ใบความรู้ เรื่อง การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยือ่ ปจจุบันนี้ เทคโนโลยีดานการเกษตรไดกาวหนาไปอยางมาก เปนท่ีรูจักกันมากในขณะนี้คือ การตัดตอยีนสเพื่อใหสายพันธุพืชสายใหมที่ทนตอโรค แมลง และใหผลผลิตสูง หรือรูจักกันในนามพืช GMO ท่ีกําลังเปนปญหาถกเถียงกันในขณะนี้วาพืชบางอยางไดตัดตอยีนสแลวบางตัวมีผลทําใหแมลงตาง ๆ ตาย ซ่ึงแมลงบางตัวเปนแมลงทีมีประโยชน อาจสงผลใหสภาพความสมดุลทางธรรมชาติสูญเสียไปดวย การเพาะพันธุตนไมในสภาพที่ปลอดเช้ือหรือ การเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือพืช (Tissue Culture) เปนอีกวิธีหนึ่งของเทคโนโลยีดานการเกษตรชนิดอ่ืนที่นอกเหนือจากพืชสวน พืชไร ไมดอก เชนการเพาะเลี้ยงเย่ือสมุนไพรเพราะวิธีการน้ีสามารถขยายพันธุไดเร็วและจํานวนมาก แตมีขอเสียอยูคือตนทุนในการจัดต้ังหองปฏิบัติการคอนขางสูง และข้ันตอนในการปฏิบัติการขยายพันธุคอนขางยาก ถาเทียบกับการขยายพันธุไมดอก กลวยไมหรือไมประดับ เพราะวาสมุนไพรในแตละชนิดจะมียาง ซึ่งในยางนั้นจะมีตัวยาแตกตางกันไป และตัวยาในยางของสมนุ ไพรนเี่ องทม่ี กั จะทําปฏิกริยากบั ธาตอุ าหารสงั เคราะหท่ใี ชเล้ยี งตน พชื สมุนไพร บางครงั้ อาจทําใหพืชนั้นไมเจริญเติบโต ไมแตกกอ ไมดูดสารอาหาร และจะทําใหพืชนั้นตายในที่สุด แตถาหากทดลองสูตรอาหารไดสูตรทีเ่ หมาะสมกับพืชนั้นๆ ก็จะเจรญิ เติบโตไดดีการเพาะเลย้ี งเน้ือเยอ่ื พืช คือ การนําสวนใดสว นหนึ่งของพืชไมว า จะเปน สวนเนื้อเยือ่ อวัยวะตาง ๆ ของพืชหรอื เซลล มาเล้ยี งในสภาพที่ปลอดเชอ่ื จุลินทรีย โดยมกี ารควบคมุ สภาพแวดลอม เชน อณุ หภูมิ แสง ความชน้ืสว นตางๆ ของพชื เหลานีจ้ ะสามารถเจริญเตบิ โตพัฒนาเปนตน ใหม โดยท่พี ชื ทกุ ตนจะมีลักษณะเหมอื นกนัดว ยเหตนุ ้กี ารเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พืชจึงมีประโยชนอ ยา งกวางขวางในหลายสาขา เชน ทางดานการเกษตรทําใหสามารถขยายพนั ธไุ ดจ าํ นวนมากในเวลาอนั รวดเรว็ หรือสามารถผลิตตน พันธทุ ป่ี ลอดเชอ้ื ไดจ าํ นวนมาก และยงั สามารถสรางพันธุใ หม ๆ ไดโดยการเพาะเลยี้ งคพั ภะ (Embryo) อบั ละอองเกสร (Anther Culture)นอกจากนเ้ี ทคนิคการเพาะเลีย้ งเน้ือเย่ือพืชยงั มคี วามสาํ คัญ สาํ หรบั การเกบ็ รักษาพันธุพ ชื ในสภาพปลอดเชอ้ื ไดดีประโยชนข องการเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอื่คุณสมบตั ิทถ่ี กู นํามาใชใ หเกิดประโยชนข องวธิ เี พาะเลี้ยงเนอ้ื เยือ่ มีหลายขอพอสรุปไดด ังนี้ 1. สามารถผลิตตนพันธุพืชปรมิ าณมาณมากในระยะเวลาอนั รวดเรว็ ตัวอยางเชน หากพชื สามารถเพิม่ ปรมิ าณได 3 เทา ตอการยา ยเนอื้ เยื่อลงอาหารใหมท ุกเดอื นๆ ละ 1 ครงั้ เมอื่ เวลาผานไป 6 เดือน จะ สามารถผลิตตนพนั ธุพชื ไดถึง 243 ตน

2. ตน พชื ท่ผี ลติ ไดจะปลอดโรค โดยเฉพาะโรคท่ีมสี าเหตจุ ากเช้อื ไวรสั มายโคพลาสมา ดว ยการตดั เน้อื เยือ่ เจรญิ ทอ่ี ยูบริเวณปลายยอดของลาํ ตน ซึง่ ยงั ไมม ีทอ นํ้าทออาหาร อนั เปนทางเคลื่อนยายของ เชอ้ื โรค ดงั กลา ว 3. ตนพืชทผี่ ลติ ได จะมลี ักษณะทางพันธกุ รรมเหมือนตน แม คือ มลี ักษณะตรงตามพันธุ ดว ยการใช เทคนคิ ของการเลยี้ งจากชิน้ ตาพืชพฒั นาเปน ตนโดยตรง หลีกเล่ียงขั้นตอนการเกดิ กลมุ กอ นเซลลที่ เรียกวา แคลลัส 4. ตน พืชท่ีผลติ ไดจ ะมขี นาดสม่ําเสมอ ผลผลติ ทีไ่ ดมีมาตรฐานและเกบ็ เก่ียวไดคราวละมากๆ พรอ มกนั หรอื ในเวลาเดยี วกัน 5. เพอื่ การเก็บรกั ษาหรอื แลกเปล่ยี นพันธพุ ชื ระหวา งประเทศ เชน การมอบเช้อื พันธุกลว ยในสภาพ ปลอด เช้ือขององคก รกลว ยนานาชาติ (INIBAP) ใหกรมสง เสรมิ การเกษตร เมอื่ ป พ.