ศักยภาพของสารสกัดจากผักพื้นบ้านต่อการพัฒนาผลิตภัณฑ์เครื่องสําอาง (เจนจิรา ลานแก้ว, 2562)

ศกั ยภาพของสารสกดั จากผักพ้นื บ้านต่อการพัฒนาผลติ ภัณฑเ์ ครื่องสาอาง Potential of local vegetables extract to apply for cosmetic product development. เจนจิรา ลานแกว้ รงุ่ ทพิ ย์ ทองบญุ โท ชุมพล พาใจธรรม ประสงค์ เหลย่ี มโสภณ มหาวทิ ยาลยั เทคโนโลยีราชมงคลล้านนา น่าน พ.ศ. 2562



รายงานผลการวิจยั ศักยภาพของสารสกัดจากผกั พื้นบ้านต่อการพัฒนาผลติ ภัณฑ์เครื่องสาอาง Potential of local vegetables extract to apply for cosmetic product development. เจนจิรา ลานแกว้ รงุ่ ทิพย์ ทองบญุ โท ชมุ พล พาใจธรรม ประสงค์ เหลย่ี มโสภณ คณะวทิ ยาศาสตรแ์ ละเทคโนโลยกี ารเกษตร มหาวทิ ยาลยั เทคโนโลยรี าชมงคลลา้ นนา น่าน งบประมาณปี 2562

กติ ติกรรมประกาศ โครงการวิจัย น้ีเป็นโครงการที่คณะผู้วิจัยมีความสนใจศึกษาศักยภาพของสารสกัดจาก ผัก พนื้ บ้านตอ่ การพฒั นาผลิตภัณฑเ์ คร่ืองสาอาง โดยมีวัตถปุ ระสงค์เพอื่ ตรวจหากลมุ่ สารในสารสกดั จากผัก พื้นบ้านบางชนิดเพื่อศึกษาความสามารถของสารสกดั จากผักพ้ืนบ้านบางชนิดต่อการยบั ยั้งเอนไซม์ไทโร ซิเนส ทดสอบผลของสารสกดั จากผักพ้ืนบ้านบางชนดิ ตอ่ การเจรญิ ของเซลล์เมลาโนมาซี 32 ท่เี พาะเล้ยี ง ในหลอดทดลอง เพื่อนาไปสู่การต้ังตาหรับสูตรเครื่องสาอางสาหรับทาผิวขาว และประเมินคุณภาพ ผลิตภัณฑ์เบอื้ งตน้ เพื่อใช้เป็นข้อมูลทเ่ี ป็นประโยชน์ เผยแพร่ข้อมูลให้กับคนในชมุ ชนและช่วยเพ่ิมคุณค่า ของพชื พน้ื บา้ นในทอ้ งถนิ่ ใหม้ มี ูลคา่ มากข้ึน คณะผู้วิจัยขอขอบคณุ สานักงานคณะกรรมการวิจัยการแห่งชาตทิ ่ีให้การสนบั สนุนงบประมาณ มหาวทิ ยาลยั เทคโนโลยรี าชมงคลลา้ นนาท่ใี ห้การสนับสนุนในสว่ นของอุปกรณ์ ครุภัณฑ์ ท่ีเปน็ ประโยชน์ ต่อการวิจัย และขอขอบคุณกัลยาณมิตรอีกหลายท่านท่ีให้ความช่วยเหลือและคาปรึกษาท่ีดีตลอดการ วิจยั คณะผูว้ จิ ัย

ชื่อเรอื่ ง : ศักยภาพของสารสกัดจากผกั พน้ื บ้านต่อการพัฒนาผลิตภัณฑ์เครอ่ื งสาอาง ช่อื ผู้วิจัย : เจนจริ า ลานแกว้ รุ่งทพิ ย์ ทองบุญโท ชุมพล พาใจธรรม ประสงค์ เหล่ียมโสภณ บทคดั ยอ่ จากการสารวจรวบรวบผกั พน้ื บ้านจานวน 50 ชนิด นามาทดสอบฤทธ์ิต้านอนุมลู อิสระท้ัง 3 วิธี ได้แก่ DPPH assay, ABTS assay และ FRAP assay พบผักพื้นบ้านท่ีมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระมากที่สุด จานวน 15 ชนิด ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระจากวธิ ี DPPH พบ ผักกาดช้าง บะงัว(ลั๊วะ) ใบหม่อน สะค้าน ใบ บัวบก ผักบุ้งส้ม และผักเส้ียว มีค่า IC50 เท่ากับ 26.22 ± 0.022, 32.80 ± 0.006, 41.08 ± 0.021, 47.62 ± 0.012, 49.61 ± 0.006, 56.65 ± 0.006 และ 58.11 ± 0.022 µg/ml ตามลาดับ วธิ ี ABTS พบ สารสกัดจากผักพื้นบ้านบางชนิด มีค่า IC50 เท่ากับ 1746.67 ± 0.004, 140.64 ± 0.004, 401.70 ± 0.017, 148.33 ± 0.005, 1174.95 ± 00.084 , 856.67 ± 0.008 และ 412.97 ± 0.012µg/ml ตามลาดับ วิธี FRAP พบ ค่า FRAP value เท่ากับ 336.61 ± 0.061, 672.40 ± 0.012, 680.28 ± 0.024, 1699.09 ± 0.015, 443.27 ± 0.029, 453.52 ± 0.156 และ 235.92 ± 0.085µmole/ g Extract ตามลาดับ ดังน้ันผักพ้ืนบา้ นท่ที าการคัดเลือก จานวน 15 ชนดิ นามาทดสอบหาความสามารถ ในการต้านอนุมูลอิสระ ผักสมุนไพรพื้นบ้านท่ีมีฤทธ์ิต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH ABTS และ FRAP assay จานวน 7 ชนิดทีม่ ีฤทธติ์ ้านอนุมูลอิสระท่ีดี ได้แก่ ผักกาดช้าง บะงัวะ(ลัวะ) ใบหม่อน สะค้าน ใบ บัวบก ผักบุ้งส้ม และผักเส้ียวนามาทดสอบหาองค์ประกอบทางเคมีเบ้ืองต้น ได้แก่อัลคาลอยด์ ฟลาโวนอยด์ และแทนนิน พบว่าผักพ้ืนบ้านแต่ละชนิดพบสารอัลคาลอยด์ ฟลาโวนอยด์ และแทนนิน เป็นองค์ประกอบ ผลการทดสอบฤทธิ์ยังยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนสพบว่า สารสกัดหยาบจากใบหม่อน มรี ้อย ละการยับยั้งการทางานของเอนไซม์ไทโรซิเนส เท่ากับ 67.43 ± 0.01 รองลงมาได้แก่สารสกัดจากใบ บัวบก เท่ากับ 26.47 ± 0.03 การทดสอบความเป็นพิษของสารสกัดผักพ้ืนบ้านทั้ง 7 ชนิด ที่ความ เขม้ ข้นตา่ งๆ(25, 50, 100, 200, 400 และ 800 ug/m/) เป็นเวลา 24 ช่ัวโมง พบว่าสารสกัดผักพื้นบา้ น ทุกชนิด ทุกความเข้มข้นไม่มีผลทาให้อัตราการรอดชีวิตของเซลล์ลดลงจึงสรุปได้ว่าสารสกัดจากผัก พ้ืนบา้ นไม่มคี วามเป็นพษิ ตอ่ เซลล์เพาะเลย้ี ง คาสาคญั : ผักพนื้ บ้าน ฤทธิ์ต้านอนมุ ูลอิสระ เซลล์เมลาโนมา ฤทธิย์ ับย้ังเอนไซม์ไทโรซเิ นส,

สารบัญเรอ่ื ง กติ ติกรรมประกาศ หนา้ บทคัดยอ่ ก สารบัญ ข ค) บทนา ตรวจเอกสาร 114 วธิ ีการดาเนนิ การวจิ ยั 2 ผลการวจิ ัยและวจิ ารณ์ 9 สรุปผลการวจิ ัย 14 เอกสารอ้างอิง 17 ภาคผนวก 18 20

