5. Pembiakan Mikroorganisme

Pem biakan M i kroorganismePembiakan adalah proses memperbanyak organisme pelepasan energi bebas ketika proton masuk ke sitoplasmadengan memberikan keadaan lingkungan yang tepat. dari luar membran. Proses metabolik yang menin-rbulkanMenumbuhkan mikroorganisme adalah membuat replika gaya gerak proton dibahas dalam Bab 6. Energi bebasdari mikroorganisme tersebut, dan memerlukan unsur-unsur yang ada daiam komposisi kimianya. Zat makanan dapat digunakan untuk menggerakkan sel, untukharus menyediakan unsur-unsur.tersebut dalam bentuk mempertahankan gradien ionik atau molekular padayang dapat diatr<ses secara metabolik. Selain itu, organisme membran, untuk menyintesis ikatan anhidrida pada AIP,memerlukan energi metabolik untuk menyintesis atau kombinasi berbagai tujuan ini. Alternatifnya, sel-sel yang mendapatkan sumber ATP dapat menggunakanmakromolekul dan mempertahankan gradien kimia'yang energi ikatan anhidridanya untuk membentuk gaya gerakpenting pada membrannya. Faktor-faktor yang harus proton yang dapat digunakan untuk menggerakkan seldiatur selama pertumbuhan mikroorganisme adalah zat dan mempertahankan gradien kimia.makanan, pH, temperatur, aerasi, konsentrasi garam, dankekuatan ionik pada medium. Untuk tumbuh, suatu organisme memerlukan semua unsur dalam bahan organiknya dan seluruh ion pelengkapPERSYARATAN UNTUK yang diperlukan untuk proses kerja dan katalisis. Seiain itu, harus ada sumber energi untuk menghasilkan gayaPERTUMBUHAN gerak proion dan memungkinkan terjadinya sintesis makromolekular. Kebutuhan zat makanan dan sumberSebagian besar berar kering mikroorganisme adalah bahan energi metabolik pada mikroorganisme sangat beragam.organik yang mengandung unsur-unsur karbon, hidrogen, SUMBER ENERGI METABOLIKnitrogen, oi<sigen, fosfor, dan sulfur. Selain itu, ion-ionanorganik seperti kalium, natrium, besi, magnesium, Tiga mekanisme utama untuk menghasilkan energikalsium, dan klorida diperlukan untuk memfasilitasikatalisis enzimatik dan untuk mempertahankan gradien metabolik adalah fermentasi, respirasi, dan fotosintesis.kimia pada membran sel. Jika organisme sedang tumbuh, sekurangnya satu Sebagian besar bahan organik berupa makromolekulyang dibentuk oleh ikatan anhidrida antarunsur-unsur mekanisme tersebut harus digunakan.pembangunnya. Sintesis ikatan anhidrida memerlukanenergi kimia, yang dihasilkan oleh dua ikatan fosfodiester Fermentasidalam ATP (adenosin trifosfat; lihat Bab 6). Untuk Pembentukan ATP dalam fermentasi tidak dibarengimempertahankan komposisi sitoplasma y^ng relatif dengan transfer elektron. Fermentasi ditandai dengan fosforilasi substrat, suatu proses enzimatik yang secarakonstan selama pertumbuhan dalam berbagai iingkungan langsung memberikan ikatan pirofosfat pada ADPkimia ekstrasel, diperlukan energi tambahan yang (adenosin difosfat) lewat suatu zar ant^ra metabolik yangdihasilkan dari gaya gerak proton. Gaya gerak proton terfosforilasi. Zat antara yang terfosforilasi dibentuk olehadalah energi potensial yang dapat dihasilkan dari aliranproton melewati membran. Pada eukariot, membran penataan ulang metabolisme suatu substrat yang dapatmungkin merupakan bagian dari mitokondrion atau difermentasi seperti glukosa, laktosa, atau arginin. Karenakloroplas. Pada prokariot, membran adalah membran fermentasi tidak disertai dengan perubahan keseluruhan status oksidasi-reduksi dari substrat itu, komposisi dasarsitoplasma sel. hasil fermentasi harus identik dengan komposisi substrat tersebut. Misalnya, fermentasi molekul glukosa (C6Hr106) Gaya gerak proton adalah gradien elektrokimia melalui jalur Embden-Meyerhof (lihat Bab 6) menghasilkandengan dua komponen: perbedaan pH (konsentrasi ion dua ikatan pirofosfat dalam ATP dan menghasilkan duahidrogen) dan perbedaan muatan ion. Muatan di sisi luar molekul asam laktat (C3H6O3).membran bakteri iebih positif daripada muatan di sebelahdalam, dan perbedaan muatan ini akan menyebabkan 63