ศ. 2542 6. เพอ่ื ประโยชนด านการสกดั สารจากตน พืช นํามาใชป ระโยชนดานตางๆ เชน ยาฆา แมลง ยารักษาโรค เปน ตนนอกจากนี้ ยงั มคี ุณประโยชนอ ีกหลายประการ เชน เพือ่ การผลิตพืชทนทานตอ สภาพแวดลอม ทนกรดทนเคม็ เปน ตน หรือการใชป ระโยชนเ กยี่ วกับการศกึ ษาทางชีวเคมี และสรีรวทิ ยาของพืช เปน ตน ในสว นของกรมสง เสริมการเกษตรไดน าํ ประโยชนขอ 1-4 มาเปนขอกําหนดคณุ ลักษณะพนั ธุพืชท่ผี ลิตดว ยวธิ ีการเพาะเลย้ี งเนื้อเย่ือกอ นนาํ เขา ระบบสงเสรมิ สเู กษตรกร คือ ตนพันธุพชื ท่ีผลิตไดต อ งปลอดโรค มีลักษณะตรงตามพันธุและสามารถขยายไดปริมาณมากในเชงิ อุตสาหกรรม นบั เปน หนว ยงานแรกของภาครัฐทมี่ ีการนาํเทคโนโลยีเพาะเลี้ยงเนอื้ เยื่อมาพัฒนาใชก บั งานขยายพันธุพืชเศรษฐกจิ ในเชิงพานิชยอ ยา งเปนรูปธรรมและพรอ มนําไปใชใ นระบบสงเสรมิ ตวั อยา งพันธพุ ืชเพาะเลย้ี งท่มี ีการทดลองนํารองปลูกในสภาพไร และประสบผลสําเร็จเปนอยางดี ไดแ ก หนอ ไมฝรั่ง กลว ย ออ ย สบั ปะรด ไผ เบญจมาศ และสตรอเบอร่ี เปนตนอปุ กรณอปุ กรณที่ใชก บั งานเพาะเลย้ี งเนือ้ เยื่อคอ นขางมมี ากชนิด การจัดวางเครอ่ื งมือตองคํานงึ ถึงความสะดวกใน การใชต อ พื้นท่ีใหเ กดิ ประโยชนม ากทีส่ ุดถากําหนดชนิดของเครือ่ งมอื ตามตําแหนงของการใชง านภายในหองปฏบิ ตั ิการ จะแบงออกเปน 3 หอ งใหญๆ คอื 1. หอ งเตรยี มอาหาร 2. หองตัดเน้อื เยอ่ื 3. หอ งเลย้ี งเนือ้ เยือ่ภายในแตละหอ งจะมอี ปุ กรณแ ละเครือ่ งมือทีใ่ ชงานเปน ประจาํ แตกตา งกนั ไปตามลกั ษณะงานดงั น้ี

1 หองเตรยี มอาหาร เปน หอ งทีใ่ ช เ ก็บสารเคมแี ละวัสดุอปุ กรณเพ่อื การช่ังสาร หรอื ผสมอาหารหมอนงึ่ ความดันไอ ตูอบความรอนแหง ดังนี้จดั วางในตหู รือบนชน้ั วางของอยา งเปน ระเบียบเปน หมวดหมหู รือตามอกั ษรที่สําคัญควรอยบู รเิ วณเดียวกับทวี่ างเครอ่ื งชงั่1.2 เครือ่ งชง่ั เคร่ืองวัดความเปน กรด-ดาง ควรวางอยบู นโตะ ทม่ี ่นั คงไมส นั่ สะเทอื นงาย1.3 เคร่ืองแกวและเคร่ืองมอื อื่นๆ ควรมีท่เี กบ็ มิดชดิ และไมห า งจากอางนํ้ามากนกั1.4 อา งนํ้า ใชส าํ หรับลางทาํ ความสะอาดเครอ่ื งมอื ตางๆ เพ่ือความสะดวกตอการปฏบิ ตั งิ าน อาจอยูมมุ หน่ึงของบริเวณหอง1.5 บรเิ วณเตรยี มอาหาร ควรเปน โตะหรอื พนื้ ท่ีทีม่ คี วามสงู พอท่ีจะปฏบิ ตั ิงานในลกั ษณะยืนหรือนง่ั กไ็ ด1.6 เครอ่ื งกรองนาํ้ อาจใชเ ครอ่ื งกรองนํา้ ดม่ื ตามบานได1.7 เคร่อื งชงั่ มี 2 แบบ คอื เครอ่ื งชง่ั อยา งละเอยี ด และเครอ่ื งช่ังอยา งหยาบ-- เครอ่ื งชงั่ อยา งละเอียด สามารถชั่งไดเ ปนมิลลกิ รัม หรือทศนิยม 4 ตาํ แหนง ใชสาํ หรบั ชั่งสารเคมี วติ ามินและสารควบคมุ การเจริญเตบิ โต ซ่งึ ใชป ริมาณนอยมาก-- เครอ่ื งช่งั อยางหยาบ ชงั่ ไดเ ปน กรมั หรอื ทศนยิ ม 2 ตําแหนง ใชส าํ หรบั ชง่ั สารเคมีทใ่ี ชปรมิ าณมาก เชน วนุและนํา้ ตาล1.8 เครอ่ื งวดั ความเปนกรด-ดา ง (pH-meter) ใชวัดคาความเปน กรด-ดา ง ของอาหารสงั เคราะหควรอยูทรี่ ะดบั 5.61.9 เคร่อื งคนสารละลาย ใชสาํ หรับคนสารละลายเมือ่ ใสแทง คนไฟฟา (Magnetic stirror) ขณะเตรยี มอาหาร1.10 เตาตม อาหาร อาจเปนเตาไฟฟาหรือเตาแกส ใชสาํ หรับตม อาหารเพ่อื ใหว นุ ละลาย

