บทปฏิบัติการที่ 3 จุลชีววิทยา

บทปฏิบตั ิการท่ี 3 การตรวจนับจานวนจลุ นิ ทรยี ์ในตัวอย่างโดยการเลย้ี งเช้ือบนอาหาร บทนา ในการศึกษาวิชาจุลชีววิทยานั้น มักจาเป็นต้องทาการตรวจนับจานวนจุลินทรีย์ เพ่ือจะได้ทราบถึง ปริมาณจุลินทรีย์ท่ีมีในตัวอย่าง ซ่ึงจะเป็นข้อมูลสาหรับใช้ประกอบการศึกษา การนับจานวนจุลินทรีย์ใน ตัวอย่างอาจนับได้โดยตรงจากกล้องจุลทรรศน์ (direct count หรือ microscopic count) วิธีน้ีจะสะดวก รวดเร็ว ไมส่ นิ้ เปลอื งคา่ ใชจ้ า่ ยเหมอื นวิธกี ารตรวจนับเชือ้ บนจานอาหารแต่วธิ นี ้ีมีขอ้ เสีย คือจะตรวจนับปริมาณ เชื้อได้มากเกินความเป็นจริง เน่ืองจากเป็นการตรวจนับเช้ือตายรวมกับเชื้อที่ยังมีชีวิตอยู่ ซึ่งวิธีนี้จะไม่ทราบ ว่าปริมาณเช้ือท่ียังมีชีวิตอยู่มีเท่าใด การตรวจนับเชื้อบนจานอาหารแข็ง มีท้ังข้อดีและข้อเสียเช่นเดียวกัน ข้อดีของวิธีนี้ คือทราบปริมาณเช้ือที่ยังมีชีวิตอยู่จริง ส่วนข้อเสีย คือเสียเวลาในการเตรียมอาหาร เครื่องแก้ว สิ้นเปลืองค่าใช้จ่าย และถ้าใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่เหมาะสมต่อชนิดของเชื้อท่ีมีในตัวอย่าง ก็อาจจะตรวจไม่ พบการเติบโตของเชอ้ื ท่ีมีอยูไ่ ด้ ด้งั น้นั วิธนี จ้ี ึงควรเลือกใชอ้ าหารท่มี สี ารอาหารท่ีอดุ มสมบูรณ์ โดยท่ัวไปจะนิยม ใช้อาหาร Standard Plate Count Agar ในการตรวจนับจุลินทรีย์ทั้งหมด ซึ่งควรเป็นเช้ือในกลุ่ เคโมเฮท เทอร์โรโทรฟ (chemoheterotroph) ท่ีต้องการธาตุคาร์บอนแหล่งอาหารสารอินทรีย์ และใช้สารเคมีเป็น แหล่งพลังงาน แต่อย่างไรก็ตามถ้าต้องการตรวจนับเช้ือจุลินทรีย์ที่อยู่ในดิน ควรเลือกใช้สูตรอาหารให้ เหมาะสมกับความต้องการของเช้ือท่ีจะตรวจด้วย เน่ืองจากจุลินทรีย์ในดินมีหลายชนิด บางชนิดเป็นพวกเค โมออโตโทรฟ (chemoautotroph) ซ่ึงต้องการอาหารจาพวก chemically define medium ในการ เติบโต ซ่ึงเปน็ อาหารทีป่ ระกอบด้วยสารเคมีต่าง ๆ ทที่ ราบองค์ประกอบทางเคมีแล้ว อย่างไรก็ตามมีผู้กล่าวว่า การใช้วิธีการน้ีตรวจนับเช้ือในสภาพแวดล้อมเช่น ในดิน น้า จะตรวจพบเช้ือเพียง 10 เปอร์เซ็นต์ จากท่ีมีอยู่ จริง วิธีการน้ีจึงควรใช้ในการตรวจนับจุลินทรีย์ในอาหารมากกว่า เน่ืองจากเชื้อที่อยู่ในอาหารมีชนิดและ ปรมิ าณนอ้ ยกว่าในธรรมชาติดังกล่าว การตรวจนับจุลินทรีย์โดยการเล้ียงเช้ือบนจานอาหารแข็ง นอกเหนือจากการเตรียมอาหารและ สารละลายสาหรับเจือจางตัวอย่างแล้ว จะต้องเตรียมเคร่ืองแก้วต่าง ๆ ท่ีจะต้องใช้ในการศึกษาได้แก่ ปิเปต และจานอาหารที่ผ่านการอบฆ่าเชื้อแล้ว รวมท้ังจะต้องทราบเทคนิควิธีการเจือจางลงตามลาดับ (serial dilution) เช่นเดยี วกับการปฏิบตั ิการโดยใช้เทคนิควิธกี ารปราศจากเช้อื (aseptic tectnique) วตั ถุประสงค์ 1. เพอื่ ฝกึ ใหน้ ักศกึ ษาสามารถปฏิบตั กิ ารนบั เช้อื จลุ นิ ทรียโ์ ดยใช้เทคนิค spread plate 2. เพอ่ื ฝึกนกั ศกึ ษาให้มคี วามชานาญและเห็นความสาคัญของเทคนิคปราศจากเชื้อ