64 BAB 5Respirasi yang dapat diasimilasi. Naftalen, misalnya, dapat menyediakan semua karbon dan energi yang diperlukanRespirasi analog dengan serangkaian proses bergantung- pada respirasi untuk pertumbuhan heterotrofik, tetapienergi yang terjadi pada peristiwa pelepasan energi dari sangat sedikit organisme yang memiliki jalur metabolik yang diperlukan untuk asimilasi naftalen. Di lain pihak,suatu baterai. Reduksi kimia terhadap suatu oksidan(akseptor elektron) melalui rangkaian khurrl, pembawa Glukosa dapat menunjang pertumbuhan fermentatif atauelektron di dalam membran menimbulkan gaya gerak respiratorik pada banyak organisme. Substrat pertumbuhanproton pada membran bakteri. Reduktan (donor elektron)dapat berupa zat organik arau anorganik: Misalnya, asam harus disuplai pada kadar yang sesuai untuk strain mikroba yang sedang ditumbuhkan: Kadar yang akanlaktat bekerja sebagai suatu reduktan untuk beberapaorganisme, dan gas hidrogen adalah suatu reduktan untuk menunjang pertumbuhan satu organisme dapatorganisme lain. Gas oksigen (Or) sering digunakan sebagai menghambat pertumbuhan organisme lain.oksidan, tetapi oksidan alternatif yang digunakan oleh Karbon dioksida diperlukan untuk sejumlah reaksibeberapa organisme adalah karbon diolaida (COr), sulfat(SO42-), dan nirrat (NO3J. biosintetik. Banyak organisme respiratorik menghasilkanFotqsintesis karbon dioksida iebih dari cukup untuk memenuhi kebutuhan tersebut, retapi organisme yang iainFotosintesis menyerupai respirasi dalam hal reduksi suatu memerlukan sumber karbon dioksida dalam mediumoksidan melalui serangkaian pembawa eiektron khususyang menimbulkan gaya gerak proton. Perbedaan kedua perrumbuhannya.proses itu adalah pada fotosintesis, reduktan dan oksidandibentuk secara fotokimiawi oleh energi cahaya yang Sumber Nitrogendiserap pigmen dalam membran; oleh karena iru,fotosintesis hanya dapat terus berlangsung selama ada Nitrogen adalah komponen utama dari prorein dan asamsumber energi cahaya. Tanaman dan beberapa bakteri nukleat, mencakup sekitar 10% dari berat kering sel bakteri yang khas. Nitrogen dapat disuplai dalam berbagaimampu menyimpan sejumlah energi cahaya saatmemanfaatkan air sebagai reduktan untuk karbon bentuk, dan kemampuan mikroorganisme untukdioksida. Dalam proses ini, digunakan oksigen dandihasilkan bahan organik. Respirasi, oksidasi bahan mengasimilasi nitrogen juga berbeda-beda (Tabel 5-1).organik oleh akseptor elektron seperti oksigen yang Produk akhir dari semua jalur asimilasi nitrogen adalah bentuk yang paling tereduksi dari unsur nitrogen, yaitumenguntungkan dalam proses pembentukan energi, dapat ion amonium (NH4-).memberikan energi bagi organisme fotosintetik dalamkeadaan tanpa cahaya. Banyak mikroorganisme memiliki kemampuan untukNUTRISI mengasimilasi nitrat (NO3-) dan nitrit (NOr-) secaraNutrisi pada medium pertumbuhan harus mengandung reduktif dengan mengubah ion ini menjadi amonia (NH3).semua unsur yang diperlukan untuk sintesis organismebaru secara biologis. Pada diskusi selanjutnya, nutrisi Jalur asimilasi tersebut berbeda dengan jalur yangdigolongkan berdasarkan unsur-unsur yang disuplainya. digunakan untuk disimilasi nitrat dan nitrit. JalurSumber Karbon disimilasi digunakan oleh organisme yang memakai ion- ion tersebut sebagai akseptor elektron terminal dalamSeperti telah disebutkan sebelumnya, tanaman dan respirasi; proses tersebut dikenal sebagai denitrifikasi,beberapa bakteri mampu menggunakan energi fotosintetik dan hasilnya adalah gas nitrogen (Nr), yang dilepaskanuntuk mereduksi karbon dioksida dengan menggunakan ke dalam atmosfer.air. Organisme tersebut masuk dalam kelompok autotrof,makhluk yang tidak memerlukan nutrisi organik untuk Kemampuan mengasimilasi N, secara reduktif melalui NHr, IanB disebut fiksasi nitrogen, adaiah suatu sifatpertumbuhannya. Autotrof jenis lainnya adalah yang unik untuk prokariot, dan relatif sedikit bakterikemolitotrof, organisme yang menggunakan substrat yang memiliki kapasitas metabolik ini. Proses inianorganik seperti hidrogen atau riosuifat sebagai suatureduktan dan karbon dioksida sebagai sumber karbon. memerlukan sejumlah besar energi metabolik dan mudah Heterotrof memerlukan karbon organik untuk Tabel 5-1 . Sumber nitrogen dalam makanan mikrobapertumbuhan, dan karbon organik harus dalam bentuk Noi Valehsi, N5,1;;; Not +5 N2 +3 NHo- R-NH21 0 3 1R = radikal organik. -?