1.11 ตูอบความรอ นแหง (Hot air oven) ใชใ นการอบฆาเช้อื เครือ่ งแกวและอปุ กรณใ นการตัดยา ย เนือ้ เย่อื โดยใชอณุ หภมู ิ 180 องศาเซลเซียส เปน เวลา 2-3 ชั่วโมง1.12 เคร่อื งแกว ปจ จุบนั นยิ มใชเปน พลาสตกิ เพราะลดความเสยี หายจากการแตกรา วไดคอ นขางมาก-- ฟลาสคหรือขวดรูปชมพู ขนาด 50-1,000 มิลลิลติ ร-- บกี เกอร ใชป รบั ปรมิ าตรของอาหาร ขนาด 20-1,000 มิลลิลติ ร-- กระบอกตวง ขนาด 5-1,000 มลิ ลิลติ ร-- ไปเปต ใชดดู สารละลายปริมาณนอ ย ขนาด 0.1-10 มลิ ลลิ ิตร1.13 หมอนึ่งความดนั ไอ (Autoclave) ใชน ง่ึ ฆา เชอื้ จลุ นิ ทรียในอาหารวุน โดยใชค วามรอ น ที่อณุ หภมู ิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดต อตารางน้ิว เปน เวลา 15-20 นาที อาจเปนแบบหมอ ไฟฟาอัตโนมัติ หรือเปน แบบทใี่ ชค วามรอนจากเตาแกส มีทั้งแบบแนวตงั้ และแนวนอน หมอแบบแนวนอนจะมีความจุมากกวา หมอ แบบแนวตง้ั และมีราคาคอนขา งสงู-- หมอ น่ึงความดันไอแบบใชไฟฟา แนวตงั้ เปนแบบที่ไดร บั ความนยิ ม มีใชใ นหอ งปฏบิ ตั กิ ารเพาะเลย้ี งเนือ้ เยื่อเกือบทุกแหง-- หมอ น่งึ ความดนั ไอ แบบใชไ ฟฟาแนวนอน สามารถนงึ่ อาหารไดปรมิ าณมากกวาหมอแบบแนวตง้ั-- หมอนึ่งความดันไอ แบบใชแ กส ใชหลักการเดยี วกบั หมอ นึง่ เชอื้ เหด็ ประสทิ ธิภาพการทาํ งานสงู หรอื ตา่ํ ขนึ้ อยูก ับผปู ฏบิ ัติงาน สามารถควบคุมอณุ หภมู ิ และความดันใหคงที่ตามกําหนดเวลา ไดหรอื ไม2 หองตัดเนอ้ื เยือ่ เปนหอ งทมี่ เี จาหนา ท่ีปฏบิ ัตงิ านมากทสี่ ดุ ศูนยรวมของกิจกรรมเพาะเลี้ยงเน้ือเย่ือจะอยใู นหอ งน้ี ควรเปน หองทมี่ รี ะบบปอ งกันการปนเปอ นของเชอ้ื ผวิ พนื้ หอ งทกุ ดา นทงั้ ฝาผนงั พืน้ หอง ควรมีผดิ เรียบมนั ไมเปน ท่ีสะสมของฝุนละออง ทําความสะอาดงาย วสั ดอุ ปุ กรณท ี่อยใู นหองนี้จะประกอบไปดว ยตตู ัดเนื้อเยื่อ จาํ นวนมากนอยเปนไปตามปริมาณการผลติ ของแตละแหง ดงั นี้2.1 ตตู ดั เนอื้ เยอ่ื เปน ตปู ลอดเชอื้ ที่ใชกบั งานตดั ยา ยชิน้ พชื มีระบบการหมุนเวยี นของอากาศภายในตทู สี่ ะอาดปราศจากเช้อื จลุ นิ ทรียตลอดเวลาของการปฏบิ ัตงิ าน ดว ยระบบการถายเทอากาศผานแผนกรองทีม่ ีรูพรนุขนาดเลก็ ประมาณ 0.3 ไมครอน ซ่ึงเช้อื จุลนิ ทรยี ไมสามารถเล็ดลอดผา นได ท้ังนี้ควรเช็ดทาํ ความสะอาดตทู งั้กอ นปฏบิ ัติงานและหลังเลกิ งานในแตล ะวนั โดยเชด็ออกดา นนอกตูเสมอดวยแอลกอฮอล 70% รวมท้งั การเปล่ียนแผน กรองเช้ือจุลนิ ทรยี ต ามกําหนดเวลาเพอื่ รักษาประสิทธภิ าพความเปน ตูปลอดเชือ้

2.2 วัสดุหรอื เคร่อื งมอื ทใ่ี ชตัดเนื้อเยื่อ ไดแก- มดี ผา ตดั นยิ มใชดา มมดี เบอร 3 กบั ใบมีดเบอร 10 หรอื 11- ปากคบี (forcepts) ใชหนีบจับชิน้ พืช มขี นาดความสัน้ ยาว ตา งกันไปขึน้ กับความสะดวกในการปฏิบัตงิ าน- ตะแกรงสําหรบั วางมดี และปากคบี- ตะเกียงแอลกอฮอล- จานรองหรือกระดาษ ทผี่ า นการน่งึ ฆาเชอ้ื แลว ใชรองตดั ช้ินเนื้อเยอื่วัสดุเหลา นก้ี อ นนาํ มาตดั เนอ้ื เยื่อตองทาํ การฆาเชื้อจุลนิ ทรยี โดยการนงึ่ ฆา เชือ้ ดว ยหมอ น่ึงความดนั ไอหรอื การอบความรอ นแหง ภายหลงั ส้ินสดุ การปฏิบัตงิ านทกุ ครัง้ ตองนําเครื่องมอื เหลา นัน้ มาลา งใหส ะอาดดว ยนาํ้ ยาลางจาน เช็ดใหแ หง หอดว ยกระดาษตะกว่ั แลวจงึ นําไปฆา เช้อื จลุ นิ ทรยี เ พื่อการนาํ มาใชใ หมใ นครั้งตอ ไป2.3 อุปกรณอ นื่ ๆ ไดแก1. เกาอ้มี พี นกั สําหรับพนกั