1 บทที่ 1 บทนา หลักการและเหตผุ ล จังหวัดน่าน มีพ้ืนที่ 11,472 ตารางกิโลเมตร เป็นจังหวัดชายแดนทางภาคเหนือของประเทศ ไทยมีพื้นท่ีราบซ่ึงเหมาะแก่การเกษตรเพียงร้อยละ 12 และมีพื้นเป็นเทือกเขาสูงและป่าไม้ปกคลุม ประมาณร้อยละ 85 ส่งผลทาให้มีความอุดมสมบูรณ์ทางทรัพยากรทางธรรมชาติสูง (เบญจมาส และ คณะ, 2555) อาเภอเฉลิมพระเกียรติเป็นอาเภอเล็กๆ ของจังหวัดน่าน อยตู่ ิดชายแดนทางตอนเหนือสุดของ จังหวัดน่าน ลักษณะภูมิประเทศมสี ภาพพน้ื ที่ส่วนใหญ่เป็นเทือกเขาสูง มีทรัพยากรปา่ ไม้ทอ่ี ุดมสมบูรณ์ และเป็นแหล่งต้นน้าลาธาร มีความหลากหลายทางชีวภาพสูง อาหารพ้ืนเมืองของคนในท้องถ่ินจะมี พชื ผักพ้ืนบา้ นเป็นองคป์ ระกอบหลกั ผักแตล่ ะชนดิ จะมีความสามารถในการตา้ นอนุมลู อสิ ระในปรมิ าณท่ี แตกต่างกันไป โดยสารต้านอนุมูลอิสระมีประโยชน์ในการรักษาโรคต่างๆ เช่น โรคไขมันในเลือดสูง โรคหัวใจ ความดันโลหิตสูง โรคเบาหวาน โรคชรา โรคมะเรง็ ฯลฯ นอกจากนี้สารสกดั จากผักพน้ื บ้านท่ี มีฤทธ์ิตา้ นอนุมูลอิสระสงู ยงั มีคุณสมบตั ิในการยับย้ังเอนไซม์ไทโรซิเนสซ่ึงเป็นสาเหตุสาคัญทาให้เกดิ ฝ้า กระ และจดุ ด่างดา และความหมองคลา้ เกดิ ข้นึ ดังนั้นสารสกดั ที่มีฤทธใิ์ นการยบั ยงั้ เอนไซมไทโรซิเนสจะ สามารถลดกระบวนการสังเคราะหเม็ดสี เมลานิน ชวยปองกันการสะสมของเมลานิน ลดความหมอง คล้า และช่วยปรบั สภาพให้ผวิ ขาวขึน้ ได้ดงั น้นั ผู้ศึกษาวิจัยจึงมีความสนใจศึกษาศักยภาพของสารสกัดจากผักพื้นบ้านในอาเภอเฉลิมพระ เกียรติ จังหวัดน่าน ต่อการพัฒนาผลิตภัณฑ์เครื่องสาอาง โดยเก็บรวบรวมตัวอย่างพืชท่ีมีรายงาน เกยี่ วกบั มฤี ทธติ์ ้านอนมุ ลู อสิ ระสูงมาทดสอบฤทธยิ์ บั ยง้ั เอนไซมไ์ ทโรซิเนส และทดสอบความเป็นพิษของ สารสกัดต่อเซลล์เมลาโนมาที่เพาะเลี้ยงในหลอดทดลอง จากนั้นนามาต้งั ตาหรับสตู รเคร่ืองสาอางสาหรับ ทาให้ผิวขาว ประเมินคุณภาพผลิตภัณฑ์ และนาข้อมูลที่ได้มาใช้ประโยชน์กับคนในชุมชน เพื่อเป็น ฐานข้อมูลทางวิทยาศาสตร์ช่วยเพิ่มคุณค่าของพืชพ้ืนบ้านในท้องถิ่นให้มีมูลค่ามากขึ้น สามารถนามา พัฒนาและประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมเคร่ืองสาอางข้ันสูง และเป็นทางเลือกให้กับคนในชุมชนที่จะ พัฒนาศกั ยภาพความหลากหลายทางชวี ภาพ และจัดการทรพั ยากรพชื ผักพืน้ บา้ นให้เกดิ ประโยชน์อย่าง ย่ังยืนตอ่ ไป วัตถปุ ระสงคข์ องโครงการวิจยั 1. เพ่อื ตรวจหากลุ่มสารในสารสกัดจากผักพน้ื บา้ นบางชนิด 2. เพอื่ ศกึ ษาความสามารถของสารสกัดจากผกั พน้ื บา้ นบางชนิดต่อการยบั ยงั้ เอนไซมไ์ ทโรซิเนส 3. เพื่อทดสอบผลของสารสกัดจากผักพ้ืนบ้านบางชนิดต่อการเจริญของเซลล์เมลาโนมาซี 32 ท่ี เพาะเล้ียงในหลอดทดลอง 4. ตั้งตาหรบั สูตรเครือ่ งสาอางสาหรบั ทาผิวขาว และประเมินคุณภาพผลิตภัณฑเ์ บ้อื งตน้ 5. เพอ่ื เผยแพร่ขอ้ มูลใหก้ ับชมุ ชนและช่วยเพมิ่ คุณคา่ ของพชื พ้นื บา้ นในทอ้ งถ่นิ ให้มมี ูลค่ามากขึ้น

2 บทที่ 2 การตรวจเอกสาร จังหวัดน่าน มีพื้นท่ี 11,472 ตารางกิโลเมตร เป็นจังหวัดชายแดนทางภาคเหนือของประเทศ ไทย เป็นแหล่งต้นน้าที่สาคัญของประเทศไทย มีประชากรประมาณ 4.77 แสนคน (ส้ินปี 2554) ส่วน ใหญเ่ ป็นคนพ้ืนเมือง และชนกลุ่มนอ้ ย (ม้ง ขมุ ล๊วั เปน็ ต้น) อาศัยในบริเวณพื้นที่สูง เป็นจังหวัดยากจน เป็นอันดับสองของภาคเหนือ มีมูลค่าผลิตภัณฑ์มวลรวมจังหวัดน่าน(GPP) ในปี 2553 เท่ากับ 24.7 พันล้านบาท คิดเป็นค่า GPP ต่อหัวเท่ากับ 50,507 บาท มีภาคการเกษตรเป็นบทบาทสาคัญ มีแม่น้า น่านเป็นแม่น้าสายหลักไหลผ่าน มีพื้นท่ีราบซึ่งเหมาะแก่การเกษตรเพียงร้อยละ 12 และมีพ้ืนท่ี ประมาณร้อยละ 85 ของพื้นที่จังหวัดเป็นเทือกเขาสูงมีป่าไม้ปกคลุม (เบญจมาศและคณะ, 2555) จึง ส่งผลทาให้มีศักยภาพทางด้านความหลากหลายทางชีวภาพค่อนข้างสูง วิถีชีวิตของคนน่านสามารถ หลอมรวมเข้ากันได้ดีกับธรรมชาติ คนน่านสามารถใช้ประโยชน์จากพืชพรรณธรรมชาติได้หลายด้าน เช่น ด้านอาหาร ยารกั ษาโรค และนามาจาหน่ายเพือ่ เพิ่มรายได้ให้กบั ครอบครัว การตระหนักถึงคุณค่า ของพืชทอ้ งถ่ินและรว่ มกันรักษาสภาพพืน้ ปา่ ให้คงอยู่จึงเปน็ ทางเลอื กเพือ่ เป็นทางรอดของคนในจังหวัด น่าน อาเภอเฉลิมพระเกียรติเป็นอาเภอเล็กๆ ของจังหวัดน่าน อย่ตู ิดชายแดนทางตอนเหนือสดุ ของ จังหวัดน่าน มีด่านชายแดนไทย - ลาว ห้วยโก๋น-น้าเงิน ที่เปิดให้คนไทยและลาวติดต่อค้าขายกันได้ รวมถึงเป็นเส้นทางที่จะสามารถเดินทางออกไปยงั หลวงพระบางของลาว หรือเมอื งสบิ สองปนั นาของจีน ได้อย่างสะดวก ลักษณะภูมิประเทศมีสภาพพื้นที่ส่วนใหญ่เป็นเทือกเขาสูงมีทรัพยากรป่าไม้ท่ีอุดม สมบูรณ์ และเปน็ แหล่ง ต้นน้าลาธาร มีความหลากหลายทางชีวภาพสูง ประชากรมีวิถีการดาเนนิ ชวี ิตท่ี เรียบง่าย เงียบสงบมีการอยรู่ ่วมกันระหว่างคนกับป่า โดยพ้ืนที่ตั้งของอาเภออยู่ในเขตป่าสงวนแห่งชาติ ดอยภูคาและปา่ ผาแดง อาหารพื้นเมืองของประชากรในอาเภอเฉลิมพระเกียรติ จังหวัดน่าน จะมีพืชผักพ้ืนบ้านเป็น องค์ประกอบหลัก ซึง่ ผักแต่ละชนิดจะมีสารสาคัญทรี่ า่ งกายตอ้ งการแตกต่างกันไป เชน่ ผักพ้ืนบา้ นทม่ี ีสี เขียว และรสฝาดจะมีสารต้านอนมุ ูลอิสระสงู ซึง่ มปี ระโยชน์ในการรกั ษาโรคต่างๆ เชน่ โรคไขมันในเลอื ด สงู โรคหวั ใจ ความดันโลหิตสงู โรคเบาหวาน โรคชรา โรคมะเรง็ โรคความจาเสอื่ ม โรคข้ออักเสบ และ โรคภูมแิ พ้ เป็นตน้ ดงั นัน้ มนษุ ย์จึงต้องรับสารต้านอนุมลู อิสระในปริมาณสูง ผกั พน้ื บ้าน หมายถงึ พรรณพืชผักพื้นบ้านหรือพรรณไม้พืน้ เมอื งท้องถน่ิ ที่นามาบริโภคกนั ในท้องถ่ิน ซึง่ อาจ เกิดขึ้นเองตามธรรมชาติ หรือนามาปลูกไวเ้ พ่ือสะดวกในการเกบ็ มาบรโิ ภค ผกั พ้ืนบา้ นจึงมีชื่อเฉพาะแต่ ละทอ้ งถิน่ และมักนาไปประกอบอาหารตามทอ้ งถ่นิ นนั้ ๆ (ณัฐ, 2548) สมุนไพร เป็นยาพ้ืนบ้านแผนโบราณของไทยมาแต่อดีต ความนิยมในการใชส้ มนุ ไพรได้ลดถอยลงไปบ้าง เมื่อเทคโนโลยีทางการแพทย์และเภสัชศาสตร์สมัยใหม่จากตะวันตกมีอิทธิพลเข้ามา อย่างไรก็ดี ใน

