มอก 531-2558

เล่ม ๑๓๒ ตอนพิเศษ ๗๖ ง หนา้ ๓ ๓ เมษายน ๒๕๕๘ ราชกจิ จานุเบกษา ประกาศกระทรวงอุตสาหกรรม ฉบับท่ี ๔๖๗๗ (พ.ศ. ๒๕๕๘) ออกตามความในพระราชบัญญัตมิ าตรฐานผลิตภณั ฑอ์ ตุ สาหกรรม พ.ศ. ๒๕๑๑ เรือ่ ง ยกเลิกและกาํ หนดมาตรฐานผลิตภัณฑ์อตุ สาหกรรม ภาชนะพลาสตกิ สําหรับบรรจุผลติ ภณั ฑเ์ ภสัชปราศจากเช้อื โดยท่ีเป็นการสมควรปรับปรุงมาตรฐานผลิตภัณฑ์อุตสาหกรรม ภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุ ผลิตภัณฑ์เภสัชปราศจากเชอ้ื มาตรฐานเลขที่ มอก. 531 - 2546 อาศัยอํานาจตามความในมาตรา ๑๕ แห่งพระราชบัญญัติมาตรฐานผลิตภัณฑ์อุตสาหกรรม พ.ศ. ๒๕๑๑ รัฐมนตรีว่าการกระทรวงอุตสาหกรรมออกประกาศยกเลิกประกาศกระทรวงอุตสาหกรรม ฉบับที่ ๓๒๔๗ (พ.ศ. ๒๕๔๗) ออกตามความในพระราชบัญญัติมาตรฐานผลิตภัณฑ์อุตสาหกรรม พ.ศ. ๒๕๑๑ เร่ือง ยกเลิกและกําหนดมาตรฐานผลิตภัณฑ์อุตสาหกรรม ภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุ ผลิตภัณฑ์เภสัชปราศจากเช้ือ ลงวันที่ ๒ เมษายน พ.ศ. ๒๕๔๗ และออกประกาศกําหนดมาตรฐาน ผลิตภัณฑ์อุตสาหกรรม ภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุผลิตภัณฑ์เภสัชปราศจากเช้ือ มาตรฐานเลขท่ี มอก. 531 – 2558 ขึ้นใหม่ ดงั มรี ายการละเอยี ดต่อทา้ ยประกาศนี้ ทั้งนี้ ให้มีผลตั้งแตพ่ ระราชกฤษฎีกาวา่ ดว้ ยการกําหนดให้ผลติ ภัณฑ์อุตสาหกรรม ภาชนะพลาสติก สําหรับบรรจุผลิตภัณฑ์เภสัชปราศจากเช้ือ ต้องเป็นไปตามมาตรฐานเลขที่ มอก. 531 - 2558 ใช้บังคับ เปน็ ต้นไป ประกาศ ณ วนั ที่ ๑๖ กุมภาพนั ธ์ พ.ศ. ๒๕๕๘ จกั รมณฑ์ ผาสุกวนิช รัฐมนตรวี ่าการกระทรวงอุตสาหกรรม

มอก. 531–2558 มาตรฐานผลิตภณั ฑอ ตุ สาหกรรม ภาชนะพลาสตกิ สาํ หรบั บรรจุผลิตภัณฑ เภสัชปราศจากเชื้อ 1. ขอบขาย 1.1 มาตรฐานผลิตภัณฑอ ุตสาหกรรมน้ีครอบคลมุ เฉพาะภาชนะพลาสตกิ ที่ใชบ รรจุผลิตภณั ฑเภสชั ปราศจาก เชื้อที่เปนของเหลวสาํ หรบั ฉดี เขา สรู างกาย โดยไมรวมถงึ อุปกรณป ระกอบอืน่ ๆ ซงึ่ ตอไปในมาตรฐานนี้ จะเรียกวา “ภาชนะพลาสติก” 1.2 มาตรฐานผลติ ภณั ฑอตุ สาหกรรมนไี้ มครอบคลมุ กระบอกฉีดยาพลาสตกิ ทบี่ รรจุผลติ ภณั ฑเ ภสัชปราศจาก เชอื้ พรอ มใช 2. บทนิยาม ความหมายของคําทใ่ี ชใ นมาตรฐานผลิตภณั ฑอตุ สาหกรรมน้ี มีดังตอ ไปน้ี 2.1 ผลิตภัณฑเภสัชปราศจากเชอื้ (sterile pharmaceutical products) หมายถึง ของเหลวที่ผานกรรมวิธีการทําให ปราศจากเชื้อแลว ท่ีใชฉีดเขาสูรางกายเพื่อการวินิจฉัย บําบัด บรรเทา รักษา หรือปองกันโรคหรือความ เจ็บปวยของมนุษยและสัตวหรือเพ่ือใหเกิดผลแกสุขภาพ โครงสราง หรือการกระทําหนาที่ใด ๆ ของ รา งกายของมนษุ ยหรือสตั ว 2.2 พลาสติกหลายช้นั (multilayer plastic) หมายถงึ พลาสตกิ ทป่ี ระกอบดว ยแผนพลาสติกตงั้ แต 2 ชนั้ ขึน้ ไปอดั ประกบกนั และสว นประกอบแตละชนดิ ตอ งไมละลายเขา ดว ยกนั 3. ชนิด 3.1 ภาชนะพลาสตกิ แบง เปน 4 ชนดิ คือ 3.1.1 พอลเิ อทลิ ีน 3.1.2 พอลโิ พรพิลีน 3.1.3 พอลไิ วนิลคลอไรด 3.1.4 พลาสตกิ หลายชน้ั ซึง่ ตอ งไมมีพอลิไวนิลคลอไรดเ ปนสวนประกอบ -1-