งานตัดเนอ้ื เย่ือ2. รถเข็นสําหรับวางขวดอาหาร ขวดเน้ือเยือ่ พชื2.4 อุปกรณดบั เพลงิ ควรมปี ระจาํ ทกุ ชน้ั และทกุ หอ ง โดยเฉพาะหองตัดเนอ้ื เย่ือเพราะขณะปฏบิ ตั ิงาน มีการลนไฟฆา เชื้อวสั ดอุ ุปกรณต ลอดเวลา อาจเกดิ อบุ ตั เิ หตุไฟลกุ ไหมภายในตไู ด3 หอ งเล้ียงเนอื้ เยอ่ื เปนหอ งปลอดเช้ือ ควบคุมอณุ หภมู ใิ หอยูระหวา ง 25-25 องศาเซลเซียส ใชเ ปนสถานทว่ี างขวดเน้ือเยอ่ื พชื เปน หอ งท่ไี มค วรอนุญาตใหผทู ไ่ี มม หี นา ท่เี ก่ียวของเขา ออกโดยเดด็ ขาดเพราะจะทําใหเกดิ การปนเปอ นของเชอ้ื จลุ ินทรยี ใ นขวดเนื้อเย่อื พชื อาจทาํ ใหเ กิดความเสียหายกับตนพันธพุ ชื ในภาพรวมได อปุ กรณทสี่ าํ คัญท่ีติดต้ังอยใู นหอง ไดแก3.1 ชัน้ วางเนอ้ื เยอ่ื วัสดุทีป่ ระกอบเปนชนั้ อาจทาํ ดว ยไม เหลก็ ฉาก แสตนเลส หรืออลมู ิเนยี มเปน ตน ขนาดกวาง x ยาว x สงู ประมาณ 60 x 125 x 200 มชี ั้นวาง 5 ชน้ั แตละชนั้ หา งกนั ประมาณ 30เซนติเมตร โดยสว นท่ที ําเปน พื้นควรจะเปน กระจกหรือฟอรไ มกา สีขาว หรือเปนตาขายโปรง มีหลอดไฟฟาท่ีใหความสวา งแกพ ืชเพ่อื การสังเคราะหแสง นิยมใชห ลอดไฟทเี่ รยี กวา Grolux เพราะมีคุณสมบัตขิ องการใหแสงสีแดง ซึ่งเหมาะกับการสงั เคราะหแสงของพชื แตหลอดชนดิ น้ีมรี าคาคอนขางสูง จงึ อาจใชห ลอดไฟฟลอู อเรสเซนต ชนิดธรรมดาท่ีใชกบั อาคารบา นเรือนก็ได ทั้งนี้การติดต้ังหลอดไฟควรใหห ลอดอยหู างจากชนั้วางเนือ้ เยื่อในระยะประมาณ 20 เซนติเมตร และแตละหลอดอยูหา งกนั ประมาณ 30 เซนตเิ มตร เพอ่ื ใหไดความเขมแสง 2,000-3,000 ลักซ เมื่อวดั ดวยเคร่อื งมือ ทเ่ี รยี กวา Lux meter โดยเปด ไฟติดตอ กนั นาน16 ชว่ั โมงตอ วนั จึงควรมนี าฬกิ าควบคมุ การปด -เปดไฟฟา (timer) ดวย

3.2 เครอ่ื งเขยาแบบโยก ใชส ําหรบั เนอ้ื เยอ่ื พืชท่เี ลีย้ งในอาหารเหลว มีลกั ษณะการเคลอื่ นทใ่ี นแนวขนานกับพน้ื โลกอัตรา 100-150 รอบตอ นาที เปน การเพมิ่ ออกซิเจนลงไปในอาหารเพอื่ ใหเน้ือเย่ือพืชไดรับออกซเิ จนอยา งเพยี งพอตอ การเจรญิ เตบิ โตกิจกรรมภายในหองเตรยี มอาหารการปฏบิ ตั งิ านภายในหอ งเตรยี มอาหาร จะเริ่มตนจากการชั่งสารตามสูตรอาหารที่ตองการผสมเปน สตอ็ กสารละลาย ปรับคาความเปนกรด-ดา ง หลอมอาหาร และบรรจขุ วดกอนนง่ึ ฆาเชื้อเพอื่ รอการนาํ ไปใชตามลาํ ดบั ดงั นี้1. ช่งั สารเคมี เปนขนั้ ตอนทส่ี ําคญั ขน้ั ตอนหน่งึ ตองการความแมน ยาํ สงู โดยเฉพาะสารเคมที ีใ่ ชป รมิ าณนอยจึงตอ งช่ังดว ยเครอ่ื งชั่งอยา งละเอียด สามารถช่งั ไดทศนยิ ม 4 ตาํ แหนง2. สาํ หรับสารเคมที ใี่ ชป ริมาณมาก จะช่ังดว ยเครอ่ื งช่งั อยา งหยาบ ชัง่ ไดท ศนิยม 2 ตําแหนง เชน นาํ้ ตาล หรือวุน3. ผสมสารเคมี ตองทาํ ใหส ว นประกอบของสารเคมลี ะลายผสมเขา กันไดห มด โดยใชเ ครือ่ งคนสารละลายรว มกบั แทงคนไฟฟา4. วัดความเปน กรด-ดา ง (pH) ใหป รบั ใชท ร่ี ะดับ 5.6 ซ่ึงเหมาะสมตอ การทพ่ี ชื จะนาํ ธาตอุ าหารไปใชใ นการเจรญิ เติบ แตในอาหารบางสูตรอาจใชทีร่ ะดับ pH 5 เชน อาหารกลวยไม5. หลอมอาหาร เมอื่ ผสมอาหารเสรจ็ เรียบรอยแลว นาํ มาหลอมวนุ ใหล ะลายบนเตาแกสหรือไมโครเวฟกไ็ ด6. กรอกอาหาร ลงภาชนะตา งๆ เชนขวดหรือถงุ หรอื กลองพลาสตกิ เปนตน แตภ าชนะที่ตองทนความรอ นและสิง่ ทีต่ อ งระมดั ระวงั ขณะกรอกอาหาร คอื พยายามอยา ใหอาหารเลอะปากภาชนะ เพราะเปน สาเหตขุ องการปนเปอนจากเชอ้ื จลุ ินทรยี ไ ดง าย7. อาหารวุนในขวด กรอกอาหารลงขวดขนาด 4 ออนซ (ขวดน้าํ พรกิ เผา) ปรมิ าณอาหารที่กรอกขวดละ 20-25มลิ ลลิ ิตร (1 ลติ รกรอกไดป ระมาณ 40-45 ขวด) ปด ฝาใหส นทิ นาํ ไปนงึ่ ฆาเช้ือ