3 ปัจจุบันสมุนไพรกลับมาได้รับความนิยมกันอย่างมากทั้งในเมืองไทยและโลกตะวันตก การใช้สมุนไพร นอกจากจะเป็นการอนรุ ักษ์วัฒนธรรมไทย อนุรกั ษ์ธรรมชาติแล้ว ยังเปน็ การส่งเสรมิ เศรษฐกิจโดยการ นาเอาทรัพยากรธรรมชาติท่ีมีอยู่แล้วมาใช้ประโยชน์ให้คุ้มค่าอีกด้วย เพราะสมุนไพรหลายชนิดมี ประสิทธิภาพดี และสามารถเป็นทางเลือกเพ่อื ทดแทนยาสมัยใหม่ได้ (พเยาว์, 2526) สมนุ ไพรพน้ื บา้ น สมุนไพรพ้ืนบ้าน หมายถึง พืชผักพื้นบ้าน หรือพรรณไม้พ้ืนเมืองในท้องถ่ินท่ีชาวบ้านนามา บริโภคเป็นผักตามวัฒนธรรมการบริโภคของท้องถ่ินจากแหล่งธรรมชาติ สวนนาไร่ หรือชาวบ้านนามา ปลูกไว้ใกล้บ้านเพ่ือสะดวกในการเก็บมาบริโภคสมุนไพรพื้นบ้านนอกจากจะเป็นแหล่งธรรมชาติของ วิตามินและเกลือแร่ที่สาคัญแล้ว ยังมีคุณค่าทางด้านยาสมนุ ไพรที่หมอพ้ืนบ้านนามาใช้รักษาโรคได้ ใน การเลือกใช้พืชผักและสมุนไพรในการดูแลสุขภาพนั้น ควรเป็นสมุนไพรท่ีมีข้อมูลสนับสนุน หรือมี ประวตั ิการใช้ตอ่ เน่อื งกันมา เนื่องจาก องค์ประกอบสาคัญท่ีพบในพืชผักและสมุนไพรนั้น เป็นสารที่มี ฤทธิท์ างชีวภาพ ประกอบในแต่ละส่วนของพชื อายุพืช และฤดูกาลในการเกบ็ เก่ียวที่แตกต่างกันมีผล ทาให้ปริมาณสารสาคัญแตกต่างกันด้วย ดังน้ันการนาพืชผักและสมุนไพรมาใช้ประโยชน์ควรมี หลักเกณฑ์ คือ ใชใ้ ห้ถูกต้อง ถูกส่วน เก็บถูกฤดูกาล ใช้ให้ถูกขนาด ใช้ถูกวิธี จึงจะทาให้ได้รับประโยชน์ จากการใชพ้ ืชผักและสมุนไพรนน้ั ตามสรรพคุณ โดยไม่เกิดการเป็นพิษ นอกจากนแ้ี หล่งที่มาของพืชผัก และสมนุ ไพร ควรเป็นแหล่งปลูกที่มีมาตรฐาน เช่น เกษตรอนิ ทรีย์ เพื่อป้องกันการปนเป้ือนของยาฆ่า แมลงและโลหะหนัก (สานกั การแพทยพ์ น้ื บ้านไทย, 2554) ความสาคัญของพืชสมนุ ไพร พืชสมุนไพรจัดได้ว่ามีความสาคัญทางเศรษฐกิจมาก มีการนามาใช้ประโยชน์ในการสกัดสาร บริสทุ ธิ์ เช่นสาร quinine และ quinidine จากเปลือกลาต้น ( Cinchona ) เพื่อนาไปใช้ประโยชน์เป็น สารต้ังต้นในการสังเคราะห์วิตามิน (เช่น fixed oil สาหรับวิตามินอี) และสเตียรอยด์ เช่น Dioscorea และราก (Smilax ) และใช้เป็นยาสมุนไพรและยาแผนโบราณ นอกเหนือจากการเป็นแหล่งอาหารที่ให้ พลังงานสาคัญ พืชยังเป็นแหล่งวิตามินและสารอาหารต่าง ที่มีความสาคัญในการเจริญเติบโต แต่ท้ังน้ี แม้ว่าการบริโภคพืชบางชนิดอาจจะมีผลในการป้องกันโรคลักปิดลักเปิดโดยการบริโภคส้ม (ส้มที่มี วติ ามินซีสง) พืชที่มีสรรพคุณดังกล่าวนี้ถูกรวมไว้ในหนังสือ PROSEA เล่มอ่ืน โดยเฉพาะในหนังสือ ‘PROSEA 2: ไม้ผลและไม้ผลเค้ียวมัน’ และ ‘PROSEA 8 : พืช’ การศึกษาพืชที่มีการนามาใช้ ประโยชน์เป็นยาในตาราแผนโบราณ เป็นวิธีการทีมีประสิทธิภาพ เพราะมีปริมาณของสารท่ีน่าสนใจ มากกว่าท่ีไดจ้ ากสุ่มคดั เลือกจากตัวอย่างพืชโดยทั่วไป ซ่ึงเป็นเหตุผลหน่ึงท่ีบริษัทผผู้ ลิตยาหลายบริษัท ได้รวมข้อมูลในด้าน ethnobotany ในงานวิจัยและพัฒนาผลิตภัณฑ์ยา อย่างไรก็ตาม ยังมีข้อมูล ความรู้อกี มากทีย่ งั คงมอี ย่ใู นลกั ษณะของการบอกเลา่ สู่กันโดยไมม่ กี ารบันทกึ รวมท้ังพืชอกี หลายชนิดท่ี จะต้องทาการศกึ ษาดา้ นองคป์ ระกอบและการออกฤทธิท์ างชีวภาพ (biological effects) มีการนาพืช หลายชนิดมาใช้ประโยชน์เป็นสมุนไพรพื้นบ้านในการรักษาสัตว์ท่ีป่วย เกษตรกรรายย่อยส่วนใหญ่ใน ภูมิภาคเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ ใช้ยาสมุนไพรพ้ืนบ้านในการรักษาสัตว์ เพราะหาได้ง่ายและราคาถูก ทง้ั นม้ี ีการบนั ทกึ ข้อมลู ดา้ นสรรพคุณเป็นยาสัตว์นอ้ ยมาก ข้อมลู ความรู้ส่วนใหญย่ ังคงเป็นการบอกเลา่ สู่ กัน (พรี ศกั ดิ์ และคณะ, 2546)

4 สารสาคญั จากสมนุ ไพร การศึกษาสมุนไพรไทยในเชิงลึก มักปรากฏผลงานในรูปของการตีพิมพ์เผยแพร่ในวารสารทาง วิชาการต่างๆ ส่วนใหญ่เปน็ เรือ่ งราวเก่ยี วข้องกบั การสกดั และโครงสร้างเคมีของสารสาคญั การทดสอบ ฤทธิ์ทางชีวภาพของสารบริสุทธ์ิ หรือสารสกัดในตัวทาละลายชนิดต่างๆหรือการวิเคราะห์หาปริมาณ สารสาคัญจากตัวอย่างพืชสมุนไพร และอาจรวมไปถงึ การใช้เทคนิคทางชีวโมเลกุลมาเป็นตัวนาในการ ตรวจสอบ เป็นต้น หากพิจารณาถึงจานวนชนิดของพืชสมุนไพรท่ีใช้อยู่ในตารับยาต่างๆ แสดงให้เห็น อย่างเป็นรูปธรรมชัดเจนว่า ยังมีสมุนไพรในประเทศไทยอีกมากมายหลายชนิดท่ียังไม่ได้มีการศึกษา ค้นคว้าหรอื กาหนดมาตรฐาน สารสาคัญแสดงฤทธ์ิทางชวี ภาพ การศึกษาถงึ สารสาคญั แสดงฤทธ์ิทางชีวภาพในพืชสมนุ ไพรแต่ละชนิดย่อมมีความสาคัญอย่าง มากตราบเท่าท่ีสังคมไทยยังคงใช้สมุนไพรในการรักษาโรค ตามวิถแี ห่งการแพทย์พื้นบ้าน ประเด็นนี้ทา ให้การค้นหาสารสาคัญแสดงฤทธิ์ทางชีวภาพจากสมุนไพรท่ีไม่เคยมีรายงานผลการศึกษาวิจัย หรือมี การศึกษาเบ้ืองต้นมาบ้างแล้ว (preliminary studies) มักได้รับการสนับสนุนจากหน่วยงานสนับสนุน การวิจัย แต่มีประเด็นท่ีน่าสังเกตว่าโครงการวิจัยเกี่ยวข้องกับสกัดแยกองค์ประกอบเคมีหรือค้นหา สารสาคัญจากสมุนไพร มักถูกกาหนดให้ทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพควบคู่ไปด้วย โดยเลือกรูปแบบการ ทดสอบฤทธ์ใิ นรูปแบบใดรูปแบบหน่ึงและกลุ่มวิจยั เก่ียวกับพืชสมุนไพรส่วนมากจะเน้นไปที่ทดสอบหา สารสาคญั ทีแ่ สดงฤทธ์ิชัดเจน ใช้เวลาไม่นาน ใชป้ ริมาณสารสกดั ในการทดสอบน้อย มีคา่ ใชจ้ ่ายสูง และ สามารถทดสอบภายนอกร่างกายได้ (in vitro) ดังนั้นรูปแบบของการทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพจึงมีไม่ มากนัก เช่น การทดสอบหาสารสาคัญแสดงฤทธิ์ต้านจุลชีพต่างๆ (antimicrobial activity) การ ทดสอบหาสารต้านอนุมูลอิสระ (antioxidant activity) การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์มะเร็ง (cytotoxic activity) เป็นตน้ หากพิจารณาในแง่มุมทางตรรกะแล้ว ยังมีสมุนไพรอกี หลายชนิดซ่ึงแสดง ฤทธิ์ทางชีวภาพอ่ืนๆ และน่าสนใจตอ่ การพัฒนา รวมถึงการตรวจสอบวา่ มฤี ทธ์ิทางชีวภาพตามคากลา่ ว อ้างไว้ในการแพทย์พื้นบ้านจริงหรือไม่ เช่น ฤทธิ์ในการลดระดับน้าตาลในเลือด ฤทธิ์ต่อระบบ ประสาท ฤทธ์ิต่อระบบสืบพันธ์ุ เป็นต้น การทดสอบฤทธ์ิทางชีวภาพเหล่าน้ีมีกรรมวิธีในการทดสอบท่ีซับซ้อนและมักไม่นิยมเลือกให้ เป็นรปู แบบของการทดสอบสารแสดงฤทธิ์ ดังนน้ั จึงแทบไม่มีโอกาสที่พบสารสาคญั แสดงฤทธิเ์ หล่านน้ั นอกจากน้ีการศึกษาวิจยั แยกหาสารสาคัญควบคู่ไปกับการทดสอบฤทธ์ทิ างชีวภาพเพียงไม่กี่รูปแบบน้ัน ไมส่ ามารถเป็นตัวแทนสารออกฤทธิ์ทั้งหมดท่ีพบในพชื ชนิดตา่ งๆ ได้ เพราะมคี วามเป็นไปไดส้ งู ท่ีอาจจะ ละเลยสารแสดงฤทธ์ิทางชีวภาพในรูปแบบอื่น ซึ่งแตกต่างออกไปจากฤทธ์ิทางชีวภาพตามวิธีในการ ตรวจสอบเบ้ืองต้น และอาจไม่มีการค้นพบสารแสดงฤทธ์ิดังกล่าวในพืชนั้นๆ ตราบเท่าท่ีรูปแบบของ การทดสอบสารแสดงฤทธิ์ชนิดนั้นๆ ไม่ถูกนามาใช้ หรืออีกมุมหน่ึงสมุนไพรชนิดน้ันๆ อาจถกู ละเลยไป เนื่องจากสารสกัดเริ่มต้นไม่แสดงฤทธทิ์ างชีวภาพ นอกจากนีร้ ูปแบบของการทดสอบการแสดงฤทธ์ิทาง ชีวภาพ มกั เป็นการทดสอบภายนอกรา่ งกาย (in vitro) จึงเป็นไปได้ว่า สารแสดงฤทธเ์ิ มอ่ื ภายในระบบ ของสิ่งมีชีวิต (in vivo) บางตัวจะไม่แสดงฤทธิ์เมื่อทดสอบภายนอกร่างกายและบ่อยคร้ังพบว่า ส่วน แสดงฤทธ์ิ (active fraction) ไดส้ ญู หายไประหวา่ งกระบวนการสกัดและแยกสารให้บรสิ ุทธ์ิ เป็นได้ว่ามี การเปล่ียนสภาพจากสารมีฤทธ์ิเปน็ สารไม่มฤี ทธ์ิ ซ่ึงถือวา่ เป็นสารที่ไม่ได้ปรากฏอยู่จริงในธรรมชาติ ใน

