8 การสืบพันธุ์และการเจริญของแบคทีเรีย

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จลุ ชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี บทท่ี 8 การสืบพนั ธแ์ุ ละการเจริญของแบคทีเรยี เนื้อหา 1. การสบื พนั ธุข์ องแบคทเี รยี 2. การเจรญิ ของแบคทเี รยี 3. ลกั ษณะการเจรญิ ของแบคทเี รยี 3.1 ลกั ษณะการเจรญิ บนอาหารแขง็ 3.2 ลกั ษณะการเจรญิ ในอาหารเหลว 4. การวดั การเจรญิ เตบิ โต 4.1 การวดั การเจรญิ โดยวธิ ที างตรง 4.2 การวดั การเจรญิ โดยวธิ ที างออ้ ม 5. สรุป 130

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จลุ ชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี บทที่ 8 การสืบพนั ธแ์ุ ละการเจริญของแบคทีเรยี 1. การสืบพนั ธข์ุ องแบคทีเรยี การสบื พนั ธุแ์ บคทเี รยี สามารถทาได้ 3 วธิ คี อื การแบ่งเซลลแ์ บบไบนารีฟิ ชนั ่ เป็นการแบง่ เซลลจ์ าก 1 เซลล์ เป็น 2 เซลล์ พบไดใ้ น แบคทเี รยี ทวั ่ ไป (ภาพท่ี 8-1ก.) การแตกหน่อ พบไดใ้ น Hyphomicrobium เรยี กแบคทเี รยี กลุ่มน้ีวา่ บดั ดง้ิ แบคทเี รยี ม (Budding bacterium) (ภาพท่ี 8-1ข.) การสร้างโคนิ ดิโอสปอร์ พบได้ในแอคตโิ นมยั ซสิ (Actinomycetes) เรยี กแบคทเี รยี กลุม่ น้วี า่ แบคทเี รยี เสน้ สาย (Filamentous bacteria) (ภาพท่ี 8-1ค.) ก. ข. ค. ภาพที่ 8-1 การสบื พนั ธุข์ องแบคทเี รยี ก. การแบง่ เซลลแ์ บบไบนารฟี ิชนั ่ ข. การแตกหน่อ ค. การสรา้ งโคนิดโิ อสปอร์ ท่ีมา: ก. Bauman (2007) ข.และค. Tortora และคณะ (2014) 2. การเจริญของแบคทีเรยี ระยะการเจรญิ มี 4 ระยะ คอื (ภาพท่ี 8-2) ภาพที่ 8-2 กราฟแสดงระยะการเจรญิ เตบิ โต ที่มา: Pommerville (2004) 131