PEMBIAKAN MIKROORGANISME / 65l,.lnit perri:angun Hzo Makralnolekul 10 A Protein Asam amino Hzo Asam nukleatMononukleotid Hzo > Polisakarida Monosakarida A Prekursor isoprenoid Asam lemakGamhar 5-1. Sintesis makromolekul. Polimerisasi unit pembangun menjadi makromolekulterutama dilakukan denganmemasukkan ikatan anhidrida. Pembentukan asam lemak dari asetat memerlukan beberapa tahap reduksi biokimiayang menggunakan donor hidrogen organik (D . Hr).diinaktivasi oleh oksigen. Kapasitas untuk fiksasi nirrogen Sumber Fosforditemukan pada berbagai bakteri yang telah mengembangkanstrategi biokimia yang berbeda-beda untuk melindungi Fosfat (POr3-) diperlukan sebagai suatu komponen AIBenzim pemfiksasi nitrogennya dari oksigen. asam nukleat, dan koenzirn-koenzim seperti NAD, NADB dan flavin. Selain itu, banyak metabolit, lipid Sebagian besar mikroorganisme dapat menggunakan (fosfolipid, lipid A), komponen dinding sel (asam teikoat),NHr' sebagai satu-satunya sumb€r nitrogen, dan banyak beberapa polisakarida kapsular, dan beberapa proreinorganisme memiliki kemampuan untuk menghasilkan mengalami fosforilasi. Fosfat selalu diasimiiasi .sebagaiNH.- dari amina (R-NHr) atau dari asam amino fosfat anorganik bebas (P,).(RCHNHTCOOH). Produksi amonia dari deaminasiasam amino disebut amonifikasi. Amonia dimasukkan Sumber Mineralke dalam bahan organik melalui jalur biokimia yang Berbagai mineral diperlukan untuk fungsi enzim. Ionmelibatkan glutamat dan glutamin. Jaiur-jalur tersebut magnesium (Mg'-) dan ion fero (Fe'z.) juga ditemukandibahas dalam Bab 6. dalam derivat porfirin: magnesium dalam rnolekul klorofil, dan besi sebagai bagian dari i<oenzim sitokrom danSumber Sulfur peroksidase. M92- dan K. penting untuk fungsi dan integritas ribosom. Ca2- diperlukan sebagai komponenSeperti nitrogen, sulfur adalah komponen dari banyal< dinding sei gram positif, meskipun mineral ini kadang-substansi sel organik. Suifur membentuk sebagian strukturbeberapa koenzim dan ditemukan pada rantai samping kadang tidak diperlukan oieh bakteri gram negatif. Banyakprotein, yaitu sisteinil dan metionil. Sulfur dalam bentuk organisme laut memerlukan Na' untuk pertumbuhannya.dasar tidak dapat digunakan oleh tanaman atau hewan.Namun, beberapa bakteri autotrofik dapat mengoksidasinya Dalam memformulasikan suatu medium untukmenjadi sulfat (SOr'z-). Kebanyakan mikroorganisme dapar pembiakan sebagian besar mikroorganisme, kita harusmenggunakan sulfat sebagai sumber sulfur, yang mereduksi memberikan sumber kalium, magnesium, kalsium, dan besi, biasanya dalam bentuk ion-ionnya (K-, Mg2., Ca'?t,sulfat menjadi hidrogen sulfida (HrS). Beberapa dan Fe2'). Banyak mineral lain (misal, Mn2', Mo2-, Co2', Cu2-, dan Zn2-) yang juga diperlukan; mineral-mineralmikroorganisme dapat mengasimilasi HrS secara langsung tersebut sering dijumpai dalam air ledeng atau sebagai kontaminan pada bahan-bahan medium yang 1ain.dari medium pertumbuhan, tetapi senyawa tersebutbersifat toksik bagi banyak organisme.

66 BAB 5 Pada banyak bakteri dan fungi, ambilan besi, yang Bila menggunakan medium cair; medium dapat dibuatmembentuk hidroksida tak larut pada pH netral, dalam bentuk gel untuk tujuan khusus dengan caradi fasili tas i oleh siderofor yan g dihasilkannya--senyawa- menambahkan agar atau gei silika. Agar, suatu ekstraksenyawa yang dengan besi membentuk kelat sehingga polisakarida dari alga laut, sangat cocok untuk pembiakanmempermudah transpornya sebagai suatu kompleks yang mikroba karena resistan terhadap kerja mikroba dan karena larut pada suhu 100 0C tetapi tidak menjadi geldapat larut. Senyawa-senyawa tersebut termasukhidroksamat (-CONHTOH) yang disebut sideramin, sebelum suhu turun di bawah 45 0C; sel-sel dapatdan derivat katekol (misal, 2,3-dihidroksibenzoilserin). disuspensi dalarn medium pada suhu 45 0C dan mediumSiderofor yang ditentuLan oleh plasmid berperan penting secara cepat didinginkan menjadi suatu gel tanpa merusakdalam kemampuan invasi beberapa patogen bakterial(lihat Bab 7). sel-sel tersebut.Faktor Pertumbuhan Zat MakananFaktor pertumbuhan adalah suatu senyawa organik yang Pada halaman sebelumnya, dijelaskan fungsi masing-harus dimiliki sel agar dapat tumbuh, tetapi sel tersebuttidak mampu menyintesisnya; Banyak mikroorganisme, masing jenis zat makanan dan telah disajikan daftar bahanbila diberikan zat-zat makanan yang telah disebutkan di yang sesuai. Pada umumnya, hal berikut harus ada: (1)atas, mampu menyintesis semua unit pembangun donor