Bab 07. Genetika Mikroba

Genetika Mikroba pBABIlmu pengetahuan genetika mendefinisikan dan menganalisis diselipkan ke dalam plasmid. Gen dapat ditempatkan dihereditas, atau ketetapan dan perubahan dalam susunan bawah kendali promotor bakteri ekspresi-tinggi yangfungsi fisiologis yang sangat besar yang membentuk sifat-sifat memungkinkan protein yang, disandi untuk diekspresikan pada tingkat yang semakin tinggi. Genetika bakteri telahorganisme. Satuan dasar hereditas adalah gen, suatu segmen membantu perkembangan rekayasa genetik tidak hanya padaasam deoksiribonukleat (DNA) yang menyandi informasisekuens nukleotidanya untuk sifat fisiologis yang spesifik. prokariota, tetapi juga eukariota. Teknologi ini berperanPendekatan tradisional dalam genetika adalah denganmengidentifikasi gen berdasarkan pengaruhnya pada fenotip, dalam kemajuan yang luar biasa pada bidang kedokteran yangatau sifat struktural dan fisiologis secara keseluruhan pada dicapai saat ini.makhluk hidup. Sifat fenotip, seperti warna mata padamanusia atau resistensi antibiotik pada bakteri, secara umum susuru*ru €Eildapat diamati pada tingkatan mahluk hidup tersebut. Dasarkimia untuk variasi fenotip adalah perubahan dari genotip, Struktur DNA & RNAatau perubahan dalam urutan DNA, di dalam suatu gen atau Informasi genetik pada bakteri disimpan dalam bentukdi dalam susunan gen. sekuens basa DNA (Gambar 7-2). Pada bakteriofaga dan DNA sebagai elemen fundamental hereditas diperkenal- virus, informasi genetik disimpan dalam bentuk sekuens asam ribonukleat (RNA) (Bab 29). Sebagian besar molekulkan pada tahun I 930an dari suatu percobaan yang mempunyai DNA berupa untaian ganda, dengan basa komplementer (A-T; G-C) dipasangkan melaiui ikatan hidrogen pada bagiankemungkinan berkembang di masa depan, yang diiakukan pusat molekul. (Gambar 7-3). Orientasi dua untaian DNAoleh Frederick Griffith. Dalam percobaan ini (Gambar 7-1), adalah antiparalel: Satu untaian secara kimia berorientasiStreptococcus pneumoniae tipe III-S (memiliki kapsul) virulenyang telah dimatikan, jika disuntikkan ke tikus bersamaan dalam arah 5')3i dan untaian komplemennya dalam arahdengan pneumokok tipe II-R non virulen (tidak memiliki 3')51 Sifat komplementer basa ini memungkinkan untaiankapsul), akan mengakibatkan suatu infeksi yang mematikan yang satu (untaian patron) menyediakan informasi untukakibat viabilitas pneumokok tipe III-S dipulihkan. Implikasi- penggandaan atau ekspresi informasi pada untaian lainnya (untaian penyandi). Pasangan basa disusun di dalam pusatnya adalah beberapa senyawa kimia mengubah galur heliks ganda DNA (Gambar 7-2), dan mereka menentukan informasi genetiknya. Setiap putaran pada heliks mempunyainonvirulen yang hidup menjadi fenotip virulen. Beberapa satu lekukan mayor dan satu lekukan minor. Banyak proteinpuluh tahun kemudian, Avery, Macleod dan McCartymenemukan bahwa DNA merupakan agen transformasi dengan kapasitas untukmengikat DNA dan mengatur ekspresi gen berinteraksi terutama dengan lekukan mayor, tempattersebut yang memberikan dasar pengertian tentang biologi atom yang berisi basa lebih terpapar. Masing-masing keempatmolekuler yang kita pahami saat ini. Penelitian selanjutnya basa terikat pada fosfo-2'-deoksiribosa membentuk suatudengan bakteri tnengungkapkan adanya enzim restriksi, nukleotida. Sumbu utama fosfodiester bermuatan negatif DNA menghadap ke pelarut. Panjang suatu molekul DNAprotein yang memecahkan DNA pada tempat spesifik, biasanya diekspresikan dalam ribuan pasang basa, ataumenghasilkan fragmen restriksi DNA. Plasmid diidentifikasi pasangan kilobasa (kilobase pairs, kbp). Suatu virus kecil mungkin mengandung suatu molekul DNA tunggal yangsebagai elemen genetik kecil yang membawa gen dan mampu kurang dari 0,5 kbp, sedangkan genom DNA tunggal yang menyandi Escherichia coli leblh besar dari 4.000 kbp. Padabereplikasi secara bebas di dalam bakteri dan ragi. Masuknya kedua keadaan tersebut, setiap pasang basa dipisahkan darifragmen restriksi DNA ke dalam suatu plasmid memungkin- pasangan selanjutnya dengan jarak kira-kira 0,34 nm , aIaLt 3,4kan fragmen tersebut melakukan amplifikasi. Amplifikasibagian spesifik DNA juga dapat diperoleh dengan enzimbakteri menggunakan reaksi rantai polimerase (polimerasechain reaction-PcR) atau metode amplifikasi asam nukleatberbasis-enzim lainnya. DNA hasil amplifikasi dari sumberini dan dicerna dengan enzim restriksi yang tepat, dapat r00

BAB 7 .i. Genetika Mikroba 10rEksperimen A Tikus ------> Tikus mati ,-\ lnjeksi \yt,*'I/;\ t\"*L \-\-------*. )Galur A hidup berkapsulEksperimen B ritrt *rikushiduP /,-.\ ll:-' (\\t1yH/ )Galur A mati berkapsulEksperimen C lnjeksi Tikus ----------> Tikus hiduP f1 ,.'--\ i:Galur B hidup tidak berkapsulEksperimen D tljtktl --* Tikus mati lsolasi bakteri hidup dari tikus (I/H,A|),+1H\ rikusi.;\, = + yang mati s7 L*j Galur B hidupGalur B mati tidak berkapsul @ - Pneumokokberkapsul berkapsulGAMBAR 7-.1 Eksperimen Griffith membuktikan adanya suatu faktor transformasi yang selanjutnya dikenal sebagai DNA. Dalam suatuserial eksperimen, tikus disuntikan dengan Streptococcus pneumoniae yang hidup atau mati, berkapsul atau tidak berkapsul, sepertitampak pada eksperimen A sampai D. Kunci eksperimen adalah eksperimen D yang memperlihatkan bahwa bakteri mati berkapsul dapatmensupiai suatu iaktor yang memu ngkinkan bakteri tidak berkapsul untuk membunuh tikus. Selain menunjukkan faktor kunci pentingnyakapsul bagi virulensi pneumokokus, eksperimen D juga menggambarkan prinsip DNA sebagai dasar yang fundamental untuk transformasigenetik. (bikutip atas izin dari Mietner & WcClane, Microbial Pathogenesis: A Principles-oriented Approach, Fence Creek Publishing,1999).x 10-7 mm sehingga panjang total kromosom E' coli lebih yang membentuk-untaian, dengan hasil molekul RNA untai-kurang I mm. Karena dimensi keseluruhan sel bakteri kira- tunggal diasumsikan suatu struktur padat yang mampukira 1.000-kali lipat lebih kecil daripada panjangnya, sejumlah mengekspresikan informasi genetik yang terdapat di dalamdasar lipatan, atar supercoiling, terbukti berperan atas DNA.struktur fisik molekul secara in vivo' Fungsi paling umumRNA adalah komunikasi sekuens gen RNA pating sering terdapat dalam bentuk untaian- DNA dalam bentuk messengerRNA (mRNA) ke ribosom.tunggal. Basa urasil (U) menggantikan timin (T) dalam DNA Proses ini dikenal sebagai transkripsi dan translasi mRNAsehingga basa komplementer yang menentukan strukturRNA ditranskripsikan sebagai komplemen RNA ke untaian DNA pengkode. mRNA ini kemudian ditranslasi oleh ribosom'adalah A-U dan C-G. Struktur keseluruhan molekul RNA Ribosom yang mengandung kedua ribosomal RNA (rRNA)untai-tunggal ditentukan oleh pasangan basa di dalam lup

L02 BAGIAN I * Dasar-DasarMikrobiologi Ca H 5 a o // J N-H-- ------O ,\ (dR)E H+ Tulang punggung GAMBAR 7-3 Pasangan basa normal pada DNA. Atas: pasangan-PE gu la-fosfat adenin-timidin (A-T); bawah: pasangan guanin-sitosin (G-C). lkatan hidrogen ditandai oleh garis putus-putus. perhatikan6C bahwa pasangan G-C mempunyaitiga ikatan hidrogen, sedangkan pasangan A-T hanya mempunyai dua ikatan. Akibatnya, interaksi5 G-C lebih kuat daripada interaksi A-T. (dn- deoksiribosa pada tulang punggung DNA gula-fosfat.) -coll w6;{,tfsfidi ccEli rRNA #K?T'F -,JreD =l JO] 235 5S 165 (2,e kb) (0,12 kb) (1,s4 kb) Protein 31 (11- 131) 21 (S1-521)GAMBAR 7-2 Gambar skematik struktur DNA Watson-Crick, oSubunlt I *memperlihatkan tulang punggung gula-fosfat heliks pada dua I @untaian yang terikat bersama oleh ikatan hidrogen antara basa-basanya. (Diproduksi ulang atas izin dari Snyder L, Champness W:2002.)Molecular Genetics of Bacteria,2\"d ed. ASM Press,dan protein, mentranslasikan perintah ini ke dalam struktur \primer protein melalui aminoasil-transferRNA (tRNA).Molekul RNA bervariasi dalam ukurannya, dari tRNA kecil, GAMBAR 7-4 Komposisi suatu ribosom terdiri dari satu salinanyang mengandung kurang dari 100 basa sampai mRNA yang untuk masing-masing RNA 165, 235, dan 5S dan juga banyakmungkin membawa perintah genetik hingga beberapa ribubasa. Ribosom bakteri mengandung tiga jenis IRNA, dengan protein. Protein subunit 50S yang besar ditandai L1 sampai L3i,ukuran berturutrturut 120, 1.540 dan 2.900 basa dan sejumlahprotein (Gambar 7-4). Molekul rRNA yang setara pada Protein subunit 30S yang kecil ditandai S l sampai 521. (Digambarribosom eukariota biasanya lebih besar. Kepentingan ekspresi ulang atas izin dari Snyder L, Champness W; Molecular Genetics of Bacteria, 2\"d ed., ASM Press, 2002.)

BAB 7 * Genetika Mikroba 103gen individual berubah sesuai tuntutan fisiologis, dan berulang (STR) terdapat pada beberapa hingga ribuan saiinan tersebar sepanjang genom. Adanya SSR dan STR prokariotakebutuhan akan ekspresi gen yang fleksibel tercermin dalam tercatat dengan baik, dan beberapa memperiihatkan poli-perputaran metabolisme yang cepat pada sebagian besar morfisme panjangyang sangatbanyak. Variasi ini diperkirakan disebabkan oleh pemasangan untaian yang meleset dannRNA. Di lain pihak, IRNA dan rRNA-yang berkaitan merupakan prasyarat penting bagi variasi dan adaptasi fasedengan fungsi sintesis protein yang diperlukan secara bakteri. Banyak gen eukariota diseia oleh intron, sekuensuniversai-cenderung stabil dan bersamaan mencakup lebihdarig5o/o total RNA pada sel bakteri. Sebagian kecil molekul intervensi DNA yang hilang pada mRNA yang diproses ketikaRNA tampak berfungsi sebagai enzim (ribozim). Misalnya,RNA 23S pada subunit ribosom 50S (Gambar 7-4) mengatalisis ditranslasi. Intron telah diamati pada gen arkaebakteri, tetapi.pembentukan ikatan peptida selama sintesis protein. Akhir- dengan sedikit pengecualian yang jarang, tidak ditemukanakhir ini, suatu golongan baru molekul RNA yang dinamakan pada eubakteri (lihat Tabel 3-3).small interferiag RNA (siRNA) didapatkan pada tanaman. Genom ProkariotasiRNA merupakan molekul RNA untai-ganda, dengan Sebagian besar gen prokariota diteruskan oleh kromosompanjang 20-25 nukleotida yang mempunyai berbagai perandalam fungsi biologi. Beberapa perannya menunjukkan fungsi bakteri. Terdapat sedikit pengecualian, gen bakteri memilikisebagai regulator, baikmelalui pengikatan dekat dengan ujung sifat haploid. Data sekuens genom lebih dari 340 genom5' mRNA, mencegah ribosom mentranslasi perintah itu, mikroba memperlihatkan bahwa sebagian besar genomataupun memasangkan basa secara langsung dengan suatu prokariota (>90%) terdiri dari suatu molekul DNA sirkuleruntaian DNA yang dekat promotor, mencegah transkripsi' tunggal yang mengandung DNA sebanyak 580 kbp hinggaGenom Eukariotik lebih dari 5.220kbp. (Tabel 7- l). Sebagian kecil bakteri (misal:Genom adalah keseluruhan informasi genetik pada suatumakhluk hidup. Hampir semua genom eukariotik dibawakan Brucella melitensis, Burkholderia pseudomallei, dan Vibriooleh dua atau lebih kromosom linier yang dipisahkan darisitoplasma di dalam membran nukleus. Sel eukariotik diploid cholerae) mempunyai genom yang terdiri dari dua molekulterdiri dari dua homolog (salinan evolusioner divergen) padasetiap kromosom. Mutasi atau perubahan genetik, sering DNA sirkuler. Banyak bakteri yang mengandung gentidak dapat dideteksi pada sel diploid karena peranan satusalinan gen mengompensasi perubahan fungsi homolognya. tambahan pada plasmid yang berukuran dari beberapa kbpSuatu gen yang tidak mencapai ekspresi fenotipik dengankeberadaan homolognya disebut resesif, sedangkan suatu gen hingga 100 kbp.yang menutupi efek homolognya disebut dominan. Efekmutasi paling mudah dibedakan pada sel haploid yang hanya Lingkar DNA yang terikat secara kovalen (kromosom danmembawa salinan tunggal pada sebagian besar gen' Sel ragi(yang merupakan eukariotik) sering kali diteliti karena sel-sel plasmid bakteri), yang mengandung informasi genetik yangini dapat dipertahankan dan dianalisis dalam keadaan dibutuhkan untuk replikasinya sendiri, disebut replikon.haploid. Karena prokariota tidak memiliki nukleus, tidak ada membran Sel eukariota mempunyai mitokondria dan pada beberapa yang memisahkan gen bakteri dari sitoplasma, seperti yangkasus mempunyai kloroplas. Di dalam tiap organel-organel terdapat pada eukariota.ini terdapat molekul sirkuler DNA yang mengandung Beberapa spesies bakteri efisien dalam menimbulkanbeberapa gen yang fungsinya berkaitan dengan organel penyakit pada organisme yang tingkatannya lebih tinggi,tertentu. Namun, sebagian besar gen yang berkaitan denganfungsi organel terdapat dalam kromosom eukariota. Banyak karena mereka mempunyai gen spesifik penentu patogenik.sel ragi mempunyai elemen genetik tambahan berupa suatulingkaran 2 ;rm yang bereplikasi secara independen yang Gen ini sering berkelompok bersama di dalam DNA danmengandung sekitar 6,3 kbp DNA. Lingkaran kecil DNA dikenal sebagai pulau patogenisitas. Segmen gen ini dapatseperti ini dinamakan plasmid, sering ditemukan pada berukuran cukup besar (hingga 200 kbp) dan menyandigenetik prokariota. Ukuran plasmid yang kecil ini membuat sekumpulan gen virulen. Pulau patogenisitas (1) mempunyaiplasmid dapat dimanipulasi genetik, dan sesudah terjadiperubahan, plasmid dapat dimasukkan ke dalam sel. Oleh isi G+C yangberbeda dibanding genom lainnya, (2) kromosomsebab itu, plasmid lazim digunakan dalam rekayasa genetik' berkaitan erat dengan gen tRNA, (3) diapit oleh pengulangan DNA repetitif yang terdapat dalam jumlah besar pada seleukariota, makin banyak ditemukan pada prokariota. Pada langsung, dan (4) mengandung beragam gen yang pentinggenom eukariotik, DNA repetitif jarang berkaitan denganregio penyandi dan terutama terletak pada regio ekstragenik' untukpatogeiesis-termasuk adhesin, invasin, dan eksotoksinSekuens-pendek berulang (SSR) atau sekuens ganda pendek -seperti juga yang ikut terlibat dalam mobilisasi. (sering Gen yang penting untuk pertumbuhan bakteri disebut sebagai \"housekeeping genes\") diteruskan oleh kromosom dan plasmid yang membawa gen yang berkaitan dengan fungsi khusus (Tabe|7-2). Banyak plasmid menyandi gen yang memperantarai perpindahannya dari satu organisme ke yang lainnya, seperti juga gen lainnya yang berkaitan dengan perolehan genetik atau pengaturan kembali DNA. Oleh sebab itu, gen dengan asai usul evolusi yang independen dapat diterima oleh plasmid yang tersebar luas di antara populasi bakteri. Konsekuensi kejadian genetik seperti ini tampak pada penyebaran cepat pada populasi bakteri resisten terhadap antibiotik yang diperantarai oleh plasmid setelah penggunaan bebas antibiotik di rumah sakit.

