - U A C U A A C - P y A G - 3'Dari beberapa penelidan diketahui bahwa sinyal untuk pemotongan intrond a n p e n y a m b u n g a n e k s o n (splicing signals) p a d a p r e k u r s o r m R N A g e n - g e npada nukleus sangat seragam, yaitu kedua basa intron pertama hampir selalumengandung G U dan dua basa terakhir hampir selalu mengandung A G . Selain itu,keseluruhan sekuens konsensus sangat pendng untuk pemotongan intron d a npenyambungan ekson secara tepat. Mutasi pada sekuens konsensus dapat meng-a k l b a t k a n splicing y a n g a b n o r m a l . S i f a t l e s t a r i u j u n g 5 ' d a n 3 ' p a d a s i s i p e m o t o n g a n -penyambungan serta kotak T A C T A A C menunjukkan bahwa halini mempunyaifungsi sangat pendng dalam ekspresi genetik. Mutasi pada bagian tersebut dapatmenyebabkan perubahan fenodpe pada banyak jasad eukaryot. Sebagai c o n t o h ,mutasi pada daerah ini seringkali bertanggung jawab dalam pemunculan penyakitmenurun pada manusia, misalnya kelalnan hemoglobin. Penelidan menunjukkan bahwa proses pemotongan intron dari transkripR N A terdiri atas tiga dpe yang berbeda yaitu:1. Intron pada prekursor t R N A dipotong dengan menggunakan endonukleasesecara t e p a t diikud o l e h reaksi ligasi ( p e n y a m b u n g a n ) m e n g g u n a k a n e n z i m ligase.2. Intron pada beberapa p r e k u r s o r r R N A dihilangkan dengan m e k a n i s m e auto-k a t a l i t i k m e l a l u i r e a k s i u n i k y a n g m e l i b a t k a n m o l e k u l R N A i t u s e n d i r i d a n tidakmelibatkan aktivitas enzim.3. Intron pada p r e - m R N A dipotong dengan m e k a n i s m e reaksi dua-langkahyang dilakukan oleh partikel ribonukleoprotein yang disebut sp/iceosome.

M e k a n i s m e Splicing Prekursor mRNA Inti SelS e c a r a s e d e r h a n a , m e k a n i s m e splicing p r e k u r s o r m R N A n u k l e u s d i s a j i k a n p a d aG a m b a r 1 0 . 9 . D a l a m m e k a n i s m e I n i , p r o s e s splicing m e n g h a s i l k a n s u a t u s t r u k t u rcabang yang d i s e b u t d e n g a n lariat k a r e n a b e n t u k n y a s e p e r t i tali laso. Pada t a h a pp e r t a m a , g u g u s 2 ' - O H n u k l e o d d a adenine y a n g a d a d a l a m i n t r o n m e n y e r a n gikatan fosfodiester yang menghubungkan ekson 1 dengan intron. Hal Ini m e -nyebabkan terputusnya ikatan antara ekson 1 dengan intron sehingga dihasilkanekson 1 yang bebas dan struktur lariat yang merupakan gabungan antara introndengan ekson 2.Struktur lariat tersebut mempunyai ujung 5' G U yang berikatandengan titik percabangan melalui ikatan fosfodiester Pada tahap kedua, ujung3'-OH pada ekson 1 menyerang ikatan fosfodiester antara intron dengan ekson2, menghasilkan s t r u k t u r intron b e r b e n t u k lariat d a n ekson 1/ekson 2 yangbersambungan. Penyambungan antara ekson 1 danekson 2 diperantarai olehgugus fosfat pada ujung 5' ekson 2.P e n e l i d a n p a d a k h a m i r m e n u n j u k k a n b a h w a splicing b e r l a n g s u n g d l d a l a ms u a t u p a r t