dan akseptor hidrogen: sekitar 2 glL; (2) sumbermakromolekul (Gambar 5-1): asam amino; purin, karbon: sekitar I glL; (3) sumber nitrogen: sekitar 1 g/pirimidin, dan pentosa (prekursor metabolik asam L; (4) mineral: sulfur dan fosfor, masing-masing sekitarnukleat); karbohidrat tambahan (prekursor polisakarida); 50 mglL, dan unsur renik (trace element), ma.sing-masingdan asam lemak serta senyawa isoprenoid. Selain itu, 0,1-1 mg/L; (5) faktor pertumbuhan: asam amino, Purin,organisme yang hidup bebas harus mampu menyintesis dan pirimidin, masing-masing sekitar 50 mg/L, dan berbagai vitamin, masing-masing 0,1-1 mg/L.kompleks vitamin yang berperan sebagai prekursor Untuk studi metabolisme mikroba, kita biasanya haruskoenzim. menyiapkan medium yang seluruhnya sintetik, sehingga karakteristik dan konsentrasi setiap bahan diketahui. Masing-masing senyawa penting tersebut disintesis dengan tepat. Sebaliknya, penggunaan bahan-bahan alami seperti ekstrak ragi, sari protein, ata\t zat-zat serupa akanmelalui serangkaian reaksi enzimatik yang berlainan; lebih murah dan iebih mudah. Sebagian besar mikrobamasing-masing enzim diproduksi di bawah kontrol gen yang hidup bebas akan tumbuh baik pada ekstrak ragi;spesifik. Bila suatu organisme mengalami mutasi gen yang berbagai bentuk parasit mungkin memerlukan zat khususmenyebabkan kegagalan fungsi salah satu enzim ini, rantai yang hanya ditemukan dalam darah atau ekstrak jaringanakan rusak dan produk akhir tidak lagi dihasilkan. hewan. Meskipun demikian, ada mikroba parasit (misal,Kemudian, organisme harus memperoleh senyawatersebut dari lingkungan: Senyawa tersebut telah menjadi Tleponema pallidum) yang tidak dapat tumbuh in uitrofaktor pertumbuhan bagi organisme tadi. Jenis mutasi atau yang tumbuh di dalam sel-sel eukariot (misal,ini dapat diinduksi dengan mudah dalam laboratorium. Ch lamydia trach ornatis) . Spesies mikroba yang berbeda membutuhkan faktor Untuk banyak organisme, satu senyawa (seperti asampertumbuhan yang sangat berbeda pula. Senyawa-senyawayang terlibat ditemukan dalam organisme dan penting amino) dapat berperan sebagai sumber energi, sumberbagi semua organisme; perbedaan kebutuhan mencerminkan karbon, dan sumber nitrogen; organisme yang lainperbedaan kemampuan sintetiknya. Beberapa spesies memerlukan senyawa yang berbeda untuk masing-masingtidak memerlukan faktor pertumbuhan, sementara yanglain-seperti beberapa laktobasilus-telah kehilangan, sumber. Jika bahan-bahan alami untuk mediumselama evolusi, kemampuan menyintesis sebanyak 30- nonsintetik kekurangan salah satu zat makanannya, zat40 senyawa penting sehingga memerlukan faktor makanan tersebut harus disediakan tersendiri.pertumbuhan tersebut di dalam mediumnya. Konsentrasi lon Hidrogen (pH)FAKTOR.FAKTOR LI NGKUNGAN YANGMEMENGARUHI PERTUMBUHAN Sebagian besar organisme memiliki kisaran pH optimal yang cukup sempit. pH optimal harus ditentukan secaraMedium pertumbuhan yang cocok harus mengandung empiris untuk masing-masing spesies. Sebagian besarsemua zat makanan yang diperlukan oleh organisme agar organisme (neutralofil) paling baik tumbuh pada pH 5,0-dapat dibiakkan, dan berbagai faktor seperti pH, 8,0, meskipun beberapa bentuk (asidofil) mempunyai pHtemperatur, dan aerasi harus dikontrol secara cermat. optimal 3,0 dan yang lain (alkalifil) mempunyai pH optimal 10,5. Mikroorganisme mengatur pH internalnya terhadap rentang nilai pH eksternal yang cukup luas. Asidofil

PEMBIAKAN MIKROORGANISME / 67mempertahankan pH internal sekitar 6,5 pada kisaran pada ekstrak sel. Mikroorganisme dengan tanaman danpH eksternal 1,0-5,0; neutralofil mempertahankan pH hewan sama-sama memiliki respons syok-panas, berupainternal sekitar 7,5 pada kisaran pH eksternal 5,5-8,5; sintesis sesaat seperangkat \"protein syok-panas\", biladan alkalifil mempertahankan pH internal sekitar 9,5 padakisaran pH eksternal 9,0-11,0. pH internal diatur oleh terkena suhu yang tiba-tiba meningkat di atas suhuseperangkat sistem transpor proton dalam membran optimum pertumbuhan. Protein-protein tersebut tampaksitoplasma, termasuk sistem transpor primer, yaitu pompa sangat tahan terhadap panas dan dapat menstabilkanproton yang digerakkan oleh ATP, dan penukar Nat/H-. protein-protein sel yang sensitif terhadap panas.Sistem pertukaran K'/H- diduga juga ikut berperan Hubungan antara kecepatan pertumbuhan dengandalam pengaturan pH internal pada neutralofii. temperatur pada setiap mikroorganisme diperlihatkan pada kurva Arrhenius