104 BAGIAN I * Dasar-Dasar Mikrobiologi Transposon adalah elemen genetik yang mengandung Kepala (terdapat Kepalabeberapa gen, termasuk yang dibutuhkan untuk migrasi dari asam nukleat) kosongsatu lokus genetik ke yang lainnya. Dalam melakukan hal ini, lnti cekungan Sarungtransposon menimbulkan mutasi insersi. Keterlibatan Sarung (memendek)transposon yang reiatif pendek (panjang 0,75-2,0 kbp), (meluas) Serabut ekordisebut elemen insersi, menghasilkan sebagian besar mutasi Lempeng dasarinsersi. Elemen insersi ini (juga dikenal sebagai elemen GAMBAR 7-5 Gambar faga T2 dengan atau tanpa asam nukleat.sekuens insersi [IS]) hanya membawa gen untuk enzim yang Perhatikan bahwa ketika faga dimuati dengan asam nukleat, fagadibutuhkan untuk meningkatkan transportasinya sendiri ke tersebut memperlihatkan bentuk yang berbeda dibandingkanlokus genetik lainnya, tetapi tidak dapat bereplikasi sendiri. ketika tidak terdapat asam nukleat. Diagram ini digambar ulangHampir semua bakteri membawa elemen IS, dengan setiap dari pengamatan mikroskop elektron.spesies membawa sifat khasnya masing-masing. Elemen ISterkait kadang-kadang dapat dijumpai pada bakteri yang untai-tunggal, atau DNA untai-tunggal. Basa yang tidakberbeda, menunjukkan bahwa pada beberapa titik evolusi, umum, seperti hidroksimetilsitosin kadang-kadang dijumpaimereka telah menembus barier spesies. Plasmid juga pada asam nukleat faga. Bakteriofaga memperlihatkan variasi morfologi yang luas. Banyak faga mempunyai struktur khususmembawa elemen IS yang penting dalam pembentukan galur yang menyerupai alat suntik (ekor) yang terikat pada reseptorrekombinan frekuensi-tinggi (Hfr) (lihat di bawah). Trans- di permukaan sel dan memasukkan asam nukleat faga keposon kompleks membawa gen dengan fungsi khusus, seperti dalam sel pejamu (Gambar 7-5); faga lainnya tampak kubus,resisitensi antibiotik dan diapit oleh sekuens insersi. Tidak filamentosa atau pleomorfik.seperti plasmid, transposon tidak mengandung informasi Faga dapat dibedakan berdasarkan cara perkembanggenetikyang dibutuhkan untukreplikasinya sendiri. Pemilihan biakkannya. Faga litik menghasilkan banyak salinan dirinyatransposon tergantung dari replikasinya sebagai bagian dari dengan cara membunuh sel pejamunya. Faga litik yang palingsuatu replikon. Deteksi atau eksploitasi genetik transposondiperoleh dari pemilihan informasi genetik khusus (secara menyeluruh dipelajari, faga T-even (misal, T2, T4) pada E. coll, memperlihatkan perlunya waktu yang tepat untuknormal, resistensi terhadap suatu antibiotik) yang di- ekspresi gen virus, dengan tujuan mengoordinasi kejadian yang berkaitan dengan pembentukan faga. Faga temperate,bawanya. dapat memasuki keadaaan profaga non-litik, yaitu ketika replikasi dari asam nukleatnya dihubungkan dengan replikasiGenom Virus DNA sel pejamu. Bakteri yang membawa profaga dinamakan lisogenik karena sinyal fisiologis dapat mencetuskan siklusVirus mampu bertahan hidup, tetapi tidak tumbuh tanpa Iitik yang berakibat pada kematian sel pejamu dan pelepasanadanya sel pejamu. Repiikasi genom virus tergantung dari banyak salinan faga. Faga temperateyang memiliki sifat palingenergi metabolik dan perlengkapan sintetik makromolekui khas adalah faga l. (lambda) E. coli. Gen yang menentukanpejamunya. Sering kali, bentuk parasitisme genetik ini respon litik atau lisogenikterhadap infeksi l, telah diidentifikasimengakibatkan kelemahan atau kematian sel pejamu. OIeh dan interaksi kompleksnya ditelusuri hingga detail.sebab itu, pertambahan jumlah virus yang berhasil me-merlukan (1) bentuk yang stabil yang memungkinkan virus Faga filamentosa, contohnya faga M13 E. coli yangtelahbertahan hidup tanpa adanya pejamu, (2) suatu mekanisme diteliti hingga mendalam, memiliki pengecualian pada bebe-untuk menginvasi sel pejamu, (3) informasi genetik yang rapa hal. Filamennya mengandung DNA untai-tunggal yangdibutuhkan untuk replikasi komponen virus didalam sel, dan terdiri dari banyak protein dan menonjol dari pejamunya,(4) informasi timbahan yang mungkin diperlukan untuk menyebabkan pejamunya lemah, tetapi tidak mati oleh infeksi faga. Rekayasa DNA faga M13 menghasilkan untaian tunggalmembungkus komponen virus dan melepaskan hasil yang merupakan sumber berharga untuk analisis dan mani- pulasi DNA.replikasinya dari sel pejamu. REPLIKASI Pembedaan sering kali dibuat antara virus yang berkaitandengan eukariota'dan virus yang berkaitan dengan prokariota, DNA untai-ganda disintesis oleh replikasi semikonservatif.yang selanjutnya disebut bakteriofaga atau faga. Dengan Ketika dupleks induk terurai, masing-masing untaian ber- peran sebagai cetakan (yaitu sumber informasi sekuens)lebih dari 5.000 isolat morfologi yang dikenal, faga merupakankelompok terbesar di antara semua kelompok virus. Sebagianbesar pengertian kita tentang virus-kenyataannya, banyakkonsep dasar daribiologi molekuler-diperoleh dari penelitianbakteriofaga, dan kelompok virus inilah ,r'ang e1-ibahas dalambab ini. Bakteriofaga terdapat pada lebih dari 140 genus bakteridan pada banyak habitat yang beriainan. Molekul asamnukleat bakteriofaga dikelilingi oleh suatu lapisan protein.Beberapa faga jrga mengandung lipid. Asam nukleat padafaga cukup banyak bervariasi. Banyak faga yang memilikiDNA untai-ganda; Iainnya memiliki RNA untai-ganda, RNA

BAB 7 * Genetika Mikroba 105TABEL 7-1 Perbandingan Ukuran Genom pada TABEL 7-2 Contoh dari Aktivitas Metabolik yangProkariota, Bakteriofaga, dan Virus Terpilih Ditentukan oleh Plasmid 'ftqni$me Ultqran lil.rir'rili r|lii u {kbbJr i Pseudomonas sp. Degradasi kamfer, toluena, oktana, asam salisilatProkariotaArchae Met ha n oco ccu s j a n n aschi i 1 660 Eaci I I u s stearot herm oph i I u s o-Amilase Arch a eogl obu s fu lg i du s 2',180 Alcaligenes eutrophus Penggunaan H, sebagai sumber energi yang dapat dioksidasiEubakteria Mycoplasma genitalium 580 Mycoplasma pneumoniae 820 Borrelia burqdorferi 910 Escherichia coli Ambilan dan metabolisme Chlamydia trachomotis 1 040 sukrosa, ambilan sitrat Rickettsia prowazekii 1112 Treponema pallidum 1 140 Klebsiello sp. Fiksasi nitrogen Chlamydia pneumoniae 1230 Helicobacter pylori 1670 Streptococcus (grup N) Penggunaan laktosa, sistem Haemophilus influenzae 1 830 gala ktosa fosfotra nsferase, Fra n ci se I I a t u I are n s i s '1893 iretabolisme sitrat Coxiella burnetii Neisseria meningitldes serogrup A 1995 Rhodospirillum rubrum Sintesis dari pigment Neisserio meningitides serogrup B 21 80 fotosi nteti k Brucella melitensisn 2270 M ycob acter i u m tu bercu I osi s 2117 + 1178 Flavobacterium sp. Degradasi nilon Escherichia coli 4410 Bacillus anthracis 4640 mempertahankan struktur kromosom suatu spesies. Sering Bu rkh old e ri a pseu d om a I I ei 5227 kali sel haploid adalah gamet. Pembentukan gamet yang 4126 + 3182 diikuti oleh peleburan sehingga membentuk zigot diploidBakteriofaga Lambda 48 adalah sumber primer dari variabilitas genetik melaluiVirus Ebola 19 rekombinasi pada eukariota. Variola mayor 186 Vaccinia 192 DNA Bakteri Sitomegalovirus 229 Bakteri kekurangan segala sesuatu yang menyerupai struktur\"Organisme dengan dua kromosom sirkuler yang berbeda. kompleks yang berkaltan dengan pemisahan kromosom eukariota menjadi nukleus anak yang berbeda. Replikasiuntuk replikasi DNA. Untalan baru terbentuk dengan basa-basa dalam susunan yang komplementer terhadap untaian DNA bakteri dimulai dari satu titik dan bergerak ke keduayang sudah ada. Ketika sintesis sudah lengkap, masing-masing arah (yaitu replikasi bidireksional). Pada proses ini, keduamolekul anak mengandung satu untaian induk dan satu untaian DNA yang lama terpisah dan digunakan sebagaiuntaian yang baru dibentuk. cetakan untuk menyintesis untaian baru (replikasiDNA EukariotaReplikasi DNA eukariota dimulai pada beberapa titik per- semikonservatif). Struktur ketika kedua untaian terpisah dar-r sintesis yang baru terbentuk dlkenal sebagai garpu replikasi.tumbuhan sepanjang kromosom linier. Replikasi ujung akhir Replikasi kromosom bakteri dikontrol secara ketat, dan jumlah setiap kromosom (jika terdapat lebih dari satu) perkromosom linier yang akurat membutuhkan aktivitas jumlah sel yang bertumbuh berada di antara satu dan empat. Beberapa plasmid bakteri dapat n.rempunyai salinan hinggaenzimatis yang berbeda dari fungsi normal yang berkaitan sebanyak 30 buah di dalam satu se1 bakteri, dan mutasi yangdengan replikasi DNA. Aktivitas ini dapat melibatkan telomer, menyebabkan pengenduran kontrol replikasi plasmid dapatsekuens DNA yang khusus (terdapat pada ujung akhir menghasilkan jumlah salinan yang lebih banyak lagi.kromosom eukariota) yang tampaknya berkaitan denganreplikasi ujung akhir kromosom yang akurat. Eukariota sudah Replikasi DNA bakteri beruntai-ganda yang sirkulerberevolusi membentuk perlengkapan khusus yang disebut dimulai dari lokus ori dan melibatkan interaksi denganspindle, yang menarik kromosom anak ke dalam nuldeusterpisah yang baru terbentuk melalui proses mitosis. beberapa protein. Pada E. coll, replikasi kromosom berakhirPembelahan nukleus lebih lanjut melalui meiosis membagidua jumlah kromosom sel diploid membentuk sel haploid. pada daerah yang disebut fer. Lokasi original (ori) danPemisahan kromosom yang akurat selama pembelahanreduktif pada meiosis merupakan faktor yang penting dalam terminal (rer) untuk replikasi terletak pada titik yang berlawanan pada kromosom DNA sirkuler. Kedua kromosort anak terpisah atau putus sebelum pembelahan sel sehingga setiap progeni mendapat satu DNA anak. Ha1 ini diselesaikan dengan bantuan rekombinasi dan topoisomerase, enzim yang mengubah gulungan super DNA untai-ganda. (Pada

