กลุ่ม 2 PPT การแพ้คอลลาเจนจากปล วรวิทย์ เครือคำ 6110202185

การแพ้ collagen จากปลา : ความเสถียรตอ่ อณุ หภูมิของ collagen และ IgE reactivity จากเซรมั ของผ้ปู ว่ ยกบั สารสกดั จากกระดูกอ่อนปลา 11ชนิด

สมาชิก 6110200271 6110202061 นาวสาวกมลลักษณ์ มีคาแสน 6110202185 นางสาวพชั รพร ผาดจันทึก 6110202291 นายวรวิทย์ เครือคา นายศุภสชิ ฌ์ เธยี รพรานนท์

ท่ีมา - คอลลาเจนถกู ระบวุ ่าเปน็ สารกอ่ ภูมิแพต้ วั ทส่ี องทมี่ ีความสาคัญท่ีพบได้ในสตั วน์ า้ แตอ่ ย่างไรกต็ ามคุณสมบัติของสารก่อ ภูมิแพย้ งั คงไม่ปรากฏ และมีลกั ษณะการแพเ้ หมอื นกบั โปรตีน - Parvalbumin เป็นสารกอ่ ภมู แิ พ้จากปลาทส่ี าคญั ทาใหเ้ กดิ ปฏิกริ ิยาใน IgE ถึง 67% - 100% ของผ้ปู ว่ ยที่แพ้ปลา - Parvalbumin ไดร้ บั รายงานวา่ มคี วามเสถยี รต่อความร้อนและจะแตกต่างกนั ไปขึ้นกับชนดิ ของปลา - วิเคราะหด์ ว้ ยเทคนคิ SDS-PAGE, IgE-ELISA, และ SPTs - วัตถุประสงค์ : เพ่อื ตรวจสอบความสามารถในการทนอุณหภูมขิ องสารก่อภมู แิ พ้ของคอลลาเจนจากปลา ที่มา : https://www.yourgenome.org/ ที่มา : https://www.labmanager.com/ ท่มี า : https://www.ankitparakh.com/

สง่ิ ทค่ี วรรู้ !! - คอลลาเจน type I พบบรเิ วณหนงั เอ็น และกระดกู ส่วนของกรดอะมโิ นไมบ่ ดิ เปน็ เกลยี วสั้นทป่ี ระกอบดว้ ยไท โรซนี และฮิสตดิ นี - Parvalbumin เป็นโปรตนี ทาหนา้ ที่จบั กบั แคลเซยี มที่ อยู่ภายใน cytoplasm ทาใหเ้ กิดการคลายตัวของเซลล์ กล้ามเนอ้ื ลาย - การแพ้เกดิ จากระบบภูมิคุ้มกันปลอ่ ยสารทเ่ี รยี กวา่ อิมมู โนโกลบูลนิ อี (IgE) ซง่ึ เป็นสาเหตใุ หเ้ ซลลเ์ ม็ดเลือดอนื่ ๆ แตกตวั และปลอ่ ย histamine ออกมาในกระแสเลอื ด ท่มี า : https://www.nature.com/

เทคนคิ SDS-PAGE, IgE-ELISA, และ SPTs SDS-PAGE ELISA Skin Prick Test (SPTs) - เปน็ เทคนคิ การแยกสารทม่ี ปี ระจุ - หลกั การทดสอบของงาน ELISA มี - เป็นการทดสอบเพอื่ ใชใ้ นการ โดยใช้สนามไฟฟ้า โดยอาศัยความ 5 รูปแบบได้แก่ วนิ จิ ฉยั โรคภมู แิ พ้ แตกต่างของประจสุ ุทธิ ขนาดและ 1. Direct method รปู รา่ งของโมเลกุลบนตัวกลางภายใต้ 2. Indirect method - การตรวจหาปฏิกิริยาของร่างกายที่ สนามไฟฟ้าภายในเซลล์ 3. Competitive binding ตอบสนองต่อสารก่อภูมแิ พผ้ า่ นการ method สะกิดบรเิ วณผวิ หนัง เพื่อตรวจหาวา่ - มีการใช้สารชกั ฟอก (detergent) 4. Immunochromatography ผ้ปู ว่ ยแพส้ ารกอ่ ภูมิแพ้ชนิดใดบา้ ง ซึ่งมชี อ่ื วา่ โซเดยี มโคดีซิคชลั เฟต 5. Immunoblot (Western Blot) (sodium dodecyl sulfate; SDS) - ใช้ประกอบการพจิ ารณาสาหรับ ใสใ่ นระบบบฟั เฟอร์ การรักษาด้วยวัคซีนภมู แิ พ้ (Immunotherapy)