i k e l b e r u k u r a n 4 0 S y a n g d i s e b u t sebagai spliceosome. P a r t i k e l t e r s e b u tm e m p u n y a i p e r a n a n s a n g a t p e n d n g d a l a m p r o s e s splicing k a r e n a p r e - m R N Ayang mengalami mutasi dari A ^ C pada d d kpercabangan ddak dapat mengalamisplicing. H a l I t u d i s e b a b k a n R N A s e m a c a m i n i d d a k m a m p u m e m b u a t s t r u k t u rspliceosome. S e l a i n p a r t i k e l spliceosome, f a k t o r l a i n y a n g j u g a b e r p e r a n a n p e n t i n gd a l a m splicing a d a l a h m o l e k u l R N A b e r u k u r a n k e c i l y a n g d i s e b u t small nuclearRNA ( s n R N A ) y a n g b e r a s o s i a s i d e n g a n s u a t u p r o t e i n m e m b e n t u k k o m p l e k ssmall ribonuclear proteins ( s n R N P , d i b a c a \"snurp\"). K o m p l e k s t e r s e b u t d a p a tdipisahkan dengan elektroforesis gelmenghasilkan pardkel-partikel individual yangdisebut U1, U2, U4, US, d a n U6.Mekanisme Splicing S e c a r a AutokatalitikMekanisme ini terjadi pada prekursor r R N A tanpa melibatkan akdvitas enzim.Lebih jauh telah diketahui pula bahwa mekanisme semacam inijuga terjadi padapemotongan intron pada banyak prekursor r R N A , t R N A , dan m R N A yang adapada mitokondria d a nkloroplas banyak spesies, misalnya pemotongan introng e n 2 6 S r R N A p a d a Tetraiiymena. M e k a n i s m e splicing a u t o k a t a l i d k d d a k m e -merlukan energi maupun enzim tetapi melibatkan reaksi transfer ikatan fosfoestertanpa ada ikatan yang hilang. Mekanisme pemotongan intron secara autokatalitikdapat d i b e d a k a n m e n j a d i d u a ,y a i t u pada gen-gen yang m e n g a n d u n g introngrup I d a n intron grup II. P a d a i n t r o n g r u p I ( m i s a l n y a 2 6 S r R N A p a d a Tetrahymena), p r o s e s splicingm e l i b a t k a n p e n a m b a h a n n u k l e o d d a guanine p a d a u j u n g 5 ' i n t r o n . Guanine t e r s e b u tadalah nukleotida yang berasal dari luar, bukan bagian integral intron sepertiy a n g d i a m a d p a d a splicing m e n g g u n a k a n spliceosome. P a d a t a h a p p e r t a m a , n u k l e o -d d a guanine m e n y e r a n g n u k l e o d d a adenine p a d a u j u n g 5 ' i n t r o n d a n m e l e p a s k a nekson 1 .Pada tahap kedua, ekson 1 menyerang ekson 2 sekaligus melakukanpenyambungan ekson 1 danekson 2 serta melepaskan intron berbentuk linear

B a b 1 0 S i s t e m T r a n s k r i p s i p a d a E u k a r y o t 191Selanjutnya, dengan proses yang berbeda, Intron linear dipotong nukleotidanyasebanyak 1 9 nukleodda dari ujung 5' (Gambar 10.9). V OH AGpl IpGU- -A G -o: •A A G O H( a ) Splicing m R N A n u k l e u s Ekson 1 >/ Ekson 25'! lUpA^ ^ C p l .13' \ GOH GpA \ Ekson 1 Ekson 25' ] U O H ^ G p U ~|3'Ekson 1 Ekson 2 IntronI UlpUf 3' + GpA GOH( b ) Splicing i n t r o n k e l a s IG a m b a r 1 0 . 9 • M e k a n i s m e splicing i n t r o n . ( a ) Splicing m R N A n u k l e u s . ( b ) Splicingintron kelas I .(Diadaptasi dari Weaver, 2003.)

