คู่มือห้องปฏิบัติการในการตรวจโรคอหิวาต์แอฟริกาในสุกร

คมู่อืหอ้งปฏบิตักิาร โรคอหวิาตแ์อฟรกิาในสกุร 31ม.ค.62 สถาบันสุขภาพสตัวแหงชาติกรมปศุสัตวกระทรวงเกษตรและสหกรณ 50/2เกษตรกลางแขวงลาดยาวเขตจตุจกัรกรงุเทพฯ10900 E-mail:[email protected]:niah.dld.go.th

คมู่ ือห้องปฏบิ ตั ิการในการตรวจโรคอหิวาต์แอฟรกิ าในสกุ ร ตลุ ำคม 2561 ผู้จัดทำ : สถาบนั สขุ ภาพสตั ว์แห่งชาติ นำยสัตวแพทย์ฐปณฐั สงคสุภำ นำยสตั วแพทย์ประกติ บุญพรประเสริฐ นำงสำวชนกพร บญุ ศำสตร์

สารบญั 3 4 บทนำ 6 ธรรมชำตขิ องกำรเกดิ โรค 8 นยิ ำมสัตวป์ ่วย 10 กำรเก็บตัวอย่ำงเลือดสุกร 11 กำรเก็บตวั อยำ่ งมำ้ ม 13 กำรเกบ็ ตวั อย่ำงผลิตภัณฑ์และวตั ถุดบิ อำหำรสัตว์ 13 ข้นั ตอนและวธิ ตี รวจวนิ ิจฉัยโรคทำงห้องปฏิบตั กิ ำร 18 18 1. กำรเตรียมตัวอย่ำงตรวจ 21 2. กำรสกดั สำรพนั ธกุ รรม 23 3. กำรตรวจตัวอยำ่ งด้วยวธิ ี qPCR 4. กำรกำจัดขยะและทำลำยเช้อื 25 กำรแจ้งสตั ว์ปว่ ย และรำยงำนผลตรวจ 26 ภำคผนวก 29 เครอื ขำ่ ยทำงห้องปฏิบตั ิกำร 30 คำแนะนำ : 31 กำรเก็บตัวอย่ำงสำหรับเจำ้ หนำ้ ท่ี กำรปอ้ งกันโรคสำหรับฟำร์มสกุ ร 33 กำรทำลำยเชอื้ ในวตั ถุดบิ เศษอำหำรใช้เล้ยี งสกุ ร, เน้อื สกุ ร, ไสห้ มักเกลือ, ซำกและมลู สุกร กำรทำควำมสะอำดและฆำ่ เช้อื โรค



สถาบนั สุขภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศสุ ตั ว์ 3 บทนำ องค์การโรคระบาดสตั วโ์ ลก (OIE) รายงานการระบาด ของโรคอหิวาต์แอฟริกาในสุกร ในสาธารณรัฐประชาชนจนี เป็นคร้ังแรก เมื่อวันท่ี 3 สิงหาคม 2561 ณ เมืองเส่ินหยาง มณฑลเหลียวหนิง จากน้ันก็มีการระบาดต่อเนื่องมากกว่า 20 ครง้ั ในพนื้ ที่ 8 มณฑล ภายในระยะเวลา 2 เดือน โรคน้ี เป็นโรคไวรัสติดต่อเฉพาะในสุกร มีผลกระทบอย่างรุนแรง ตอ่ เศรษฐกิจและอุตสาหกรรมการผลิตสุกร เนอื่ งจากมอี ตั รา การป่วยตายสูง เชื้อมีความทนทานยากต่อการกาจดั ให้หมด ไป ภูมิภาคเอเชียตะวันออกเฉียงใต้มีความเส่ียงต่อการ ระบาด เนือ่ งจากโรคนี้มีศักยภาพในการแพร่กระจาย มกี าร แพร่โรคไดห้ ลายวธิ ี ท้ังจากการเคลื่อนย้ายสัตว์และซากสตั ว์ การปนเป้ือนมากับคน อุปกรณ์ วัตถุดิบอาหารสัตว์ และใน อาหารท่ีเป็นผลิตภัณฑ์สุกร กรมปศุสัตว์ประเมินว่าหากมี ก า ร ร ะ บ า ด ข อ ง โ ร ค น้ี จ ะ ท า ใ ห้ เ กิ ด ค ว า ม เ สี ย ห า ย แ ก่ อตุ สาหกรรมการเลี้ยงสุกรเป็นมูลคา่ นับหมน่ื ลา้ นบาท คู่มือห้องปฏิบัติการในการตรวจโรคอหิวาต์แอฟริกา ในสุกรฉบับน้ี จัดทาข้ึนเพื่อเป็นแนวทางปฏิบัติงานของ หอ้ งปฏบิ ัตกิ ารตรวจวนิ จิ ฉยั และการประสานงานท่ีเก่ียวข้อง กับทุกภาคส่วน เพื่อให้ได้ผลตรวจท่ีถูกต้อง รวดเร็ว นาไปสู่ การควบคมุ กาจัดโรคทีม่ ีประสทิ ธิภาพตอ่ ไป

4 สถาบันสขุ ภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศสุ ัตว์ ธรรมชำติของกำรเกิดโรค สำเหตุ เกิดจากเช้ือไวรัสอหิวาต์แอฟริกาในสุกร (African Swine Fever, ASF) เปน็ double-stranded DNA มเี ปลือก หุ้ม เชื้อไวรัสทาลายเมด็ เลือดขาวแมคโครฟาจและโมโนไซต์ เช้ือทนทานมากในส่ิงแวดล้อม อยู่ได้เป็นเวลานานในเลือด สารคัดหลง่ั เนื้อสุกร ซาก และผลิตภัณฑ์ เชน่ ในเลือด (4oC) 18 เดือน, มูลสัตว์ (25oC) 11 วัน, คอกเลี้ยงสุกรปนเป้ือน 15 สัปดาห์, ใน แฮม ซาลามี่ เนื้อหมักเกลือ 120–180 วัน, ไส้หมักเกลือ 30 วัน, เน้ือสุกรแช่เย็น (4oC) 150 วัน และ เนอ้ื สกุ รแช่แขง็ 1,000 วนั กำรติดต่อ โรคน้ีไม่ติดต่อระหว่างคนและสัตว์ พบเฉพาะใน สตั ว์ตระกลู สกุ รทุกชนิด สุกรเล้ยี งจะมคี วามไวรบั ต่อโรคมาก ขณะท่ีสุกรป่าอาจไม่แสดงอาการ แต่จะเป็นพาหะนาโรคท่ี สาคัญ สุกรติดเชื้อได้โดยการกินอาหารท่ีมีเชื้อ การสัมผัส เลือดและสารคดั หล่ังจากสุกรป่วยหรือสุกรพาหะ การถูกกัด โดยเห็บอ่อน (Ornithodoros spp.) การปนเป้ือนอุปกรณ์ โรงเรือน ยานพาหนะสามารถนาเชอื้ ได้ รูปที่ 1 ลักษณะโครงสร้างเปลอื กไวรัสอหิวาต์แอฟรกิ าในสุกร ทมี่ า : https://viralzone.expasy.org