yang khas (Gambar 5-2). ArrheniusTemperatur memperlihatkan bahwa logaritme kecepatan realsi kimia tertentu (log k) adalah fungsi linear yang berbandingSpesies mikroba yang berbeda membutuhkan suhu terbalik dengan temperatur (1/T); karena pertumbuhanoptimal yang amat beragam untuk pertumbuhannya: sel disebabkan oleh serangkaian reaksi kimia, diharapkanBentuk psikrofilik tumbuh paling baik pada temperaturrendah (i5-20 0C); bentuk mesofilik tumbuh paling baik akan terlihat hubungan seperti ini. Gambar 5-2pada 30-37 0C; dan sebagian besar bentuk termofiliktumbuh paling baik pada 50-60 0C. Sebagian besar memperlihatkan keadaan tersebut, yang berlaku untukorganisme adalah mesofilik; 30 0C adalah suhu optimal rentang temperatur yang normal pada suatu spesies; loguntuk banyak bentuk mikroba yang hidup bebas, dan k menurun secara linear sebanding dengan 1/T. Namun,temperatur tubuh pejamu adalah suhu yang optimal untuk di atas dan di bawah kisaran normal ini, log k turunsimbiosis hewan berdarah panas. secara cepat sehingga nilai temperatur maksimum dapat Batas atas rentang temperatur yang dapat ditoleransi ditentukan.oleh setiap spesies berhubungan erat dengan stabilitastermal dari protein spesies tersebut seperti yang diukur Diluar pengaruhnya terhadap kecepatan per- A tumbuhan, temperatur yang tinggi akan membunuh mikroorganisme. Panas berlebih digunakan untuk I mensterilisasi preparat (lihat Bab 4); dingin yang hebat I juga membunuh sel mikroba, meskipun tidak dapat digunakan secara aman untuk sterilisasi. Bakteri jugall memperlihatkan fenomena yang disebut syok dingin:Jo pembunuhan sel akibat pendinginan yang cepat (kebalikan dari yang lambat). Misal, pendinginan Escherichia coli .E secara cepat dari 37 0C sampai 5 0C dapat membunuh \t4 90% sel. Sejumlah senyawa dapat melindungi sel dari E J(! pembekuan atau syok dingin; gliserol dan dimetil II sulfoksida paling sering digunakan. I Aerasi I Peran oksigen sebagai akseptor hidrogen dibahas pada I Bab 6. Banyak organisme adalah obligat aerob, yang secara Iv spesifik memerlukan oksigen sebagai akseptor hidrogen; Temperatur . Tenmopremraatul r_Ii. Temperatur , beberapa organisme bersifat fakultatif, mampu hidup tinggi secara aerob maupun anaerob; dan organisme yang lain rendah adalah obligat aerob, memerlukan zat selain oksigen sebagai akseptor hidrogen dan menjadi sensitif terhadap 1/T (\"K) inhibisi oksigen.Gambar 5-2. Bentuk umum dari kurva Arrhenius pada Produk sampingan alami dari metabolisme aerobpertumbuhan bakteri. (Menurut lngraham JL, Maalse 0, Neidhardt adalah senyawa-senyawa reaktif, yaitu hidrogen peroksida (HrOr) dan superoksida (Or-). Dengan adanya besi, duaFC. Growth of the Bacierial Cell Sinauer Associates, 1 983.) r.n a*a tersebut dapat membentuk radikal hidroksil ('OH), yang dapat merusak setiap makromolekul biologis: 02- +H2o2-ld./Fui--62 +oH- +'oH

68 BAB.5Banyak aerob dan anaerob aerotoleran dilindungi dari dalam larutan gula yang kuat, faktor-faktor tersebut harusproduk-produk tersebut dengan adanya superoksidadismutase, suatu enzim yang mengatalisis reaksi dipikirkan. Organisme yang memerlukan konsentrasi' 2Or- +2H* -______+O2 +H2Oz garam tinggi disebut halofilik; organisme yangdan dengan adanya katalase, enzim yang mengatalisis memerlukan tekanan osmotik tinggi disebut osmofilik.reaksi Sebagian besar bakteri mampu menoleransi tekanan 2HrO; -.-.--2H2o+o2 osmotik dan kekuatan ionik eksternal yang sangat bervariasi karena kemampuannya untuk mengatur Beberapa organisme fermentatif (misal, Lactobacillus osmolaiitas dan konsentrasi ion internal. Osmolalitasp lantarum) bersifat aerotoleran, tetapi tidak mengandung diatur oleh transpor aktif ion K' ke dalam sel; kekuatankataiase atau superoksida dismutase. Oksigen tidak ionik internal dipertahankan konstan dengan kompensasidireduksi sehingga tidak menghasilkan HrO, dan O, . ekskresi putresin (suatu poliamin organik bermuatanSemua anerob sejati tidak memiliki superoksida positif). Karena putresin membawa beberapa muatan positif per molekul, kekuatan ionik dapat sangat me nurundismutase dan katalase. Beberapa organisme anaerob akibat pengaruh dari perubahan kekuatan osmotik yang(misal, Peptococcus anaerobius) sangat toleran terhadap kecil saja.oksigen karena kemampuannya menghasilkan enzimtingkat tinggi (NADH olaidase) yang mereduksi olaigen METODE PEMBIAKANmenjadi air berdasarkan reaksi Dua masalah akan dibahas: pemilihan medium yang NADH+ H- +/z)r-NAD* +HrO cocok dan isolasi