5 อีกด้านหนึ่งมักมีคากล่าวอ้างว่า สารจะแสดงฤทธ์ิทางชีวภาพเม่ืออยู่รวมกันหลายตัวโดยปราศจาก เหตุผลทางวิทยาศาสตร์รองรับโดย หากพิจารณาในมุมและประเด็นที่แตกต่างกันว่า “การศึกษาวิจัย สมุนไพรท่ีมกี ารทดสอบทางชีวภาพควบคู่ไปด้วย เป็นลักษณะของการวิจัยเพียงแค่ลักษณะหน่งึ เท่านั้น ไม่อาจเป็นตัวแทนรูปแบบท้ังหมดของการหารสารบริสุทธ์ิท่ีมีฤทธ์ิทางชีวภาพจากสมุนไพรได้” ดังนั้น ทศั นะและวิธีการศึกษาวจิ ยั สมุนไพรจงึ แตกต่างออกไปดว้ ย แตย่ งั คงไว้ซึ่งเป้าหมายเดยี วกันคือ “ค้นหา สารแสดงฤทธิ์ทางชีวภาพจากแหลง่ กาเนิดทางธรรมชาติ “โดยอาศยั สมมติฐานท่วี ่า ” องคป์ ระกอบทาง เคมที กุ ชนดิ ทีพ่ บในพืชชนดิ หน่งึ ๆ สามารถแสดงฤทธิท์ างชีวภาพได้ไม่อยา่ งใดอยา่ งหน่งึ หรอื ไมแ่ สดงฤทธ์ิ ก็สามารถทาให้แสดงฤทธิ์ทางชีวภาพได้” เช่น การใช้กระบวนการทางเคมีเพ่ือทาให้เกิดอนุพันธ์ของ กลุ่มสารชนิดน้ันๆ เป็นต้น ด้วยเหตุนี้รูปแบบการค้นหารสารสาคัญจากพืชสมุนไพรจึงไม่ได้ทาการ ทดสอบฤทธ์ิทางชีวภาพควบคไู่ ปด้วย แต่จะเป็นไปในลักษณะการศึกษาสกัดแยกองค์ประกอบทางเคมี ให้มจี านวนชนิดและปริมาณมากท่ีสดุ กอ่ น หลงั จากทราบโครงสร้างทางเคมีวา่ เป็นสารองคป์ ระกอบกลุ่ม ใด “สารกลุ่มน้นั ๆ จะเป็นตัวกาหนดฤทธ์ิทางชวี ภาพเอง”(ตรเี พชร, 2552) ประสงค์ และพรรณพร (2555) ได้ศึกษาความหลากหลายพืชพื้นบ้านท่ีมีจาหน่ายในจังหวัด น่านและศักยภาพการใช้ประโยชน์พบว่า พืชพ้ืนบ้านมีศักยภาพการใช้ประโยชนไ์ ด้ท้ังเป็นอาหาร สร้าง รายได้ให้ครัวเรือน และมีสรรพคุณทางยา นับว่าพืชพ้ืนบ้านเป็นทรัพยากรที่เป็นแหล่งความมั่นคง ทางดา้ นอาหาร สาหรบั คนเมอื งนา่ นไดด้ ีแหล่งหนึง่ สารเหตขุ องการเกิดโรคต่างๆ สามารถเกิดข้ึนไดเ้ น่ืองจากกระบวนการเส่ือมสลายของเซลลแ์ ละ อวัยวะต่างๆ เนื่องจากปฏกิ ริ ิยาของอนมุ ูลอิสระ (นวลศรี รักอริธรรม และอญั ชนา เจนวิถีสุข, 2545) ผล ของอนมุ ูลอิสระต่อการเกิดพยาธิสภาพชนิดต่างๆ ได้รับความสนใจอย่างมาก เช่น โรคมะเร็ง โรคหัวใจ และหลอดเลอื ด โรคเกย่ี วกบั ระบบภูมคิ ุ้มกันทางานไมป่ กติ ต่างมีความสัมพันธ์กับการเกิดอนุมูลอสิ ระ ในรา่ งกาย ดังน้ันการทาลายหรอื ควบคมุ ปริมาณอนมุ ลู อิสระจงึ เป็นสว่ นช่วยในการป้องกันและรักษาโรค ท่ีเกี่ยวกบั อนมุ ูลอสิ ระ (โอภา วชั ระคุปต์, 2549) อนุมูลอิสระ หมายถึง สารท่ีมีอิเล็กตรอนโดดเดีย่ วในอะตอมหรือโมเลกุล เป็นสาเหตุให้เกิดโรค ต่าง ๆ มากมาย ได้แก่ โรคชรา โรคมะเร็ง โรคหวั ใจขาดเลือด โรคความจาเส่ือม โรคข้ออกั เสบ โรคภูมิแพ้ โรค ความดันโลหติ โรคเก่ยี วกับสายตา เกดิ ความผดิ ปกตขิ องปอดและระบบประสาท (ไมตรี, 2555) ทีม่ า :http://thaiherbcare.net

6 สารต้านอนุมูลอิสระ หรือมีอีกช่ือว่า “Antioxidant” ทาหน้าท่ีในการต้านอนุมูลอิสระโดยจับ กับโลหะท่ีสามารถเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชัน การหยุดปฏิกิริยาการสร้างอนุมูลอิสระ ในการต้านอนุมูล อสิ ระมีหลายรูปแบบ เช่น การดักจับอนุมูลอิสระ การยบั ย้ังการทางานของออกซิเจนที่ขาดอิเล็กตรอน สารต้านอนุมูลอิสระพบมากในพืชผักและผลไม้บางชนิด จึงได้มีการสนับสนุนให้รับประทานส่ิงเหล่านี้ เพ่มิ มากข้ึน (เจนจิราและประสงค์, 2554) สารตา้ นออกซิเดชันบางชนิดได้มาจากพชื ได้แก่ สารกลุ่มโพลฟี ีนอล (polyphenols) เช่น ฟลา โวนอยด์ (flavonoids) ท่ีมีท่ัวไปในพืช และสารกลุ่มฟลาโวนอยด์ยังมีฤทธ์ิทางชีวภาพ เช่น ฤทธ์ิต้าน แบคทีเรีย ฤทธิ์ต้านการอักเสบ และฤทธ์ิกระตุ้นการทางานของภูมิคุ้มกัน (Akula, Uma Sankar and Bharti Odhav. 2008) สารประกอบฟนี อลในพชื และคุณสมบัติการเป็นสารต้านออกซเิ ดชัน ในปัจจุบันสารประกอบฟีนอลได้รับความสนใจเป็นอย่างมากเน่ืองจากมีคุณสมบัติในการต้าน ปฏิกิริยาออกซิเดชัน และต้านการกลายพันธ์ุ (antimutagrns) ซ่ึงเกิดจากอนุมูลอิสระ และมีการใช้ใน การรักษาโรคต่างๆ เช่น โรคหัวใจขาดเลือด โรคมะเรง็ โดยสารประกอบฟีนอลจะทาหน้าท่ีกาจัดอนุมูล อิสระและไอออนของโลหะที่เร่งการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของไขมันและโมเลกุลอ่ืนๆ ด้วยการให้ อะตอมไฮโดรเจนแกอ่ นมุ ูลอสิ ระอยา่ งรวดเร็วดังปฏกิ ริ ยิ าต่อไปนี้ ROO + PPH ROOH + PP ………. (1.1) RO + PPH ROOH + PP ………. (1.2) เมอ่ื ROO , RO คือ อนุมูลอิสระ, PPH คือ สารประกอบฟีนอล เมื่อสารประกอบฟีนอลให้อะตอมไฮโดรเจนแก่อนุมูลอิสระไปแล้ว อนุมูลอิสระของ สารประกอบฟนี อลจะคอ่ นข้างมเี สถยี รภาพ ดังนน้ั จงึ ไม่สามารถทาปฏกิ ริ ยิ าอื่นตอ่ ไป นอกจากน้ันอนุมูล อสิ ระของสารประกอบ ฟนี อลบางชนิด สามารถรวมตัวกบั อนุมูลอิสระอ่ืนได้อีกทาให้ลดจานวนอนุมูล อิสระไดถ้ งึ 2 เทา่ ดังปฏิกิริยาต่อไปนี้ (รชั ฏาพร, 2554) ROO + PP ROOPP ……….(1.3) RO + PP ROPP + PP ……….(1.4) สารประกอบฟีนอลสามารถพบได้ในส่วนต่างๆ ของพืช เช่น เมล็ด ผล ใบ และส่วนอื่น สารประกอบ ฟีนอลท่ีเป็นท่ีรู้จักกันดีคือ สารฟลาโวนอยด์ (flavonoids) ได้แก่ flavones, flavonols, isoflavones, catechins, flavonones และ chalcones โดยสามารถพบได้ในเกือบทุกส่วนของพืช แต่จะมีความแตกต่างกันออกไปในด้านของชนิดและปริมาณ นอกจากน้ีมียาแผนปัจจุบันบางชนิดท่ีใช้ รักษาโรคมะเรง็ ซ่ึงมีแหล่งที่มาเริ่มตน้ จากพชื เชน่ ฟีนอลิกและฟลาโวนอยดพ์ บในข้ีเหล็ก (Pitchaon et all, 2008) เอนไซม์ไทโรซิเนส (Tyrosinase enzyme) (EC 1.14.18.1) ไทโรซิเนส เป็นเอนไซม์ที่พบในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เอนไซม์น้ีมีหน้าที่ สร้างเม็ดสีให้ผิวหนัง ผม และ ตา ในพืชผักผลไม้ไทโรซิเนส เก่ียวข้องกับกระบวนการเกิดสีหมองคล้า