2 วัสดอุ ุปกรณ์ 1. จานเลีย้ งเชอื้ และไมโครปิเปต 2. อาหารเลยี้ งเช้อื NA และ TCBS agar 3. อาหารเล้ียงเช้อื NA slant 4. ตัวอยา่ งสัตวน์ า้ และตวั อย่างนา้ 5. แท่งแก้วเกลยี่ เชือ้ 6. ตะเกยี งแอลกอฮอล์ 7. ดนิ สอหรอื ปากกาเคมี 8. สาลี วธิ ีการปฏิบตั ิ ทาการเจือจางตัวอย่าง และกระจายตัวอย่างอย่างสม่าเสมอในสารละลาย ในที่นี้คือ น้ากลั่นหรือน้าเกลือ เขม้ ข้น 0.85 เปอรเ์ ซน็ ต์ หรือท่ีเรยี กว่า “นอร์มอลซาลนี (normal saline)” 1. นาสารละลายของตัวอย่างที่ผ่านการเจือจางแล้ว มาเพาะเลี้ยงบนจานอาหารเล้ียงเชื้อท่ี เหมาะสม 2. บม่ เพาะเช้อื ในสภาพท่ีเหมาะสมต่อการเติบโตของเชื้อเป็นเวลา 24–48 ชวั่ โมง 3. นับจานวนโคโลนีเฉลี่ยต่อจาน เพื่อนามาคานวณปริมาณจุลินทรีย์ที่มีอยู่ในตัวอย่าง 1 กรัม หรือ 1 มิลลลิ ติ ร โดยถือว่า 1 โคโลนี เตบิ โตมาจาก 1 เซลล์ (Colony Forming Unit : CFU) วธิ ีการเจือจางลงตามลาดับ การเจอื จางลงตามลาดับมวี ิธีการดงั รปู ที่ 18 ดงั นี้ 1. ชัง่ ตัวอยา่ งอาหาร (ท่เี ป็นของแข็ง) หนัก 25 กรมั ใสใ่ นบกี เกอร์หรือถ้าเป็นของเหลวให้ใช้ปิเปตดูด ตัวอย่างปริมาตร 25 มิลลิลิตรใส่ในน้าเกลือ 0.85 เปอร์เซ็นต์ ปริมาตร 225 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันจะได้ ความเข้มข้นเป็น 1/10 หรือ 10-1 เท่าหรืออาจใช้ตัวอย่างหนัก 11 กรัม (ของแข็ง) หรือ 11 มิลลิลิตร

3 (ของเหลว) ใส่ในน้ากลั่นหรือน้าเกลือ ปริมาตร 99 มิลลิลิตร ผสมให้เข้ากันจะได้ความเข้มข้นเป็น 1/10 หรือ 10-1 เท่า 2. ใช้ปิเปตดูดสารละลายตัวอย่างในข้อ 1 ซึ่งมีความเข้มข้น 10-1 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใส่ในน้ากล่ัน หรอื นา้ เกลอื ปรมิ าตร 9 มลิ ลิลติ ร จะไดค้ วามเข้มขน้ 10-2 3. ใช้ปิเปตดูดสารละลายตัวอย่างในข้อ 2 ซึ่งมีความเข้มข้น 10-2 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใส่ในน้ากล่ัน หรอื น้าเกลือปรมิ าตร 9 มลิ ลลิ ิตร จะไดค้ วามเข้มข้น 10-3 4. ใช้ปิเปตดูดสารละลายตัวอย่างในข้อ 3 ซึ่งมีความเข้มข้น 10-3 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร ใส่ในน้ากล่ัน หรือน้าเกลือปริมาตร 9 มลิ ลลิ ิตร จะไดค้ วามเข้มขน้ 10-4 5.ถ้าตอ้ งการเจือจางตวั อย่างลงไปอกี ใหด้ าเนนิ การโดยใช้วิธีการที่ผ่านมาจนได้ระดับความเข้มข้นหรือ ความเจอื จางทตี่ อ้ งการ การบนั ทึกผล ตรวจผลหลังจากการบ่มเช้ือ ไว้ 24-48 ชั่วโมง จนเห็นโคโลนีของเช้ือ และนับจานวนโคโลนีจุลินทรีย์ ในตัวอยา่ งโดยการเลีย้ งเชื้อบนอาหาร รายงานผลบทปฏบิ ตั กิ ารที่ 3 เรอ่ื ง การตรวจนบั จานวนจุลินทรยี ใ์ นตัวอย่างโดยการเล้ียงเชอื้ บนอาหาร ชื่อ-สกลุ ……………………………………………………ชัน้ …………..เลขท่ี…………… ใหน้ กั ศึกษานบั จานวนและสังเกตสีโคโลนขี องเชอ้ื ในตัวอย่างโดยการเล้ยี งเชอ้ื บนอาหาร จานวนเชือ้ โคโลนสี ีเหลือง โคโลนีสเี ขยี ว คา่ เฉล่ีย จานท1่ี จานท่ี 2 จานท่ี 3