lgE-ELISA 2. Indirect method หลักการทดสอบของงาน ELISA ท่ีมา : https://www.creative-diagnostics.com/ 1.Direct method ที่มา : https://www.creative-diagnostics.com/

lgE-ELISA 4. Immunochromatography หลกั การทดสอบของงาน ELISA 3. Competitive binding method ท่ีมา : https://ruo.mbl.co.jp/

lgE-ELISA หลักการทดสอบของงาน ELISA 5. Immunoblot (Western Blot) - เปน็ เทคนิคที่ใชต้ ิดตามโปรตนี ทีส่ นใจในสารตวั อยา่ ง หรอื ใชด้ กู ารแสดงออกในระดบั โปรตนี โดยใช้ หลักการของ gel electrophoresis เขา้ มารว่ มด้วย ที่มา : https://www.labmanager.com/

การวิเคราะหด์ ว้ ย SDS-PAGE, IgE-ELISA และ SPTs ในการวจิ ัยเราจะใช้ 3 เทคนิครว่ มกนั ดงั นี้ SDS-PAGE ELISA Skin Prick Test (SPTs) - ใช้หาองคป์ ระกอบของ collagen ในสาร - ใช้ดูการเกดิ ปฏิกิริยาของ IgE จากเซรัม - ดูการเกดิ การแพข้ องสารสกัดจากตัวอยา่ ง สกัดจากปลาทเ่ี ตรยี มจากปลาที่ผา่ นการให้ ของผปู้ ่วย โดยใช้สารสกดั จากปลาที่เตรยี ม ปลาที่เตรียมจากปลาที่ผ่านการให้ความ ความรอ้ นและไมผ่ ่านการให้ความร้อน โดย จากปลาทีผ่ า่ นการให้ความร้อนและไม่ผ่าน รอ้ นและไมผ่ า่ นการใหค้ วามรอ้ น ทีท่ ดสอบทอ่ี ุณหภูมิต่างกนั ในเวลาทเ่ี ท่ากนั การใหค้ วามรอ้ น โดยการทดสอบการ (collagen) โดยดูจากการเกดิ ตมุ่ ตรง และทดสอบทีอ่ ุณหภูมิ 100˚C ในเวลาที่ เกดิ ปฏกิ ริ ยิ าของ IgE จะทดสอบจากสาร บรเิ วณผวิ ท่ีมกี ารทาการทดสอบ ต่างกนั เพอื่ ดูความสามารถในการทนความ สกัดทีไ่ ดร้ บั ความรอ้ นตา่ งกนั ในเวลาเท่ากนั ร้อนขององค์ประกอบ collagen และสารสกัดท่ไี ด้รับความรอ้ นทอี่ ุณหภมู ิ 100˚C ในเวลาที่ต่างกนั เพ่ือดกู าร เกดิ ปฏิกิรยิ าของ IgE กบั Parvalbumin และ คอลลาเจน

วธิ กี ารทดลอง ตวั อยา่ งปลา : เลอื กปลามา 11 ชนดิ ที่ได้รับความนยิ มในการบริโภคกันอย่างแพร่หลายในประเทศญปี่ นุ่ การเตรียมสารสกัดจากปลา : ใหค้ วามร้อนดว้ ยเคร่อื ง ทาตัวอยา่ งใหเ้ ขา้ กนั ดว้ ย ฟอสเฟต Joule ตามตัวอยา่ งที่ต้องการ บัฟเฟอร์ และน้าเกลือ บดเน้อื ปลา สารละลายตัวอยา่ งทไ่ี ด้รับ แยกส่วนใสมาใช้ ความร้อน