7 เม่ือถูกกระแทก หรือขีดข่วน โดยไทโรซิเนสเปนเอนไซมซึ่งพบในส่ิงมีชีวิตทั่วไป ทาหน้าท่ีเก่ียวของกับ กระบวนการเปล่ียนเปนสีน้าตาลของเห็ด ผัก ผลไม การลอกคราบในแมลง การเกิด สีผิว ผม ตา ของ สัตว เปน เอน ไซมที่ ควบคมุ กระบวนการสงั เคราะหเมลานิน (Kim andUyama, 2005) แสดงกลไกดัง ภาพ 1 ภาพท่ี 1 ปฏกิ ริ ยิ าการสรา้ งสารเมลานนิ ท่ีมา : http://biochem.pepperdine.edu/dokuwiki/doku.php?id=chem330:fall2013:lab_3_-- _ph_dependence_of_enzymatic_activity_harry_potter_edition เมลานนิ (Melanins) คือเม็ดสีของผิวหนังทาหน้าท่ีปกป้องผิวจากแสงแดด แต่หากมีเมลานินมากเกินไปจะทาให้ ผิวหนังมีสีคล้าทาให้เกิด ฝ้า กระ และภาวะเม็ดสีมีมาก กระบวนการสร้างเมลานิน เกิดข้ึนโดยมีไทโร ซิเนสเป็นเอนไซมจ์ ากดั อัตรา ซึ่งจะเร่งปฏิกิริยาระหวา่ ง tyrosine กับ oxygen ได้เป็น dopa และช่วย เร่งปฏิกิริยาระหว่าง dopa กับ oxygen ได้เป็น dopaquinone ซึงจะทาปฏิกิริยาต่อจนได้เมลานิน แสดงดงั ภาพ 1 สารยบั ย้งั เอนไซมไ์ ทโรซเิ นส (Antityrocinase inhibitor activity) สารท่ีมีฤทธิ์ยับย้ังเอนไซม์ไทโรซิเนสคือ สารที่ช่วยลดการะบวนการสร้างเม็ดสีเมลานิน ช่วย ป้องกันการสะสมเม็ดสีเมลานีนนามาใชในอุตสาหกรรมเคร่ืองสาอางเพ่ือทาใหผิวขาว แสดงกลไกการ เกิดปฏกิ ิริยาดังภาพ 2

8 ภาพที่ 2 แสดงปฏิกริ ิยาการยงั ยั้งเอนไซมไ์ ทโรซเิ นสดว้ ย Flavonoid derivatives ที่มา : https://www.google.co.th/search?biw=1360&bih=623&tbm=isch&sa=1&q=+tyrosinase ในการทดสอบความเป็นพษิ ของสารมีหลายวธิ ี เชน่ การทดสอบโดยใช้สตั ว์ทดลอง การทดสอบ โดยใช้เซลล์เพาะเล้ยี ง เป็นตน้ การนาเซลล์ของคนมาเพาะเลยี้ งในหลอดทดลองเพือ่ ใช้ทดสอบคณุ สมบัติ ของสารหรอื ความเป็นพษิ ของสารเป็นวิธีท่ปี ัจจบุ ันเลือกใชท้ ดสอบ เน่ืองจากการทดสอบในสตั ว์ทดลองมี ข้อกาหนดในการปฏิบัติทางด้านจริยธรรม และมีค่าใช้จ่ายสูง การทดสอบความเป็นพิษของสารโดย ทดสอบกับเซลล์เพาะเลีย้ งในหลอดทดลองจึงเป็นท่นี ิยม และมกี ารพฒั นาทดสอบกับเซลลไ์ ดห้ ลายชนิด เนอื่ งจากสามารถเลือกชนดิ ของเซลลท์ ี่จะใช้ทดสอบได้เหมาะสมกบั ฤทธิ์ของสารสกัด (ทัศนีย์ และคณะ, 2556) จากการศึกษาผลการวิจัยท่ีผ่านมาของนักวิจัยกลุ่มอื่นๆ ได้นาเซลล์เมลาโนมา มาใช้ศกึ ษาฤทธ์ิ ของสารสาคญั ทางเครือ่ งสาอาง และทางเภสัช (Mckim et al, 2012) เซลลเ์ มลาโนมา ซี 32 เป็นชนิดอะเมลาโนทิค เมลาโนมา (Amanotic melanoma) เป็นเซลล์ ท่ีพบในผิวหนังชั้นอิพิเดอร์มิส (epidermis) ของร่างกาย เซลล์ชนิดนี้ สามารถเพาะเล้ียงได้ในหลอด ทดลอง แบ่งตัวได้ไม่ส้ินสุด สามารถเล้ียงได้อย่างต่อเนื่อง มีการศึกษานาสาระสาคัญในพืชสมุนไพร ธรรมชาติ มาศึกษาในเซลล์เมลาโนมาซี 32 ไดแ้ ก่ ศึกษาสารเคอร์คูมิน (curcumin) จากขม้ินในการ เหนี่ยวนาให้เกิด Antiproliferative และ Proapoptotic ท่ีมีผลต่อเซลล์เมลาโนมา ซี 32 การศึกษา ความเป็นพิษของสาร ที่เป็นองค์ประกอบของสารต้านอนุมูลอิสระจาก Hypericum triquetrifolium Turra ในเซลล์เมลาโนมา ซี 32 (Conforiti et al., 2008)

9 บทที่ 3 วธิ กี ารดาเนนิ การวิจยั อปุ กรณ์เครือ่ งมอื และสารเคมี 1. บกี เกอร์ (Beaker) 2. ชอ้ นตกั สาร (Spatula) 3. แทง่ แก้วคนสาร (Stirring rod) 4. ออโตป้ เิ ปตต์ (auto pipette) ขนาด 100 , 1000 , 5000 µL 5. กระดาษกรอง (Filter paper) 6. หลอดทดลอง (Test tube) 7. ตะแกรงใสห่ ลอดทดลอง (Test Tube Rack) 8. หลอดหยด (Dropper) 9. กระจกนาฬกิ า (Watch glass) 10. กระดาษชง่ั สาร(Weighing papers) 11. กระบอกตวง (Cylinder) 12. ขวดวัดปรมิ าตรขนาด 5,10, 100 ml (Volumetric flask) 13. พาราฟลิ ม์ (Parafilm M) 14. ขวดใส่เห็ดป่าตวั อย่างรบั ประทานได้ 15. ขวดใส่สารสกัดตวั อย่าง เคร่ืองมอื 1. เครอื่ งชัง่ แบบหยาบและแบบละเอยี ด Precision balances (ทศนิยม 2 4 ตาแหนง่ ) 2. อา่ งนา้ ควบคมุ อุณหภมู ิ (Water bath) 3. เครอ่ื งวดั การดูดกลนื แสง (UV-VIS Spectrophotometer) 4. เครื่องผสมสารละลาย (Vortex mixture) 5. เครื่องระเหยสุญญากาศ (Vacuum evaporator) 6. แผน่ ความร้อน (Hot plate) 7. การทาแหง้ แบบแช่เยือกแข็ง (Freeze Dry) 10 0จ สารเคมี

1. กรดแอซีติก (Acetic acid) CH3COOH 2. โพแทสเซียมไอโอไดด์ (Potassium iodide) KI 3. นา้ กลน่ั (distilled water) H2O 4. เอทานอล (Ethanol) C2H6O 5. กรดไฮโดรคลอรกิ (2M Hydrochloric acid) HCl 6. กรดซัลฟิวริก (Sulfuric acid) H2SO4 7. กรดอะซติ ิกแอนไฮไดรด์(Acetic Anhydrides) CH2CO3 8. กรดแกลลิค (Gallic acid) C6H2(OH)3COOH 9. โฟลนิ ซโิ อ-เคาทูรเี อเจนต์ (Folin-Ciocalteu regent) 10. โซเดยี มไบคาร์บอเนต (Sodium bicarbonate) Na2CO3 11. เฟอร์ริกคลอไรด์ (Ferric chloride) FeCl3 12. บวิ ทิลไฮดรอกซโี ทลอู นี (ButylatedHydroxy Toluene) BHT 13. เฟอรสั ซลั เฟต (Ferrous sulfate) FeSO4 14. (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH 15. 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine (TPTZ) วิธดี าเนินการวิจยั 1. กลุม่ พชื ตัวอย่างที่ใชใ้ นการวิจยั ศกึ ษาเอกสารและงานวิจัยท่ีเกยี่ วขอ้ งทาการสารวจ และเก็บรวบรวมตัวอยา่ งพชื พื้นบ้านที่มี รายงานเกีย่ วกับฤทธิ์ตา้ นอนมุ ลู อิสระสูง ในอาเภอเฉลิมพระเกียรติ จงั หวัดน่าน 2. การสกดั สารจากพืชตัวอย่าง นาตัวอย่างพืชสมุนไพรพ้ืนบ้านท่ีมีรายงานเก่ียวกับฤทธ์ิต้านอนุมูลอิสระสูงในอาเภอเฉลิมพระ เกียรติ จังหวดั นา่ น มาสกดั ดว้ ยตวั ทาละลายท่เี หมาะสม จากนั้นนาสารละลายทไ่ี ด้จากการสกัดมากรอง ผ่านกระดาษกรอง แล้วนาไประเหยด้วยเครื่องระเหยแห้ง (vacuum rotating evaporator) นาสาร สกัดเข้าเครอื่ งทาแห้งแบบเยือกแข็ง (freeze dryer) เพื่อให้ได้สารสกดั อยู่ในรูปผงแหง้ และคานวณหา เปอรเ์ ซ็นต์ท่ไี ด้จากการสกัด 3. การหาปรมิ าณสารประกอบฟนิ อลคิ ด้วยวธิ ี Total phenolic content assay หาปริมาณ สารฟีนอลรวมโดยวิธี Folin-Ciocalteu method ดัดแปลงมาจากวิธีของ (Pourmad et al, 2006) โดยเตรียมสารสกัดจากผักพ้ืนบ้านท่ีความเข้มข้นต่างๆ เติม 0.2 N Folin – Ciocalteu reagent 1 มิลลิลิตร และเติมสารละลาย 1 M โซเดียมคาร์บอเนต 0.8 ml ผสม ใหเ้ ข้ากัน ทิ้งไว้ท่ีอุณหภูมิห้อง เปน็ เวลา 20 นาที นามาวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลน่ื 765 nm โดยใช้เครื่อง UV-visible spectrophotometer การทดสอบสารละลายมาตรฐาน gallic acid ที่ความเข้มข้นต่างๆ ทาการทดลองตัวอย่างละ 3 คร้ัง (triplicate) จากน้ันคานวณ หาปริมาณฟีนอล