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จุลชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี 2.1 ระยะแลก็ (Lag phase) - เป็นระยะท่เี ซลล์ปรบั ตวั เขา้ กบั สภาพแวดล้อมใหม่ เตรียมความพร้อมของเซลล์ สาหรบั การเจรญิ ในอาหารใหม่ ยงั ไมม่ กี ารแบง่ เซลลเ์ พม่ิ จานวน - ลกั ษณะกราฟในระยะแลก็ จะคอ่ นขา้ งคงท่ี - ทงั้ น้ีระยะแลก็ จะใชเ้ วลามากหรอื น้อยขน้ึ อยกู่ บั ชนิดแบคทเี รยี สารเคมแี ละปจั จยั ทาง กายภาพของอาหารเลย้ี งเชอ้ื 2.2 ระยะลอ๊ ก หรือ ระยะเอกโพเน็นเชียล (Log phase, Exponential growth phase) - เป็นระยะทเ่ี ซลลจ์ ะมกี ารสงั เคราะหส์ ารเคมสี าหรบั เมทาบอลซิ มึ ทจ่ี ะใชใ้ นอาหารใหม่ - มกี ารแบง่ เซลลเ์ พม่ิ จานวนอยา่ งรวดเรว็ - ลกั ษณะกราฟจะมคี วามชนั ขน้ึ มากอยา่ งรวดเรว็ - สามารถหาอตั ราการเจรญิ (Generation time) ไดจ้ ากระยะน้ี อตั ราการเจรญิ คอื ระยะเวลาทใ่ี ชใ้ นการแบง่ เซลลจ์ าก 1 เป็น 2 เซลล์ - ความสาคญั คอื ไวต่อของสารยบั ยงั้ แบคทเี รยี โดยเฉพาะสารยบั ยงั้ ท่มี ผี ลต่อการ สรา้ งผนงั เซลล์ เช่น ยาเพนนิซลิ ลนิ การยอ้ มสแี กรมมคี วามสมบรู ณ์ การตดิ สแี กรมใหผ้ ลไดอ้ ยา่ งถกู ตอ้ ง ทางอุตสาหกรรม เป็นช่วงท่ีการผลิตสารเมทาบอไลท์ขนั้ ท่ี 1 (Primary metabolites) เชน่ กรดอะมโิ นทใ่ี ชเ้ ป็นอาหารเสรมิ และเอทานอล 2.3 ระยะสเตชนั ่ นารี (Stationary phase) - เป็นระยะทอ่ี าหารเรมิ่ เหลอื น้อยลงและของเสยี จากการเจรญิ เรมิ่ มมี ากขน้ึ - อตั ราการตายเรม่ิ มากข้นึ และอตั ราการเจรญิ เพิ่มเซลล์จานวนใหม่เรม่ิ ลดลง อตั รา เมทาบอลซิ มึ เรมิ่ ลดลง - ลกั ษณะกราฟจะคอ่ นขา้ งคงท่ี - เป็นช่วงท่มี กี ารผลติ สารเมทาบอไลด์ขนั้ ท่ี 2 (Secondary metabolites) เช่น สาร ปฏชิ วี นะ (ภาพท่ี 8-3) ภาพท่ี 8-3 การผลติ สารเมทาบอไลทข์ นั้ ท่ี 1 และ 2 ท่ีมา: Nester และคณะ (2012) 132

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จลุ ชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี 2.4 ระยะเดท (Death phase) - เป็นระยะทอ่ี าหารเหลอื น้อยมากและของเสยี มมี าก ส่วนใหญ่เซลลจ์ ะตาย - ระยะน้ีอตั ราการตายของเซลลจ์ ะมมี ากกวา่ อตั ราการเกดิ - ลกั ษณะกราฟจะลดลง - ในแบคทเี รยี บางชนดิ จะมกี ารสรา้ งเอน็ โดสปอรเ์ พ่อื ความอยรู่ อดต่อไป 3. ลกั ษณะการเจริญของแบคทีเรยี 3.1 ลกั ษณะการเจริญบนผิวหน้าอาหารแขง็ แบคทเี รยี จะมกี ารเจรญิ เป็นกลมุ่ แบคทเี รยี เรยี กวา่ โคโลนี (Colony) (ภาพท่ี 8-4) ซ่งึ แต่ละโคโลนีจะมลี กั ษณะแตกตา่ งกนั โคโลนี ภาพที่ 8-4 โคโลนี ท่ีมา: ถ่ายโดย พรรณพร กุลมา 3.2 ลกั ษณะการเจริญในอาหารเหลว แบคทเี รยี จะเจรญิ เป็นเซลลเ์ ดย่ี วๆ กระจายทวั ่ ในอาหารเหลว อาหารจะขนุ่ (ภาพท่ี 8-5) ก. ข. ภาพท่ี 8-5 ลกั ษณะการเจรญิ ในอาหารเหลว ก. อาหารเลย้ี งเชอ้ื ใส แบคทเี รยี ไม่มกี ารเจรญิ ข. อาหารเลย้ี งเชอ้ื ขนุ่ แบคทเี รยี มกี ารเจรญิ ท่ีมา: ถ่ายโดยพรรณพร กลุ มา 133