106 BAGIAN I i. Dasar-Dasar Mikrobiologigulungan super, molekul DNA menggulung seperti kabel Faga ssRNA adalah satu partikel ekstraseluler terkecil yang mengandung informasi yang memungkinkan replikasitelepon, yang akan memendekkan molekul.) Topoisomerase dirinya sendiri. RNA faga MS2, misalnya, mengandungbekerja dengan cara memotong sementara satu atau kedua (kurang dari 4.000 nukleotida) tiga gen yang dapat bertindak sebagai mRNA sesudah terjadi infeksi. Satu gen mengodeuntaian DNA untuk mengendurkan gulungan dan me- protein pelapis, dan lainnya mengode polimerase RNA yangmanjangkan molekul DNA. Karena topoisomerase bakteri membentuk suatu bentuk replikatif dsRNA. ssRNA yangpenting dan unik, enzim ini dijadikan target antibiotik (misal, dihasilkan dari bentuk replikatif adalah inti partikel infektif baru. Mekanisme pertambahan jumiah bakteriofaga RNAfluorokuinolon). Proses yang serupa terjadi pada replikasi melalui intermediasi RNA berbeda jauh dengan pertambahanDNA plasmid, kecuali pada beberapa kasus replikasi bersifat jumlah retrovirus, virus RNA hewan yang memakai RNAunidireksional (satu arah). sebagai cetakan untuk sintesis DNA.Transposon Beberapa bakteriofaga temperate, dicontohkan oleh faga Pl E. coli dapat bertahan dalam suatu keadaan profaga sebagaiTransposon tidak membawa informasi genetik yang di- plasmid. dsDNA bakteriofaga temperate lainnya bertahanbutuhkan untuk menggandakan replikasinya sendiri hingga sebagai suatu profaga melalui insersinya ke dalam kromosompembelahan sel, dan oleh sebab itu pertambahan jumlahnyatergantung dari penggabungan fisiknya dengan replikon pejamu. Tempat insersi dapat cukup spesifik, sepertibakteri. Penggabungan ini dibantu perkembangannya oleh dicontohkan pada penggabungan faga X E. coli di lokus lnfenzim yang memberikan kemampuan kepada transposon tunggal kromosom bakteri. Spesifisitas penggabunganuntuk membentuk salinan dirinya; enzim ini memungkinkan ditentukan oleh identitas sekuens DNA bersama oleh iokustransposon untuk bergabung ke dalam replikon yang sama kromosom int dan regio yang sesuai pada genom faga. Fagaatau replikon bebas. Spesifisitas sekuens pada tempat insersi temperate lainnya, seperti faga Mt E. coli, bergabung dalamumumnya rendah sehingga transposon sering tampak kisaran lokasi kromosom yang luas dan dalam hal inimelakukan insersi dalam poia yang acak, tetapi transposon menyerupai transposon.cenderung membantu regio yang mengode IRNA. Banyak Profaga mengandung gen yang dibutuhkan untuk replikasiplasmid dipindahkan di antara sel bakteri, dan insersi Iitik. (disebut juga replikasi vegetatif), dan ekspresi gen-gentransposon ke dalam suatu plasmid merupakan kendaraanyang membawa penyebaran transposon pada suatu populasi tersebut ditekan selama masa pemeliharaan bentuk profaga.bakteri. Manifestasi represi pada profaga yang terbentuk sering berupaFaga imunitas seluler melawan infeksi litik yang disebabkan olehBakteriofaga memperlihatkan keanekaragaman yang tinggi faga yang serupa. Rangkaian interaksi molekuler mencetuskanpada sifat asam nukleatnya, dan keanekaragaman ini tercerminpada cara replikasi yang berbeda. Strategi pertambahan derepresi (pelepasan dari represi) sehingga profaga yangjumlah yang berbeda secara mendasar diperlihatkan oleh faga mengalami replikasi vegetatif, menyebabkan pembentukan ledakan partikel infeksius. Stimulus buatan, seperti sinarlitik dan faga temperate. Faga litik menghasilkan banyak ultraviolet dapat menyebabkan derepresi profaga. Peralihansalinan diri mereka sendiri dalam suatu lonjakan tunggal antara lisogenik-pertambahan jumlah genom faga denganpertumbuhan. Faga temperate menetapkan diri mereka pej amu-dan pertumbuhan faga vegetatif dengan penggunaansebagai profaga, baik dengan cara menjadi bagian dari sel dapat ditentukan sebagian melalui keadaan fisiologis sel.replikon yang sudah ada (kromosom atau plasmid), ataupundengan membentuk replikon yang independen. Suatu bakteri yang tidak sedang bereplikasi tidak akan dsDNA pada banyak faga litik berbentuk linier, dan tahap mendukung pertumbuhan vegetatif faga, sebaliknya sel yangpertama replikasinya adalah pembentukan DNA sirkuler. sedang bertumbuh pesat mempunyai cukup energi dan blokProses ini tergantyng dari ujung kohesif, ujung untai-tunggal untuk membangun yang dipakai untuk mendukung replikasikomplemen,pada DNA yang berhibridisasi. Ligasi, pem- faga yang cepat.bentukan ikatan fosfodiester antara ujung DNA 5' dan 3lmenghasilkan DNA sirkuler yang berdekatan secara kovalen, TRANSFER DNAyang dapat mengalami replikasi dengan cara yang serupadengan yang dipakai oleh replikon lainnya. Pemecahan Sifat haploid genom bakteri kemungkinan membatasisirkuier menghasilkan DNA linier yang dikemas di dalamlapisan protein untuk membentuk faga anak. plastisitas genomik bakteri. Namun, keberadaan berbagai ssDNA faga filamentosa dikonversi menjadi bentuk macam bakteri di alam menyediakan penampungan genreplikatif sirkuler untai-ganda. Satu untaian dari bentukreplikatifdigunakan sebagai cetakan dalam suatu proses yang subur yang berperan dalam keanekaragaman genetik yang luar biasa melalui mekanisme pertukaran genetik. Pertukaranterus-menerus yang menghasilkan DNA untai-tunggal. genetik bakteri dicirikan oleh transfer fragmen yang relatif kecil pada genom donor kepada sel resipien diikuti olehCetakannya adalah lingkaran yang bergulung, dan ssDNA rekombinasi genetik. Rekombinasi genetik bakteri agakyang dihasilkannya dipecah dan dikemas dengan protein berbeda dengan fusi gamet yang terlihat pada eukariota; diuntuk ekstrusi ekstraseluler. sini ada syarat bahwa DNA donor direplikasi pada organisme rekombinan. Replikasi dapat diperoleh, baik melalui integrasi

BAB 7 .i. Genetika Mikroba 107DNA donor ke dalam kromosom resipien ataupun melalui disandi oleh DNA integrasi dan paling jelas dicontohkan olehpemantapan DNA donor sebagai replikon yang independen. insersi DNA ke dalam resipien untuk membentuk suatuRestriksi & Pembatasan Lainnya pada salinan transposon donor. Mekanisme rekombinasi yang dimediasi oleh produk genTransfer Gen recbersifat resiprokal: Memasukkan sekuens donor ke dalamEnzim restriksi (endonuklease restriksi) memperlengkapi resipien dicerminkan oleh transfer sekuens resipien homologbakteri dengan suatu mekanisme untuk membedakan antaraDNAnya sendiri dengan DNA dari sumber biologis lainnya. ke dalam DNA donor. Semakin banyak perhatian ilmiah ditujukan pada peran konversi gen-transfer nonresiprokalEnzim ini menghidrolisis (memecah) DNA pada tempat sekuens DNA dari donor ke resipien-dalam perolehanrestriksi yang ditentukan oleh sekuens DNA spesifik berkisar keanekaragaman genetik.antara 4 hingga 13 basa. Fragmen DNA dapat dipersiapkan MekanismeTransfer Gensecara terpilih karena selektivitasnya; ini adalah dasar darirekayasa genetik. Setiap galur bakteri yang memiiliki sistem Komposisi DNA mikroorganisme dapat sangat cair. DNArestriksi juga dapat menyamarkan tempat pengenalan ini di dapat ditransfer dari satu organisme ke yang lainnya, dan DNA dapat digabungkan secara stabil ke dalam reslpien,dalam DNAnya sendiri dengan cara memodifikasinya melalui secara permanen mengubah komposisi genetiknya. Proses inimetilasi residu adenin atau sitosin pada tempat tersebut. disebut transfer gen lateral atau horizontal untuk mem-Sistem restriksi-modifikasi ini digolongkan ke dalam dua bedakannya dari penurunan gen orang tua, suatu Proses yangkelas besar: sistem tipe I, ketika aktivitas restriksi dan disebut penurunan sifat secara vertikal. Tiga mekanisme luasmodifikasi digabungkan dalam protein multisubunit tunggal, memediasi pergerakan DNA antar sel secara efisien-dan sistem tipe II, yang terdiri dari endonuklease dan metilaseyang terpisah. Sebagai akibat biologis langsung dari restriksi konjugasi, transduksi, dan transformasi.dapat berupa pecahnya DNA donor sebelum DNA tersebut Konjugasi memerlukan adanya kontak sel resipien-ke-selsempat menjadi bagian dari replikon rekombinan. Oleh sebabitu, banyak resipien yang digunakan pada rekayasa genetik donor untuk memindahkan hanya satu sekuens DNAmenjadi tidak berfungsi pada gen res yang berkaitan dengan (Gambar 7-6). Resipien melengkapi struktur DNA untai- ganda dengan sintesis galur yang berkomplemen denganrestriksi-modifikasi. Beberapa plasmid memperlihatkan suatu kisaran pejamu gaiur yang didapat dari donor. Pada transduksi, DNA donor dibawa dalam mantel faga dan ditransfer ke dalam resipienyang sempit dan hanya dapat bereplikasi di dalam kumpulan melalui mekanisme yang digunakan pada infeksi faga.bakteri yang berkerabat dekat. Plasmid lainnya, contohnya,beberapa plasmid resisten obat, bereplikasi dalam kisaran Transformasi, ambilan langsung dari DNA donor yangluas rekombinan bakteri. Namun, tidak semua jenis plasmiddapat stabil berdampingan di dalam satu sel. Beberapa tipe \"telanjang\" oleh sel resipien, dapat secara alamiah ataupunakan memengaruhi replikasi atau pemisahan tipe lainnya dengan paksaan. Relatif sedikit spesies bakteri yang secarasehingga jika dua plasmid tersebut dimasukkan ke dalam selyang sama, saiah satu akan hilang lebih cepat ketika sel alamiah kompeten untuk proses transformasi; spesies inimembelah. Fenomena ini disebut inkompatibilitas plasmid; mengasimilasi DNA donor dalam bentuk linier. Transformasidua plasmid yang tidak dapat stabil bersamaan berada dalam paksa diinduksi dalam laboratorium, yaitu seteiah pemberiangrup inkompatibilitas (Inc) yang sama, dan dua plasmid garam berkadar tinggi dan renjatan suhu, banyak bakteriyang dapat stabil bersamaan berada dalam grup Inc yang dibuat menjadi kompeten untuk mengambil plasmid ekstra- seluler. Kemampuan untuk memaksa bakteri tergabungberbeda. dengan plasmid ekstraseluler melalui transformasi adalahMekanisme Rekornbinasi dasar utama dalam rekayasa genetik.DNA donor yang tidak membawa informasi yang diperlukan A. Konjugasiuntuk replikasi dirinya sendiri harus melakukan rekombinasidengan DNA resipien supaya stabil di dalam galur resipien. Plasmid adalah elemen genetik yang paling sering ditransfer Rekombinasinya dapat homolog, suatu hasil dari kemiripan melalui konjugasi. Fungsi genetik yang dibutuhkan untukyang sangat dalam sekuens DNA donor dan resipien, ataupun transfer disandi oleh gen tra yang dibawa oleh plasmid yang nonhomolog, hasil rekombinasi yang dikatalisasi oleh enzim dapat bertransmisi sendiri. Beberapa plasmid yang dapat bertransmisi-sendiri dapat memobilisasi plasmid atau bagiandi antara sekuens DNA yang tidak serupa. Rekombinasi dari kromosom lainnya untuk pemindahan. Pada beberapa kasus mobilisasi dicapai karena gen tra menyediakan fungsi homolog hampir selalu melibatkan pertukaran antar gen yang yang dibutuhkan untuk memindahkan plasmid yang tadinya tidak dapat ditransmisi (Gambar 7-7 dan Gambar 7-8). Pada mempunyai nenek moyang yang sama. Proses ini memerlu- kasus lainnya, plasmid yang dapat bertransmisi-sendiri ber- integrasi dengan DNA replikon lain, dan sebagai ekstensi dari kan suatu kumpulan gen yang menunjukkan rec, dan disfungsi dirinya sendiri, membawa suatu galur DNA ini ke dalam sel pada gen ini menghasilkan bakteri yang dapat mempertahan- kan gen homolog yang berkerabat erat tanPa rekombinasi. resipien. Rekombinasi nonhomolog tergantung pada enzim yang Analisis genetik E. coli maju pesat melalui uraian faktor fertilitas yang dibawa oleh suatu plasmid yang ditandai F*.