11 0จ รวมเฉลี่ย ในรูป มิลลิกรัมของ gallic acid equivalents (GAE) ต่อสารสกัดจากในผักพ้ืนบ้าน 1 กรมั 4. การทดสอบฤทธต์ิ า้ นอนมุ ลู อิสระ ด้วยวธิ ี DPPH radical scavenging activity นาสารละลาย DPPH มา 0.1 ml เติมลงใน Ethanol ml จากน้ันเติมสารละลายสารสกัด ตวั อย่างท่ีความเข้มข้นต่างๆ ปริมาตร 0.3 ml นาไปบม่ ในที่มดื 30 นาที จากนั้นวดั ค่าการดดู กลนื แสงท่ี 517 nm ด้วยเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ ทาการทดลองซ้า 3 ครั้ง คานวณหาฤทธิต์ ้านอนุมูลอิสระจาก กราฟมาตรฐาน Ascorbic acid (Devi P. and Meera R., 2010) 5. การทดสอบฤทธิต์ ้านอนุมูลอิสระด้วยวธิ ี Ferric reducing antioxidant power assay (FRAP assay) นาสารสกัดจากผักพ้ืนบ้าน 1 mg ละลายในตัวทาละลาย 1 ml จากน้ันปิเปตต์มา 0.1 ml เติมลงใน FRAP reagent Benzie and Strain,(1996) , Griffin and Bhagooli, (2004). ปริมาตร 3.0 ml ผสมให้เข้ากันทิง้ ไวท้ ี่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที แล้วนามาวดั ค่าการดูดกลืนแสงท่ี 593 nm วิธีการเตรียม Blank ใช้ตัวทาละลาย 0.1 ml แทนสารสกัดตัวอย่าง และหาฤทธ์ิต้านอนุมูลอิสระของ สารสกัดโดยเปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน L-ascorbic acid (0.1, 0.3, 0.5 และ 1.0 mM) แสดงค่าใน รูป ascorbic acid equivalents (AAE/mg) ของสารสกัด ทาการทดลองซ้า 3 ครั้ง Saeed, et all. (2007). 6. ตรวจหากลุ่มสารสาคญั ในสารสกัดจากผกั พืน้ บา้ นบางชนิด ดงั นี้ 6.1 ฟลาโวนอยด์ การทดสอบสารในกลุ่มสารฟลาโวนอยด์ (flavonoids) ทดสอบโดยใช้ ปฏิกิริยาไซยานิดิน (cyanidin reaction) ประกอบด้วยโลหะแมกนีเซียมและกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น ให้ผลการทดสอบเฉพาะฟลาโวนอยด์ ที่มีฟีนิลเบนซิล-แกมมา-ไพโรนเป็นโครงสร้างหลกั ผลการทดสอบ มสี ีส้มถึงสีแดงแสดงว่ามีฟลาโวน สีแดงถึงสีแดงเข้มหรือสีแดงเลือดหมู (crimson) มีฟลาโวนอล สีแดง เขม้ ถึงสีแดงอมมว่ ง (margenta) มีฟลาโวโนนไกลโคไซด์ สีเขยี วหรอื สนี า้ เงิน มฟี ลาโวโนนอสิ ระบางชนิด สแี ดงหรือสีม่วงมลี วิ โคแอนโธไซยานดิ ิน สีแดงอมสม้ ถงึ สีแดงอมน้าเงินแสดงว่ามีแอนโธไซยานดิ นิ 6.2 อัลคาลอยด์ การทดสอบสารในกลุ่มอัลคาลอยด์ โดยวิธีรีเอเจนต์ดราเจนดรอฟฟ์ (Dragendroff ’s reagent) สารสกัดผักพ้ืนบ้าน 1 กรัม ละลายด้วย 5% HCl นามาทดสอบด้วย สารละลาย Dragendroff ถ้าผลการทดสอบมีสารกลุ่มอัลคาลอยด์ ผลการทดสอบจะเกิดตะกอนสีส้ม หรือสแี ดง 6.3 แทนนนิ การทดสอบดว้ ยปฏิกิริรยาการเกดิ สหี รือตะกอน สารสกัดผักพื้นบ้าน 1 กรัม เติม EtOH 1 มิลลิลิตร จากนั้นเติมน้าลงไป 10 มิลลิลิตร เขย่าให้เข้ากัน ปิเปตต์มา 2 มิลลิลิตร ใส่ในหลอด ทดลอง จากน้ันเติม 1% FeCl2 ลงไป 1-2 หยด สังเกตสีและตะกอนท่ีเกิดขึ้น ถ้าสารสกัดที่ใช้ทดสอบ เกิดตะกอนสีเขียว น้าเงนิ หรือดา แสดงว่าพบสารกลุ่มแทนนนิ 7. การทดสอบฤทธ์ิยบั ยังเอนไซม์ไทโรซเนสดว้ ยวีธิ Modified Dopachrome นาสารละลายผักพ้ืนบ้านตัวอย่างท่ีความเข้มข้นต่างๆ มาทดสอบฤทธ์ิยับย้ังการทางาน ของ เอนไซม์ไทโรซิเนส เทียบกับสารยับย้ังเอนไซม์ไทโรซิเนสมาตรฐาน วิตามินซี (L-ascorbic acid) และ

12 0จ กรดโคจิก (Kojic acid) โดยเติม สารละลาย L-dopa ความเข้มข้น 1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลติ ร ปรมิ าตร 50 ไมโครลิตร ร่วมกับสารสกัดจาก ผักพื้นบ้านท่ีความเข้มข้นต่างๆ ปริมาตร 50 ไมโครลิตร จากนั้น เติม สารละลายเอนไซม์ไทโรซเิ นส 100 ยูนติ ต่อมลิ ลิลิตร ปริมาตร 50 ไมโครลิตร ใน 96-well microplates จากนน้ั วัดค่าการดูดกลนื แสงท่ี 450 นาโนเมตร ด้วย 96-well Microplate Readers บ่มท่ีอุณหภมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาที วัดค่าการดดู กลืนแสงอีกครั้งท่ีความยาวคลื่นเดิม จากน้ัน คานวณหา ค่ารอ้ ยละของการยบั ย้ังเอนไซมไ์ ทโรซิเนส ทาการทดสอบตัวอยา่ งละ 3 ซา้ จากสูตรคานวณดงั นี้ % Inhibition = [(A-B) – (C-D)] / (A-B) x 100 โดย A, B, C และ D คือ ผลตางของค่าการดดู กลนื แสงทค่ี วามยาวคล่ืน 450 นาโนเมตร ระหว่างค่าท่ีวัด ได้ ไดก้ ่อนการบม่ และหลังบม่ 60 นาที จากนั้นคานวณหาคา่ ความเข้มขน้ ของสารสกดั จากผกั พ้ืนบา้ นท่ี สามารถยบั ยั้งเอนไซม์ไทโรซิเนส 50% (IC50) จากกราฟระหวา่ งเปอร์เซ็นต์การยับยง้ั เอนไซม์ไทโรซิเนส และความเขม้ ขน้ ของสารสกัดผกั พนื้ บา้ นตวั อยา่ ง (Long et al., 2002) 8. การเพาะเล้ียงเซลลเ์ มลาโนมา C32TG Melanoma cell line (C32TG) ถูกเลี้ยงในห้องปฏิบัติการมาตฐานความปลอดภัย Biosafety Level II ตู้ชีวนิรภัยระดับ 2 (Biosafety Cabinet Class II) ควบคุมอุณหภูมิบรรยากาศที่อุณหภูมิ 37 0C CO2 5 % ความช้ืน 95% ด้วยอาหารเลี้ยงเซลล์ชนิด Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ร่วมกบั fetal bovine serum (FBS) 10% 9. ศึกษากราฟการเจรญิ ของเซลล์ (growth curve) นาเซลล์เมลาโนมาซี 32 มาทาการหาค่าการเจริญเติบโตของเซลล์ในแต่ละวัน เพ่ือเลือก จานวนเซลล์ท่ีเหมาะสมเพ่ือนาไปใช้ในการศึกษาฤทธิ์ของสารสกัดจากผักพ้ืนบ้านต่อการเจริญเติบโต ของเซลล์เมลาโนมา (Freshney & Jan, 1987) 10. การทดสอบความเปน็ พษิ ของสารสกัดต่อเซลล์เพาะเลย้ี ง C32TG โดยวธิ ี MTT เซลล์เพาะเล้ียง C32TG จะถูกเล้ียงใน 96 well-plate จานวน 2×105 เซลล์ต่อหลุม ปรมิ าตร 100 ไมโครลิตร จากน้ันจึงทาการเติมสารสกดั จากผกั พืน้ บ้านที่ความเข้มข้นต่างๆโดยให้ มีความเข้มข้นสุดท้ายเป็น 25, 50, 100, 200,400 และ 800 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร 100 ไมโครลิตร บ่มทิ้งไว้ที่ 37 0C เป็นเวลา 24 ช่ัวโมง เมื่อครบเวลาทาการดดู อาหารเล้ยี งเซลล์ ออกแล้วเติมสารละลาย 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ปริมาตร 100 ไมโครลิตร ทิ้งไว้ 4 ช่ัวโม ง เซลล์ที่มีชีวิตจะใช้เอนไซม์ succinate dehydrogenase ในไมโทคอนเดรีย เปลย่ี น MTT ซึ่งเป็นสารสีเหลืองให้เป็นผลึก formazan ซึ่งมีสี ม่วง จากน้ันดูดสารละลายท้ังหมดออก และเติม dimethyl sulfoxide (DMSO) ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เพื่อละลายผลึก formazan ที่เกิดขึ้นซึ่งจะเห็นเป็นสารละลายสีม่วง วิเคราะห์หา

เปอร์เซ็นต์การรอดชีวิต (% cell viability) ด้วยเครื่อง microplate reader ที่ความยาวคล่ืน 540 nm เทียบกับกลุ่มควบคุม 13 0จ 10. การวิเคราะหข์ อ้ มูล วเิ คราะห์ความแตกต่างการเจริญของเซลล์ในอาหารเล้ียงเซลล์ในสภาวะควบคุมคือ ในอาหาร ชนดิ DMEM และในอาหารเลย้ี งเซลล์ทมี่ สี ารสกัด ดว้ ยโปรแกรม SPSS สถานทีท่ าการทดลอง/เกบ็ ข้อมูล ห้องปฏิบัติการสาขาวิทยาศาสตร์ ศูนย์ปฏิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพ คณะวิทยาศาสตร์และ เทคโนโลยีการเกษตร มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลล้านนา น่าน อ. เมือง จ. น่าน ห้องปฏิบัติการ ชวี เคมีและโภชนาการ คณะวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ มหาวทิ ยาลัยพะเยา