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จลุ ชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี 4. การวดั การเจริญเติบโต การวดั การเจรญิ เตบิ โตมี 2 แบบ คอื โดยทางตรง และ โดยทางออ้ ม การวดั การเจรญิ เตบิ โตโดยทางตรง ไดแ้ ก่ 1) การนบั จานวนเซลลโ์ ดยตรง 2) การนบั จานวนโดยวธิ เี พทเคาท์ (Plate count) 3) การกรอง (Filtration) 4) วธิ เี อม็ พเี อน็ (The Most Probable Number, MPN) การวดั การเจรญิ โดยทางออ้ ม ไดแ้ ก่ 1) ความขนุ่ (Turbidity) 2) วดั จากกจิ กรรมเมทาบอลซิ มึ (Metabolic activity) 3) วดั น้าหนกั แหง้ (Cell dry weight) 4.1 การวดั การเจริญเติบโตโดยทางตรง 4.1.1 การนบั จานวนเซลลโ์ ดยตรง - โดยใชส้ ไลด์ Petroff – Hausser cell counter (ภาพท่ี 8-6 ก.) - เคร่อื ง Coulter counters โดยใหเ้ ซลลผ์ า่ นช่องแคบๆ แลว้ ให้เคร่อื งตรวจนบั (ภาพท่ี 8-6 ข.) ภาพท่ี 8-6 การนบั จานวนเซลลโ์ ดยตรง ก. สไลด์ Petroff – Hausser cell counter ข. เครอ่ื ง Coulter counters ที่มา: ก. Pommerville (2004) ข. Nester และคณะ (2012) 134

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จลุ ชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี 4.1.2 การนับจานวนโดยวิธีเพทเคาท์ (Plate count) - เป็นการนบั จานวนโคโลนีแบคทเี รยี ทข่ี น้ึ ในจานอาหารเลย้ี งเชอ้ื - โดยทาการเจอื จางเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ก์ อ่ นแลว้ นบั โดยวธิ ี Pour plate หรอื Spread plate - จานวนโคโลนีทส่ี ามารถนบั ไดต้ ามมาตรฐานกาหนดให้อย่รู ะหวา่ ง 25 – 250 โคโลนี ตอ่ 1 จานอาหารเลย้ี งเชอ้ื - การรายงานผลใหร้ ายงานเป็นหน่วย CFU (Colony forming units) - วธิ นี ้ีจะนบั ไดเ้ ฉพาะเซลลท์ ย่ี งั มชี วี ติ อยู่ (ภาพท่ี 8-7) ภาพท่ี 8-7 การนบั จานวนแบคทเี รยี โดยวธิ เี พทเคาท์ ที่มา: Bauman (2007) 135

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จลุ ชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี 4.1.3 การกรอง (Filtration) - ใชน้ บั จานวนจุลนิ ทรยี ท์ อ่ี ยใู่ นน้าโดยเฉพาะโคลฟิ อรม์ แบคทเี รยี (ภาพท่ี 8-8) ภาพท่ี 8-8 การนบั จานวนโดยวธิ กี ารกรอง ที่มา: Nester และคณะ (2012) 4.1.4 วิธีเอม็ พีเอน็ (The Most Probable Number, MPN) ใชใ้ นการนบั จานวนจุลนิ ทรยี ท์ อ่ี ยใู่ นน้าโดยเฉพาะโคลฟิ อรม์ แบคทเี รยี (ภาพท่ี 8-9) ภาพที่ 8-9 การนบั จานวนโคลฟิ อรม์ แบคทเี รยี โดยวธิ เี อม็ พเี อน็ ที่มา: Nester และคณะ (2012) 136