108 BAGIAN I Dasar-Dasar Mikrobiologi 'Donor Resipien Pembentukan pasangan Plasmid yang dapat bertransmisi sendiri mengkode fungsi tra yang memungkinkan kontak sel. Torehan untai-tunggal pada Torehan dibuat pada oriT dari oriT dan pemindahan galur plasmid yang dapat dimobilisasi Transfer dan replikasi Transfer dari plasmid yang dapat galur dimobilisasi Pemisahan pasangan Plasmid yang dapat dimobilisasi bereplikasi di dalam resipien. ffi ffi ffiffi ffiDonor TranskonjuganGAMBAR 7-6 Mekanisme transfer DNA selama konjugasi. Sel GAMBAR 7-7 Mekanisme dari mobilisasi plasmid. Sel donordonor memproduksi pilus yang dikodekan oleh plasmid danmengontak suatu sel resipien yang potensial yang tidak membawa dua plasmid, suatu plasmid yang dapat bertransmisi sendiri, F yang mengode fungsi tra yang mempromosi kontak selmengandung plasmid. Retraksi dari pilus membawa sel dalam dan transfer plasmid, dan suatu plasmid yang dapat dimobilisasi.kontak dekat dan sebuah lubang terbentuk pada sel membranyang berdampingan. Pembentukan pasangan memberi tanda Fungsi mob yang dikodekan oleh plasmid yang dapat dimobilisasi,pada plasmid untuk mulai mentransfer dari torehan untaian membuat suatu torehan untaian tunggal pada oriT di regio mob.tunggal pada oriT. Torehan dibuat oleh plasmid yang berkode Kemudian terjadi transfer dan replikasi dari plasmid yang dapatfungsi tra. Ujung 5' dari untaian tunggal plasmid ditransfer ke dimobilisasi. Plasmid yang dapat bertransmisi sendiri mungkin juga ditra nsfer. (Direprod uksi dengan izin dari Snyder L, Cha mpnessresipien melalui lubang. Selama transfer, plasmid di dalam donor W: Molecular Genetics of Bacteria. ASM press, 2\"d ed. 2002.)bereplikasi, sintesis DNAnya dipancing oleh 3,OH dari torehanoriT. Replikasi dari untaian tunggal di dalam resipien diteruskandengan mekanisme yang berbeda dengan primer RNA. Kedua selsekarang mengandung plasmid untaian ganda, dan pasangantadi berpisah. (Direproduksi dengan izin dari Snyder L, ChampnessW: Molecular Genetics of Bacteria. ASM press, 1997.)

BAB 7 .t Genetika Mikroba 109 ru #f \"%GAMBAR 7-8 A: Sel jantan dan sel betina dihubungkan oleh pilus F (pilus seks). B: Pasangan sel E. coli. Sel Hfr tampak memanjang' C:Gambar potongan tipis pasangan pada pemeriksaan mikroskop elektron. Kontak intim dinding sel pasangan yang kawin berada di area,Jembatan,i (Gambar IBI dan [C] diproduksi ulang dengan izin dari Gross JD dan Caro LG: DNA transfer in bacterial conjugation. J Mol Biol1966;16:269.)Plasmid memberikan sifat donor tertentu pada sel; sifat ini Integrasi DNA kromosom ke dalam suatu plasmidmeliputi pilus seks, suatu penonjolan protein ekstraselulermultimerik yang menempelkan sel donor ke organisme konjugal dapat menghasilkan replikon rekombinan-suaturesipien yang kekurangan faktor fertilitas. lembatan antar sel prima F (fertilitas), atau prima R (resistensi), tergantung darimemungkinkan galur plasmid F-, yang disintesis oleh donor, plasmidnya-ketika DNA kromosom yang terintegrasi dapatberpindah ke resipien, tempat galur komplemen DNAdibentuk. Faktor fertilitas F* dapat berintegrasi ke dalam bereplikasi pada plasmid secara independen dari kromosom.banyak lokus di dalam kromosom sel donor. Faktor fertilitas Hal ini terjadi jika plasmid terintegrasi (misal, F) digolongkanterintegrasi menciptakan donor rekombinasi frekuensi tinggi(HFR), dari sini DNA kromosom dipindahkan (dari tempat oleh dua salinan dari suatu elemen IS. Bakteri yang membawa salinan gen, rangkaian lengkap kromosom dan rangkaianinsersi) dengan arah yang ditentukan oleh orientasi insersinya parsial pada suatu prime adalah diploid parsial, atau(Gambar 7-9). merodiploid, dan bermanfaat untuk penelitian komple- mentasi. Gen tipe-liar sering kali berkomplemen dengan Kecepatan transfer kromosom dari sel Hfr bersifat homolog mutan-nya, dan pilihan fenotipe tipe-liar me-konstan, dan kumpulan hasil dari berbagai eksperimen mungkinkan pemeliharaan merodiploid di laboratorium.konjugasi memungkinkan perslapan pemetaan genetik E. Galur seperti ini dapat dipakai untuk menganalisis interaksi di antara alel yang berbeda, varian genetik pada gen yangcoli yaittt jarak antar lokus diukur dalam menit yang sama. Merodiploid sering stabil secara genetis karenadibutuhkan untuk transfer pada konjugasi. Pemetaan yang rekombinasi antara plasmid dengan kromosom homologserupa telah dibuat untuk Salmonella typhimurium baktericoliform (serupa E. coli) yang berkaitan, dan perbandingan dapat menimbulkan kehilangan atau pertukaran alel mutankedua pemetaan memperlihatkan pola pengorganisasian gen atau tipe-liar. Problem ini biasanya dapat dihindari denganyang berhubungan. memelihara merodiploid di dalam suatu latar belakang Prosedur serupa dengan plasmid lain memungkinkan genetik ketika recA, suatu gen yang dibutuhkan untukpeneliti memetakan kromosom sirkuler milik anggota genus rekombinasi antar segmen homolog DNA, telah diinaktifkanbakteri yang berkerabat jauh; misal, plasmid resisten obat,disebut faktor R, dapat membantu transfer kromosom dari melalui mutasi.bakteri yang berbeda, termasuk Pseudomonas spp' Per-bandingan pemetaan kromosom antara Pseudomonas Gen homolog dari organisme yang berbeda mungkinaeruginosa dan Pseudomonas putida memperlihatkan bahwa telah menyimpang luas sehingga mencegah rekombinasiterdapat meskipun sedikit, tetapi bermakna, pengaturankembali genetik di antara keduanya menyertai divergensi homolog di antara mereka, tetapi tidak mengubah kapasitaskedua spesies yang berkerabat dekat. Peta Pseudomonas satu gen untuk meiengkapi aktivitas lainnya yang hilang.mempunyai sedikit kesamaan dengan bakteri coliform yang Contohnya, asal mula genetik enzim yang diperlukan untuk biosintesis asam amino tidak mungkin memengaruhi aktivitasberkerabat jauh secara biologis. katalitik di sitoplasma pada pejamu yang secara biologis berkerabat jauh. Merodiploid yang membawa gen untuk enzim juga akan membawa gen pengapit yang berasal dari organisme donor. Oleh sebab itu, genetik mikroba

110 BAGIAN I rt Dasar-Dasar MikrobiologiHfr F_ konvensional berdasarkan seleksi plasmid primer dapat digunakan untukmengisolasi gen dari organisme pilihan dari Plasmid F menyandi fungsi E. coli atat P. aeruginosa. Manfaat teknologi ini terletak pada tra, termasuk pili kemampuannya untuk menyederhanakan atau menghindari Suatu torehan pada prosedur yang relatif mahal yang diperlukan dalam rekayasa oriT memulai transfer genetik. Replikasi terjadi pada donor, ketika satu untaian B. Transduksi dipindahkan Transduksi adalah rekombinasi genetik yang diperantaraiw Fragmen yang dipindahkan oleh faga pada bakteri. Dalam istilah yang paling sederhana, Hfr mengalami rekombinasi di partikel transduksi dapat dianggap sebagai asam nukleat dalam resipien bakteri di dalam mantel faga. Bahkan pada suatu populasiGAMBAR 7-9 Transfer DNA kromosom melalui plasmid ter- faga litik dapat mengandung beberapa partikel dengan caraintegrasi. Pembentukan pasangan kawin, lekukan sekuens F oril mantel faga mengelilingi DNA yang diturunkan dari bakteri,dan transfer ujung 5'pada untai-tunggal DNA F berjalan seperti bukan diturunkan dari faga. Popuiasi ini telah digunakanpada transfer plasmid F. Transfer dari DNA kromosom yangterhubung secara kovalen juga akan terjadi sepanjang pasangan untuk mentransfer gen dari satu bakteri ke bakteri lainnya. Faga temperate adalah sarana pilihan untuk transfer genkawinnya stabil. Transfer kromosom lengkap jarang terjadi karena infeksi pada bakteri resipien berada dalam kondisisehingga sel resipien tetap F-, sekalipun sehabis kawin. Replikasi yang membantu lisogenik meminimalisasi iisis sel danpada donor biasanya diikuti dengan transfer DNA. Beberapa karenanya membantu pertahanan galur rekombinan. Se-replikasi dari untaian tunggal yang ditransfer juga dapat terjadi. sungguhnya, bakteri resipien yang membawa profaga yangSekali di dalam sel resipien, DNA yang ditransfer mungkin sesuai dapat membentuk represor yang membuat sel kebal terhadap infeksi litik; sel seperti ini masih mengambil DNAbergabung dengan urutan homolog didalam kromosom resipien. bakteri dari partikel transduksi. Campuran transduksi yang(Direproduksi dengan izin dari Snyder L, Champness W: Molecular membawa DNA donor dapat disiapkan di bawah kondisi yang membantu siklus faga litik.Genetics of Bacteria, 2\"d ed. ASM Press, 2002). Ukuran DNA pada partikel transduksi biasanya tidak lebih dari beberapa persen kromosom bakteri, dan oleh sebab itu ko-transduksi-transfer lebih dari satu gen pada satu waktu-terbatas pada gen bakteri yang terkait. proses ini terutama penting daiam pemetaan gen yang letaknya terlalu berdekatan satu sama lain untuk diletakkan pada urutan pemetaan menggunakan metode keseluruhan dari transfer konjugal. Faga mutan dapat diidentifikasi atas dasar morfologi plak yang terbentuk melalui lisis tempat bakteri tumbuh pada medium agar yang dipadatkan. Pulau patogenisitas sering dipindahkan oleh faga. Contohnya, dua faga memindahkan pulau patogenisitas yang menyebabkan perubahan bentuk benigna Vibrio cholerae menjadi bentuk patogen yang menyebabkan epidemi kolera (ihat Bab 17). Faga ini menyandi gen untuk toksin kolera dan piii pembentuk berkas serabut yang berfungsi dalam per- lekatan. Kecepatan faga berekombinasi dan bereplikasi membuat mereka menjadi topik pusat kajian mengenai proses ini, dan banyak generalisasi berkenaan dengan mekanisme yang mendasarinya muncul dari genetik faga. Kapasitas faga untuk membuat replika DNA secara cepat, menjadikannya bernilai dalam rekayasa genetika. Faga rekombinan yang direkayasa sedemikian rupa sehingga mereka mengandung DNA yang diinsersi dari sumber biologis lainnya merupakan hat yang sangat bermakna. DNA yang diinsersi dapat direplikasi dengan kecepatan yang mencirikan DNA faga dan didapat dalam bentuk yang bermanfaat untuk manipulasi. DNA untai-tunggal yang dihasilkan oleh faga M13 dan turunannya, berperan sebagai cetakan untuk mutagenesis berdasarkan tempat dan pengurutan.