Gen-gen m i t o k o n d r i a dan kloroplas mengandung intron grup I dan II, tetapimekanisme pemrosesannya berbeda. Kalau pada intron grup I pemotongan intrond i l a k u k a n d e n g a n p e n y e r a n g a n o l e h n u k l e o d d a guanine, m a k a p a d a i n t r o ng r u p II p e n y e r a n g a n t e r s e b u t d i l a k u k a n o l e h adenine y a n g a d a d i d a l a m i n t r o ns e h i n g g a t e r b e n t u k l a r i a t . M e k a n i s m e splicing i n t r o n g r u p I I m e m p u n y a i k e m i r i p a nd e n g a n m e k a n i s m e splicing y a n g m e n g g u n a k a n k o m p l e k s spliceosome y a n g t e r j a d ipada m R N A gen-gen inti sel. Hal inim e m b e r i k a n gambaran mengenai adanyak e m i r i p a n f u n g s i a n t a r a s n R N P (spliceosome) d e n g a n g u g u s k a t a l l d k p a d a i n t r o ngrup II. Lebih lanjut hal ini m e n l m b u l k a n dugaan bahwa intron pada m R N A gen-gen ind selsecara e v o l u s i o n e r berasal dari i n t r o n grup II yang ada pada b a k t e r ikarena ada hipotesis yang mengungkapkan bahwa mitokondria berasal dariprokaryot awal.M e k a n i s m e S p l i c i n g Prekursor tRNAP r o s e s splicing p r e k u r s o r t R N A p a d a Saccharomyces cerevisiae d i l a k u k a n m e l a l u id u a t a h a p a n . D a l a m t a h a p a n I , e n z i m y a n g d i s e b u t splicing endonuclease (tRNAendonuklease) yang t e r i k a t pada m e m b r a n n u k l e u s m e l a k u k a n dua p e m o t o n g a nsecara t e p a t pada ujung-ujung i n t r o n . Selanjutnya pada tahapan II suatu e n z i my a n g d i s e b u t splicing ligase ( R N A ligase) m e n y a m b u n g k e d u a b a g i a n t R N A s e h i n g g adihasilkan molekul t R N A yang sudah 'matang' (Gambar 10.10).B e b e r a p a m e k a n i s m e splicing y a n g d i j e l a s k a n d i a t a s a d a l a h m e k a n i s m e cis-splicing, y a i t u p r o s e s splicing y a n g m e l i b a t k a n d u a e k s o n a t a u l e b i h y a n g a d a p a d agen yang sama. Penelitian pada tripanosoma, p r o t o z o a yang m e m p u n y a i alatg e r a k f l a g e l l a , m e n u n j u k k a n a d a m e k a n i s m e splicing a l t e r n a d f y a n g d i s e b u t trans-splicing. P a d a trans-splicing e k s o n - e k s o n y a n g d i g a b u n g k a n b u k a n b e r a s a l d a r igen yang sama, bahkan dapat berasal dari k r o m o s o m yang berbeda. Penelitianlebih lanjut pada jasad inimenunjukkan bahwa semua m R N A mempunyai 3 5n u k l e o t i d a a w a l (leader), d i s e b u t s e b a g a i spliced leader (SL), t e t a p i g e n - g e n y a n gmengkode m R N A tersebut tidak mempunyai urutan komplementer ke-35nukleotida awal. Gen yang mengkode SL tersebut diketahui berulang sekitar 200kali pada g e n o m tripanosoma. G e n tersebut hanya mengkode SL ditambah 100n u k l e o t i d a y a n g t e r s a m b u n g p a d a S L m e l a l u i s e k u e n s splicing k o n s e n s u s p a d aujung 5'. Dengan demikian, g e n mini tersebut tersusun atas ekson SL yangpendek dan ujung 5' suatu intron.Poliadenilasi mRNATranskrip m R N A pada eukaryot juga mengalami pemrosesan dalam bentukp e n a m b a h a n poliA (rantai A M P ) pada u j u n g 3' sepanjang k u r a n g lebih 2 0 0 - 2 5 0n u k l e o t i d a . P e n a m b a h a n p o l i A s e m a c a m i n i tidak t e r j a d i p a d a r R N A m a u p u nt R N A . R a n t a i p o l i A t e r s e b u t d i t a m b a h k a n p a s c a - t r a n s k r i p s i k a r e n a tidak a d abagian gen yang m e n g k o d e rangkaian A atau T semacam Ini. Penambahan tersebutdilakukan dengan m e n g g u n a k a n aktivitas e n z i m poli(A) polimerase yang ada d idalam nukleus. Sebagian besar m R N A mengandung poliA, kecuali m R N A histon.