สถาบนั สขุ ภาพสัตวแ์ หง่ ชาติ กรมปศุสัตว์ 5 ระยะฟักตัวและอำกำรทำงคลินิก การติดเช้ือตาม ธรรมชาติมีระยะฟักตัว 5-15 วัน สุกรมีไข้สูงมากกว่า 41oCไม่กินอาหาร นอนแน่นิ่ง ไม่มีแรง พบผ่ืนแดงและจา้ เลือดท่ัวผิวหนังบริเวณปลายหู จมูก ขา อก และท้อง รวมถึงอวัยวะภายใน อาจพบอาการอาเจียน ท้องเสียมี เลือดปน และแท้งในแม่สุกร อัตราการตายสูงมากกว่า 95% มกั ตายภายใน 2-3 วัน หลงั แสดงอาการป่วย รูปท่ี 2 อาการและพยาธสิ ภาพโรค: ป้ืนเลือดออก แท้ง ถ่ายเหลว ปนเลอื ด ม้ามโต จุดเลอื ดออกทตี่ อ่ มน้าเหลอื ง ท่ีมา : CFSPH, PIADC, APHIS, FAO

6 สถาบันสขุ ภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศสุ ัตว์ นิยำมสัตว์ป่วย 1. เกณฑ์การเฝา้ ระวังโรคอหวิ าต์แอฟรกิ าในสกุ ร อาการป่วย มีไข้สงู (>41 ºC) นอนสุม ซมึ เบือ่ อาหาร ไม่ลุกเดิน ผิวหนังแดง มีจดุ เลอื ดออกหรือรอยช้าทผี่ วิ หนังตามใบ หู ถ่ายเหลวมีเลอื ดปน แท้งทกุ ชว่ งอายุ และตาย เฉียบพลันภายใน 2-3 วนั หลังแสดงอาการ การตรวจทางหอ้ งปฏิบัติการ เพาะเชอ้ื ได้จากเลอื ด อวัยวะ ส่ิงคดั หลงั่ สตั วป์ ว่ ย หรือ ให้ผลบวกตอ่ การตรวจหาเชอื้ ASFV ดว้ ยวธิ ี ELISA test for ASFV, polymerase chain reaction หรอื real–time PCR, DNA sequencing 2. สัตว์ปว่ ย 1) สัตว์ป่วยต้องสงสยั (suspected case) หมายถึง สุกรที่แสดงอาการปว่ ย รวมถึงสกุ รทมี่ ขี อ้ มลู ระบาด วิทยาวา่ มโี อกาสรับเช้อื ไดแ้ ก่ - สกุ รท่ีสงสัย และมีประวัติสัมผสั กบั สัตว์ติดโรค - สุกรท่มี าจากแหลง่ ทมี่ ีการระบาดของเชื้อ - สุกรที่มกี ารใชว้ สั ดุอุปกรณ์ หรอื อยู่ใน สภาพแวดลอ้ มเดียวกนั - สุกรท่ีกนิ เศษอาหารทไี่ ม่ผ่านความรอ้ นอยา่ งถกู วธิ ี หรือบรโิ ภควตั ถดุ บิ อาหารที่คาดว่าปนเปือ้ นเชอ้ื 2) สตั ว์ปว่ ยทใ่ี หผ้ ลบวก (presumptive positive case) หมายถงึ สกุ รป่วยที่ใหผ้ ลบวกในการตรวจ ทดสอบทางห้องปฏบิ ัตกิ ารดว้ ยวิธี PCR

สถาบนั สขุ ภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศสุ ัตว์ 7 3) สตั ว์ป่วยยนื ยนั (confirmed positive case) หมายถึง สุกรป่วยทใ่ี ห้ผลบวกในการตรวจทดสอบ ดว้ ยวิธี sequencing ท่ีหอ้ งปฏบิ ตั ิการกรมปศุสตั ว์ 3. การรายงานสัตวป์ ว่ ยตามระบบเฝ้าระวังโรค – เจ้าหน้าท่ีรายงานสัตว์ป่วยที่สงสัย ตามระเบียบกรม ปศุสตั ว์ วา่ ดว้ ยการดาเนนิ การเฝา้ ระวัง ป้องกัน และ ควบคุมโรคระบาดสตั ว์ พ.ศ. 2560 รูปท่ี 3 สุกรตายเฉียบพลัน ในฟาร์มสกุ รขุน สาธารณรฐั ประชาชน จนี ทีม่ า: National Research Center for Exotic Animal Diseases

8 สถาบันสขุ ภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศุสัตว์ กำรเก็บตัวอยำ่ งเลอื ดสกุ ร อุปกรณ์ – กระบอกฉดี ยาและเข็มฉดี ยา ชนดิ สตั ว์ ขนาดกระบอกฉดี ยา (มล.)/เข็ม เลือด (มล.) ลูกสุกร <20 กก. 5/ 18Gx1” (1.2 x 25 มม.) 3-5 สกุ รเล็ก 20-60 กก. 5–10/ 18Gx1½”(1.2 x 40 มม.) 5-10 สุกรขุน–พอ่ แม่พันธุ์ 5–10/ 18Gx1½”(1.2 x 40 มม.) 5-10 – หลอดเกบ็ เลอื ดมสี ารปอ้ งกันเลือดแข็งตัว ชนดิ EDTA – ถงุ พลาสติก, นา้ แข็ง หรอื ice pack, กลอ่ งโฟม หรือ กระติก วิธกี าร 1) เจาะเก็บเลอื ดสกุ รป่วยจากหลอดเลอื ดดา :– ลูกสกุ รและสกุ รขนาดเลก็ ท่ี cranial vena cava หรือ external jugular vein, สุกรขนุ เกบ็ เลือดทา่ ยืนที่ external jugular vein, สกุ รเพงิ่ ตายใหเ้ กบ็ เลือดจาก หัวใจ 2) บรรจเุ ลอื ดลงในหลอดเกบ็ เลอื ด โดยถอดหวั เข็มออกจาก กระบอกฉีดยา แลว้ ดันก้านกระบอกฉดี ยาชา้ ๆ ป้องกนั ไม่ให้เมด็ เลอื ดแดงแตก และกลบั หลอดไปมาให้เขา้ กนั 3) เขยี นหมายเลขหลอดดว้ ยหมกึ กนั นา้ และใบนาสง่ ระบชุ อ่ื หรือรหสั ชนิดสตั ว์ เพศ อายุ สถานที่ และวนั เกบ็ ตวั อย่าง 4) บรรจุหลอดเกบ็ เลอื ดในถงุ พลาสติก 2 ชน้ั และพ่นนา้ ยา ฆา่ เชอ้ื บรเิ วณภายนอกถุง ใส่ในกลอ่ งโฟมหรอื กระตกิ แช่เยน็ ในนา้ แข็ง ปิดให้สนทิ สง่ ตรวจหอ้ งปฏบิ ัติการทันที