BAB 7 * GenetikaMikroba l1lC. Transformasi yang baru disintesis untuk memastikan bahwa hasilnyaAmbilan langsung DNA donor oleh bakteri resipien ter- sempurna berkomplemen dengan cetakannya. Enzim yanggantung pada kemampuan untuk bertransformasi. Bakterijarang memiiiki kemampuan alamiah, dan beberapa galur memperbaiki salah pasang membedakan untaian yang barubakteri ini dapat ditransformasi hanya jika terdapat faktor disintesis dari untaian yang sudah ada atas dasar metilasikompetensi yang dihasilkan hanya pada suatu titik spesifik adenin dalam sekuens GATC pada untaian yang sudah ada.seiama siklus pertumbuhan. Gaiur lain siap mengalami Ketika kerusakan DNA terlalu luas, sistem perbaikan DNAtransformasi alami, dan organisme ini menjanjikan bagi yang khusus, respons SOS, menolong se1 yang DNAnya telah rusak. Respons SOS adalah sistem perbaikan DNA pascarekayasa genetika karena kemudahan mereka menggabungkan replikasi yang memungkinkan replikasi DNA memintas lesi atau kesalahan pada DNA.DNA modifikasi ke dalam kromosom mereka. Bakteri yangdapat ditransformasi secara alami dijumpai pada beberapa - Banyak substitusi basa luput dari proses deteksi padagenus dan meliputi Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae' tingkat fenotip karena mereka tidak mengganggu fungsiN e i s s er i a gon orrh o e ae, N ei s s er i a meningiti di s dan Str ep t o c o c cu s produk gen secara bermakna. Contohnya, mutasi missense,pneumoniae. Fragmen DNA yang mengandung gen dari yang mengakibatkan substitusi dari satu asam amino denganorganisme seperti ini dapat segera dikenali berdasarkan atas yang lainnya, dapat tanpa efek fenotip yang terlihat. Mutasikemampuan mereka untuk mengubah sel mutan menjadi tipe noflsense menghentikan sintesis protein dan hal ini me-liar. Teknik ini menunjukkan kemajuan pesat prosedur nyebabkan suatu protein yang terpotong pada lokasi mutasinya. Produk gen dari mutasi nonsense biasanyalaboratorium yang digunakan oleh Avery dan koleganya inaktif.dalam mendemonstrasikan bahwa dasar transformasipneumokokus adalah DNA (Gambar 7-1). Akibat mutasi delesi atau insersi juga berat karena hal ini dapat mengubah secara drastis urutan asam amino produk Transformasi genetik dikenal sebagai suatu kekuatan gen. Seperti dijelaskan di bawah ini, ekspresi sekuens DNAutama dalam evolusi mikroba. Transformasi alami adalah yang akurat tergantung dari translasi triplet kodon nukleotidaproses aktif yang membutuhkan protein spesifik yang di- pada fase sempurna. Insersi atau delesi nukleotida tunggalhasilkan oleh sel resipien. Untuk Nelsseria dan Haemophilus memutuskan fase translasi dan dengan demikian menghasil-spp, sekuens DNA spesifik (sekuens ambilan) diperlukan kan suatu perbedaan total urutan protein distal terhadapuntuk ambilan DNA. Sekuens ambilan ini bersifat spesifik kodon asam amino yang diubah oleh mutasi.bagi spesies sehingga membatasi pertukaran genetik padaspesies tunggal. DNA yang tidak disatukan dapat didegradasi Banyak mutasi spontan merupakan hasil dari delesi yangdan digunakan sebagai sumber nutrisi untuk mendukungpertumbuhan mikroba. membuang sebagian besar gen atau bahkan sekelompok gen. Deiesi besar ini melibatkan rekombinasi antara urutan yang Sebagianbesar bakteri tidak dapat mengalamitransformasi berulang secara langsung (misal, elemen IS) dan hampir tidakalami. Pada kasus ini, transformasi dapat dipaksa dengan pernah kembali. Mutasi spontan lainnya menyebabkan duplikasi, sering kali dalam bentuk berpasangan, untukpemberian kalsium klorida dan syoktemperatur. Transformasi panjang DNA yang sebanding. Mutasi seperti ini biasanyadengan plasmid rekombinan hasil rekayasa dengan prosedur tidak stabil dan segera kembali. Masih ada mutasi lain yang dapat mengembalikan potongan sekuens DNA atau me-ini adalah landasan bagi biologi molekuier modern, karena mindahkan sekuens ini ke lokus baru. Perbandingan peta genhal ini memungkinkan DNA dari sumber biologis yang pada galur bakteri terkait memperlihatkan bahwa pengaturan ulang dapat menetap pada populasi alami. Pengamatan iniberagam dijadikan sebagai bagian dari replikon bakteri yang menunjukkan fakta bahwa pemisahan linier fragmen DNA tidak memutuskan secara total kemungkinan interaksi fisikmemiliki sifat khas. dan kimia di antara mereka.MUTASI & PENGATURAN UTANG GEN MutagenMutasi Spontan Frekuensi mutasi bertambah besar dengan adanya pemaparanMutasi adalah perubahan dalam sekuens DNA. Mutasi sel terhadap mutagen. Sinar ultraviolet (UV) adalah mutagenspontan pada gen tertentu dengan latar belakang tipe-liar fisikyang merusak DNA dengan menghubungkan basa timinbiasanya terjadi dengan frekuensi sebesar 10 6-10-8 dalam yang bersebelahan sehingga membentuk dimer (Bab a).suatu populasi yang berasal dari bakteri tunggal (tergantung Kesalahan urutan dapat terjadi selama perbaikan enzimatikdari spesies bakteri dan kondisi yang digunakan untuk pada kerusakan genetik ini. Mutagen kimia dapat bekerjamengidentifikasi mutasi). Mutasi meliputi substitusi basa,delesi, insersi dan pengaturan ulang. Substitusi basa dapat dengan cara mengubah struktur fisik ataupun strukturterjadi sebagai konsekuensi dari pembentukan pasangan yangsalah antara basa komplementer selama replikasi. Pada E' coli, kimiawi DNA. Bahan kimia reaktif mengubah struktur basa DNA. Misalnya, asam nitrit (HNO,) mengganti grup aminohal ini terjadi sekitar satu kali setiap 1010 kali inkorporasi dengan grup hidroksil. DNA hasil mutasi ini mengalaminukleotida; suatu proses yang sangat akurat. Kejadian basayang salah pasangan dikurangi sekecil mungkin oleh enzim perubahan aktivitas cetakannya selama periode replikasiyang berkaitan dengan perbaikan salah pasang, suatu selanjutnya. Mutasi frameshift-memasukkan atau meng-mekanisme yang sangat utama mengoreksi cetakan untaian

t12 BAGIAN I * Dasar-DasarMikrobiologihilangkan pasangan basa tunggal dari DNA-disebabkan oleh amino yang dibawanya diletakkan pada sambungan peptidauntaian DNA yang sedikit tergelincir. Proses ini dibantu olehpewarna akridin (misal, akridin jingga) yang dapat ber- dengan asam amino pada molekul IRNA sebelumnya. Enziminterkalasi di antara basa-basa. peptidiltransferase (yang sebetulnya adalah rRNA 23S, yaitu ribozim) mengatalis pembentukan ikatan peptida. Ribosom Secara umum, efek langsung mutagen fisik atau kimiawi bergerak sepanjang mRNA, polipeptida bertambah panjangadalah kerusakan DNA. Hasil mutasi terjadi oleh prosesreplikasi dan lolos dari proses perbaikan enzim yang telah secara berurutan hingga seluruh molekul mRNA telahdijelaskan di atas. Mutasi yang mengubah aktivitas replikasi ditranslasikan ke dalam urutan asam amino yang sesuai.atau perbaikan enzim dapat membuat bakteri menjadi lebihrentan terhadap mutagen biologis dan disebut gaiur mutator. Proses ini disebut translasi, digambarkan pada GambarReversi & 5upresi 7-r0.Mendapatkan kembali aktivitas yang hilang akibat mutasi, Pada prokariota, gen yang berhubungan dengan fungsidiistilahkan dengan reversi fenotip, dapat atau dapat tidak terkait dikelompokkan secara khusus atau ditemukan padadiakibatkan oleh restorasi dari sekuens DNA asal, seperti operon. Karena tidak ada nukleus, transkripsi/translasi di-yang diperiukan oleh reversi genotip. Sering kali mutasi pada pasangkan, artinya adalah mRNA yang baru terbentuklokus kedua, disebut mutasi supresor, memperbaiki aktivitas melekat pada ribosom dan ditranslasikan pada saat bersamaanyang hilang. Pada supresi intragenik, setelah mutasi primer ketika ditranskripsikan. Pasangan transkripsi/translasi inimengubah struktur enzim sedemikian sehingga aktivitasnya memungkinkan respon cepat terhadap perubahan dalamhilang, mutasi kedua, pada tempat yang berbeda dari gen Iingkungan. Demikian juga, mRNA mempunyai siklus hidupenzim, memperbaiki struktur yang diperlukan untuk aktivitas. yang singkat, dengan waktu paruh beberapa detik hinggaSupresi ekstragenik disebabkan oleh mutasi kedua yang beberapa menit.berada di luar gen yang semula terkena. Pada eukariota, pengelompokkan gen yang terkait tidakEKSPRESI GEN lazim dilakukan. Sekuens penambah adalah regio pada DNA eukariota yang meningkatkan transkripsi dan bisa terletakPemisahan evolusioner yang luar biasa dari genom eukariota jauh di atas dari gen yang ditranskripsi. Gen eukariotadan prokariota diperlihatkan dengan membandingkan membawa intron, insersi DNA yang tidak ditemukan padamekanisme ekspresi gen mereka yang hanya merupakan gen prokariota. Intron memisahkan ekson, regio penyandisebagian kecil dari sifat-sifatnya. Pada kedua grup, informasi pada gen eukariota. Intron yang ditranskripsi dipindahkangenetik disandi dalam DNA, ditranskripsikan ke mRNA, dan dari transkrip eukariotik selama pemrosesan RNA, suatuditranslasikan pada ribosom melalui tRNA menjadi struktur serial reaksi enzimatik yang terjadi di dalam nukleus. mRNAprotein. Kodon triplet nukleotida yang digunakan pada pada eukariota mengalami poliadenilasi pada ujung 3ltranslasi bersifat umum, dan banyak enzim yang berkaitan terlindung dari eksonuklease sehingga mRNA dapat melintasidengan sintesis makomolekuler pada kedua kelompok membran nukleus masuk ke dalam sitosol, tempat ribosombiologis mempunyai kemiripan sifat. Mekanisme tempat berada; dalam kasus ini, translasi tidak bersamaan denganurutan nukleotida pada gen menentukan urutan asam amino transkripsi. Karena adanya poliadenilasi ini, mRNA eukariotadalam protein sebagian besar serupa pada prokariota dan mempunyai waktu-paruh antara beberapa jam sampai bebe-eukariota, dan mekanismenya sebagai berikut. rapa hari. (1) RNA polimerase membentuk untaian poliribonu- Ribosom eukariota dan prokariota berbeda dalam banyakkleotida tunggal, yang disebut \"messenger RNA' (mRNA), hal. Ribosom eukariota lebih besar dan mempunyai koefisienmemakai DNA sebagai cetakan; proses ini disebuttranskripsi.mRNA mempuhyai urutan nukleotida komplementer ter- sedimentasi, yaitu B0S sedangkan koefisien sedimentasihadap untaian cetakan pada rantai ganda DNA jika dibacadengan arah 3'ke 51 Jadi suatu mRNA mempunyai orientasi ribosom prokariota sebesar 70S. Subunit ribosom eukariotaaran 5 Ke J. adaiah +0S dan 605,lebih besar dibandingkan dengan subunit ribosom prokariota, berturut-turut adalah 30S dan 50S, dan (2) Asam amino diaktivasi secara enzimatis dan ditransfer ribosom eukariota relatif kaya akan protein. Perbedaanke molekul adapter khusus RNA, disebut \"transfer RNA' bermakna adalah sifat bawaan dalam hal sensitifitas aktivitas ribosom terhadap antibiotik (misal, tetrasiklin), banyak di(tRNA). Setiap molekul adapter mempunyai suatu triplet basa antaranya menghambat sintesis protein secara selektif pada(antikodon) yang berkomplementer terhadap triplet basa sitoplasma prokariota, tetapi tidak di dalam sitoplasmamRNA, dan pada satu sisi asam aminonya yang spesifik.Triplet basa pada mRNA disebut kodon untuk asam amino eukariota (lihat Bab 9). Namun, harus diingat, bahwa ribosomtersebut. mitokondrial pada eukariota menyerupai yang ada pada (3) mRNA dan tRNA bersama-sama menuju ke per- prokariota.mukaan ribosom. Karena setiap IRNA menemukan tripletnukleotida yang komplementernya pada mRNA maka asam Pengaturan Ekspresi Gen Prokariota Protein spesifik, produk dari gen regulator, memerintahkan ekspresi gen struktural yang menyandi enzim. Transkripsi DNA menjadi mRNA dimulai dari promotor, sekuens DNA yang mengikat RNA polimerase. Tingkatan ekspresi gen ditentukan sebagian oleh kemampuan promotor untuk meng-

BAB 7 * GenetikaMikroba 113 @ o-\o-*V\"/ t (4\l, I tRNA2 WMNItlH NH, tl NH - Anticodon 2 Col1=oO C=O mI CI :O I o o\\ @ o-\"':#\"r \ I\\anr.rn, NH \A ffI i Hs I b'r> C:O {l NH mI I C:O I omRNA 1234GAMBAR 7-10 Empattahapan dalam pemanjangan rantai polipeptida pada permukaan suatu ribosom 70s. Kiri atas: Molekul IRNAmembawa antikodon komplementer ke kodon 1 pada satu ujung dan AA, pada tempat pengikatan lainnya ke temapat A. AA, melekatpada IRNA melalui grup karboksilnya, amino nitrogennya membawa grup formil (F). Kanan atas: Suatu molekul IRNA membawa AA,ierikat pada tenlpat B; antikodonnya adalah komplementer terhadap kodon2. Kanan bawah: suatu kompleks enzim mengatalisis transferAA, ke grup amino dari AAr, membentuk suatu ikatan peptida. (Perhatikan bahwa transfer dengan arah berlawanan dihalangi oleh formilasisebelumnyu atas grup amino dari AA,.) Kiri bawah: Ribosom bergerak ke kanan sehingga tempat A dan B sekarang berlawanan dengankodon 2 dan 3; dalam proses ini, tRN[, digeser dan IRNA, pindah ke tempat A.Tempat B sekali lagi kosong dan siap menerima tRNA3,membawa AA, (Ketika polipeptida sudah lengkap dan dilepas, grup formil secara enzimatis dilepas). (Digambar kembali dan direproduksidengan izin dari stanier Ry doudoroff M, Adelberg EA:The Microbial wortd 3'd ed. copyright 1970. Prentice-Hall, lnc. Englewood cliffs,NJ.)ikat polimerase, dan efektifitas intrinsik promotor satu dengan Rangkaian gen yang berdampingan ini diekspresikan sebagai transkrip mRNA tunggal, dan ekspresi dari transkrip dapatlainnya berbeda luas. Pengaturan lebih lanjut atas ekspresi gen ditentukan oleh gen regulator tunggal' Contohnya, lima gendilakukan oleh protein regulator yang dapat terikat di regio yang berkaitan dengan biosintesis triptofan terkumpul diDNA dekat promotor. operon trp pada E. coll. Ekspresi gen diperintah oleh atenuasi, seperti dijelaskan di bawah ini, dan juga diperintahkan oleh Banyak gen struktural prokariotik yarg mengoderangkaian reaksi metabolisme terkumpul pada operon.