organisme bakteri dalam biakan murni. Sebagian besar toksisitas hidrogen peroLsida dilakukan Mediummelalui perusakan DNA. Mutan-mutan yang tidak Teknik yang digunakan dan jenis medium yang dipilihmemiliki sistem perbaikan DNA sangat sensitif terhadap bergantung pada sifat penelitian. Pada umumnya, dapathidrogen peroksida; produk gen recA, yang berfungsi ditemukan tiga situasi: (1) Mungkin kita harusuntuk rekombinasi dan perbaikan genetik, telah terbuktilebih penting daripada katalase atau superoksida dismutase membiakkan sel dari spesies tertentu yang sudah ada; (2)dalam melindungi sel-sel E coli terhadap toksisitas mungkin kita harus menentukan jumlah dan jenishidrogen peroksida. organisme yangada dalam suatu bahan; atau (3) mungkin Penyediaan udara ke dalam biakan aerob adalah kita bermaksud untuk mengisolasi jenis mikroorganisme tertentu dari sumber alami.masaiah teknis utama. Tabung biasanya dikocok secaramekanis untuk memasukkan oksigen ke dalam medium, A. MEMBIAKKAN SEL DARI SPESIES TERTENTUatau udara dipaksa melaiui medium dengan tekanan.Difusi oksigen sering menjadi faktor penghambat dalam Mikroorganisme yang dengan mii<roskop terlihat tumbuhpembiakan bakteri aerob; bila tercapai konsenrrasi sel dalam lingkungan alamiah mungkin sangat sulit untuksebesar 4-5 x l}elmL, kecepatan difusi oksigen ke sel tumbuh dalam biakan murni pada medium buatan. Bentuk-bentuk parasit tertentu, misalnya, tidak pernahsangat membatasi kecepatan pertumbuhan selanjutnya. dibiakkan di luar pejamu. Namun, pada umumnya, dapat Di lain pihak, anaerob obligat, menghadapi masalah dirancang suatu medium yang cocok dengan menirupengeluaran olaigen. Banyak metode yang tersedia untuk secara saksama keadaan yang ditemukan dalammemcahkan masalah tersebut: Agen pereduksi seperti lingkungan alamiah organisme tersebut. pH, temperatur,natrium tioglikolat dapat ditambahkan ke dalam biakancair; tabung agar dapat disegel dengan selapis petrolatum dan aerasi mudah untuk ditiru; zat makanan merupakandan parafin; tabung biakan dapat ditempatkan dalamwadah yang oksigennya dikeluarkan dengan cara evakuasi masalah utama. Kontribusi yang diberikan olehatau cara kimia; atau organisme dapat dibiakkan dalamsuatu kotak anaerob. lingkungan hidup sangat penting dan sulit untuk dianalisis; parasit mungkin memerlukan ekstrak jaringan pejamu,Tekanan Osmotik & Kekuatan lonik dan suatu bentuk yang hidup bebas mungkin memerlukan substansi yang dieftskresi oleh mitr<roorganisme yang adaKadang-kadang, faktor-faktor seperti tekanan osmotik dan hubungannya dengan bakteri tersebut dalam aiam.konsentrasi garam harus dikendalikan. Untuk sebagian Diperlukan penelitian yang luas untuk menentukanbesar organisme, sifat-sifat medium yang biasa sudahmemuaskan; namun, misalnya pada bentuk yang hidup kebutuhan organisme, dan keberhasilan bergantung padadi laut dan organisme yang beradaptasi untuk tumbuh penyediaan sumber yang cocok untuk setiap kategori nutrisi yang terdaftar pada awal bab ini. Pembiakan parasit obligat seperti riketsia dibahas pada Bab 47.

PEMBIAKAN MIKROORGANISME 59B. PEMERIKSAAN MIKRoBIoLoGI BAHAN ALAMIAH koloni yang terlal-r penuh. Apabila ridak, kompetisi akanSuatu bahan alami mungkin rnengandung berbagai jenis mencegah pembe ntukan koloni pada beberapa jenislingkungan mikro yang masing-masing memberikan nisiauntuk spesies yang berbeda. Penanaman suaru sampel m il<roorgan isnre .material daiam lempeng biakan pada satu ser keadaal.rtertentu akan memungkinkan kelompok mikroorganisme C. ISOLASI MIKRooRGANISME JENIs TERTENTUtertentu untuk menghasilkan koloni, tetapi banyak jenislainnya akan terabaikan. Oleh karena iru, biasanya sampel Sejumlah kecil sampel yang berasal dari tanah, apabila ditangani dengan baik, akan rnenghasilkan organismemateriai ditanam pada sebanyak mungkin media dengan jenis yang berlainan untuk tiap lingkungan mitr<ropembiakan dan berbagai kondisi inkubasi yang dapat yang ada. Pada tanah yang subur (lembab, dengan aerasidilakukan. Enam sampai delapan kondisi biakan yang yang bail<, kaya akan mineral dan bahan organik)berbeda bukanlah jumlah yang tak masuk akal jika kita mempunyai arti bahwa rarusan atau bahkan ribuan jenisingin menemukan sebagian besar bakteri yang ada pada organisme dapat diisolasi. Keadaan tersebut diiakukan dengan cara menyeieksi jenis organisme yang diinginkan.bahan tersebut. Satu gram tanair, misalnya, diranam ke dalarn tabung )'ang berisi medium cair yar-rg telah dibuat sedemikian Karena