8. อาหารวนุ ในถุง กรอกอาหารลงถงุ ขนาด 4*6 น้ิว (ถุงรอน) ปริมาณอาหารที่กรอกถุงละ30-35 มลิ ลลิ ิตร (1ลติ ร กรอกไดป ระมาณ 25-30 ถุง) นําไปนง่ึ ฆาเชอ้ื9. นําอาหารวนุ เขาหมอน่ึงความดนั ไอ เพอ่ื น่ึงฆา เชอื้ เมอื่ เตรียมอาหารเรียบรอ ยแลว ควรทาํ ใหปลอดเชอ้ืภายในวนั เดยี วกนั ดว ยหมอ นึ่งความดนั ไอทอ่ี ณุ หภมู ิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนดตอ ตารางน้วิ เปนเวลา 15-20 นาที (เวลาอาจปรบั เปลยี่ นตามขนาดของภาชนะและปริมาตรของอาหาร) เมอ่ื น่งึ ฆา เชอื้ เรยี บรอยแลว รีบนาํ อาหารออกจากหมอ น่ึงความดนั ไอทันทที ค่ี วามดนั ลดลงเปน 0 ถา เปนขวดควรปด ฝาใหแ นนเน่ืองจากฝาขวดอาจขยายตัว เม่อื ผา นการนง่ึ ฆา เชื้อแลว และควรเกบ็ ไวป ระมาณ 1 สัปดาหกอนนาํ ไปใช เพอ่ืตรวจสอบอกี ครง้ั วา ไมม กี ารปนเปอ นของเชอื้ จลุ นิ ทรยี 10. สต็อกอาหารวนุ ผา นการนึง่ ฆา เชอ้ื แลว เก็บไวประมาณ 1 สปั ดาห กอ นนํามาใชกจิ กรรมภายในหองตดั เนอ้ื เยอ่ื จะเปนการตัดยายเนอื้ เยือ่ ไปเล้ยี งบนอาหารใหม ซึง่ ตองอาศยั เทคนคิ ปลอดเชื้อ เจาหนา ท่ปี ระจําหองปฏบิ ัติการ ตองเตรียมตวั ใหอ ยใู นสภาพท่ีพรอมทํางานตงั้ แตทาํ ความสะอาด มอื และแขนดวยสบู สวมผาคลุมผม ใสถ ุงมือ ผา ปด ปากปด จมกู และสวมชดุ ปฏิบัติการ เปน ตน ตามลําดบั ดังนี้1. การรักษาความสะอาดดว ยการลางมือใหสะอาดดว ยสบู และสวมชดุ ปฏบิ ตั กิ าร ประกอบดว ยถงุ มือ ผาคลมุผม ผาปด ปากปด จมูก และเปลี่ยนรองเทากอ นเขาหองปฏิบัตกิ ารทกุ ครั้ง2. เชด็ ทําความสะอาดตูปลอดเชอื้ กอนใชงานและควรเปด สวิทซต ใู หร ะบบตางๆ ภายในตูทาํ งานกอ นปฏบิ ตั ิงาน 15-30 นาที3. วางอปุ กรณท ่ใี ชตัดเน้ือเยอ่ื ในตาํ แหนง ท่ีเหมาะสมและสะดวกตอการปฏบิ ัติงาน4. การลนไฟเคร่ืองมือทใ่ี ชปฏิบตั ิงานเพอ่ื ฆาเชอ้ื จลุ นิ ทรยี กอ นเร่มิ ตดั เน้อื เยื่อ5. ตดั เนอื้ เย่อื ปลายยอด apical meristem ในกรณที ่ผี ลิตปลอดโรค6. ตดั เนือ้ เยอื่ ระยะเพิ่มปริมาณภายในตปู ลอดเช้ือ7. นําชิ้นพชื ทตี่ ดั แบง วางเลยี้ งบนอาหารในขวดกอนปด ฝา8. ลนไฟปด ปากถงุ9. ลงบันทกึ ชนดิ พชื และ วนั /เดือน/ป ทตี่ ดั ยา ย10. เนื้อเยือ่ พชื พรอมนาํ เขาเรียงบนช้ันในหอ งเลยี้ งเนอื้ เยอื่ ทีค่ วบคมุ แสง และอุณหภมู ิ

กจิ กรรมภายในหอ งเล้ียงเนอ้ื เยอื่1. นําขวดเน้ือเย่อื พชื ทเ่ี ปล่ยี นอาหารใหม เขา หองเลี้ยงเนอื้ เยือ่2. ทําความสะอาดช้ันเรียงพชื ดวยแอลกอฮอล 70% กอนเรียงเน้ือเยือ่ พชื3. นําถงุ เน้อื เยอื่ พืชวางเรยี งบนชน้ั ทมี่ คี วามเขม แสง 2,000-3,000 ลักซ4. เน้อื เยอื่ พืชระยะเพมิ่ ปริมาณในขวด5. เนอ้ื เยอ่ื พืชระยะสดุ ทา ย (เกดิ ราก) ในถุง6. ตรวจสอบการปนเปอ นเชอื้ จลุ นิ ทรียหากพบจะตองเกบ็ ทิ้งทนั ที หากปลอยทงิ้ ไวจ ะทาํใหสปอรของเช้อื ราแพรกระจายออกจากขวดสบู รรยากาศของหองได7. คัดเลือกแมพ นั ธุ เพ่อื การตดั -ขยาย8. บนั ทกึ รายละเอียดและลักษณะของชนิ้ พชื9. เตรยี มสง พชื เน้ือเย่อื ออกปลกู ในสภาพโรงเรือนเมื่อตน พันธุพชื เพาะเลีย้ งเนอ้ื เยอ่ื ผลติ ไดครบจาํ นวนตามเปาหมาย จะถกู จัดเตรยี มเพอื่ นาํ ออกอนบุ าล ในสภาพโรงเรอื นวธิ ีการเพาะเลี้ยงเนอื้ เย่ือโดยสังเขปการเพาะเลี้ยงเนือ้ เยอ่ื พืชประกอบดว ยข้นั ตอนสาํ คญั หลัก 6 ข้ันตอน คอื1. การคัดเลอื กเน้ือเยือ่ พชื2. การฟอกฆาเชื้อ3. การเตรยี มอาหารสาํ คัญเพาะเล้ยี งเนอื้ เย่ือ4. การขยายพนั ธเุ พมิ่ จํานวน5. การชักนํารากพืช6. การยา ยออกปลกูการทจ่ี ะทาํ การเพาะเลีย้ งเนอ้ื เยอื่ พชื ใหไดผ ลน้ันขน้ั แรกตองฆาเช้ือหองปฏิบตั ิการเพราะการเพาะเล้ยี งเน้ือเย่ือพืชนเ้ี ปนการเลี้ยงในสภาพท่ปี ลอดเชื้อ หองปฏบิ ตั ิการและเครอื่ งมอื ทุกอยา งตองปลอดเชื้อจลุ ินทรยี  เพราะจลุ ินทรียเปน ศัตรตู ัวฉกาจที่จะทําใหก ารทาํ งานของเรามีปญ หาท่สี ุด และนอกจากฆาเช้ือหอ งและอปุ กรณแลวช้ินสวนพืชทจ่ี ะนาํ มาขยายพนั ธตุ อ งทําการฆา เช้ือดว ย เรยี กวา วธิ ีฟอกฆา เชอ้ื ขนั้ ตอนในการทําก็คอื1. เลอื กช้นิ สว นพชื ท่ีอยใู นชว งเจริญเตบิ โต เชน ยอดออ น เมลด็ ตาขาง ปลายราก แลว แตชนดิ ของพชื นั้น ๆ2. นาํ ช้นิ สวนนัน้ มาตดั เปน เปน ทอ นใหส วนขอท่ีจะออกรากควรอยตู รงกลาง .....หรอื ถาเปน เมล็ดควรทําความสะอาดแตถ าเมลด็ นนั้ แข็งควรนาํ ไปแชน าํ้ อนุ สัก 1 คืน3. เตรียมน้าํ ปรมิ าณขวดละ 90 ml นําไปนง่ึ ฆาเช้ือที่อณุ หภมู ิ 121 Cํ เปนเวลา 15 นาที

4. เม่ือไดนาํ้ ทผี่ านการฆาเชอื้ แลว ตวง Chlorox ปริมาณ 10-15 ml หยด Tween ประมาณ 2-3 หยด ถา เปนพืชท่ีคอ นขา งสกปรกใสย าฆา เชอื้ (Anti biotic) ดว ย5. นาํ ชน้ิ สว นทีล่ างสะอาดแลว ใสล งไปในขวด แลว เขยา ประมาณ 15 นาที6. หลงั จากเขยา ครบ 10-15 นาทแี ลว ลางดว ยนา้ํ กล่ัน 3 ครัง้ คร้ังละ 15 นาที แตควรทาํ ภายใตสภาพปลอดเชอ้ื7. หลงั จากทําการฟอกฆาเชอื้ แลว นําช้นิ สวนลงปลกู ในขวดอาหารทเี่ ตรยี มไววธิ กี ารเลอื กชิน้ สวนเนือ้ เยอื่ ทจี่ ะนาํ มาฟอกฆาเชอื้1. พืชทเ่ี ปนเมล็ดควรเลือกเมล็ดที่มคี วามสมบรู ณท่ีสดุ เมล็ดออนหรือแกก ็ได2. พชื ทีใ่ ชใ บขยายพนั ธุ เชน แอฟรกิ นั ไวโอเลต กลอกซเี นีย หรือกกุ ลายหิน ควรเลือกใบเพ่ิงแตกใหม....เพราะการปนเปอนนอ ยและเย่อื กาํ ลงั เจริญ3. พืชท่ีใชย อดขยายพนั ธุ ควรเลอื กยอดที่เพ่ิงจะแตกตาใหม เพราะเปน ชว งทพ่ี ืชพรอมจะเจรญิ เปน ตน4. พชื ที่เปน หวั เปนเหงาหรอื แงง เชน กลว ย ขงิ ดาหลา ควรเลือกที่มตี าสมบรู ณ ถาเปนกลวย.... ควรเลือกหนอ ทม่ี ีใบแคบหรือหนอ ทก่ี าํ ลังงอก5. พชื ทีใ่ ชคพั ภะ ควรเลอื กคพั ภะทแี่ ก ไมค วรเลือกทอี่ อนเกนิ ไปจะไมงอก

ชนดิ ของเนือ้ เยือ่เนอื้ เยือ่ ของพชื แบงเปน 2 ประเภท ตามความสามารถในการแบง ตัวของเนอื้ เยอื่ คอื1. เนอื้ เย่อื เจริญ (meristematic tissue) จาํ แนกเปน 3 ชนดิ ตามตําแหนงที่อยใู นสว นตา ง ๆ ของพืช คือ1.1 เน้อื เยอื่ เจรญิ สวนปลาย (apical meristem) พบตามบรเิ วณปลายรากและปลายยอดพชืเม่อื แบงเซลลทําใหร ากและลําตน ยืดยาวออก1.2 เนอ้ื เยอ่ื เจริญเหนือขอ (intercalary meristem) อยูบริเวณเหนอื ขอหรอื โคนของปลอง1.3 เน้อื เย่อื เจรญิ ดา นขา ง (lateral meristem) จะแบงตวั ออกทางดานขา ง ทําใหร าก และลําตน ขยายขนาดใหญขึ้น2. เนือ้ เย่ือถาวร (permanent tissue) เปนเนอื้ เยอ่ื ที่เจรญิ เปล่ียนแปลงมาจากเนอ้ื เยอ่ื เจรญิ แบง ออกเปน 2ประเภท คอื2.1 เนือ้ เยอื่ ถาวรเชิงเดยี่ ว (simple permanent tissue) แบงไดห ลายชนิดตามหนา ทแี่ ละสวนประกอบภายในเซลล ไดแก1. เอพิเดอรมิส (epidermis) คือ เน้อื เย่อื ทอ่ี ยูช้นั นอกสุดของสว นตาง ๆ ของพืช มกั เรยี