Bab 10 Sistem Transkripsi pada Eukaryot 1 9 3 3'-OH 3'-OH5'-P 5'-P Splicing e n d o n u k l e a s e Sekuens intron OH HQ- Sekuens intron 3' S'3'-OH 3'-OHG a m b a r 1 0 . 1 0 > S k e m a m e k a n i s m e splicing t R N A . ( D i a d a p t a s i d a r i S n u s t a d d a nSimmons, 2003.)Penambahan pollA pada ujung 3' meningkatkan stabilitas m R N A sehinggam R N A mempunyai u m u r yang lebih panjang dibandingkan dengan m R N A yangtidak mempunyai pollA. Selain itu juga ada bukd yang menunjukkan bahwa ke-beradaan poliA meningkatkan efisiensi translasi m R N A semacam itu. Diketahuia d a s u a t u p r o t e i n , y a i t u poly{A)-binding p r o t e i n I, y a n g m e n e m p e l p a d a p o l l Asehingga meningkatkan efisiensi translasi. Bukd lain juga menegaskan bahwa m R N Ayang mempunyai pollA mempunyai kemungkinan yang lebih dnggi untuk mengikatribosom sehingga dapat meningkatkan efisiensi translasi dibandingkan m R N Ayang ddak mengalami poliadenilasi. Poliadenilasi dilakukan pada prekursor m R N Abahkan sebelum terjadi terminasi transkripsi. Hal tersebut dilakukan dengan caram e m o t o n g prekursor m R N A pada bagian yang nantinya akan menjadi bagianm R N A yang 'matang', kemudian dilanjutkan dengan menambahkan pollA padaujung 3' yang t e r b u k a . Bagian m R N A yang disintesis setelah sisi poliadeniasiselanjutnya akan didegradasi.

T e m p a t d i l a k u k a n n y a poliadenilasi d i c i r i k a n o l e h s u a t u sinyal poliadenilasipada gen mamalia. Sinyal tersebut terdiri atas rangkaian nukleodda A A T A A Ayang diikud oleh sekitar 2 0 nukleodda yang kaya akan residu G T serta diikudoleh m o d f yang kaya akan T . Transkrip m R N A pada tanaman dan khamir jugamengalami poliadenilasi tetapi sinyal poliadenilasinya berbeda dari yang ada padamamalia karena ada variasi pada sekuens A A T A A A . Pada khamir, jarang sekaliada motif A A T A A A yang ditemukan.P e n a m b a h a n T u d u n g (Cap) p a d a mRNASejak tahun 1974, para penelld telah m e n e m u k a n bahwa m R N A jasad eukaryotm e n g a l a m i metilasi ( p e n a m b a h a n gugus m e t i l ) yang sebagian besar t e r a k u m u l a s ipada ujung 5 ' m R N A . S t r u k t u r ini k e m u d i a n dikenal sebagai tudung m R N A(mRNA cap). P e n e l i t i a n s e l a n j u t n y a y a n g d i l a k u k a n o l e h Y a s u h i r o F u r u l c h i d a nKin-Ichiro Miura menunjukkan bahwa tudung m R N A tersebut berupa molekul7-metilguanosin ( m ^ G ) . T u d u n g m R N A t e r s e b u t disintesis d a l a m b e b e r a p a tahapan.Yang pertama, enzim R N A trifosfatase m e m o t o n g gugus fosfat pada ujung pre-m R N A , kemudian enzim guanilil transferase menambahkan G M P (guanosin m o n o -fosfat). Selanjutnya, enzim medl transferase melakukan medlasi tudung guanosinpada N'' dan gugus 2'-0-metil pada nukleotida ujung tudung tersebut. Prosespenambahan tudung tersebut berlangsung pada tahapan awal transkripsi sebelumtranskrip mencapai panjang 3 0 nukleodda. Tudung m R N A mempunyai empat macam fungsi, yaitu: (1) melindungi m R N Adari degradasi, ( 2 ) meningkatkan efisiensi translasi m R N A , ( 3 ) meningkatkanpengangkutan m R N A dari nukleus k esitoplasma, dan (4) meningkatkan efisiensip r o s e s splicing m R N A . T u d u n g m ^ G b e r i k a t a n d e n g a n m R N A m e l a l u i i k a t a ntrifosfat dan hal ini diduga melindungi m R N A dari serangan R N a s e yang ddakdapat m e m o t o n g ikatan trifosfat. Tudung tersebut juga meningkatkan efisiensitranslasi karena ribosom dapat mengakses m R N A melalui suatu protein yangmenempel pada tudung. Dengan demikian, jika tidak ada tudung, maka proteinyang melekat pada tudung tidak dapat menempel. Hal Itu akhirnya mengurangikemungkinan ribosom untuk menempel dan melakukan translasi.P e m r o s e s a n rRNA dan tRNAMolekul r R N A yang dihasilkan pada prokaryot maupun eukaryot pada awalnyaberupa prekursor yang berukuran lebih panjang dari molekul yang matang. Sebagaicontoh, pada mamalia, dihasilkan prekursor r R N A berukuran 45S yang sesungguh-nya terdiri atas struktur yang lebih kecil yaitu 28S, IBS, dan 5,8S. Nukleotida dia n t a r a u n i t - u n i t y a n g lebih kecil t e r s e b u t h a r u s d i p o t o n g (diproses) u n t u k m e n g -hasilkan unit-unit fungsional yang lebih kecil. Perlu diperhatikan bahwa pemrosesanp r e k u r s o r r R N A y a n g d i m a k s u d d i s i n i b u k a n l a h splicing k a r e n a splicing a d a l a hproses pemotongan intron yang ada di dalam struktur internal transkrip dandiikuti oleh penyambungan ekson. Pada pemrosesan p r e k u r s o r r R N A semacami n i tidak a d a p e n y a m b u n g a n k e m b a l i m o l e k u l - m o l e k u l r R N A y a n g s u d a h d i p o t o n gkarena masing-masing unit yang dihasilkan adalah unit independen.

Bab 10 Sistem Transkripsi pada Eukaryot 195 Selain r R N A , molekul t R N A juga disintesis dalam bentuk prekursor Padaprokaryot, prekursor tersebut dapat terdiri atas satu t R N A atau lebih, ataukadang-kadang bercampur dengan rRNA. Untuk m e m o t o n g prekursor yang terdiriatas lebih dari satu t R N A atau campuran t R N A d a nr R N A pada prokaryotdiperlukan aktivitas e n z i m R N a s e III. Setelah dipotong, t R N A masih mengandungbeberapa nukleodda pada ujung 5' maupun 3'. Demikian pula pada eukaryot,ujung-ujung 5' dan 3' pada prekursor t R N A mengandung beberapa nukleodda.Nukleotida tambahan yang ada pada ujung 5' pada prekursor t R N A prokaryotmaupun eukaryot akan dipotong oleh enzim RNase R sedangkan ujung 3'-nyaakan diproses dengan enzim RNase D, RNase BN, RNase T , RNase PH, RNaseII, dan p o l i n u k l e o d d a fosforilase (PNPase).P e n y u n t i n g a n RNAS e l a i n f e n o m e n a trans-splicing, pada tripanosoma juga terdapat mekanisme pasca-t r a n s k r i p s i l a i n y a n g a n e h y a n g d i s e b u t s e b a g a i penyuntingan R N A (RNAediting). Pada tahun 1986 R o bBenne dan kawan-kawan menemukan bahwasekuens m R N A s i t o k r o m oksidase II ( C O I I ) pada t r i p a n o s o m a t e r n y a t a d d a ksesuai dengan sekuens gen yang mengkodenya. Sekuens m R N A C O I I diketahuimengandung empat nukleotida yang tidak terdapat pada gen C O I I yang ada did a l a m kinetoplast ( s e m a c a m m i t o k o n d r i a yang