บทที่ 4 ผลการวจิ ัยและวิจารณ์ จากการศึกษาข้อมูลผลการสารวจรวบรวบผักพื้นบ้านในอาเภอเฉลิมพระเกียรติ จังหวัดน่าน จานวน 50 ชนิด นามาทดสอบฤทธ์ิต้านอนุมูลอิสระท้ัง 3 วิธีได้แก่ DPPH assay, ABTS assay และ FRAP assay พบผักพนื้ บ้านทีม่ ีฤทธ์ติ ้านอนุมลู อสิ ระมากที่สดุ จานวน 15 ชนิด ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระจาก วิธี DPPH พบ ผักกาดช้าง บะงัว(ลั๊วะ) ใบหม่อน สะค้าน ใบบัวบก ผักบุ้งส้ม และผักเสี้ยว มีค่า IC50 เท่ากับ 26.22 ± 0.022, 32.80 ± 0.006, 41.08 ± 0.021, 47.62 ± 0.012, 49.61 ± 0.006, 56.65 ± 0.006 และ 58.11 ± 0.022 µg/ml ตามลาดับ วิธี ABTS พบ สารสกัดจากผักพ้ืนบ้านบางชนดิ มีค่า IC50 เท่ากับ 1746.67 ± 0.004, 140.64 ± 0.004, 401.70 ± 0.017, 148.33 ± 0.005, 1174.95 ± 00.084 , 856.67 ± 0.008 และ 412.97 ± 0.012µg/ml ตามลาดับ วิธี FRAP พบ ค่า FRAP value เท่ากับ 336.61 ± 0.061, 672.40 ± 0.012, 680.28 ± 0.024, 1699.09 ± 0.015, 443.27 ± 0.029, 453.52 ± 0.156 และ 235.92 ± 0.085µmole/ g Extract ตามลาดบั ดังนั้นผักสมุนไพรพื้นบ้านท่ที าการคดั เลอื กนามาทดสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ จานวน 15 ชนิด มาทดสอบฤทธ์ิต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH ABTS และ FRAP assay พบว่าผักพ้ืนบ้านจานวน 7 ชนิด มีฤทธ์ิต้านอนุมูลอิสระที่ดี ได้แก่ ผักกาดช้าง บะงัว (ลั๊วะ) ใบหม่อน สะค้าน ใบบัวบก ผักบุ้งส้ม และผกั เส้ียว ตามลาดบั แสดงดังตารางที่ 1 ตาราง 1 ผลการทดสอบฤทธิต์ า้ นอนมุ ูลอสิ ระของสารสกดั ผกั พื้นบ้าน วิธีทดสอบฤทธต์ิ า้ นอนมุ ูลอิสระ สารสกดั ผกั พื้นบา้ น % Yield DPPH assay ABTS assay FRAP assay ผักกาดช้าง 3.00 IC50 (ug/ml) IC50 (ug/ml) µmole/ g Extract 26.22 ± 0.022 1746.67 ± 0.004 336.61 ± 0.061 บะงวั (ล๊วั ะ) 3.70 32.80 ± 0.006 140.64 ± 0.004 672.40 ± 0.012 ใบหม่อน 1.80 41.08 ± 0.021 401.70 ± 0.017 680.28 ± 0.024 สะคา้ น 0.75 47.62 ± 0.012 148.33 ± 0.005 1699.09 ± 0.015 ใบบัวบก 3.15 49.61 ± 0.006 1174.95 ± 00.084 443.27 ± 0.029 ผกั บงุ้ ส้ม 6.95 56.65 ± 0.006 856.67 ± 0.008 453.52 ± 0.156 ผักเส้ยี ว 0.21 58.11 ± 0.022 412.97 ± 0.012 235.92 ± 0.085 ผักกดู หว้ ย 1.60 62.42 ± 0.026 309.06 ± 0.016 989.79 ± 0.008 ผกั หนัง 0.28 95.68 ± 0.002 395.95 ± 0.022 848.70 ± 0.021 ผกั หนาม 0.49 130.40 ± 0.020 57.33 ± 0.007 1987.34 ± 0.019

15 0จ ตาราง 1 ผลการทดสอบฤทธ์ติ ้านอนมุ ูลอิสระของสารสกดั ผักพื้นบ้าน (ต่อ) มะเดอ่ื ป่า 5.10 131.67 ± 0.016 453.33 ± 0.006 376.17 ± 0.020 829.49 ± 0.007 บะพอด (ลว๊ั ะ) 0.36 135.90 ± 0.016 405.80 ± 0.051 221.27 ± 0.017 1230.95 ± 0.020 ผักมว้ น 1.55 147.69 ± 0.066 233.33 ± 0.037 2628.87 ± 0.009 ผักกูดบก 1.85 267.15 ± 0.016 33.14 ± 0.002 หวายขม 1.03 288.32 ± 0.026 105.60 ± 0.026 องคป์ ระกอบทางเคมเี บือ้ งตน้ กลุม่ สารสาคญั บางชนิด ไดแ้ ก่ อัลคาลอยด์ ฟลาโวนอยด์ และแทนนนิ ในสารสกัดจากผกั พืน้ บา้ นบาง ชนดิ แสดงดังตาราง 2 ตาราง 2 ผลการทดสอบองคป์ ระกอบทางเคมเี บอ้ื งตน้ ของสารสกดั พ้นื บ้าน สารสกัดผกั พื้นบ้าน Alkaloids Flavonoids Tannin ผักกาดชา้ ง + +++ + บะงวั (ล๊วั ะ) + ++ + สะค้าน ++ ++ + ใบหม่อน ++ ++ ++ ใบบัวบก - ++ - ผกั บุ้งสม้ + ++ + ผกั เสี้ยว - + +

16 ผลการทดสอบฤทธ์ิยับย้ังการทางานของเอนไซม์ไทโรซิเนสของสารสกัดผกั พน้ื บา้ น สารสกัดผักพ้ืนบ้าน 7 ชนดิ นามาทดสอบฤทธิ์ในการยับยั้งการทางานของเอนไซม์ไทโรซิเนสที่ ความเข้มขน้ 1,000 ไมโครกรมั /มิลลิลติ ร โดยใช้ L-DOPA เปน็ สารตั้งต้น แสดงดงั ตาราง 3 ตาราง 3 ผลการยบั ยั้งการทางานของเอนไซมไ์ ทโรซเิ นสของสารสกัดพน้ื บ้านท่ีความเขม้ ข้น 1000 ug/ml สารสกัดผักพน้ื บ้าน % Tyrosinase Inhibition ผักกาดช้าง 8.24 ± 0.02 บะงัว(ล๊ัวะ) 12.3 ± 0.04 สะค้าน 21.08 ± 0.03 ใบหมอ่ น 67.43 ± 0.01 ใบบัวบก 26.47 ± 0.03 ผกั บุ้งสม้ 15.68 ± 0.03 ผักเสย้ี ว 13.20 ± 0.02 ผลการทดสอบความเป็นพิษของสารสกดั ผกั พื้นบา้ นต่อเซลล์เพาะเลีย้ ง C32TG เซลลเ์ พาะเล้ียง C32TG ถกู นามาทดสอบความเป็นพิษโดยวิธี MTT ซึง่ ทาการเล้ียงเซลล์ ร่วมกับสารสกัดหยาบจากผักพื้นบ้านที่ความเข้มข้น 25, 50, 100, 200, 400 และ 800 g/ml เป็นเวลา 24 ช่ัวโมง ผลการทดลองพบว่าสารสกัดจากผักพื้นบ้านทุกความเข้มข้นไม่มีผลทาให้ อัตราการรอดชีวิตของเซลล์ลดลงดังน้ันจึงสรุปได้ว่า สารสกัดจากผักพื้นบ้านไม่มีความเป็นพิษ ต่อเซลลเ์ พาะเล้ยี ง

บทที่ 5 สรปุ ผลการวิจยั จากการสารวจรวบรวบผกั พ้ืนบ้านจานวน 50 ชนดิ นามาทดสอบฤทธ์ิต้านอนุมูลอิสระท้ัง 3 วิธี ได้แก่ DPPH assay, ABTS assay และ FRAP assay พบผักพื้นบ้านที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระมากท่ีสุด จานวน 15 ชนิด ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระจากวธิ ี DPPH พบ ผักกาดช้าง บะงัว(ล๊ัวะ) ใบหม่อน สะค้าน ใบ บัวบก ผักบุ้งส้ม และผักเส้ียว มีค่า IC50 เท่ากับ 26.22 ± 0.022, 32.80 ± 0.006, 41.08 ± 0.021, 47.62 ± 0.012, 49.61 ± 0.006, 56.65 ± 0.006 และ 58.11 ± 0.022 µg/ml ตามลาดับ วธิ ี ABTS พบ สารสกัดจากผกั พ้ืนบ้านบางชนิด มีค่า IC50 เท่ากับ 1746.67 ± 0.004, 140.64 ± 0.004, 401.70 ± 0.017, 148.33 ± 0.005, 1174.95 ± 00.084 , 856.67 ± 0.008 และ 412.97 ± 0.012µg/ml ตามลาดับ วิธี FRAP พบ ค่า FRAP value เท่ากับ 336.61 ± 0.061, 672.40 ± 0.012, 680.28 ± 0.024, 1699.09 ± 0.015, 443.27 ± 0.029, 453.52 ± 0.156 และ 235.92 ± 0.085µmole/ g Extract ตามลาดับ ดังน้ันผักพ้ืนบ้านท่ที าการคัดเลือก จานวน 15 ชนดิ นามาทดสอบหาความสามารถ ในการต้านอนุมูลอิสระ ผักสมุนไพรพื้นบ้านท่ีมีฤทธ์ิต้านอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH ABTS และ FRAP assay จานวน 7 ชนิดทม่ี ีฤทธติ์ ้านอนุมูลอสิ ระที่ดี ไดแ้ ก่ ผักกาดช้าง บะงัวะ(ลัวะ) ใบหม่อน สะค้าน ใบ บัวบก ผักบุ้งส้ม และผักเสี้ยวนามาทดสอบหาองค์ประกอบทางเคมีเบื้องต้น ได้แก่อัลคาลอยด์ ฟลาโวนอยด์ และแทนนิน พบว่าผักพ้ืนบ้านแต่ละชนิดพบสารอัลคาลอยด์ ฟลาโวนอยด์ และแทนนิน เปน็ องคป์ ระกอบ ผลการทดสอบฤทธิ์ยังย้ังเอนไซม์ไทโรซิเนสพบว่า สารสกัดหยาบจากใบหม่อน มีร้อยละการ ยับยั้งการทางานของเอนไซม์ไทโรซิเนส เท่ากับ 67.43 ± 0.01 รองลงมาได้แก่สารสกัดจากใบบัวบก เทา่ กบั 26.47 ± 0.03 การทดสอบความเป็นพิษของสารสกดั ผกั พื้นบา้ นทง้ั 7 ชนดิ ทค่ี วามเขม้ ข้นต่างๆ (25, 50, 100, 200, 400 และ 800 ug/m/) เปน็ เวลา 24 ช่ัวโมง พบว่าสารสกดั ผักพื้นบ้านทุกชนิด ทุก ความเขม้ ขน้ ไมม่ ีผลทาใหอ้ ัตราการรอดชีวติ ของเซลลล์ ดลงจงึ สรปุ ได้ว่าสารสกัดจากผักพื้นบา้ นไม่มีความ เปน็ พษิ ต่อเซลล์เพาะเล้ยี ง