งตัวช้ันเดียวเซลลมลี ักษณะแบน แวควิ โอลขนาดใหญ เซลลเ รยี งตวั อดั แนน จนไมมชี อ งวางระหวา งเซลล ผนงั เซลลท่อี ยูดา นนอกมกั หนากวาผนังเซลลท่ีอยดู านใน มีควิ ทิน ( cutin )เคลอื บท่ีผนงั เซลล2. พาเรงคมิ า (parenchyma) เน้ือเยื่อชนดิ นพี้ บไดท ว่ั ๆ ไปในพืช เซลลมีรปู รา งหลายแบบ ไดแ กคอ นขา งกลม รี หรอื รูปทรงกระบอก เม่อื เรียงตัวตดิ กันจงึ เกิดชอ งวางระหวางเซลล แวคิวโอลมขี นาดใหญเกือบเต็มเซลล พาเรงคมิ าทม่ี ีคลอโรพลาสอยูดว ย อาจเรยี กใหมว า คลอเรงคมิ า (chlorenchyma) ผนงั เซลลประกอบดว ยเซลลูโลส (cellulose)3. คอลเลงคมิ า (collenchyma) เปนเนื้อเยื่อทีม่ ีเซลลรูปรางคลา ยคลงึ กบั พาเรงคิมา ผนงั เซลล

ประกอบดว ยเพกติน (pectin) และเซลลโู ลส ผนงั เซลลจะมคี วามหนาไมเ ทา กันโดยสวนหนามักอยตู ามมุมเซลล พบเน้ือเย่อื ชนดิ นอี้ ยูตามกา นใบ เสน กลางใบ และในสว นคอรเ ทกซ (cortex) ของพชื ลม ลกุ คลอเรงคิมาจะทําหนา ที่เพมิ่ ความแข็งแรงใหกับพืช4. สเกลอเรงคิมา (sclerenchyma) เนอ้ื เย่ือชนิดน้ปี ระกอบดวยเซลลทมี่ ผี นงั หนามาก เพราะมีสารลกิ นนิ (lignin) เคลือบผนงั เซลล จงึ เปน สวนท่ีทําใหพชื มีความแข็งแรง สเกลอเรงคมิ าประกอบดว ยเซลล 2ชนดิ คอื ไฟเบอร (fiber) และสเกลอรีด (sclereid) ซ่งึ แตกตา งกนั ท่รี ปู รา งของเซลล- ไฟเบอร เปนเซลลเ รยี งและยาว สว นสเกลอรีด เซลลม ีลักษณะสั้นกวาและมรี ปู รางตา งกันพบไดต ามสว นทีแ่ ข็งแรงของเปลอื กตนไม และเปลือกหมุ เมลด็ หรอื เนอื้ ผลไมส าก ๆ2.2 เนื้อเยื่อถาวรเชงิ ซอ น (complex permanent tissue) ประกอบดว ยกลมุ เซลลห ลายชนดิ มาทาํ งานรว มกันไดแก เน้อื เยือ่ ทอลําเลยี ง (vascular tissue) ซ่งึ ประกอบดว ย1.ไซเลม (xylem)เปนเน้ือเยอื่ ทที่ ําหนา ท่ลี ําเลียงนํ้าและแรธาตตุ าง ๆ ไปสสู วนตาง ๆ ของพชื ประกอบดว ยกลมุ เซลลท ีท่ ําหนาท่ีหลักในการลําเลยี งน้ํา คอื- เทรคดี (tracheid) เปน เซลลท ่ีมีรูปรางยาว ปลายคอนขา งแหลม ผนังเซลลหนามี สารพวกลิกนนิ สะสม เม่ือเซลลโตเต็มท่ีจะตาย โพรโทพลาสซึมสลายทาํ ใหเ กดิ ชอ ง ตรงกลางลําเลียงนาํ้ ไดด ี- เวสเซล (vessel) มีขนาดใหญแตส ั้นกวา เทรคดี ประกอบดว ยเวสเซลเมมเบอร (vessel member) ซ่ึงเปน เซลลท่ีมผี นังหนามสี ารพวกลิกนนิ สะสม เซลลม ีรปู รางยาวหรอื สนั้ ปลายเซลลอาจเฉยี งหรือตรงและมชี อ งทะลุถงึกนั เวสเซลเมมเบอรห ลาย ๆ เซลลม าเรียงตอ กนั มลี กั ษณะคลา ยทอ นาํ้ เรียกวาเวสเซล2.โฟลเอ็ม (phloem)เปน เนือ้ เยอื่ ทที่ ําหนา ทลี่ าํ เลยี งสารอาหารทีใ่ บสงั เคราะหข นึ้ ไปสูสว นตา ง ๆ ของพชื ประกอบดว ยกลมุ เซลล- ซีฟทวิ บเ มมเบอร (sieve tube member) มีรปู รา งเปน ทรงกระบอกยาว ท่ปี ลายผนังเซลลทง้ั 2 ดานจะมรี พู รนุเรียกวาซีฟเพลต (sieve plate) ซีฟทวิ บเมมเบอรห ลาย ๆ เซลลมาเรียงตอกันเรยี กวา ซีฟทวิ บ (sieve tube)- คอมพาเนยี นเซลล (companion cell)ตวั อยา งการเพาะเลยี้ งเนือ้ เยื่อการขยายพันธดุ าหลาโดยวธิ กี ารเพาะเล้ยี งเนอ้ื เย่ือ นําหนอขา ง ท่ีแตกออกมาจากเหงาเดิม ซ่งึ ปลกู เลีย้ งไวในแปลงปลกู ตัดเอาหนอ ขางมีขนาดความกวา ง 3 ซม. ยาว 5 ซม. ออกจากเหงา ลางทําความสะอาดดว ยน้ําไหลเอาเศษดนิ ทต่ี ิดมาออกใหห มดแลวจึงลางดว ยสบเู หลว พรอ มกับลอกกาบใบท่ีหมุ อยทู เี่ ปนแผล หรอื ทเี่ สียหายออกทิง้ ไป 2 - 3 ช้นั หลงั จาก