สถาบนั สุขภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศุสตั ว์ 9 รูปที่ 4 การเกบ็ เลอื ดสกุ รเล็ก (cranial vena cava) ท่มี า: James Cook University และ The Medical University of South Carolina รูปท่ี 5 การเก็บเลอื ดสุกรใหญ่ (external jugular vein) ท่มี า: Virginia Tech และ กรมปศุสตั ว์ รปู ที่ 6 การเกบ็ เลือดจากหัวใจ กรณสี ตั วพ์ ่ึงตายใหม่ ทีม่ า: คณะสตั วแพทยศาสตร์ มหาวทิ ยาลัยเกษตรศาสตร์ https://www.youtube.com/watch?v=AviI1OltroU

10 สถาบนั สขุ ภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศุสัตว์ กำรเกบ็ ตวั อยำ่ งมำ้ ม สาหรบั ซากสุกรซ่งึ ไม่สามารถเก็บเลอื ดได้ ให้เก็บตัวอยา่ งม้าม อุปกรณ์ – มีดผา่ ซาก – ถุงพลาสติก, น้าแข็ง หรือ ice pack, กล่องโฟม หรือ กระตกิ วธิ ีการ 1) ก่อนการเปิดผา่ ซากสกุ ร ให้เตรยี มการลา้ งฆ่าเชอ้ื ทาลาย ซาก ปอ้ งกันการแพรก่ ระจายเชอื้ สวมใสอ่ ปุ กรณป์ ้องกนั อันตรายส่วนบคุ คล เชน่ ถงุ มอื รองเทา้ บูท หน้ากาก อนามัย ผา้ กันเป้อื น ฯลฯ 2) เปิดผา่ ซากบริเวณด้านลา่ งชายโครง หลังซโ่ี ครงซส่ี ุดทา้ ย เขา้ สู่ชอ่ งทอ้ ง ตัดมา้ มขนาด 1 ฝ่ามอื 3) บรรจุในถุงพลาสตกิ ซิปล็อก 2 ชนั้ และพ่นนา้ ยาฆ่าเชอ้ื ภายนอกถงุ แลว้ ใส่ในกลอ่ งโฟมหรอื กระตกิ พร้อมแชเ่ ยน็ ในน้าแขง็ ปิดใหส้ นทิ สง่ ตรวจหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทนั ที รปู ท่ี 7 แสดงตาแหน่งและวิธีการเปิดผ่าซากเก็บมา้ ม ท่ีมา: Afrivet; คณะสัตวแพทยศาสตร์ มหาวทิ ยาลัยเกษตรศาสตร์ https://www.youtube.com/watch?v=AviI1OltroU

สถาบนั สุขภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศุสัตว์ 11 กำรเก็บตวั อย่ำงผลิตภณั ฑแ์ ละวัตถุดบิ อำหำรสตั ว์ 1) ผลติ ภณั ฑ์สุกร เชน่ เนือ้ หมกั เนอื้ รมควนั เนื้อแชเ่ ย็น เนื้อแช่แข็ง ไส้กรอก ซาลามี ไส้สกุ รหมกั เกลอื หนงั สกุ ร ฯลฯ 2) วัตถุดิบอาหารสัตว์ เชน่ เน้อื และกระดูกป่น หรือ ผลิตภัณฑ์อาหารท่ีมาจากประเทศทมี่ กี ารระบาด อุปกรณ์ – ภาชนะบรรจภุ ณั ฑ์ ถุงพลาสติกซปิ ลอ็ ก – กลอ่ งโฟม หรอื กระตกิ นา้ วธิ ีการ 1) การสมุ่ เกบ็ ตัวอย่างท่ีอยใู่ นบรรจภุ ณั ฑ์ยอ่ ย ไดแ้ ก่ อาหาร กระปอ๋ ง ผลติ ภณั ฑบ์ รรจซุ องพลาสตกิ ผลติ ภัณฑบ์ รรจุ ขวด เปน็ ตน้ ให้เก็บตวั อยา่ งโดยวิธสี มุ่ ตามจานวนหน่วย หรือปริมาณตามที่ตอ้ งการ 2) การสมุ่ เกบ็ ตวั อยา่ งในกองรวม ได้แก่ อาหารปรงุ สาเร็จ อาหารทีอ่ ย่ใู นกระบวนการผลติ อาหารสด และวตั ถุดิบ อาหารสตั ว์ เปน็ ต้น ใหส้ มุ่ เก็บตวั อย่างหลาย ๆ จดุ จุดละ เท่า ๆ กนั เกบ็ ตวั อยา่ งต่ากว่าผิวหน้ากองประมาณ 1 นิว้ เกบ็ ตวั อย่างในปริมาณที่ตอ้ งการ บรรจภุ าชนะสะอาด ปดิ สนทิ ตดิ ฉลากท่ีภาชนะบรรจุทกุ อนั และแยกภาชนะ บรรจุวตั ถุดบิ ต่างชนิดกนั สาหรบั วัตถดุ บิ อำหำรสตั ว์บรรจกุ ระสอบ ใหส้ มุ่ เก็บ ตวั อย่างไมน่ อ้ ยกวา่ 5 ตาแหนง่ รวมประมาณ 500 กรมั บรรจใุ สใ่ นถงุ พลาสตกิ หากเป็นอำหำรสตั ว์กองรวม ให้สุ่มเกบ็ รอบ ๆ กองอย่างนอ้ ย 5 จุด และเกบ็ ลึกเข้าไป ในกองอย่างนอ้ ย 1 เมตร อกี 3 จุด นามาคลุกเคล้า

12 สถาบันสขุ ภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศสุ ัตว์ ใหเ้ ขา้ กนั ให้ไดต้ วั อย่างประมาณรวม 500 กรัมบรรจใุ ส่ ในถงุ พลาสตกิ 3) ตัวอยา่ งทเี่ สียหรือเสอื่ มสภาพง่าย เชน่ อาหารสดหรอื อาหารปรงุ สาเรจ็ เมอ่ื ทาการส่มุ เกบ็ ตวั อย่างและติดฉลาก เรยี บร้อยแลว้ ควรนาภาชนะทีบ่ รรจตุ วั อยา่ งนน้ั ใสใ่ น ถงุ พลาสติกทสี่ ะอาดอกี ชนั้ หนง่ึ ปดิ ผนกึ ถงุ ให้แน่น แช่น้าแข็งเพอ่ื รกั ษาอณุ หภูมิไวท้ ี่ประมาณ 4 oC นาส่ง หอ้ งปฏิบัตกิ ารโดยเรว็ ทสี่ ุด ** การส่งตรวจตัวอยา่ งผลิตภณั ฑ์จากสกุ ร และวตั ถดุ ิบ อาหาร ควรติดตอ่ ประสานงานกบั สานกั งานปศุสัตว์ จงั หวัด หรอื ปศสุ ัตวอ์ าเภอในพน้ื ทก่ี อ่ นนาส่ง รูปท่ี 8 ผลิตภัณฑส์ กุ ร :– หมกู ี้ ไส้หมักเกลอื ซาลามี และ วตั ถุดิบอาหารสัตว์ :– เน้ือและกระดูกปน่ ทม่ี า: กรมปศุสัตว์