Il4 BAGIAN I * Dasar-Dasar Mikrobiologi represi: Pengikatan dari triptofan oleh protein represor mem- yang secara bebas mengendaiikan gen lacl, mengeluarkan berinya suatu konformasi yang memungkinkannya untuk kontrol negatif atas transkripsi dari operon lac dengan cara terikat pada operator lac. Dengan adanya penginduksi, melekat pada operator frp, sekuens pendek DNA yang represor dilepaskan dari operator, dan terjadi transkripsi. membantu pengaturan ekspresi gen. Pengikatan protein _ Ekspresi operon lac dan banyak operon lainnya yang represor ke operator mencegah transkripsi gen trp. Represi dapat dipandang sebagai suatu mekanisme latih-kontrol, berkaitan dengan penghasilan energi diperkuat dengan pengikatan oleh protein pengikat-AMp siklik (CAp) ke suatu pendekatan semua-atau-tidak-sama-sekali untuk peng- sekuens DNA yang spesifik dekat promotor untuk operon yang diregulasi. Protein mengeluarkan kontrol positif dengan aturan gen. Bentuk pengaturan seperti ini bebas dari atenuasi, cara memperkuat aktivitas RNA polimerase. Metabolit yang mencetuskan kontrol positif dengan pengikatan ke CAp suatu mekanisme penyetelan-halus yang juga dipakai untuk adalah 3]5'-siklik AMP (cAMP). Senyawa ini, dibentuk di menentukan ekspresi gen trp. dalam sel yang sangat kekurangan-energi, bekerja melalui CAP memperkuat ekspresi dari enzim katabolik yang meng- Atenuasi adalah mekanisme pengaturan beberapa jalur hasilkan energi metabolik. biosintesis (misal, jalur biosintesis triptofan) yang mengontroi Siklik AMP tidak sendiri dalam kemampuannya me- efisiensi transkripsi sesudah transkripsi dimulai, tetapi ngontrol gen yang tidak terhubung padaE. coli. Sejumlah gen sebelum sintesis mRNA gen operon berlangsung, terutama yang berbeda bereaksi terhadap ppGpp nukleotida (dalam hal ketika produk akhir dari jalur ini hanya sedikit tersedia. ini'p'berarti fosfodiester dan \"G\" berarti guanin) sebagai Contohnya, dalam keadaan pertumbuhan normal, sebagian besar transkrip mRNA trp berhenti sebelum mencapai gen tanda dari kekurangan akan asam amino, dan gen yang tidak struktural operon /rp. Namun, ketika terjadi kekurangan terhubung diekspresikan sebagai bagian dari respons SOS terhadap kerusakan DNA. Ada lagi sekelompok gen yang triptofan yang parah, penghentian dini transkripsi tidak tidak terhubung digunakan sebagai respons terhadap renjatan suhu. Respons ini ditemukan, baik pada prokariota maupun terjadi, memungkinkan ekspresi operon pada tingkatan 10- eukariota. kali-lipat lebih tinggi daripada keadaan normal. penjeiasan Penjelasan mengenai sistem kontrol transkripsional pada fenomena ini terletak pada sekuens regulator 162 bp di depan prokariotik membuktikan adanya dua nilai, konseptual dan gen struktural, trp (Gambar 7-1I) dikenal sebagai sekuens teknikal. Operon /ac memberikan suatu model yang ber- manfaat untuk studi perbandingan mengenai ekspresi gen.pemimpin atau trpL. Sekuens frp pemimpin dapat di- Contoh, fenomena represi, pertama kali dengan jelas di- transkripsikan ke dalam mRNA dan selanjutnya ditranlasikan menjadi polipeptida 14 asam amino dengan dua residu paparkan untuk operon lac,bertanggung jawab atas respon triptofan yang berdekatan, suatu kejadian yang jarang terjadi. lisogenik terhadap infeksi oleh faga termperate seperti ),. Studi sistem lac E. coli telah memberikan banyak derivatifDi ujung trpL, dan ke atas dari sinyal pengaturan yang genetik yang berguna dalam rekayasa genetik. Insersi DNAmengontrol translasi gen struktural frp adalah suatu asing ke dalam piasmid untukmembentukvektor rekombinanterminator bebas-Rho. Sekuens DNA di daerah ini me- sering kali dipantau secara fenotip dengan menggunakan tes warna untuk memantau inaktivasi insersionai gen lacy, dannunjukkan bahwa mRNA yang telah dikode mempunyai promotor lac sering digunakan untuk mendapatkan ekspresikemungkinan besar untuk membentuk struktur sekunder kontrol atas gen yang diinsersi.stem loop. Sekuens ini dinamakan loop pause (1:2), REKAYASA GENETIKterminator loop (3:4), dan loop antiterminator (2:3). Rekayasa merupakan penerapan ilmu pengetahuan ke dalamAtenuasi operon trp menggtnakan struktur sekunder mRNA bidang kebutuhan sosial. Pada tahun terakhir, rekayasa atas dasar genetika bakteri telah mengubah bidang biologi.untuk mendeteksi jumlah triptofan di dalam sel (sebagai Fragmen DNA khusus dapat diisolasi dan diamplifikasi, dantRNA-trp) menurut model yang diperlihatkan pada Gambar gen mereka dapat diekspresikan pada tingkat tinggi. Spesifisitas nukleotida yang dibutuhkan untuk pemecahan7-11. oleh enzim restriksi memungkinkan gen yang mengandung Pencegahan transkripsi oleh protein represor disebut fragmen atau bagian dari gen diikat (diinkorporasi) ke dalamkontrol negatif. Bentuk sdbaliknya pada inisiasi-regulasi piasmid (\"vektor\") yang selanjutnya dapat digunakan untuktranskripsional dari transkripsi sebagai akibat pengikatan mengubah sel bakteri. Koloni bakteri atau gen khususprotein aktivator-disebut kontrol positif. Kedua bentuk pembawa klon dapat diidentifikasi melalui hibridisasi DNAkontrol digunakan untuk ekspresi operon lac, gen yang atau RNA dengan ajur yang ditandai (serupa dengan yangberkaitan dengan. fermentasi laktosa pada E. coli. Operon diperlihatkan pada Gambar 3-4). Alternatif lain, produkmempunyai tiga gen struktural. Transpor laktosa ke dalam sel protein yang disandi oleh gen dapat diketahui melalui aktivitasdiperantarai oleh produk gen lacY. Betagalaktosidase, enzimyang menghidrolisis laktosa menjadi galaktosa dan glukosa,disandi oleh gen lacZ. Prod'tk gen ketiga (lacA) adalahtransasetilase; fungsi fisiologis enzim ini belum terungkapsepenuhnya. Sebagai produk-sampingan dari fungsi normalnya,p-galaktosidase menghasilkan alolaktosa, isomer strukturallaktosa. Laktosa sendiri tidak memengaruhi pengaturantranskripsional; yang memengaruhinya adalah alolaktosa,yang merupakan penginduksi operon lackarena alolaktosaadalah metabolit yang paling langsung menimbulkan ekspresigen. Pada keadaan tanpa alolaktosa, represor /ac, suatu produk

BAB 7 * GenetikaMikroba ll5 Langkah 1 Langkah 2 Langkah 3 Alternatif langkah 4 Alternatif langkah UGGUGGIGAMBAR 7-1 Perkiraandari model atenuasi (Langkah'1 ).Transkripsi/translasiterjadipadasetiapgenbakteri.(langkah2) RNApolimeraseterhenti dan 1:2 stem loop terbentuk. (langkah 3) Ribosom memutuskan 1:2 stem loop dan menghadap dua trp kodon. (langkah 4) jikaterdapat cukup banyaktriptofan, trp-tRNA yang bermuatan akan tersedia dan ribosom akan mentranslasi trpl. Hal ini menyebabkan RNAPolimerase berhenti pada terminator Rho-independen yang dibentuk dari suatu 3;4 stem loop. (alternatif langkah 4) Jika triptofan terbatas(tidak ada trpt-RNA), ribosom berhenti pada dua trp kodon, sedangkan RNA polimerase terus berlanjut.2:3 loop stem terbentuk. (Alternatiflangkah 5) Terminator 3:4 tidak dapat membentuk dan RNA polimerase meneruskan transkripsi ke dalam gen structural trp. Hal inimemaparkan tempat pengikatan ribosom (RBS) ke hulu dari trpE, memungkinkan proses translasi (Dikutip dengan izin dariTrun N,TrempyJ: Fundamental Bacterial Genetics. Blackwell Science 1td,2004.)

116 BAGIAN I * Dasar-DasarMlkrobiologi enzim maupun dengan teknik imunologis. Prosedur terakhir Pemisahan Fisis Fragmen DNA yang tersebut berkembang pesat dengan adanya selektivitas yang luar biasa, dengan antibodi monoklonal (lihat Bab B) terikat Berbeda Ukuran pada faktor penentu antigenik spesifik pada protein. Oieh karenanya teknik rekayasa genetik dapat digunakan untuk Banyak kesederhanaan yang mendasari teknik rekayasa mengisolasi hampir setiap gen dan banyak dari gen ini yang genetik terletak pada kenyataan bahwa elektroforesis gel dapat diekspresikan sehingga sifat biokimiawi yang dikenal memungkinkan fragmen DNA dipisahkan menurut ukuran- dapat dipelajari atau dimanfaatkan. nya (Gambar 7-12): Makin kecil fragmennya, makin cepat kecepatan migrasinya. Kecepatan keseluruhan migrasi dan Gen yang diisolasi dapat digunakan untuk berbagai kisaran optimal ukuran untuk proses pemisahan ditentukan oleh sifat alami kimiawi gel dan oleh tingkatan hubungan- tujuan. Mutagenesis yang berdasarkan tempat dapat meng- identifikasi dan mengubah sekuens DNA suatu gen. Dengan silangnya. Gel hubungan-silang yang tinggi mengoptimalkan demikian, residu nukleotida yang penting untuk fungsi gen dapat ditentukan, dan jika diinginkan, dapat diubah. Dengan pemisahan fragmen DNA yang kecil. Zat warna etidium teknik hibridisasi, DNA dapat digunakan sebagai suatu alat bromida membentuk fluoresensi terang yang tampak saat yang mengenali asam nukleat yang berhubungan dengan terikat pada DNA sehingga sejumlah kecil fragmen DNA urutan komplementer dari DNAnya sendiri. Misalnya, suatu virus laten pada jaringan hewan dapat dideteksi dengan ajur yang terpisah dapat divisualisasi pada gel (Gambar 7-12A). DNA, bahkan daiam keadaan tidak adanya infeksi virus yang jelas. Produkprotein dari gen virus yang diisolasi memberikan Fragmen DNA spesifik dapat dikenali dengan ajur yang harapan besar sebagai vaksin karena produk protein tersebut mengandung sekuens komplementer (Gambar 7-l2B dan dapat disiapkan tanpa gen yang menyandi replikasi asam c). nukleat virus. Terlebih lagi, protein seperti insuiin yang sangat bermanfaat, dapat dibuat dalam jumlah besar dari bakteri Elektroforesis geI p uls ed-fi eld memungkinkan pemisahan yang mengekspresikan gen yang diklon. fragmen DNA yang mengandung hingga 100 kbp yangPenyediaan Fragmen DNA dengan Enzim dipisahkan pada gel poliakrilamida beresolusi tinggi. Restriksi Karakterisasi fragmen besar ini memungkinkan konstruksi Keanekaragaman genetika bakteri tercermin dari kisaran peta fisik untuk kromosom dari beberapa spesies bakteri dan enzim restriksi yang luas, yang mempunyai selektivitas luar merupakan sesuatu yang sangat bernilai dalam melacak isolatbiasa sehingga memungkinkan mereka mengenali daerah bakteri yang berkaitan dengan wabah penyakit infeksi.spesifik pada DNA untuk pembelahan. Sekuens DNA yang dikenali oleh enzim restriksi sebagian besar adalah palindrom Kloning Fragmen Restriksi DNA (pengulangan sekuens yang terbalik). Paiindrome sekuenstipikal yang dikenali oleh enzim restriksi EcoRl yang sering Banyak enzim restriksi memecahkan secara asimetri dandigunakan adalah GAATTC; pengulangan terbalik, di- menghasilkan fragmen DNA dengan ujung kohesif (lekat) yang dapat berhibridisasi satu dengan yang lainnya. DNA ini turunkan dalam bentuk saling melengkapi dari pasangan basa dapat digunakan sebagai donor dengan resipien plasmid G-C dan A-T, menghasilkan TTC urutan 5'yang direfleksikan untuk membentuk plasmid rekombinan yang direkayasa sebagai AAG pada untaian 31 secara genetis. Contohnya, pemecahan DNA dengan EcoRl menghasilkan DNA yang mengandung sekuens AATT ujung Panjang fragmen DNA yang dihasilkan oleh enzim 5'dan sekuens TTAA ujung 3'komplementer (Gambar 7-13).restriksi sangat bervariasi, karena ciri khas setiap sekuens Pemecahan plasmid (potongan sirkuler DNA) dengan enzimDNA. Panjang rata-rata fragmen DNA ditentukan terutama restriksi yang sama menghasilkan fragmen linier dengan ujung kohesif yang identik satu sama lain. Pemindahanoleh jumlah basa spesifik yang dikenali oieh enzim. Sebagianbesar enzim restriksi mengenal empat, enam atau delapan enzimatis grup fosfat bebas dari ujung ini memastikan merekaurutan basa, tetapi enzim restriksi lainnya mengenal 10, 11, tidakakan diligasi untukmembentukplasmid sirkuler semula. 12 atat l5 urutan basa. Pengenalan empat basa menghasilkanfragmen dengan panjang rcta-rata sebanyak 250 pasang basa Ligasi dalam keadaan adanya fragmen DNA lain yangdan karenanya secara umum bermanfaat untuk analisis ataumanipulasi fragmen gen. Gen yang lengkap sering kali mengandung kelompok fosfat bebas menghasilkan plasmidtercakup oleh enzim restriksi yang mengenal enam basa dan rekombinan yang mengandung fragmen DNA, seperti yangmenghasilkan fragmen dengan ukuran rata-rata 4 kbp. Enzim diinsersikan ke DNA sirkuler yang tertutup secara kovalen.restriksi yang mengenal delapan basa menghasilkan fragmen Plasmid harus berada dalam bentuk sirkuler untuk dapatdengan ukuran yang khas, 64 kbp dan berguna untuk analisis bereplikasi di dalam pejamu bakteri.area genetik yang luas. Enzim restriksi yang mengenal lebihdari 10 basa berguna untuk konstruksi peta fisik dan untuk Plasmid rekombinan dapat dimasukkan ke dalam pejamupenentuan tipe molekuler dengan elektroforesis gel pulse- bakteri, sering kali E. coli, dengan cara transformasi. Sebagai alternatif, elektroporasi merupakan prosedur yang dikem-feld. bangkan baru-baru ini yang memasukkan DNA ke dalam bakteri dengan menggunakan gradien eiektris. Sel yang mengalami transformasi dapat dipilih atas dasar satu atau lebih faktor resistensi obat yang disandi oleh gen plasmid. Populasi bakteri yang dihasilkan mengandung satu perpus- takaan plasmid rekombinan yang membawa berbagai fragmen restriksi insersi yang diklon, yang diturunkan dari DNA donor. Teknik hibridisasi dapat dipakai untuk meng-