นัน้ ลา งดว ยนํ้ากลั่นอีกครง้ั แลวซับน้ําท่ีติดมาดว ยกระดาษทิชชู เม่ือแหง แลว ทาํ การฆาเชอ้ื ท่ีผิวนอกของหนอโดยเชด็ ดวยแอลกอฮอลเ ขมขน 70 เปอรเซน็ ต ใหทวั่ ท้ังหนอ หลังจากน้นั ทาํ การฆา เชื้อครัง้ ท่ี 2 โดยนาํ ไปเขยา ในสารละลาย คลอรอ กซท่ีมคี วามเขม ขน 10 เปอรเซน็ ต เปนเวลานาน 15 นาที เมอื่ ครบเวลาจงึนาํ มาลางดว ยน้ํากลั่นท่นี ึ่งฆา เชอ้ื แลว 3 คร้ัง ทาํ ภายในตูปลอดเช้อื หนอ ทผี่ านการฆา เช้ือแลว มาตัดโดยเรม่ิจากการลอกกาบใบออกทลี ะช้ัน จนถึงสว นของปลายยอด (shoot tip) ตัดชนิ้ สวนใหม ีขนาด 0.5 x 0.5 ซม.แลว นาํ ไปเลย้ี งบนอาหารวนุ สตู ร MS (1962) ท่ีเตมิ BAP ความเขม ขน 2 มก/ล. เลีย้ งในหอ งเลี้ยงท่ใี หความเขมแสงประมาณ 1,900 ลักซ เปนเวลานาน 16 ชั่วโมงตอ วัน อุณหภมู ิ 25 2 cํ หลังจากเลีย้ งเน้อื เยอื่ ไดนานประมาณ 60 - 80 วนั เรม่ิ แทงใบออกมาและคลอ่ี อก ยอดประกอบดว ยใบออ นทอ่ี ดั กันแนนมีการพฒั นาขนาดใหญและมีใบจาํ นวนมากข้ึน สําหรบั การขยายเพ่อื เพิ่มจํานวนตน สามารทาํ ไดโดยใชย อด (shootlet) ท่ีไดจ ากการเลี้ยงเนอื้ เยอ่ื ในสภาพปลอดเช้อื โดยเลือกตน ทมี่ คี วามสมํ่าเสมอกันสูงประมาณ 4 ซม. และมใี บ 3 - 5 ใบ แลวตัดใบทิ้งโดยใหช นิ้ สว นบรเิ วณลําตนมีขนาดยาว 1 ซม. แลว ทาํ การผา แบงครง่ึ ตามแนวยาว นาํ ไปเลย้ี งบนอาหารเหลวสตู ร MS (1962) ทเ่ี ติม BAP ความเขม ขน 2 มก/ล. นานประมาณ 30 วนั โดยมีอตั ราการขยายพนั ธุ 1 ชน้ิ สวน สามารถพฒั นาเปน ยอดได 2 - 3 ยอด โดยข้นึ อยูก บั จาํ นวนตาขา งของชิ้นสว น สามารถทําการยา ยเปลีย่ นอาหารเพ่อื เพ่มิ จํานวน ควรทาํ การยายประมาณ 2 - 3 ครั้ง เนือ่ งจากเมอ่ื เลี้ยงในอาหารเหลวเปน เวลานานจะทาํ ใหช ้นิ สว นหรอื ยอดมลี ักษณะฉาํ่ นา้ํ ใบมลี กั ษณะเปราะหักงา ยดงั นน้ั จงึ ควรทาํ การยายเลี้ยงขยายเพือ่ เพิม่ จาํ นวนโดยเลี้ยงบนอาหารวนุ สูตร MS (1962) ทเ่ี ตมิ BAP ความเขม ขน 2 มก/ล. นานประมาณ45 วัน การชกั นาํ ใหเ กดิ ราก หลงั จากนัน้ เม่อื ยอดทเี่ ลย้ี งมีขนาดความสูงประมาณ 6 - 7 ซม. นาํ ยอดมากระตุนใหเ กิดรากโดยยายยอดดาหลาทมี่ ีขนาดดงั กลา วเลย้ี งบนอาหารวนุ สูตร MS ที่ไมเตมิ สารควบคมุ การเจรญิ เตบิ โตพชื เลย้ี งนานประมาณ 30 วัน จงึ ทาํ การยายออกปลูก สวนการยา ยตน กลา ดาหลาออกปลกู โดยนําตนกลาทีม่ รี ากแลว นาํ ตน กลามาลา งเอาเศษวนุที่ติดมากับรากออกใหห มด แลว ทําการตดั รากออกใหมีขนาดความยาวประมาณ 1 - 2 ซม. แลวนาํ ไปปลกู ในถุงพลาสตกิ สดี าํ ขนาด 2 x 4 นิว้ โดยใชว ดั สปุ ลูก คือ ทราย, ขเี้ ถา แกลบ และ ขุยมะพรา ว อตั ราสว นผสม 1ตอ 1 ตอ 1 หลงั จากนน้ั นาํ ไปไวใ นแปลงพนหมอก เพาะชาํ นานประมาณ 1 - 2 เดือน จงึ ยา ยออกปลกู ลงแปลงตอไป

ข้นั ตอนการขยายพนั ธดุ าหลาดวยวธิ กี ารเพาะเล้ยี งเนือ้ เยอ่ื หนอขางที่แตกมาจากเหงา โดย มีขนาด 3 x 5 ซม. การชักนําใหเกดิ ยอดเม่ือเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ทเี่ ติม BAP 2 มก/ล. นาน 60 - 80 วัน การเพ่ิมจาํ นวนยอดจาํ นวนมากเมอ่ื เลีย้ งใน อาหารเหลวสตู ร MS ทเ่ี ตมิ BAP 2 มก/ล. นาน 30 วัน ในชวงแรก การเพม่ิ จํานวนยอดจาํ นวนมากเมอื่ เล้ียงบน อาหารสตู ร MS ทีเ่ ติม BAP 2 มก/ล. นาน 30 วนั ในชวงหลัง ยอดจํานวนมากเมื่อเลย้ี งในอาหารเหลวสตู ร MS ไมท เี่ ตมิ สารควบคุมการเจรญิ เตบิ โตพืช นาน 30 วัน การยายตน กลา ออกปลกู นาน 30 วนั