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จุลชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี 4.2 การวดั การเจริญเติบโตโดยทางอ้อม การวดั การเจรญิ โดยทางออ้ ม ไดแ้ ก่ 1) ความขนุ่ (Turbidity) 2) วดั จากกจิ กรรมเมทาบอลซิ มึ (Metabolic activity) 3) วดั น้าหนกั แหง้ (Cell dry weight) 4.2.1 ความข่นุ (Turbidity) - หลกั การคอื เม่อื แบคทเี รยี เจรญิ เพม่ิ จานวนมากขน้ึ อาหารเลย้ี งเชอ้ื จะขนุ่ - เครอ่ื งม่อื ท่ี คอื เครอ่ื งสเปกโตรโฟโตมเิ ตอร์ (Spectrophotometer) (ภาพท่ี 8-10) เปอรเ์ ซนตก์ ารดูดกลนื แสง ต่า ก. สงู ข. ภาพที่ 8-10 การวดั การเจรญิ ดว้ ยวธิ วี ดั ความขนุ่ ด้วยเครอ่ื งสเปกโตรโฟโตมเิ ตอร์ ก. อาหารใสไม่มแี บคทเี รยี เจรญิ ค่าการดดู กลนื แสงจะต่า ข. อาหารขนุ่ ทม่ี แี บคทเี รยี เจรญิ ค่าการดดู กลนื แสงจะสงู ที่มา: ดดั แปลงจาก Cowan (2012) 4.2.2 วดั จากกิจกรรมเมทาบอลิซึม (Metabolic activity) โดยวดั จากผลผลิตท่ีเกิดจากกิจกรรมเมทาบอลิซึม เช่น ปริมาณกรด ปริมาณ คารบ์ อนไดออกไซด์ ปรมิ าณวติ ามนิ เป็นตน้ 4.2.3 วดั น้าหนกั แห้ง (Cell dry weight) นยิ มใชว้ ดั การเจรญิ ของจุลนิ ทรยี ท์ เ่ี ป็นเสน้ สาย เช่น แอคตโิ นมยั ซสี (Actinomycetes) และ รา 137

เอกสารประกอบการสอนวชิ า จุลชวี วทิ ยาทวั ่ ไป (22034201) บทท่ี 8 การสบื พนั ธุแ์ ละการเจรญิ ของแบคทเี รยี 5. สรปุ การสบื พนั ธุแ์ บคทเี รยี มี 3 วธิ คี อื การแบ่งเซลลแ์ บบไบนารฟี ิชนั ่ การแตกหน่อ และการ สรา้ งโคนดิ โิ อสปอร์ ระยะการเจรญิ มี 4 ระยะ คอื ระยะแล๊ก ระยะลอ๊ ก ระยะสเตชนั ่ นารี และ ระยะเดท ลกั ษณะการเจริญของแบคทีเรยี บนผวิ หน้าอาหารแขง็ จะเจรญิ เป็นกลุ่มแบคทีเรยี เรยี กวา่ โคโลนี ในอาหารเหลวส่วนใหญ่จงึ เหน็ ลกั ษณะการเจรญิ เป็นแบบขนุ่ การวดั การเจรญิ เตบิ โตมี 2 แบบ คอื การวดั การเจรญิ เตบิ โตโดยทางตรง ไดแ้ ก่ การนบั จานวนเซลลโ์ ดยตรง การนบั จานวนโดยวธิ เี พทเคาท์ การกรอง วธิ เี อม็ พเี อน็ (MPN) การวดั การ เจรญิ โดยทางออ้ ม ไดแ้ ก่ ความขนุ่ วดั จากกจิ กรรมเมทาบอลซิ มึ วดั น้าหนกั แหง้ คาถามท้ายบทเรยี น 1. แบคทเี รยี มกี ารเพม่ิ จานวนขยายพนั ธุโ์ ดยวธิ ใี ด 2. อธบิ ายระยะการเจรญิ ของแบคทเี รยี 3. หากตอ้ งการวดั การเจรญิ เตบิ โตของราจะใชว้ ธิ ใี ด 138