วธิ กี ารทดลอง การทาคอลลาเจนให้บรสิ ทุ ธิ์ phosphate buffer phosphate buffer Acetic acid ป่นั เหวย่ี ง Dialyzed PSB NaOH หนังปลา ป่ันเหวย่ี ง ป่นั เหวยี่ ง ป่นั เหวย่ี ง Collagen PSB กับหนังปลา ล้าง ล้าง ล้าง ทาใหเ้ ป็นกลาง สารสกดั การทา Parvalbumin ใหบ้ ริสุทธ์ิ หนูโมโนโคนอล Parvalbumin ฉีดสารสกัดใสห่ นู สารสกัด

วธิ กี ารทดลอง วิธีการในงาน Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) : Poly acrylamide gel สารสกัดตวั อย่าง dithiothreitol power supply Coomassie brilliant blue solution gel เคร่ือง WSE-1100 Page Run-R ใส่สารสกดั ลง Gel ใหก้ ระแสไฟฟ้าใน ย้อมสี Gel ระบบ (แยกสาร ตวั อยา่ ง)

วธิ ีการทดลอง Poly acrylamide gel Polyvinylidene difluoride PBST membrane Western blotting : Polyvinylidene difluoride membrane เคร่ือง NA-1512s ยา้ ยโปรตนี จาก gel สู่ ล้าง membrane โดยใช้ PBST membrane ลา้ งดว้ ย PBST ลา้ งด้วย ใส่ substrate PBST ใช้ ECL Prime Kit ดกู ารเรืองแสง ใส่ secondary AB บม่ 1 ชม. ดกู ารเกดิ ปฏกิ ริ ยิ า ใส่ primary AB บม่ 2 ชม. หลงั จากนั้นใส่ H2SO4 ยบั ยั้งการเกดิ ปฏกิ ริ ยิ า ดกู ารเกิดปฏกิ ริ ยิ า

วธิ ีการทดลอง PBST ลา้ งด้วย PBST ELISA : Antigen ELISA Plate ลา้ ง Plate ด้วย PBST ใส่ primary AB บ่ม 2 ชม. ใส่ secondary AB บ่ม 1 ชม. SPT : รอผล 15 ล้างดว้ ย PBST นาที ลา้ งด้วย substrate PBST สารสกัด แทงโดย Steel lancets ใหค้ ะแนน วดั การดูดกลืนแสง ใส่ substrate Histamine และบันทกึ ผล dihydrochloride

ผลการทดลอง การวิเคราะห์ SDS-PAGE จากสารสกดั ของปลา Pacific mackerel ทง้ั ท่ไี ม่ผา่ นความรอ้ นและผา่ นความร้อน - ตรวจไม่พบแถบท่คี ลา้ ยกับคอลลาเจนในสารสกดั ทไี่ มผ่ ่านความรอ้ นและสาร สกัดที่ผ่านความร้อนทอ่ี ุณหภมู ิ 20˚C - 60˚C - ตวั อย่างที่ให้ความร้อน 80˚C - 120˚C มแี ถบทีส่ อดคล้องกับมวลโมเลกลุ ของ คอลลาเจน โดยท่ีแถบที่มีมวล 125 kDa คือ α-chain, 250 kDa คอื β-chain และ 300 - 400 kDa คือ γ-chain - ตัวอยา่ งท่ีให้ความร้อน 140˚C ตรวจจบั α-chain ไดย้ าก

ผลการทดลอง การวิเคราะห์ SDS-PAGE จากสารสกดั ของปลา Pacific mackerel ทง้ั ทีไ่ มผ่ า่ นความรอ้ นและผ่านความร้อน - ตัวอยา่ งทีใ่ ห้ความร้อน 100˚C นาน 5 – 20 นาที จะแสดงแถบการเคลอ่ื นที่ ของ α-chain, β-chain และ γ-chain ในตัวอยา่ งทไ่ี มผ่ า่ นการใหค้ วามร้อนจะ ไม่พบ - ตัวอยา่ งทใ่ี หค้ วามร้อนนาน 40 นาที พบแถบ α-chain, β-chain จะมีอยู่ใน ระดับท่ีมคี วามเข้มขน้ ตา่ และไมพ่ บแถบ γ-chain - ตวั อย่างทค่ี วามรอ้ นนาน 80 -160 นาที จะตรวจพบแคแ่ ถบ α-chain ใน ระดับที่มคี วามเขม้ ขน้ ต่า - ตัวอยา่ งท่ใี หค้ วามร้อนนาน 320 นาที จะไม่พบแถบท่สี อดคล้องกบั คอลลาเจน