setiap jenis organisme yang ada pada bahan rupa sehingga cocok untuk satu jenis organisme, misalnya, perrgikat nitrogen aerobik (Azotobacter). Pada kasus ini,tersebut harus diberi kesemp'atan untuk rumbuh,digunakan medium padat dan dicegah per:tun.rbuhzrnTabel 5-2. Beberapa biakan diperkaya.Kandungan dari semua medium: MgSOo, K2HpO4, FeCl' CaCl, CaCO' unsur renik. Atqt.qp\"f,.e . ,, ', Oiganisme Utama yang Periyinaran :j------!. -- :- Pertama Ka.li Diperkaya 'N, CO, Aerob atau anaerob Gelap Tidak adaNaNO, Alkohol, asam lemak, dllNH4CI G I ukosa Terang Cyanobacteria CO, Anaerob Gelap Tidak ada Alkohol, asam Iemak, dll Glukosa Udara Gel ap Azotobacter CO, Anaerob Gelap mCl os t ri d i u pasteu ri a nu m Alkohol, asam lemak. dll Udara Gel ap Azotobacter Glukosa Aerob atau anaerob Gelap Tidak ada Terang Alga hijau dan cyanobacteria Anaerob Gelap Kuman denitrifikasi Uda ra Gel ap Aerob Anaerob Gelap Perag i Udara Gel ap Aerob Anaerob Gelap Tidak ada Aerob Gel ap N itrosomon as Aerob atau anaerob Terang Alga hijau dan cyanobacteria Anaerob G elap Pereduksi sulfat atat-r karbonat Aerob Gelap Aerob Anaerob Gelap Perag! Aerob Gel ap Aerob

70 BAB 5medium ddak dicampur dengan nitrogen dan diinkr.rbasi Tabel 5-2 menyajikan berbagai contoh keadaan biakan yang diperkaya dan jenis bakteri yang akan diseleksi.secara aerobik. Jika ada di dalam tanah, sel-sel azotobakter lsolasi Mikroorganisme pada Biakan Murniakan tumbuh dengan baik dalam medium ini; bentuk-bentuk yang tidak mampu mengikat nitrogen akan Untuk mempelajari sifat organisme tertentu' kita harustumbuh hanya bila tanah tersebut memasukkan membiakkannya dalam biakan murni yang bebas darikontaminan pengikat nitrogen ke dalam medium. Bila selnua jenis organisme lain. Untr,rk melakukan halbiakan tumbuh dengan baik, persentase azotobakter dalam tersebut, satu sel harus diisolasi dari semua sel lain danpopulasi total akan sangat meningkat; oleh karena itu, dibiakkan dengan cara sedemikian ruPa sehingga seluruh turunannya juga tetap terisolasi. Bebe rapa metodemetode ini disebut \"biakan yang diperkaya'. Pemindahan tersedia.suatu sampel biakan ini ke medium segar akan A, PENANAMAN PADA LEHPENG BIAKANmenghasilkan azotobakter yang semakin banyak lagi; Tidak seperti sel-sel di dalam medium cair, sel-sel yangsetelah beberapa kali pemindahan, biakan dapat ditanam ada di dalam atau di atas medium gel tidak dapatpada medium padat yang diperkaya dan koloni bergerak. Oleh karena itu, apabila sel-sel dalam jumlahazotobakter dapat diisolasi. secukupnya ditempatkan di dalam atau di atas medium Medium cair digunakan untuk memungkinkan gel, setiap se1 akan tumbuh menjadi koloni yang terisolasi.terjadinya kompetisi dan seleksi yang optimal, meskipun Bahan pemberi bentuk gel yang ideal untuk sebagian besardi tanah itu hanya ada beberapa sel bakteri yang diinginkan medium mikrobiologi adalah agar, suatu polisakaridadari populasi jutaan bakteri. Dapat diambil keuntungandari keadaan yang disebut sebagai \"penyuburan alami\". asam yang diekstraksi dari alga merah tertentu' SuatuMisalnya, untuk mencari pengoksidasi minyak tanah, suspensi 1,5-2o/o daiam air akan larut pada suhu 100 ')C,dipilih tanah yang mengandung minyak, karenamerupakan lingkungan yang subur untuk bentuk membentuk larutan jernih yang akan menjadi gel padaorganisme tersebut. suhu 45 \"C. Oleh karena itu, larutan agar steril dapat didinginkan sampai suhu 50 \"C, ditambahkan bakteri Biakan yang diperkaya adalah suatu prosedur yang atau sel-sel mikroba lain, dan kemudian larutan secaramediumnya disiapkan sedemikian rupa untuk menirulingkungan alami (\"nisia') dari mikroorganisme yang cepat didinginkan di bawah suhu 45 0C untuk membentukdiinginkan, sehingga sesuai untuk mikroorganisme suatu gel. (Meskipun sebagian besar sel mikroba matitersebut. Prinsip penting yang terlibat pada seleksi pada suhu 50 0C, perjalanan waktu proses pembunuhansemacam ini adalah sebagai berikut: Organisme yang cukup lambat pada temperatur ini sehingga metode inidicari adalah jenis organisme yang kebutuhan nutrisinya dapat dilakukan; lihat Gambar 4-3). Sekali terbentuk gel,hampir tidak terpenuhi. Misalnya, azotobakter, palingbaik tumbuh pada medium yang mengandung nitrogen agar tidak akan mencair lagi s,ampai dipanaskan di atas 80 i'C sehingga setiap tempdr\"tut yang cocok untukorganik, tetapi kebgtuhan minimumnya adalah adanya inkubasi biakan mikroba akhirnya dapat digunakan. PadaNr; karena itu digunakan suatu medium yang