สถาบันสขุ ภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศสุ ตั ว์ 13 ข้นั ตอนและวธิ ีตรวจวนิ ิจฉัยโรคทำงหอ้ งปฏิบตั ิกำร 1. กำรเตรียมตวั อยำ่ งตรวจ 1) เลอื ด กำรเตรียม buffy coat extraction – ปั่นเหว่ียงแยกตะกอน ด้วยเครอื่ ง refrigerated centrifuge ความเร็ว 1000xg เปน็ เวลา 10 นาที – เทสว่ นใส (supernatant) ทิง้ และใช้ปเิ ปตดูดเก็บ เมด็ เลอื ดขาว จากบรเิ วณ buffy coat ใส่ในหลอด centrifuge tube ขนาด 15 มล. – เตมิ น้ากลน่ั สะอาด ปรมิ าตร 5 มล. เขยา่ 5-10 วินาที เพอ่ื ทาใหเ้ มด็ เลอื ดแดงแตก จากนน้ั เตมิ สารละลาย 2x PBS buffer ปรมิ าตร 5 มล. – ปั่นเหว่ยี งแยกตะกอน ดว้ ยเครอื่ ง refrigerated centrifuge ความเร็ว 1000xg เปน็ เวลา 10 นาที

14 สถาบนั สขุ ภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศสุ ัตว์ – เทส่วนใส (supernatant) ทิ้ง และเตมิ สารละลาย 2% complete growth media (minimum essential media + 2% fetal bovine serum) ปรมิ าตร 0.2 - 0.5 มล. ผสมให้เข้ากนั และแยกใสใ่ น หลอด microcentrifuge ใหม่ พรอ้ มบง่ ช้ีหมายเลข ตัวอย่าง – นาไปทดสอบในขนั้ ตอนตอ่ ไป หรอื เก็บรกั ษาสภาพ ในตัวอยา่ งทอ่ี ณุ หภมู ิ –20 ºC เพอ่ื เกบ็ รกั ษาเชือ้ ใน ระยะยาว กำรเตรียม buffy coat extraction (Lymphoprep™) – เตรียมสารละลาย Lymphoprep™ และเตมิ ลงใน หลอด centrifuge tube ตามอัตราสว่ นตารางที่ 1 – เจอื จางเลอื ดดว้ ยสารละลาย 2% complete growth media (MEM + 2% FBS) ดว้ ยปรมิ าตรทเี่ ท่ากนั – ดูดเลือดท่ีเจือจางแลว้ ดว้ ยปิเปต และนาปเิ ปตแตะ ดา้ นในหลอด แลว้ ค่อยๆ ปลอ่ ยเลอื ดลงบนสารละลาย ที่เตรยี มไว้ โดยไม่ใหส้ ารละลายผสมกนั ดงั รปู ท่ี 9 – ป่นั เหวี่ยงแยกตะกอน ดว้ ยเครอ่ื ง refrigerated centrifuge ความเรว็ 800xg เป็นเวลา 20 นาที – เทส่วนใสท้ิง พยายามไมใ่ หก้ ระทบชน้ั Plasma : Lymphoprep™ interface และใช้ปิเปตดดู เกบ็ เมด็ เลอื ดขาว จากบรเิ วณ buffy layer ในชั้นน้ี ใส่ในหลอด centrifuge tube ขนาด 15 มล. – เติมสารละลาย complete growth media ใน ปรมิ าตรทเ่ี ท่ากัน – ปน่ั เหว่ียงแยกตะกอน ดว้ ยเครอ่ื ง refrigerated centrifuge ความเร็ว 350xg เป็นเวลา 10 นาที

สถาบันสขุ ภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศสุ ัตว์ 15 – เทสว่ นใสทงิ้ และเติมสารละลาย complete growth media ปรมิ าตร 0.2–0.5 มล. – นาไปทดสอบในขน้ั ตอนตอ่ ไป หรอื เกบ็ รกั ษาสภาพ ในตวั อยา่ งทอ่ี ณุ หภมู ิ –20 ºC เพอ่ื เก็บรกั ษาเชอ้ื ใน ระยะยาว กำรเตรยี มจำกเลอื ด (whole blood) – ใชช้ ดุ สกัดสารพนั ธุกรรม DNA จากเลอื ด ** กรณีตวั อยา่ งมกี ารแยกชนั้ ใหน้ าซรี มั มาทดสอบ แทน ตารางท่ี 1 ปริมาตรและขนาดหลอดที่แนะนา เลอื ด MEM + 2% Lymphoprep™ ขนาดหลอด (มล.) FBS (มล.) (มล.) (มล.) 1 1 1.5 5 2 2 3 15 3 3 3 15 4 4 4 15 5 5 10 50 10 10 15 50 รปู ท่ี 9 กอ่ นและหลังการปนั่ เหว่ยี ง Lymphoprep™ ทมี่ า: Cockshell and Bonder, 2016.

16 สถาบนั สุขภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศุสตั ว์ 2) อวยั วะ กำรเตรียม 10% (w/v) organ suspension – นาตวั อยา่ งอวยั วะ หนักประมาณ 1 กรัม ตดั เป็นชน้ิ เลก็ ด้วยกรรไกรสะอาด บดตวั อย่างให้ละเอียด – เตมิ สารละลาย 1x PBS buffer ปรมิ าตร 10 มล. – เทแบง่ ตวั อยา่ งใส่หลอด microcentrifuge tube ขนาด 1.5 มล. – ป่ันเหวยี่ งสารละลายด้วยเครอื่ ง refrigerated centrifuge ความเรว็ 10,000 rpm 10 นาที – เทส่วนใสใส่หลอด microcentrifuge tube ขนาด 1.5 มล. – กาจดั แบคทเี รยี ทอ่ี าจปนเป้อื นโดยการกรอง สารละลายดว้ ย syringe filter ขนาด 0.45 ไมครอน หรอื เติมยาปฏิชีวนะ เช่น ampicillin แลว้ ตงั้ ทิ้งไวท้ อ่ี ณุ หภมู ิหอ้ ง 30 นาที – นาไปทดสอบในขัน้ ตอนต่อไป หรอื เกบ็ รกั ษาสภาพ ในตวั อยา่ งทอ่ี ุณหภมู ิ –20 ºC เพอื่ รอการทดสอบ 3) ชนิ้ เนื้อตวั อย่ำง – ทาการเตรยี มตวั อยา่ งเชน่ เดยี วกับตวั อย่างอวยั วะ 4) ผลิตภณั ฑส์ กุ ร และวตั ถุดบิ อำหำรสตั ว์ วธิ กี ำรเตรยี มตัวอยำ่ ง (1) 1 สุ่มตวั อยา่ งสับเปน็ ชนิ้ เล็กพอประมาณ และบดให้ ละเอยี ด กรณีที่ไมส่ ามารถบดตวั อยา่ งได้ ให้นา ตวั อย่างอาหารแช่ไนโตรเจนเหลว แล้วคอ่ ยบดให้ ละเอยี ด ใหไ้ ดน้ า้ หนกั รวม 50 กรมั 1. US FDA’s Bacteriological Analytical Manual 26B: detection of hepatitis A virus in foods. https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laborator ymethods/ucm374006.htm