เอกสารอา้ งองิ เบญจมาส และคณะ. 2555. โครงการสนับสนุนทางเลอื กการพฒั นาเพื่อบรรลุเป้าหมายสงั คมอยเู่ ยน็ เปน็ สุข จงั หวัดน่าน. ณัฐ อาจสมิติ. 2548. คุณค่าทางโภชนาการของผักพ้ืนบ้านในประเทศไทย. กลุ่มงานพัฒนาวิชาการ แพทยแ์ ผน ไทยและสมนุ ไพร สถาบนั การแพทย์แผนไทย. พเยาว์ เหมอื นวงศ์ญาติ. 2526. ค่มู ือการใช้สมนุ ไพรสานกั พิมพ์เมดิคัลมีเดยี บรษิ ทั เมดิคลั มเี ดยี . สานักการแพทย์พ้ืนบ้านไทย กรมพัฒนาการแพทย์แผนไทยและการแพทย์ทางเลือก. 2554. สมุนไพรพ้ืนบ้านลดความเสี่ยงโรคเบาหวานตามภูมิปัญญาของหมอพื้นบ้าน. โรงพิมพ์องค์การ สงเคราะหท์ หารผ่านศกึ . กรุงเทพฯ พรี ศักด์ิ และคณะ. 2546. ทรัพยากรพืชในภูมิภาคเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ 12 (1) พืชสมุนไพรและพืช พิษ : สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย. พิมพ์คร้ังท่ี 1. สถาบันวิจัย วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย. กรุงเทพฯ ตรีเพชร กาญจนภมู ิ . 2552. เคมีของสมนุ ไพร : การหาโครงสร้างเคมขี องสารแอโรแมตกิ ไกลโคไซด์ ดว้ ยนิวเคลยี ร์แมกเนตกิ เรโซแนนซส์ เปกโทรสโกปี. ศนู ยห์ นังสอื แหง่ จฬุ าลงกรณ์มหาวิทยาลยั . กรงุ เทพฯ ประสงค์ เหลี่ยมโสภณ และพรรณพร กลุ มา. 2555. ความหลากหลายพชื พ้ืนบ้านท่มี ีจาหน่ายในจงั หวัด นา่ นและศักยภาพการใชป้ ระโยชน.์ มหาวทิ ยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลล้านนา นา่ น. นวลศรี รักอริยธรรม และ อญั ชนา เจนวิถีสุข. 2545. แอนตอิ อกซแิ ดนท์: สารต้านมะเร็งในผกั สมุนไพร ไทย. กรุงเทพฯ: นพบุรีการพมิ พ.์ โอภา วัชระคุปต์. 2549. สารต้านอนุมลู อสิ ระ (Radical Scavenging Agents). พิมพ์คร้งั ที่ 1. นนทบุรี : พ.ี เอส. พริ้นท์. ไมตรี สุทธจิตต์. 2555. ความรู้พ้ืนฐานของออกซิเดชัน หน้า 1-14 ในวรพล เองวานิช (บรรณาธิการ) อนุมูลอิสระและสารต้านอนุมูลอิสระ. คณะวิทยาศาสตร์การแพทย์ มหาวิทยาลัยพะเยา. สานกั พิมพ์นวตั กรรมสุขภาพ, เชยี งใหม.่ เจนจิรา จิรัมย์ และประสงค์ สีหานาม. 2554. อนุมูลอิสระและสารต้านอนุมูลอิสระ : แหล่งที่มาและ กลไกการเกดิ ปฏิกิริยา. วารสารวิชาการ มหาวทิ ยาลัยราชภฎั กาฬสินธุ์ 1(1): 59-70. Akula, Uma Sankar and Bharti Odhav. 2008. “In vitro 5-Lipoxygenase inhibition of polyphenolic antioxidant from undomesticated plants of South Africa,”.Journal of Medicine Plants Research. 2(9): 207-212. รัชฏาพร อุ่นวิไล และคณะ. 2554. ฤทธิ์ทางชีวภาพและคุณสมบัติเชิงหน้าที่ของสารสกัดย่านาง เครือ หมาน้อย และรางจืด. สาขาวิชาการอาหาร สานักวิชาเทคโนโลยีการเกษตร มหาวิทยาลัย เทคโนโลยสี ุรนารี. Pitchaon Maisuthisakul, Sirikarn Pasak and Pitiporn Ritthiruangdej. 2008. Relationship between antioxidant properties and chemical composition of some Thai plants. J FOOD COMPOS ANAL 21(3): 229-240.

19 0จ Cornish, M.L. and Garbary, D.J. 2010. Antioxidants from macroalgae: potential applications in human health and nutrition. Algae 25(4): 000-000 DOI: 10.4490/algae.2010.25.4.000 อรสรุ ินทร์ ฮวบบางยาง, มัณฑนา บัวหนอง, เฉลมิ ชัย วงษอ์ ารี, ชัยรตั น์ เตชวุฒิพร และ วาริช ศรี ละออง. 2553. การ ศึกษาคุณค่าทางอาหารและความสามารถในการ ต้านอนมุ ูลอสิ ระใน ดอกไม้ทร่ี ับประทานได.้ วารสาร วิทยาศาสตรเ์ กษตร 41(พเิ ศษ):381-384. ประนอม สุขเก้อื , 2557. ฤทธิ์ต้านอนมุ ูลอิสระ ฤทธ์ิยบั ย้งั การทางานของเอนไซมไ์ ทโรซเิ นส และปรมิ าณ สารประกอบฟนี อลิกทัง้ หมดของสารสกดั จากพืชทอ้ งถน่ิ (โสน, Sesbania javiaca Mig.) Wang, K.H., Lin, R.D., Hsud, F.L., Huange, Y.H., Changf, H.C., Huangd, C.Y., and Lee, M.H., 2006, “Cosmetic applications of selected traditional Chinese herbal medicines”, Journal of Ethnopharmacology, Vol.106, No. 3, pp. 353-359 Tengchaisri T., Chawengkirttikul R., Rachaphaew N., Reutrakul V., Sahgsuwan R., Sirisinha S.(1998). Antitumor activity of triptolide against cholangiocarcinoma growth in vitro and in hamster. Cancer Lett, 133, 169-175. Chan, et all. 2009. Effects of Different Drying Methods on the Antioxidant Properties of Leaves and Tea of Ginger Species. Journal of Food Chemistry113: 166-172. Nabavi SM, Ebrahimzadeh MA, Nabavi SF, Hamidinia A, Bekhradnia AR. 2008. Determination of antioxidant activity phenol and flavonoids content of Parrotia persica Mey. Pharmacology Online. Yen, G. and Wu, J. 1999. Antioxidant and radical scavenging properties of extract from Gonodermatsugae. Food Chem. 65: 375-379.

20 0จ ภาคผนวก

ภาคผนวก ก วิธีการเตรยี มสารเคมที ีใ่ ชใ้ นการวเิ คราะห์ วิธกี ารเตรียมสารเคมีที่ใช้ในการวิเคราะห์ 1) วิธกี ารเตรยี มสารละลาย 10 % Folin-ciocalteu สารละลาย Folin-ciocalteu 10 มิลลลิ ิตร จากนั้นนาไปปรับปรมิ าตรด้วยน้ากล่ัน โดยใชข้ วด วัดปรมิ าตรขนาด 100 มิลลิลิตร 2) วิธีการเตรียมสารละลาย 7 % โซเดียมไบคาร์บอเนต (sodium bicarbonate) Na2CO3 ช่ังสารละลาย โซเดียมไบคาร์บอเนต (sodium bicarbonate) 7 กรัม ใส่บีกเกอร์ละลายด้วย นา้ กลนั่ จากนน้ั นาไปปรบั ปริมาตร จนครบ 100 มลิ ลลิ ิตร 3) วธิ กี ารเตรยี มสารมาตรฐาน กรดแกลลกิ (Gallic acid) ชงั่ สารกรดแกลลิค 50 มิลลิกรัม ใส่บกี เกอร์ ละลายด้วย เอทานอล จากน้ันนาไปปรบั ปรมิ าตร โดยใชข้ วดวัดปรมิ าตรขนาด 100 มลิ ลิลิตร จะได้ stock solution 500 ไมโครกรมั /มิลลลิ ติ ร 4) การเตรียมสารละลายมาตรฐาน 0.2 mM DPPH ชั่ง DPPH 0.0197 กรัม ละลายใน เอทานอล ปรับปริมาตรจนครบ 50 มิลลิลิตร ปิเปตต์ ปรมิ าตร 3 มิลลลิ ติ ร ปรับปริมาตรโดยเอทานอล จนครบ 100 มลิ ลิลิตร 5) การเตรียมสารละลายมาตรฐาน BHT ชั่ง BHT มา 10 ไมโครกรัม ละลายด้วยเอทานอล ปรับปริมาตร ด้วยเอทานอล จนครบ 100 มิลลิลิตร 6) วิธกี ารเตรียมสารละลาย FRAP ชั่ง Ferric chloride 0.27 กรัม ละลายในน้า DI 50 มิลลิลิตร TPTZ 0.1560 กรัมละลายใน HCl 50 มิลลลิ ติ ร 7) การเตรยี ม 20 mM Ferric chloride สารละลายมาตรฐาน 2 มิลลิโมลาร์ เฟอรัสซัลเฟต ชั่ง Ferric chloride มา 0.278 กรัม ละลายด้วยน้า DI ปรัปปริมาตรให้ครบ 50 มลิ ลิลติ ร 8) การเตรียมสารละลาย 10 มิลลิโมลาร์ TPTZ ชั่ง TPTZ มา 0.1560 กรัม ละลายใน 40 มิลลิโมลาร์ HCl ปรัปปริมาตรในน้ากลั่น 50 มิลลิลิตร จากน้ันนา ferric และ TPTZ 50 มิลลิลิตร ที่เตรียมไว้ มารวมกัน และเติม acetate buffer PH 3.6 จานวน 500 มลิ ลลิ ติ ร

22 หอ้ งปฏิบตั กิ ารเล้ยี งเซลล์

23 อปุ กรณ์เคร่อื งมือสาหรับการเพาะเล้ยี งเซลลเ์ มลาโนมา C32TG

24 การทดสอบความเปน็ พษิ ของสารสกดั ตอ่ เซลลเ์ พาะเล้ยี ง C32TG โดยวิธี MTT