ผลการทดลอง การวเิ คราะห์ SDS-PAGE และ western blotting ของสารสกัดคอลลาเจนบริสุทธ์จิ ากปลา Pacific mackerel ทีไ่ มไ่ ดผ้ า่ นความรอ้ นและท่ีผา่ นความรอ้ น - คอลลาเจนท่ผี า่ นความรอ้ นจะทารอยต้งั แต่ 40 kDa ถงึ 120 kDa และแถบ α- chain, β-chain และ γ-chain ของคอลลาเจนจะหายไป - การวเิ คราะห์ Western blotting บง่ ช้วี า่ คอลลาเจนถกู ย่อยสลายแบบสมุ่ ทช่ี ว่ ง แตย่ ังคงเกดิ IgE reaction อยู่ IgE reaction ไม่สามารถสงั เกตไดอ้ ย่างชัดเจน เนื่องจากมีรอยที่โมเลกลุ ของคอลลาเจนไม่รวมกนั เปน็ แถบ

ผลการทดลอง การวิเคราะห์ ELISA ของสารสกดั ที่ไมไ่ ด้รบั ความร้อนและสารสกดั ท่ไี ด้รบั ความรอ้ นจากเน้ือของปลา Pacific mackerel ภายใต้สภาวะความร้อนทีแ่ ตกต่างกัน - สารสกัดใหค้ วามร้อน 100˚C, 120˚C หรือ 140˚C เป็นเวลา 10 นาที และไมผ่ ่านการให้วามร้อน โดย เตรยี มจากปลาทผ่ี า่ นการให้ความร้อนแลว้ ใช้ ELISA ในการตรวจสอบโดยใชเ้ ซรัม่ ของผู้ปว่ ยตรวจ - พบปฏิกริ ยิ าต่อสารสกัดท่ีไม่ผ่านความรอ้ นในระดบั ต่าเท่านน้ั - ทีอ่ ุณหภูมิ 120˚C หรอื 140˚C พบว่ามีปฏิกิริยา IgE เทยี บเทา่ กับสารสกัดทผี่ ่านความร้อนท่อี ณุ หภมู ิ 100˚C

ผลการทดลอง การวิเคราะห์ ELISA ของสารสกดั ทไี่ ม่ไดร้ ับความรอ้ นและสารสกดั ที่ได้รบั ความร้อนจากเนื้อของปลา Pacific mackerel ภายใตส้ ภาวะความรอ้ นทแ่ี ตกต่างกัน - ใชส้ ารสกัดทเ่ี ตรยี มจากเน้อื ปลา Pacific mackerel ในความรอ้ น 100˚C เป็นเวลา 10 นาทีหรอื 320 นาที - ปฏิกิรยิ าของ IgE ตอ่ สารสกดั ท่เี ตรียมจากเนื้อปลาท่ี ผา่ นความรอ้ นเป็นเวลา 320 นาทีลดลงเลก็ นอ้ ยเมอื่ เทียบกับ 10 นาที

ผลการทดลอง วเิ คราะห์สารสกัดจากเน้อื ปลากระดูกแขง็ 6 ตัว และเนื้อปลากระดกู ออ่ น 4 ตวั ด้วยวธิ ี SDS-PAGE : - ตวั อย่างทง้ั หมดจะถกู สกัดดว้ ยความรอ้ นที่ 100 ◦C เปน็ เวลา 10 นาที พบ α - และ β -chain ของคอลลาเจน - ในปลาบางชนดิ จะไมส่ ามารถตรวจพบ γ -chain ได้ เนือ่ งจาก มปี รมิ าณความเข้มข้นของคอลลาเจนต่า - นาตัวอยา่ งปลา Pacific mackerel มาใหค้ วามรอ้ นที่ 100 ˚C เปน็ เวลา 320 นาที และนาไปตรวจด้วยวธิ ี electrophoretic ปรากฏวา่ ไม่พบ α - ,β -chain และ γ -chain ของคอลลาเจน (จากรูปหน้าท1ี่ 5-16)