สถาบนั สขุ ภาพสัตวแ์ หง่ ชาติ กรมปศุสตั ว์ 17 – เติมสารละลาย 0.75M Glycine Buffer (0.75M Glycine, 0.15M NaCl, pH 7.6) ปริมาตร 55 มล. – บ่มตัวอย่างทอ่ี ณุ หภูมหิ อ้ ง บนเครอ่ื งเขย่า ที่ความเร็ว 200 รอบตอ่ นาที เป็นเวลา 15 นาที – เกบ็ สารละลายส่วนใสใสใ่ นหลอด centrifuge tube ขนาด 50 มล. – ป่ันเหวี่ยงแยกตะกอน ด้วยเครอื่ ง refrigerated microcentrifuge ความเรว็ 9,000xg ทอ่ี ณุ หภูมิ 4 C เปน็ เวลา 30 นาที – เกบ็ สารละลายสว่ นใสใสใ่ หลอด ultracentrifuge tube ขนาด 50-70 มล. – สมดุลน้าหนักของสารละลายตวั อย่าง ดว้ ยสารละลาย Glycine Buffer ให้เท่ากัน – ปนั่ เหว่ยี งแยกตะกอน ด้วยเครอ่ื ง ultracentrifuge ความเรว็ 170,000xg ทอี่ ณุ หภูมิ 4 C เปน็ เวลา 60 นาที – เทสารละลายส่วนใส่ทง้ิ (ควรเหน็ ตะกอนทข่ี า้ งหลอด) และตง้ั หลอดท้ิงไวป้ ระมาณ 4-5 นาที เพอ่ื กาจัด ของเหลวทเ่ี หลอื ทงิ้ – ละลายตะกอนทีไ่ ดด้ ว้ ยสารละลาย Glycine Buffer ปริมาตร 200 ไมโครลติ ร วธิ ีกำรเตรยี มตัวอยำ่ ง (2) 2 – บดตัวอย่างใหล้ ะเอียด ใหไ้ ดน้ ้าหนกั รวม 25 กรมั – เตมิ สาร TRIzol™ reagent ปริมาตร 8 มล. แลว้ สกดั DNA ตอ่ ไปตามขน้ั ตอนการสกดั ดว้ ย TRIzol™ (Invitrogen, US) 2. Methods for virus detection in ready to eat (RTE) foods (Institute of Environmental Science and Research Limited)

18 สถาบนั สุขภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศุสตั ว์ 2. กำรสกดั สำรพันธกุ รรม – ชุดสกัดสารพันธกุ รรมจากตวั อยา่ งโดยใช้ชดุ ทดสอบ High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, US) – ชุดสกดั สารพนั ธุกรรมจากตวั อย่างโดยใช้ชุดทดสอบ QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, US) – ชุดสกดั สารพนั ธกุ รรมจากตวั อย่างโดยใชช้ ดุ ทดสอบ GF-1 blood DNA Extraction Kit (Vivantis, Malaysia) – ชดุ สกดั สารพันธุกรรมจากตวั อยา่ งโดยใช้ชดุ ทดสอบ GF-1 viral nucleic acid Extraction Kit (Vivantis, Malaysia) – เครอื่ งสกดั Automated MagMAX Pathogen RNA / DNA Extraction Kit – เครื่องสกดั DNA Taco Automatic Extraction System โดยปฎบิ ตั ิตามคูม่ อื วิธสี กดั ของชุดทดสอบ จากนน้ั นา DNA ที่สกดั ไดเ้ ก็บทอ่ี ณุ หภมู ิ –20 ºC เพอ่ื ทาการวิเคราะหต์ ่อไป 3 กำรตรวจตวั อยำ่ งด้วยวิธี qPCR 1. รายละเอยี ด Primer และ Probe (King et al,2003)3 ASF Forward 5’-CTGCT-CATGG-TATCA-ATCTT-ATCGA-3’ ASF Reward 5’-GATAC-CACAA-GATC(AG)- GCCGT-3’ ASFV Probe [(FAM)]- CCACG-GGAGG-AATAC-CAACC-CAGTG-3’-TAMRA 3. King, D.P., Reid, S.M., Hutchings, G.H., Grierson, S.S., Wilkinson, P.J., Dixon, L.K., Bastos, A.D. and Drew, T.W., 2003. Development of a TaqMan® PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. Journal of virological methods, 107(1), pp.53-61.

สถาบันสขุ ภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศสุ ัตว์ 19 2. การคานวณปรมิ าตร Master mix (FastStart Essential DNA Probes Master) ปรมิ าตร ปรมิ าตร...x Master mix component 1x (µl) (µl) 1. FastStart Essential DNA 10 Probes Master, 2x concentrated 2.5 1 2. Water, PCR Grade 1 0.5 3. ASF Forward 5 4. ASF Reward 5. ASFV Probe 6. Template Total reaction volume 20 3. สภาวะเคร่อื ง qPCR Step Stage Cycles Temp. (ºc) Time Hot start 21 95 10min Amplification 3 40 95 15sec 60 1min 4. การควบคมุ คณุ ภาพผลการทดสอบดว้ ยวธิ ี qPCR การตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธี qPCR จาเปน็ ต้องมีการ ควบคุมคุณภาพผลการทดสอบ ตัวควบคุมบวก และ ตวั ควบคุมลบในการทดสอบ โดยแบง่ ไดด้ งั น้ี 4.1 ตวั ควบคุมการสกดั (Extraction control) – Positive extraction control (E+) เพ่อื ควบคุม และสังเกตประสทิ ธิภาพของการสกดั โดยควรเปน็ ตัวอยา่ งทท่ี ราบค่าผลบวก เชน่ ตวั อยา่ งทใ่ี ส่ (spike) เช้ือไวรสั ASF ลงไป หรืออาจพิจารณาใช้