BAB 7 .i. Genetika Mikroba LL7 A. Fragmen restriksi C. Hibridisasi dari fragmen restriksiUkuran dari Enzim E/H/S Ukuran dari E Enzim E/H/S fragmen E/H E/S E/H E/S (kbp) fragmen (kbp) 4 4 ffisgffiwxl3 3 tlswffi$2 2'I 10,5 0,5 rsilffiffin ffi*FmxwB. Tempat restriksiPanjang (kbp) ITempat darienzim - alatGAMBAR 7-12 A: pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran dengan elektroforesis melalui suatu gel. Fragmen yang lebih kecilbermigrasi lebih cepat dibandingkln dengan fragmen yang besar, dan sampai suatu kisaran yang ditentukan oleh sifat dari gel, jarakmigraii secara kasai sebanding dengan logaritma dari ukuran fragmen. Fragmen DNA dapat divisualisasi berdasarkan atas fluoresensinya,\"*duh diberi pewarnaan dengan suatu zat warna. B: Ukuran dari fragmen restriksi ditentukan oleh lokasi dari tempat restriksi di dalamDNA. pada contoh ini, suatu fragmen 4,0 kilobase pair (kbp) yang dibentukoleh enzim restriksi EcoRl (E) mengandung tempat untukenzimrestriksi Hindlll (H) dan Sall (Siberturut-turut adalah 1,0 dan 3,5 kbp. Pola elektroforesis pada A memperlihatkan bahwa enzim resriksi Etidak memotong fragmen 4,0 kbp (jalur pertama); Pemecahan dengan enzim restriksi H menghasilkan fragmen 3,0 dan 1,0 kbp (jalurkedua); pemecuhun d\"ngun enzim restriksi 5 menghasilkan fragmen 3,5 dan 0,5 kbp (jalur ketiga); dan pemecahan dengan keduanya,bentuk H dan S fragmen 2,5,1,0, dan 0,5 kbp (jalur keempat). Fragmen 0,5 kbp terletak tempat S dan E dipilih sebagai suatu alat untukmenentukan DNA dengan urutan hibridisasi seperti diperlihatkan pada C. C: lndentifikasi dari fragmen hibridisasi. Fragmen restriksidipisahkan seperti pad; A. prosedur hibridisasi memperlihatkan fragmen-fragmen itu yang berhibridisasi dengan alat 0,5 kbp. lni adalahfragmen 4,0 kbp yang dibentuk oleh enzim restriksi E, fragmen 3,0 kbp terletak antara tempat E dan H, dan fragmen 0,5 kbp terletak antaratempat S dan H.identifikasi koloni bakteri yang membawa fragmen DNA subklon (fragmen DNA yang relatif kecil) yang dapat menjadispesifik, atau jika plasmid mengekspresikan gen insersi, koloni subjek analisis yang lebih mendalam yang dapat melibatkandapat disaring.untuk produk gen (Gambar 7-14). proses pengurutan DNA. Selain itu, peta restriksi jugaKARAKTERISASI DNA HASIT KION menyediakan dasar informasi yang sangat spesifik yangPemetaan Restriksi memungkinkan fragmen DNA, diidentifikasi berdasarkan ukuran, dikaitkan dengan fungsi gen spesifik.Manipulasi DNA yang diklon memerlukan pengertian akansekuens asam nukleatnya. Persiapan peta restriksi adalah Pengurutanlangkah pertama untuk dapat memahami hal ini. Peta restriksidisusun, seperti men1.u sun puzzle dari ukuran fragmen yang Pengurutan DNA memperlihatkan struktur gen dan me-dihasilkan melalui proses tunggal yang diperoleh dari enzim mungkinkan peneliti untuk mengambil kesimpulan atasrestriksi individual, dan melalui proses ganda yang dibentuk struktur produk gen. Selanjutnya informasi ini memungkin- kan manipulasi gen dengan tujuan untuk mendapatkandengan pasangan enzim restriksi. Peta restriksi juga pengertian atau melakukan perubahan atas fungsinya. Selainmerupakan langkah awal menuju pengurutan DNA, karena itu, anaiisis sekuens DNA mengungkapkan daerah pengaturproses ini mengidentifikasi fragmen yang akan menghasilkan yang mengontrol ekspresi gen dan \"titik panas\" genetik yang rentan terhadap mutasi. Perbandingan sekuens DNA mem-

ll8 BAGIAN I .3. Dasar-Dasar Mikrobiologi Vektor resipien ampR DNA donor EcoRl tempat EcoRl tempat restri ksi restriksi 5'- GAATTC m*rg;X*Btw! GAATTC 3' 3',- 3' CTTAAG - nro =r I --'* Restriksi I\"o I Restriksi 1 ampR + 5/- G ffinnrrc 3',- cTTAAffi -G-5i TMrIMAATTC O Fosfatase /t...-\" rro c '\" :- cfiAA ffi ampR ,1 ffi I I Hibridisasi pada I t{ujung lengket I ---- I ampR \"c9-\,l&#--rAlaAarI-c *-r. ,c': AATT; -u G c -flAAw#- c--!#\r-xnAnArrGc ;,'..;,\" 6TTAA--i6' -GAN1.-1i-Plasmid rekombinan (Chimeric)GAMBAR 7-13 Pembentukan suatu plasmid rekombinan atau chimeric dari DNA donor dan suatu vector resipien. Vektor, suatu plasmidyang membawa EcoRl tempat restriksi, dipecah oleh enzim dan disiapkan untuk proses ligasi dengan cara pengangkatan grup fosfatterminal. Langkah ini mencegah ujung lengket dari plasmid diligasi dalam keadaan tanpa suatu insert. DNA donor diberi perlaku-an denganenzim restriksi yangampR pada plasmid, sama dan lingkaran yang diikat secara kovalen dibentuk melalui ligasi. Suatu penanda resistensi obat, cdoiltiu. lEisnzdimenjlaanri dapat digunakan untuk memilih plasmid rekombinan sesudah transformasinya ke dalam Escherichiapejamu bakteri melengkapi pengikatan kovalen dari DNA sirkuler dan melakukan mediasi atas replikasinya.

BAB 7 .i. GenetikaMikroba 119 Transfer ke filter ,,n,.,,o*o f Tambahkan alat DNA yang ditandai ,\" Cuci bersih penanda yang tidak terikatOtoradiografGAMBAR 7-14 Pemakaian alat untuk identifikasi klon yang mengandupg fragmen khusus DNA. Koloni dapat ditransfer ke suatu filterdan di-tim sehingga sel-selnya lisis dan DNA menempel pada filter. Lalu filter dapat diperlakukan dengan pemberian suatu larutan yangmengandu ng alat DNA yang ditandai yang cocok, yang secara kh usus berhibridisasi ke klon yang diingin kan. Otoradiograf selanjutnya darifilter mengidentifikasi klon-klon ini (lingkaran-lingkaran gelap). Alternatif lain, klon-klon dapat diperiksa dengan alat dengan antibodiuntuk menentukan apakah mereka sudah menyintesis suatu produk protein yang spesifik.perlihatkan hubungan evolusioner yang menyediakan ke- Sanger (Gamb ar 7 -15) . Metode Sanger yang relatif sederhanarangka kerja untuk klasifikasi yang jelas bagi organisme dan membuat metode ini lebih umum dipakai, tetapi teknikvirus. Perbandingan ini dapat membantu identifikasi daerah Maxam-Gilbert dipakai secara luas karena teknik ini dapatyang dilindungi yang dapat membuktikan fungsi sebagai alathibridisasi khusus untuk mendeteksi organisme atau virus memaparkan daerah DNA yang dilindungi oleh proteindalam sampel klinis. pengikat spesifik terhadap modifikasi kimia. Dua metode yang secara umum dipakai dalam penentuan Pengurutan DNA sangat dimudahkan oleh manipulasi genetik bakteriofaga Ml3 E. coli yang mengandung DNAsekuens DNA adalah teknik Maxam-Gilbert yang meng- untai-tunggal. Bentuk replikatif DNA faga adalah suatuandalkan liabilitas kimia relatif pada ikatan nukleotida yang Iingkaran tertutup kovalen pada DNA untai-ganda yang telahberbeda, dan metode Sanger (terminasi dideoksi) yang direkayasa sedemikian rupa sehingga mempunyai beragam lokasi kloning yang memungkinkan integrasi fragmen DNAmemutus pemanj angan sekuens DNA dengan cara inkorporasidideoksinukleotida ke dalam sekuens. Kedua teknik meng- spesifik yang telah diidentifikasi sebelumnya melalui peme-hasilkan kumpulan oligonukleotida yang dimulai sumber taan restriksi. Bakteri yang terinfeksi dengan bentuk replikatiftunggal dan memerlukan pemisahan pada ge1 pengurutuntaian DNA yang berbeda berdasarkan penambahan ber- menyekresi DNA untai-tunggal termodifikasi yang me-tahap nukieotida tunggal. Gel pengurut poliakrilamida ngandung faga di dalam selubung proteinnya yang mencakupmemisahkan untaian yang berbeda panjangnya dari satu sekuens yang dimasukkan. DNA iniberperan sebagai cetakanhingga beberapa ratus nukleotida dan memperiihatkan untuk reaksi pemanjangan. Asal muasal untuk pemanjangan ditentukan oleh primer DNA yang dapat disintesis oleh mesinsekuens DNA dengan panjang yang beragam. yang sangat otomatis untuk sintesis oligonukleotida secara Empat jalur paralel dengan ge1 yang sama memperlihat- kimia. Mesin ini, yang dapat menghasilkan untaian DNAkan panjang relatif untaian yang mengalami terminasidideoksi pada adenin, sitidin, guanidin, dan timidin. Per- yang mengandung 75 atau lebih oligonukleotida dalam suatubandingan keempat jalur yang mengandung reaksi campuran urutan yang belum ditentukan, sangat penting untuk prosesyang berbeda hanya dalam metode terminasi rantai me-mungkinkannya menentukan urutan DNA melalui metode pengurutan dan untuk modifikasi DNA melalui mutagenesis yang berdasarkan-lokasi.

L20 BAGIAN I * Dasar-Dasar MikrobiologiTerminasi di tempat dugaan regio penyandi, operon dan sekuens regulator diidentifikasi. Sampai saat ini sudah dilakukan pengurutan genom dari sejumlah mikroorganisme yang penting. Analisis lanjutan data sekuens dari patogen manusia yang penting yang digabungkan dengan studi patogenesis molekuler akan membantu kita memahami bagaimana organisme ini me- nimbulkan penyakit dan pada akhirnya akan membantu dalam menemukan vaksin dan strategi pengobatan yang lebih baik. Urutan: CACGTG rgl UTAG E FI ES I S TERA RA H-TE M PATGAMBAR 7-15 Penentuan urutan DNA menurut metode Sanger Sintesis oligonukleotida secara kimiawi membuat peneliti(terminasi dideoksi). Pemanjangan (elongasi) enzimatik DNA mampu melakukan introduksi substitusi basa terkontrol kediinterupsi oleh masuknya analog trinukleotide dideoksi yang dalam sekuens DNA. Substitusi khusus dapat digunakanmasing-masing secara terpisah terkait dengan A, C, G dan T dalam untuk mengeksplorasi efek mutasi yang sudah dirancangcampuran reaksi yang terjadi bersamaan. Hasilnya, yaitu sebelumnya pada ekspresi gen, untuk memeriksa kontribusiserangkaian untaian elongasi yang mengalami interupsi, di- asam amino yang disubstitusi terhadap fungsi protein, ataupisahkan oleh gel pengurut sehingga masing-masing urutan atas dasar informasi sebelumnya tentang residu yang esensialdapat diketahui dengan melihat basa yang terkait dengan untuk fungsi-untuk menonaktifkan suatu gen. Oligonukleo-pemanjangan rantai. Gel pengurut dibaca dari bawah ke atas;masing-masing pita terkait dengan penambahan satu basa. tida untai-tunggal yang mengandung mutasi tertentu Oligonukleotida yang disintesis secara kimia dapat disintesis secara kimiawi dan dihibridisasi ke DNA faga untai- tunggal, yang membawa sekuens tipe-liar sebagai suat:u insertberperan sebagai primer untuk PCR, suatu prosedur yangmemungkinkan amplifikasi dan pengurutan DNA yang (Gambar 7-16). Hasilnya, yaitu dsDNA secara parsialterletak antara primer-primer. Oleh sebab itu, dalam banyakcontoh, DNA tidak perlu diklon untuk tujuan pengurutan dikonversi secara enzimatis menjadi bentuk replikatif untai- ganda lengkap. DNA ini, yang mengandung sekuens tipe-liarataupun rekayasa. pada satu untaian dan sekuens mutan pada untaian lainnya, digunakan untuk menginfeksi pejamu bakteri melalui proses Studi biologi telah mengalami perubahan revolusioner transformasi. Replikasi yang berakibat pada segregasi DNAdengan adanya perkembangan teknologi yang memungkinkan tipe-liar dan mutan, dan gen mutan untai-ganda dapatpengurutan dan analisis genom secara keseluruhan, mulai diisolasi dan selanjutnya di-klon dari bentuk replikatif faga.dari virus hingga mikroorganisme uniseluler prokariota daneukariota hingga manusia. Hal ini difasilitasi oleh pengunaan AFIAI-ISIS trEHGAT* trTSA YAT{G trI-KIOII:prosedur yang dikenal dengan shotgunning. Dalam prosedurini, DNA dipecah-pecah menjadi fragmen random yang lebih ALAT PEftIIER:KSA H I ERItrISASIkecil untuk menciptakan perpustakaan fragmen. Fragmenyang tidak beraturan ini diurutkan dengan pengurut DNA AIat pemeriksa hibridisasi (southern blotting, Iihat Gambarotomatis dan disusun kembali dalam susunan yang benar 3-4) digunakan secara rutin dalam klon DNA. Urutan asammenggunakan perangkat lunak komputer yang sangat amino suatu protein dapat digunakan untuk menyimpulkancanggih. Sejumlah fragmen yang cukup diurutkan untuk urutan DNA, tempat alat pemeriksa dapat dibuat dan dipakaimemastikan cakupan yang adekuat dari genom sehingga untuk mendeteksi suatu koloni bakteri yang mengandung genketika mereka disusun kembali, sebagian besar genom yang di-klon. DNA komplementer atau cDNA, disandi olehterwakilkan tanpa menyisakan terlalu banyak celah. (Untuk mRNA, dapat digunakan untuk mendeteksi gen yangmencapai hal ini, seluruh genom biasanya mencakup lima menyandi mRNA tersebut. Hibridisasi DNA ke RNA olehhingga delapan kali lipat, menyisakan sekitar 0,17o dari total Northern blots dapat menyediakan informasi kuantitatifDNA yang tidak terurut.) Sesudah fragmen acak disusun tentang sintesis RNA. Sekuens DNA spesifik dalam fraginenberdasarkan area sekuens yang tumpang tindih, setiap celah restriksi yang dipisahkan di atas gel, dapat diperlihatkan olehyang ada dapat diidentifikasi dan ditutup. Pemrosesan data Southern blofs, suatu metode yang menggunakan hibridisasilanjut memungkinkan pemberian keterangan data sekuens DNA ke DNA. Kedua blot ini dapat digunakan untuk mendeteksi fragmen restriksi yang tumpang tindih. Pengklonan fragmen ini memungkinkan pengisolasian regio pengapit DNA dengan teknik yang dikenal sebagai chromo- somal walking. Dengan Western b/ofs, teknik deteksi lain yang sering dipakai, antibodi dipakai untuk mendeteksi gen yang di-klon dengan cara pengikatan ke produk protein mereka.