ผลการทดลอง ปฏิกิรยิ า IgE ของแอนตเิ จนผปู้ ่วยท่ีมตี อ่ สารสกดั ทีเ่ ตรยี มจากเนือ้ ปลา 10 ชนดิ ท่ผี า่ นความรอ้ น : - ตัวอย่างจะถูกใหค้ วามรอ้ นเปน็ เวลา 10 หรือ 320 พบวา่ ปฏกิ ริ ิยาของ IgE ที่มตี ่อสารสกดั จากปลากระดกู แข็งมคี า่ สูง กวา่ ปฏกิ ริ ิยาของ IgE ทม่ี ตี ่อสารสกดั จากปลากระดูกออ่ น - ปฏกิ ิรยิ าของ IgE ทม่ี ตี ่อสารสกัดจากปลากระดูกแข็ง (yellowfin tuna, silver salmon, and the Japanese sardine) ยงั ไมม่ ีการเปล่ยี นแปลงอยา่ งชัดเจน - ปฏกิ ิรยิ าของ IgE ที่มีต่อสารสกัดจากปลากระดกู อ่อน (chicken grunt, red seabream, an goldeye rockfish) กลับลดลง

ผลการทดลอง ทดสอบการแพ้สารสกดั จากปลา 11 ชนดิ ดว้ ยวธิ ี SPT : - การทดสอบการแพข้ องผปู้ ่วยดว้ ยวิธี SPT คะแนนของเนื้อ ปลา Pacific mackerel (4+) ทถี่ ูกสกัดดว้ ยความร้อน จะมคี ่า สูงกว่าปลา Pacific mackerel ท่ีถูกสกัดโดยไม่ผ่านความร้อน (3+) - การแพ้สารสกดั จากปลากระดกู แข็งมีคา่ สูงกว่าปลากระดกู ออ่ น

สรปุ 1.เม่อื ให้ความร้อนนาน หรือความรอ้ นสูง มีผลตอ่ การสลายตัวของ collagen 2.ปฏิกิรยิ า IgE ของเซรมั ของผูป้ ว่ ยตอ่ collagen จากปลาในสารสกัดยังคงอยแู่ มว้ ่าเนอื้ ปลาจะได้รับความ รอ้ นสงู ก็ตาม 3.พบวา่ ปฏกิ ิริยาของ IgE ทม่ี ีตอ่ สารสกดั จากปลากระดกู แข็งมคี ่าสูงกว่าปฏิกริ ยิ าของ IgE ทมี่ ตี อ่ สารสกดั จากปลากระดกู อ่อน 4.การลดปฏิกิรยิ าของ IgE ต่อเนือ้ ปลาโดยใช้ความรอ้ นเป็นเรือ่ งยาก และจะต้องใชว้ ธิ กี ารอน่ื ๆ เพือ่ ผลิต เนื้อปลาทไ่ี ม่ก่อใหเ้ กดิ การแพ้ (hypoallergenic fish meat)

อ้างอิง ดลุ ยพร. ม.ป.ป. C‐DiGit Blot Scanner. มหาวทิ ยาลยั มหดิ ล. ท่ีมา : https://inmu2.mahidol.ac.th/ อารยี ร์ ตั น์. ม.ป.ป. Molecular genetic testing techniques-Polymerase chain reaction and electrophoresis. ภาควชิ าพยาธิวทิ ยา คณะแพทยศาสตร์ มหาวทิ ยาลยั สงขลานครินทร์. ที่มา : https://meded.psu.ac.th/ วรนิ ญา. 2558. การศกึ ษาผลของการรบั ประทานคลอลาเจนเสริมต่อความยดื หย่นุ และความชมุ่ ชื้นของผวิ . มหาวทิ ยาลัย ธุรกจิ บัณฑิตย์. ทม่ี า : http://libdoc.dpu.ac.th/ จรี าพร. 2018. วิธีการทดสอบทางอิมมโู นวทิ ยา (Immunological Methods). สาขาวิชาเทคนิคการแพทย์ สานกั วิชา สหเวชศาสตรม์ หาวทิ ยาลัยวลัยลักษณ.์ ที่มา : https://essentialoil.wu.ac.th/

Thank you