20 สถาบันสขุ ภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศุสัตว์ Internal positive extraction control (IPC) ใส่ลงไปในตวั อย่างจริงท่ีตอ้ งการตรวจแทน เพอ่ื ประเมนิ ประสทิ ธภิ าพการสกดั และสังเกตผล ของสารยบั ยง้ั (Inhibitors) ต่าง ๆ ในตัวอยา่ ง ทดสอบ – Negative extraction control (E–) เพ่อื ควบคุม และสงั เกตการปนเป้ือนระหวา่ งการสกัดตัวอยา่ ง โดยควรเปน็ ตวั อยา่ งชนิดเดยี วสิ่งทตี่ อ้ งการสกัด แตใ่ นกรณที ี่ไม่สามารถหาได้ ให้ใชน้ า้ DW molecular grade แทน 4.2 ตวั ควบคมุ สารผสมปฏกิ ริ ยิ า (Master mix reaction control) – Positive reaction control (R+) เชน่ พลาสมดิ ที่ มี DNA ของเช้อื ไวรัส ASF เพอื่ ควบคุมและสังเกต การทางานของสารผสมปฏกิ ิริยาวา่ สามารถเพม่ิ ปริมาณดเี อน็ เอของเชือ้ ไวรสั ASFไดห้ รอื ไม่ – Negative reaction control (R-) เช่น นา้ DW molecular grade เพ่อื ควบคมุ และสงั เกตการ ปนเปื้อนของสารผสมปฏกิ ริ ิยา 5. การตรวจเพอ่ื ยนื ยนั ผล กรณตี วั อยา่ งให้ผลเปน็ บวกดว้ ยวิธี qPCR ใหท้ าการตรวจ เพือ่ ยืนยนั ผลด้วยวธิ ี Sequencing กรณที ่ีหอ้ งปฏิบัตกิ ารไมม่ เี ครอ่ื ง Sequencing ให้นาตวั อยา่ งส่งสถาบันสุขภาพสตั ว์แหง่ ชาติ

สถาบันสขุ ภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศุสัตว์ 21 – รายละเอียด Sequencing Primer สาหรับ Partial P72 gene (Bastos et al., 2003)4 p72-U 5’-GGCACAAGTTCGGACATGT-3’ p72-D 5’-GTACTGTAACGCAGCACAG-3’ 4. กำรกำจดั ขยะและกำรทำลำยเชอ้ื การลดการปนเปอ้ื นของเชื้อและการกาจดั ขยะปนปือ้ นใน ห้องปฏิบัตกิ าร ดาเนนิ การหลายวธิ คี วบค่กู นั เชน่ – แช่น้ายาฆา่ เชอ้ื เชน่ sodium hypochlorite, phenolic compound, alcohol, iodine solution เป็นต้น โดยดาเนนิ การตามคาแนะนาของน้ายาแต่ละชนิด – ต้มในนา้ เดอื ด นานอย่างนอ้ ย 5 นาที – นึ่งในเครื่องอบฆ่าเชื้อดว้ ยไอนา้ ความดนั สูง (Autoclave) – ทง้ิ ในถงุ ขยะตดิ เชือ้ และกาจัดตามมาตรฐานขยะติดเชอื้ ก่อนการกาจัดขยะ ควรแยกขยะออกเปน็ กล่มุ คือ 1.ขยะทั่วไป (general waste) หมายถงึ ขยะที่ไมเ่ กีย่ วของ กับบริการการตรวจวินจิ ฉัยการดแู ลรกั ษา เชน กระดาษ เศษอาหาร 2.ขยะติดเชอื้ (infectious waste ) หมายถึง ขยะทาง หอ้ งปฏิบตั ิการซึ่งสงสัยวามีเชอื้ โรค ขยะทีส่ มั ผัสหรือ สงสยั วาไดสัมผัสกบั เลอื ดสารคดั หล่งั จากรางกาย อวยั วะจากสัตว์ 4. Bastos, A.D., Penrith, M.L., Cruciere, C., Edrich, J.L., Hutchings, G., Roger, F., Couacy-Hymann, E.G.R.T. and Thomson, G.R., 2003. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation. Archives of virology, 148(4), pp.693-706.

22 สถาบันสุขภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศสุ ตั ว์ 1) ขยะท่ีเปนของเหลวหรอื สารคดั หล่ัง 2) ขยะท่ีเปนอวยั วะหรอื ชิ้นสวนของอวยั วะจากการตรวจทาง หองปฏบิ ัติการ ซากสัตว์ วัสดทุ สี่ ัมผสั ระหวางการตรวจ 3) ขยะของมีคมติดเชื้อที่ใชแลว 4) ขยะจากกระบวนการเก็บและเพาะเชอ้ื เชน เช้อื จากการ เพาะเลยี้ ง วัสดอุ น่ื และเครอ่ื งมอื ท่ีใชเพาะเช้ือแลว 3. กลุ่มขยะตดิ เชอ้ื สาหรบั นาไปนึ่งฆา่ เชอ้ื แลว้ กลบั มาใช้ใหม่ เช่น ขวดแกว้ เสอื้ หอ้ งปฏิบัตกิ าร เป็นตน้ 4. กลุม่ ขยะตดิ เชอ้ื สาหรบั นาไปนึ่งฆ่าเช้อื แลว้ กาจัดในที่ เหมาะสมหรือเผา เชน่ ซากสัตว์ เนอื้ เยื่อของสตั ว์ หมวก ถงุ มอื และหนา้ กากอนามยั เปน็ ต้น

สถาบันสขุ ภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศุสตั ว์ 23 กำรแจ้งสตั ว์ปว่ ย และรำยงำนผลตรวจ

24 สถาบนั สุขภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศสุ ตั ว์

สถาบนั สุขภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศุสตั ว์ 25 ภำคผนวก

26 สถาบันสขุ ภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศุสตั ว์ เครอื ข่ำยทำงห้องปฏบิ ัติกำร ช่อื ที่อยูห่ น่วยงำน โทรศพั ท์ ทีอ่ ยู่ กรมปศสุ ัตว์ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์ สถาบันสุขภาพสตั วแ์ หง่ ชาติ 0-2579-8908-14 50/2 เกษตรกลาง ถนนพหลโยธนิ กลมุ่ ไวรัสวิทยา ตอ่ 422 แขวงลาดยาว เขตจตจุ ักร กรงุ เทพฯ 10900 ศนู ย์วจิ ยั และพัฒนาการสัตวแพทย์ 0-5483-0195 221 ม.6 ถ.ลาปาง-เชยี งใหม่ ภาคเหนือตอนบน 0-5483-0196 ต.เวยี งตาล อ.ห้างฉัตร จ.ลาปาง 52190 ศูนยว์ ิจยั และพัฒนาการสตั วแพทย์ 0-5531-3137-9 9 ม.15 ถ.พิษณุโลก-หล่มสกั ภาคเหนือตอนลา่ ง ต.วังทอง อ.วงั ทอง จ.พิษณโุ ลก 65130 ศนู ย์วจิ ัยและพฒั นาการสตั วแพทย์ 0-4326-2050 404 ม.15 ถ.มิตรภาพ ภาคตะวันออกเฉียงเหนือตอนบน ต.ท่าพระ อ.เมือง จ.ขอนแก่น 40260 ศูนย์วจิ ยั และพัฒนาการสตั วแพทย์ 0-4454-6104 291 ม.9 ถ.สุรินทร์-ปราสาท ภาคตะวันออกเฉียงเหนือตอนล่าง ต.นาบัว อ.เมือง จ.สรุ ินทร์ 32000 ศูนย์วจิ ัยและพฒั นาการสัตวแพทย์ 0-7577-0008-9 124/2 ม.7 ถ.ทงุ่ สง-ห้วยยอด ภาคใต้ 0-7577-0128-30 ต.ท่วี งั อ.ทุ่งสง จ.นครศรธี รรมราช 80110 ศนู ยว์ จิ ยั และพัฒนาการสัตวแพทย์ 0-3874-2116-19 844 ม.9 ต.คลองกิว่ อ.บา้ นบงึ ภาคตะวนั ออก จ.ชลบรุ ี 20220 126 ม.10 ต.เขาชะงมุ้ อ.โพธาราม ศูนย์วิจยั และพัฒนาการสตั วแพทย์ 0-3291-9575-6 จ.ราชบรุ ี 70150 ภาคตะวนั ตก ด่านกกั กนั สตั วม์ ุกดาหาร ต.คาอาฮวน อ.เมือง จ.มกุ ดาหาร กองสารวตั รและกักกนั 0-4280-1067 49000 กรมปศสุ ตั ว์

สถาบันสุขภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศุสัตว์ 27 ชอื่ ท่ีอย่หู นว่ ยงำน โทรศพั ท์ ท่ีอยู่ กระทรวงทรพั ยำกรธรรมชำติและสิง่ แวดลอ้ ม สานกั อนรุ ักษ์และวจิ ัย องค์การ 02-282-6125 71 ถ.พระราม 5 แขวงดสุ ติ สวนสตั ว์ ในพระบรมราชูปถมั ภ์ เขตดสุ ิต กทม. 10300 ทบวงมหำวิทยำลัย หน่วยชันสูตรโรคสัตวก์ ลาง 02-218-9604 39 ถ.อังรีดูนังต์ คณะสัตวแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์ แขวงวังใหม่ เขตปทุมวนั มหาวทิ ยาลยั กรุงเทพมหานคร 10330 หนว่ ยชันสูตรโรคสัตว์ โรงพยาบาล 034-270968-70 57 ม.1 ถ.ทหารบก ปศุสตั ว์ คณะสตั วแพทยศาสตร์ ต.บ่อพลับ อ.เมอื ง จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลยั จ.นครปฐม 73000 หนว่ ยชันสตู รโรคสัตว์ 034-351-9013 1 ม. 6 ต.กาแพงแสน คณะสัตวแพทยศาสตร์ อ.กาแพงแสน จ.นครปฐม มหาวทิ ยาลยั เกษตรศาสตร์ วทิ ยา 73140 เขตกาแพงแสน ศูนย์เฝ้าระวงั และตดิ ตามโรคจาก 02-441-5236 999 พุทธมณฑลสาย 4 สัตวป์ า่ สัตว์ตา่ งถน่ิ และสตั วอ์ พยพ ต.ศาลายา อ.พุทธมณฑล (MoZWE) คณะสัตวแพทยศาสตร์ จ.นครปฐม 73170 มหาวทิ ยาลยั มหดิ ล หนว่ ยชันสูตรโรคสตั ว์ ศนู ย์บริการ 053-948041-2 155 ม.2 ถ.เลยี บคันคลอง สขุ ภาพสตั ว์ คณะสตั วแพทยศาสตร์ ชลประทาน ต.แม่เหยี ะ มหาวทิ ยาลัยเชียงใหม่ อ.เมอื ง จ.เชียงใหม่ 50100 ห้องปฏบิ ตั กิ ารชันสูตรโรคทาง 043-202283 123 อาคาร รพ.สตั ว์ ปศสุ ัตว์ คณะสตั วแพทยศาสตร์ สัตววทิ ยรักษ์ ถ.มิตรภาพ มหาวทิ ยาลัยขอนแกน่ ต.ในเมอื ง อ.เมอื ง จ.ขอนแก่น 40002

28 สถาบันสุขภาพสัตว์แหง่ ชาติ กรมปศสุ ตั ว์ ช่ือท่อี ยูห่ นว่ ยงำน โทรศพั ท์ ท่อี ยู่ ห้องปฏบิ ตั กิ ารทางสัตวแพทย์ 043-712832 มหาวทิ ยาลัยมหาสารคาม สาธารณสุข คณะสตั วแพทยศาสตร์ ถ.นครสวรรค์ ต.ตลาด มหาวิทยาลัยมหาสารคาม อ.เมือง จ.มหาสารคาม 44000 คณะสัตวแพทยศาสตร์ 074-289600 15 อาคารจฬุ าภรณการณุ ยรกั ษ์ มหาวทิ ยาลยั สงขลานครินทร์ 074-289608 ถ.ปณุ ณกณั ฑ์ ต.คอหงส์ อ.หาดใหญ่ จ.สงขลา 90110 หอ้ งปฏบิ ตั ิกำรภำคเอกชน ศนู ยว์ ินิจฉัยโรคสัตวบ์ ก, 02-988-0671 29/2 ม.9 ถ.สรุ นิ ทวงศ์ แขวงลาผกั ชี บรษิ ทั ซีพีเอฟ จากดั (มหาชน) เขตหนองจอก กทม. 10530 ศูนย์วิทยาศาสตร์เบทาโกร จากัด 02-564-7932 136 ม.9 ถ.พหลโยธิน ต.คลองหนึง่ อ.คลองหลวง จ.ปทุมธานี 12120 ศนู ย์วทิ ยาการวินจิ ฉยั โรคสตั ว์, 089-901-1856 18 ม.16 ต.เลาขวัญ อ.เลาขวญั บริษทั ไทย ฟู้ดส์ รีเสริ ์ซ เซ็นเตอร์ จ.กาญจนบรุ ี 71210 จากดั

สถาบันสุขภาพสัตวแ์ หง่ ชาติ กรมปศสุ ตั ว์ 29 คำแนะนำกำรเก็บตัวอย่ำงสำหรับเจำ้ หนำ้ ที่

30 สถาบนั สขุ ภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศสุ ตั ว์ คำแนะนำกำรป้องกนั โรคสำหรับฟำรม์ สกุ ร