BAB 7 * GenetikaMikroba t2l6tCGTGc46.Urutan tipe\:!::yy. . -Tsnk;-.*/ )Ceta kan cetakan Transformasi menjadi bakteri pejamu Heterodupleks replikatif Bentuk mutan replikatif Bentuk tipe liar replikatifGAMBAR 7-16 Mutagenesis menurut lokasi. Primer hasil sintesis kimiawi yang mengandung mutasi G (dalam kotak) terhibridisasimenjadi urutan tipe liar yang dimasukkan ke dalam DNA dari faga beruntai tunggal. Reaksi polimerisasi dipergunakan untuk membentukheterodupleks beruntai ganda yang membawa mutasi ini di satu untainya. Masuknya heterodupleks replikatif ke dalam bakteri pejamu,diikuti oleh segregasinya, menghasilkan galur-galur turunan yang membawa bentuk replikatif dengan sisipan tipe liar atau sisipan yangmengandung mutasi kimia. Alat pemeriksa dapat dipakai untuk berbagai prosedur yang diklon yang berhubungan dengan regio spesifik DNA.analitik. Beberapa bagian DNA manusia memperlihatkan Ajur yang lebih besar memberikan keteiitian yang lebih besarvariabilitas mendasar dalam hal distribusi tempat restriksi.Variabilitas ini disebut polimorfisme pembatasan panjang karena ajur ini kurang sensitif terhadap perubahan basa tunggal pada DNA target. Di lain pihak, reaksi hibridisasifragmen (RFIP). Alat pemeriksa oligonukleotida yang terjadi lebih cepat dengan ajur kecil, dan alat ini dapatberhibridisasi dengan fragmen DNA RFLP dapat digunakan dirancang dalam menghadapi daerah teriindung pada DNA tempat substitusi basa jarang terjadi. Amplifikasi targetuntuk menelusuri DNA dari sampel kecil donor manusianya.Oleh sebab itu, teknik ini bermanfaat untuk ilmu forensik. dengan PCR, yang diikuti oleh deteksi produk yangAplikasi RFLP dalam bidang kedokteran meliputi identifikasi diamplifikasi sesudah hibridisasi ke ajur, terbukti lebih sensitifarea genetik yang berkaitan erat dengan gen manusia denganpasangan disfungsi darl penyakit genetik. Informasi ini telah daripada metode deteksi langsung.dan akan terus menjadi alat bantu yang berharga dalam Akhir-akhir ini, metode percobaan diagnostik molekulerkonseling genetik. mengalami kemajuan pesat, terutama teknologi amplifikasi Alat pemeriksa DNA menjanjikan teknik pemeriksaan yang menginkorporasi asam nukleat seperti PCR. Beberapauntuk identifikasi cepat organisme tertentu dari spesimen instrumen komersial telah tersedia dalam bentuk kombinasiklinis yang sulit dikultur di laboratorium mikrobiologi. amplifikasi PCR DNA target dengan pendeteksian ampliconSelanjutnya, pengembangan teknik memberikan kesempatanuntuk mengidentifikasi agen patogen dengan cepat dan dalam saluran tertutup yang sama. Teknologi ini dikenalIangsung di jaringan yang terinfeksi. Perlengkapan untuk sebagai PCR waktu-nyata, menunjukkan bahwa ampliconidentifikasi berbagai patogen bakteri dan virus tersedia secara PCR dapat dideteksi dalam waktu nyata. Pada keadaan yang sebenarnya, \"waktu nyata' merujuk pada deteksi ampliconkomersial. Aplikasi ajur diagnostik DNA memerlukan penilaian atas sesudah tiap siklus PCR. Format deteksi ajur melibatkan( 1) ajuritusendiri (2) sistemyangdigunakanuntukmendeteksi pendeteksian fluorofor. Hasilnya bersifat semi-kuantitatif danajur, (3) target (DNA yang dihibridisasi oleh ajur), dan (4) dapat diperoleh dalam waktu yang jauh lebih singkatkeadaan hibridisasi. Ajur dapat berupa fragmen restriksi dibandingkan jika menggunakan pemeriksaan PCR kon-relatifbesar yang diturunkan dari DNA atau oligonukleotida vensional.

L22 BAGIAN I .1. Dasar-Dasar MikrobiologiMANIPULASI KLON DNA rentan, seperti selada selama musim ketika mungkin terjadi sedikit pembekuan. Bakteri mutan yang tidak membentukTeknik rekayasa genetik memungkinkan pemisahan dan kristal es didesain oleh ahli mikrobiologi yang berharapekspresi yang sepenuhnya bebas pada gen yang berkaitandengan patogen. Vaksin yang dibuat dengan gen yang bahwa organisme mutan ini dapat rirelindungi hasil panendirekayasa memberikan tindakan keamanan yang tidak dapatdicapai sebelumnya. Contohnya, suatu vaksin dapat dibuat selada dengan cara mempergunakan sementara lingkunganterhadap protein mantel virus yang diproduksi dalam keadaan yang normainya dihuni oleh galur pembentuk-es, tetapi usahatanpa adanya gen yang berkaitan dengan fungsi replikatif menggunakan organisme mutan dalam studi lapangan yang menuai banyak protes, dan studi baru hanya dilanjutkanvirus; inokulasi dengan vaksin seperti ini mungkin tidak setelah suatu penundaan hukum yang panjang dengan biayamembawa risiko fungsional virus yang dibuat. Kesulitanpotensial dalam mengembangkan vaksin seperti ini berasal besar. Presedensi hukum yang timbul dari masalah ini dandari mudahnya terjadi mutasi virus yang akan menghasilkan aplikasi yang berkaitan akan membentuk panduan untukvarian genetik yang tidak dikenali oleh sistem pertahanan penggunaan yang progresifdan menguntungkan dari teknikimun individu yang telah divaksinasi. Pada akhirnya, vaksinsekarang (dan pada masa yang akan datang) mengandung rekayasa genetik dan memfasilitasi penentuan situasi ketikasejumlah kisaran protein yang mengantisipasi respon genetikpatogen. kewaspadaan ekstrem dibenarkan.Galur Rekombinan di dalam Lingkungan Pf, RTAI{YAAH U I.AilIIGANSebagian besar kemajuan ilmiah kadang-kadang men- 1. Mutasi pada bakteri dapat terjadi dengan mekanismedatangkan reaksi publik yang berlawanan, karena itu adalahbijaksana untuk mempertimbangkan konsekuensi potensial apa, di bawah ini.dari rekayasa genetika. Yang akhir-akhir ini paling di- (A) Substitusi basa (B) Delesikhawatirkan adalah patogen yang dikenal mengalami relatifsedikit modifikasi genetik. Hal ini telah dan harus diinvesti- (C) Insersigaii di laboratorium yang khusus dibuat untuk itu. Keperluanuntuk penahanan berkurang sesudah gen untuk fungsi (D) Pengaturan kembalikhusus, seperti mantel protein, dipisahkan dari gen yang (E) Semua jawaban di atasberkaitan dengan repiikasi atau toksisitas suatu patogen. 2. Bentuk pertukaran genetik dengan DNA donor di-Untuk sebagian besar, kewaspadaan standar yang berkaitandengan laboratorium mikrobiologi harus diawasi, jika tidak introduksi ke resipien melalui suatu virus bakterialada alasan lagi selain mereka mengembangkan kebiasaanbahwa suatu patogen potensial harus ada dalam labo- adalah:ratorium. (A) Transformasi Pengecualian menarik dari aturan umum ini adalah (B) Konjugasiorganisme hasil rekayasa yang memberikan keuntungan (C) Transfeksisosial jika berada dalam lingkungan. Banyak organisme (D) Transduksitersebut diturunkan dari bakteri non patogen yang ada di (E) Transferhorizontal 3. Bentuk pertukaran genetik pada bakteri yang palingalam dengan frekuensi hingga sebesar 10s/g tanah. Bukti yangada memperkirakan pemangsaan dan kompetisi secara cepat rentan tehadap aktivitas deoksiribonuklease seiamamengeliminasi galur bakteri hasil rekayasa setelah bakteritersebut diintroduksi ke dalam lingkungan. Tantangan utama proses ambilan DNA adalah:adalah secara ideal mempertahankan organisme rekayasa (A) Transformasiyang secara biologis menguntungkan di alam daripadamengeliminasi mereka. Namun, hal ini bukan tanpa (B) Konjugasikonsekuensi sosial. Beberapa contoh di antaranya adalah (C) Transfeksiga\w Pseudomonas yang menghasilkan protein yang mem-bantu pembentukan kristal es. Penilaian organisme tipe-liar (D) Transduksi (E) Semua jawaban di atasini diberikan oleh pemilik sarana ski yang telah meng-introduksi bakteri ini dengan sengaja ke dalam lingkungan 4. Replikasi yang mana di bawah ini yang memerlukantanpa menimbulkan kekhawatiran publik. Efek samping yang integrasi fisik dengan replicon bakteri?merugikan dari introduksi organisme ini adalah kristal es (A) Bakteriofaga DNA untai-tunggalyang dikembangkannya dapat mencederai hasil panen yang (B) Bakteriofaga DNA untai-ganda (C) Bakteriofaga RNA untai-tunggal (D) Plasmid ' (E) Transposon 5. Pembentukan pasangan kawin selama proses konjugasi pada E s cherichia coli membutuhkan: (A) Lisis dari donor (B) Pilus seks (C) Transfer kedua untaian DNA (D) Endonuklease restriksi (E) Integrasitransposon

BAB 7 .1. Genetika Mikroba 123Jawaban Condon C: RNA processing and degradation tn Bacillus subtilis.1.E Microbiol Mol Biol Rev 2003;67:157. IPMID: 12794188)2.D Drlica K, Riley M (editors): The Bacterial Chromosome. American3.A4.E Society for Microbiology, 1990.5.8 Fraser CM, Read TD, Nelson KE (editors): Microbial Genomes.REFEREHSI Humana Press,2004.Alberts B et al: Molecular Biology of the Cell,4th ed. Garland, Grohmann E, Muuth G, Espinosa M: Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 2002.Ausubel FM et al: Current Protocols in Molecular Biology.Wiley' 2003 ;67 :27 7 . [PMID : r27 9 4193) 1987. Hatfull GF: Bacteriophage genomics. Curr Opin Microbiol.'Avery O., Mcleod C, McCarty M. Studies on the chemical nature 2008:5:447. of the substance inducing transformation of pneumococcal tlpes: Induction of transformation by a desoxyribonucleic Koonin EV Makarova KS, Aravind L: Horizontal gene transfer in acid fraction isolated from pneumococcus tpe III. I Exp Med prokaryotes: Quantification and classification' Annu Rev 19 44:7 9 (2) :r37. IPMID: t987 13591 Microbiol 2007;55:709. [PMID: 11544372)Bushman F: lateral DNA Transfer Mechanisms and Consequences. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002. Kornberg A, Baker T: DNA Replication, 2nd ed. Freeman, 1992.Charlebois RL (editor): Organization of the Prokaryotic Genome' American Society for Microbiology, 1999. Lengler JW, Drews G, Schlegel HG (editors): Biology of the Prokaryotes. Blackwell Science, 1999. Liebert CA, Hall RM, Summers AO: TransposonTn2l, flagship of the floating genome. Microbiol Mol Biol Rev 1999;63:507. IPMID: 10477306]

t24