m e n g a n d u n g dua D N A lingkary a n g t e r i k a t b e r s a m a m e n j a d i s t r u k t u r catenarie). K e d a d a a n k e e m p a t n u k l e o d d atersebut pada gen COII nampaknya dapat menyebabkan terjadinya mutasi per-g e s e r a n p o l a b a c a (framesiiift) y a n g d a p a t m e n y e b a b k a n g e n m e n j a d i t i d a k a k t i f .Meskipun demikian, m R N A yang dihasilkan ternyata mengandung empat nukleotidat e r s e b u t s e h i n g g a tidak t e r j a d i p e r g e s e r a n p o l a b a c a . R o b B e n n e b e r k e s i m p u l a nb a h w a m R N A t r i p a n o s o m a t e r s e b u t d i k o p i d a r i s u a t u g e n y a n g tidak l e n g k a p ,d i s e b u t sebagai cryptogene, k e m u d i a n d i s u n t i n g lagi d e n g a n m e n a m b a h k a n e m p a tn u k l e o t i d a y a n g k e s e m u a n y a a d a l a h uridine.Penelitian-penelitian berikutnya membuktikan bahwa penyuntingan m R N Amemang fenomena u m u m pada tripanosoma. Bahkan, beberapa m R N A disuntings e c a r a s a n g a t e k s t e n s i f , m i s a l n y a s e k u e n s m R N A C O I N Trypanosonna bruceis e p a n j a n g 7 3 1 n u k l e o t i d a m e n g a n d u n g 4 0 7 uridine ( U ) y a n g d i t a m b a h k a n m e l a l u iproses penyuntingan. Selain penambahan, penyuntingan pada m R N A C O I N jugam e n g h i l a n g k a n 1 9 uridine y a n g d i k o d e . F e n o m e n a p e n y u n t i n g a n t e r s e b u t d i k e t a h u iselalu terjadi pada ujung 3' dan tidak ada pada ujung 5' dengan orientasi 3 ' ^ 5 ' .Penyuntingan tersebut diketahui dilakukan oleh suatu molekul R N A yang disebuts e b a g a i guide RNA ( g R N A ) . M o l e k u l g R N A t e r s e b u t b e r h i b r i d i s a s i d e n g a nb a g i a n m R N A y a n g tidak d i e d i t d a n m e n y e d i a k a n n u k l e o t i d a A d a n G s e b a g a icetakan untuk penggabungan nukleotida U yang tidak ada pada m R N A . Kadang-k a d a n g g R N A tidak m e m p u n y a i A a t a u G y a n g d a p a t b e r p a s a n g a n d e n g a n U p a d am R N A sehingga nukleotida tersebut dihilangkan menggunakan enzim eksonuklease.

196 Biologi Molekular Soal-soal1. Jelaskan perbedaan kelas gen pada eukaryot.Apa perbedaannya dengan yang ada pada prokaryot?2 Gambarkan secara skematis struktur gen kelas I pada eukaryot. Jelaskan perbedaannya dengan gen kelas II.3. Jelaskan bagaimana p e r b e d a a n fungsi ketiga m a c a m R N A p o l i m e r a s e pada e u k a r y o t dapat d i k e t a h u i .4. G a m b a r k a n secara skematis m e k a n i s m e inisiasi transkripsi gen kelas II.5. K o t a k T A T A m e m p u n y a i p e r a n a n sangat p e n t i n g d a l a m m e n g a r a h k a n R N A p o l i m e r a s e II k e p r o m o t e r Jelaskan bagaimana mekanisme penempelan R N A polimerase II pada gen yang tidak mempunyai kotak TATA.& J e l a s k a n p r o s e s a p a saja y a n g b e r l a n g s u n g p a s c a t r a n s k r i p s i . A p a p e r b e d a a n a n t a r a R N A splicing d e n g a n R N A editing?7. Jelaskan perbedaan pemrosesan prekursor r R N A dengan pemrosesan prekursor m R N A pada eukaryot.