สถาบนั สขุ ภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศุสตั ว์ 31 กำรทำลำยเช้อื ในวัตถุดิบ เศษอำหำรที่ใช้เลี้ยงสกุ ร (swill) มวี ธิ กี ารทาให้เชอ้ื หมดฤทธ์ิได้หลายวธิ ี ไดแ้ ก่ 1. ใหค้ วามร้อน ตม้ เศษอาหารท่ใี ชเ้ ลีย้ งสตั ว์ ทอี่ ณุ หภมู ิ 90 ºC อยา่ งนอ้ ย 60 นาที และทาการคนผสมตลอดเวลา หรือ 2. ใหค้ วามร้อนภายใตค้ วามดนั ในเศษอาหารท่ใี ช้เล้ียงสตั ว์ ท่อี ุณหภมู ิ 121 ºC ความดนั 3 บาร์ อยา่ งนอ้ ย 10 นาที เน้ือสุกร (meats) มวี ิธกี ารทาให้เช้อื หมดฤทธิ์ได้หลายวธิ ี ไดแ้ ก่ 1. การทาลายเชอ้ื ดว้ ยความรอ้ น เนื้อสัตว์ ทาได้ ดงั นี้ – สาหรับภาชนะบรรจทุ ่ีปดิ สนทิ ปอ้ งกนั อากาศเข้าออก (hermetically sealed container) ใหผ้ ่านกรรมวิธี ฆ่าเชอ้ื ด้วยความรอ้ นทอี่ ุณหภมู ิและเวลาทีก่ าหนด โดยใหค้ ่า F0 (sterilization value) ทเี่ วลา ไมต่ ่ากวา่ 3 นาที หรอื – ให้ความร้อน ทาให้เนอื้ สัตว์มอี ณุ หภูมิ 70 ºC อย่างน้อย 30 นาที โดยให้ความรอ้ นท่ัวถงึ ตลอดชน้ื เนือ้ 2. การทาลายเชอื้ ด้วยวิธกี ารหมกั แหง้ – เนื้อสัตว์จะถกู หมกั ดว้ ยการใชเ้ กลอื ทาทผ่ี วิ นอกหรอื คลุกให้ท่วั วัตถดุ บิ จากนนั้ บ่มหมักเป็นระยะเวลาอย่าง นอ้ ย 6 เดอื น

32 สถาบันสขุ ภาพสัตวแ์ ห่งชาติ กรมปศุสตั ว์ ไส้หมกั เกลอื (casings) ให้หมกั เกลือเป็นระยะเวลาอย่างนอ้ ย 30 วนั ด้วยผลกึ เกลือ โซเดยี มคลอไรด์ (dry salt NaCl) หรอื หมกั ในน้าเกลอื อิม่ ตวั ที่มีคา่ Aw (water activity) น้อยกว่า 0.80 หรอื หมกั เกลือ ที่สารประกอบฟอสเฟต ประกอบด้วย 86.5% NaCl, 10.7% Na2HPO4 โดยนา้ หนัก และหมกั ทอ่ี ณุ หภูมิไม่ต่ากว่า 12 ºC ซำกและมูลสกุ ร (litter and manure) 1.การทาลายเชอื้ ด้วยความรอ้ นชน้ื อณุ หภมู ิ 55 ºC อยา่ งนอ้ ย 60 นาที หรอื 2.การทาลายเชอื้ ด้วยความรอ้ นชน้ื อณุ หภมู ิ 70 ºC อย่างนอ้ ย 30 นาที

สถาบนั สุขภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศุสัตว์ 33 กำรทำควำมสะอำดและฆำ่ เชือ้ โรค (cleansing and disinfection procedure) ความปลอดภยั ทางชีวภาพ (biosecurity) นั้นเปน็ หวั ใจ สาคัญเพ่ือควบคมุ ปอ้ งกันโรคภายในฟาร์ม ใหเ้ นน้ ลดการ นาเขา้ เช้ือเข้าสฟู่ าร์ม หรอื นาเชื้อออกสู่ส่งิ แวดลอ้ มภายนอก ฟารม์ ซึง่ หากดาเนินการฆา่ เชื้ออย่างถกู ต้อง ย่อมลดโอกาส การระบาดของโรคเขา้ ส่ฟู ารม์ ไดอ้ ย่างมีประสิทธภิ าพ ขั้นตอนตา่ ง ๆ ทจ่ี าเปน็ จะต้องดาเนนิ การ มีดังนี้ 1. เตรียมนา้ ยาฆ่าเชอื้ โรคทผี่ สมน้าตามอตั ราสว่ นทก่ี าหนด ได้แก่ เวอร์คอน คลอรนี (เช่น โซเดียมไฮโปคลอไรท)์ ไอโอดนี (เชน่ เบตาดนี ) โดยเลอื กใช้ชนิดของนา้ ยาฆา่ เชอ้ื ใหเ้ หมาะสมกับการใชง้ าน 2. กาจดั ส่งิ ปฏกิ ูลออกจากยานพาหนะ หรอื โรงเรือน 3. คดั แยกประเภทอปุ กรณ์ โดยตอ้ งทาการฆา่ เชอ้ื โรคอยา่ งดี กอ่ นทิ้งหรือนากลบั ไปใชอ้ กี 4. ล้างทาความสะอาดดว้ ยสารซกั ลา้ ง (detergent) ขัดทาความสะอาด ลา้ งดว้ ยนา้ สะอาดหรอื ใช้ท่อความดนั สงู ฉีดน้าพน่ ลา้ ง 5. จากนนั้ จงึ พน่ นา้ ยาฆา่ เชอื้ โรคให้ชุ่มโชก ปลอ่ ยทง้ิ ไว้ 30 นาที แลว้ จงึ ฉดี พน่ นา้ ยาฆา่ เชอื้ โรคซ้าอกี ครงั้

34 สถาบันสขุ ภาพสัตว์แห่งชาติ กรมปศสุ ตั ว์ สำรฆำ่ เชือ้ ไวรัสอหวิ ำต์แอฟริกำในสกุ ร Disinfectant Field of application Concentration Exposure time surface disinfectant 1% 15 min Sulfuric acid liquid manure 1% 1 week 1% 15 min Formic acid surface disinfectant 4% 1 week liquid manure 2% 15 min Peracetic acid surface disinfectant 0% 15 min surface disinfectant 1% 1 week Formaldehyde liquid manure 0.50% > 4 days liquid manure 3% 15 min Sodium dodecyl surface disinfectant 3% 1 week sulfate liquid manure 1% 30 min surface disinfectant 1% 1 week Glutaraldehyde liquid manure 0.2 % 11 days solution tissue 0.50% 30 min 4% 1 week Shsooylddurituoiomxinde surface disinfectant 1% 150 s (4 °C) liquid manure 1% 30 min (4 °C) Citric acid liquid manure 2% 30 min (22 °C) liquid manure 1h surface disinfectant 0(p,0o1t5asbsiiusm0,0io0d7i5d%e) 30 min 1% Caustic lime dung pack 0,03 bis 0,0075 % 150 s (4 °C) shoydpioucmhloride 30 min (4 °C) Iodine 2,3 % Chlor 5 min Opnohrtelhnoy-lphe 0,15 % / 0,2 % als Natrium Chloride, surface disinfectant hypochloride Hypochlorite surface disinfectant surface disinfectant 0.003% dQcmyaomsumamrptoeonruaiunr surface disinfectant 1% Lime Ca(OH)2 liquid manure 1% Heat liquid manure 65 °C pig slurry ทมี่ า : Alonso C. et al. African Swine Fever (ASF): Gap Analysis Workshop Report. 2018. Agricultural Research Service, Washington, D.C. USA. https://www.ars.usda.gov/GARA/reports.htm