mengandung metode lempeng-tuang suspensi sel dicampurkan denganN, sebagai satu-satunya sumber nitrogen untuk agar cair pada 50 0C dan dituangkan ke dalam cawanmengisolasi azotobakter. Jika nitrogen organik Petri. Bila agar mengeras, sel-sel terfiksasi dalam agarditambahkan ke dalam medium, keadaan tidak lagi cocokuntuk seleksi azotobakter tetapi lebih cocok untuk bentuk dan tumbuh meniadi koloni-koloni. Jika suspensi selyang kebutuhan minimumnya adalah nitrogen orgar-rik. cukup encer, koloni akan terpisah dengan baik, sehingga Bila mencari jenis organisme tertentu dalam bahan alamiah, penanaman organisme yang diperoleh pada masing-masing koloni mempunyai kemungkinan tinggimedium diferensial (jika tersedia) adalah hal yang menguntungkan. Mediurn diferensial adalah medium yang b.r\"rai dari satu sei. Namun, untuk memastikannya kitamenyebabkan koloni dari jenis organisme tertentu harus mengarnbil koloni dari jenis yang diinginkan, memberikan suatu tampilan yang khas. Misalnya, koloni disuspensikan dalam air, dan lakukan penanaman ulang. E coli mempunyai kilau warna-warni yang khas pada agar yang mengandung pewarna eosin dan metilen biru (agar Pengulangan proses tersebut beberapa kali memastikan EMB). Agar EMB yang mengandung satu jenis gula dalam kita untuk memperoleh suatu biakan murni. konsentrasi tinggi juga akan menyebabkan organisme yang Cara lain iaiah dengan menggoreskan suspensi asal memfermentasi gula tersebut membentuk koloni berwarna pada lempeng agar dengan menggunakan sengkelit' kemerahan. Medium diferensial digunakan untuk tujuan tertentu seperti untuk mengenali adanya bakteri enterik Sambii terus menggores, semakin sedikit sel yang t€rtinggal daiam air atau susu dan adanya patogen tertentu pada pada sengkelit, dan akhirnya sengkeiit dapat menaruh spesimen klinis. i\"tu sel di s\"ert\"ia. pagkaorl.oLnei myapnegngtutemrsbeubhuttedrpiiniskauhbdaisaim, dbailn, kemudian disuspensikan kembali dalam air, dan sekali lagi digoreskan di atas agar. Jika suatu susPensi (dan bukan

PEMBIAKAN MIKROORGANISME I 71hanya cuilan kecil yar-rg berasal dari koloni atau biakan .iagar miring yang tumbuh) digoreskan, metode ini dapat KEPUSTAKAANdiandalkan (sama seperti metode lempeng tuang) dan lebihcep.at daripada metode lempeng-tuang. Adarns MW: Enzyrnes and protcins lrom organisms that grow near or above 100 degrees C. Annu Rev Med 7993;4'l:627 .B. PEh]GENcERAN Koch AL: Microbial physiology and ecology o1'slow grorvth. MicrobiolMetode yang kurang dapat diandalkan adalah pengenceran Molec Biol Rer' 1997;61:305. .sarnpai habis\" Suspensi.diencerkan secara serial, dansampel dari masing-masing pengcnceran diletakkan dalam Ledcrberg J (editor): Encyclopedia ofMicrobioLogv,4 voi. Acadernic Prcss, 7992.lempeng. Jika han1,a sebagian kecil. sampel dari suatupengenceran yang m€mperlihatkan adanya pertumbuhan, Maier RM, Pepper IL, Gerba CP: Enuironmentol ilIk:robiologt. Academicdiduga bahwa beberapa koloni dimulai dari satu sel. Prcss, I992.Metode tersebut tidak digunakan kecuali jika penanamanpada lempeng biakan karena beberapa alasan tertentu Marzlut GA: Regliation of sulfur and nitrogen mctabolism rn filamentarytidak mungkin dilakukan. Efek yang tidak diinginkan fungi. Annu Rev Microbiol 1993;42:89.dari merode ini adalah hanya dapat digunakan untuk Pelczai\{J Jr, Chm ECS, KriegNR: Microbi.ology: Concepts antlApplicotions. McGraw-IIill, 1993.mengisolasi jenis organisme yang dominan pada popr-rlasicampuran. PERTAHYAAi:I LATI l'lAll :l ::rSiriiiir;'*il*=*.*'uii+ rfi CI'b;-' t$,il*i#i;r\"\".:. laboratoiitrm bilb biakan diinkubasi pada suhu , , i:rin!.,ir,t5:=26 ot iF{B.} E-4, 01€ '!ir::,r {taetljiiti g?$.n'.:3?7? 0o€l: . -:lr2l.:sir.iii(lDP({tED€eriol)}):,ie35us80o-p-55e0t15rm*'9nsoOCbCcce\"d.ntu.tk.;t-.I n ATP o-leh mikroorganisme selama fermentasi $lut<osa diianOii dengan proses yang terangkai:dengan I'tEi Produksi ATP tran$feri elektibnii (E) Denitrifikasi (C) Reduksi oksigen (D) Fosforilasi substrat.' tE) Respirasi anaerob l* , 1.,' 3. Teknik biakan dan. medium'yang mana yang ,''menghasilkanjumlahspesiei.mikiobaterbesar d(Aala)mBsiaakmapnelditpanearkha?y,a :. \":\"j ,, (B) Lempe4g medium ielektif , (!CD)) Lernpeng medium diferensial ' , Tabung berisi kaldu yang berbbda-beda-4. Polimerisasi dari unit pembangun (misal, asam .:t. amino) menjadi makromolekul (misal, protein) sebagian,besar dicap;ii dengan (A) Dehidrasi '., (B) Reduksi r' (O Oksidasi .',\"1'r','i'\" '-tr.,,, (o) aiimira'ii :. (E) Hidrotisis r_'