มอก. 531–2558 4. วสั ดุ 4.1 การทดสอบชนดิ ของภาชนะพลาสตกิ ใหใชเ คร่อื งฟูเรียทรานสฟอรมอนิ ฟราเรดสเปกโทรมิเตอร (FTIR) หรือเครอ่ื งมืออนื่ ที่เทียบเทา 4.2 กรณภี าชนะพลาสตกิ ชนิดพลาสติกหลายชนั้ ใหทดสอบชนดิ เฉพาะชน้ั ทีส่ มั ผสั กบั ผลิตภัณฑเทานน้ั 4.3 กรณีภาชนะพลาสติกชนดิ พอลิไวนลิ คลอไรด 4.3.1 ตอ งประกอบดว ยพอลิไวนลิ คลอไรดเรซินไมนอ ยกวา 55% โดยมวล การทดสอบใหปฏบิ ตั ิตามขอ 8.1 4.3.2 ตอ งมีปรมิ าณได (2-เอทลิ เฮกซลิ )แทเลต (DEHP) ทสี่ กัดได ไมเกนิ 40% โดยมวล การทดสอบใหปฏิบตั ิตามขอ 8.2 4.3.3 ตองมปี ริมาณไวนลิ คลอไรดโ มโนเมอรไ มเ กิน 1 มิลลกิ รมั ตอกโิ ลกรมั การทดสอบใหปฏิบตั ติ ามขอ 8.3 5. คุณลักษณะท่ีตอ งการ 5.1 ลักษณะทว่ั ไป 5.1.1 ตอ งไมมสี ี โปรง แสง และมองเหน็ ผลิตภณั ฑเภสชั ท่บี รรจุอยภู ายในไดชัด 5.1.2 พ้ืนผิวภายในของภาชนะพลาสติกตองสะอาด เรียบ ยกเวนตะเข็บที่เกิดจากแบบ (mould) และไมมี ตําหนซิ ึ่งอาจเปน ผลเสยี ตอ การใชง าน การทดสอบใหทําโดยการตรวจพินจิ 5.2 คณุ ลักษณะทางฟสกิ ส 5.2.1 รูร่วั ตองไมม รี รู ัว่ การทดสอบใหปฏิบตั ติ ามขอ 8.4 5.2.2 ความทนตอ การตกกระแทก (ยกเวน ภาชนะพลาสติกชนดิ พอลไิ วนลิ คลอไรด) ตองไมรัว่ หรือแตก การทดสอบใหปฏบิ ัตติ ามขอ 8.5 5.2.3 ความสมาํ่ เสมอของความหนา (เฉพาะภาชนะพลาสติกชนิดพอลิไวนลิ คลอไรด) ผลตางของความหนาคา สงู สุดกับคาต่ําสุด ตอ งไมเ กนิ 0.05 mm การทดสอบใหป ฏิบัตติ ามขอ 8.6 5.2.4 ความทนความดัน (เฉพาะภาชนะพลาสตกิ ชนิดพอลไิ วนลิ คลอไรด) ตองไมร ว่ั ซมึ การทดสอบใหปฏิบัตติ ามขอ 8.7 -2-

มอก. 531–2558 5.2.5 ความยืดหยนุ (เฉพาะภาชนะพลาสติกชนดิ พอลิไวนลิ คลอไรด) สารละลายตองไหลออกไดห มดโดยไมม อี ากาศไหลเขา ไปแทนทข่ี ณะไหล การทดสอบใหปฏบิ ตั ติ ามขอ 8.8 5.2.6 การซึมผา นของไอน้ํา มวลของน้ําทห่ี ายไปตองไมเ กนิ 0.20% การทดสอบใหปฏบิ ตั ติ ามขอ 8.9 5.2.7 ปริมาณกากทเ่ี หลอื จากการเผา ตองไมเกนิ 0.10% การทดสอบใหปฏิบตั ติ ามขอ 8.10 5.2.8 ปรมิ าณอนภุ าคปนเปอ น ขนาดเสนผานศนู ยกลางตง้ั แต 10 μm ตองไมเกิน 25 อนภุ าคตอ มิลลลิ ิตร และขนาดเสน ผา นศนู ยกลาง ตัง้ แต 25 μm ตองไมเกนิ 3 อนุภาคตอ มิลลิลติ ร การทดสอบใหป ฏิบตั ติ ามขอ 8.11 5.3 คุณลักษณะทางเคมี 5.3.1 คุณลักษณะของสารละลายทสี่ กดั ได 5.3.1.1 ตองใส ไมมีสี 5.3.1.2 ฟองทเ่ี กิดขน้ึ ตองหายไปภายใน 3 min 5.3.1.3 ความเปนกรด-ดาง ผลตางคาความเปนกรด-ดางของสารละลายที่สกัดไดเมื่อเทียบกับสารละลายแบลงก ตองไมเกิน 1.5 5.3.1.4 ปรมิ าตรโพแทสเซียมเพอรแมงกาเนตที่ใชท ําปฏิกิริยา ตองไมเ กิน 1.0 ml 5.3.1.5 ปริมาณกากทไี่ มระเหย ตอ งไมเกิน 1.0 mg 5.3.1.6 คา การดดู กลืนแสงสูงสดุ (1) ตอ งไมเ กิน 0.08 ท่ชี ว งความยาวคลน่ื 220 nm ถึง 240 nm (2) ตองไมเ กนิ 0.05 ทช่ี ว งความยาวคลืน่ 241 nm ถงึ 350 nm การทดสอบใหป ฏิบัตติ ามขอ 8.12 5.3.2 ปริมาณโลหะหนัก 5.3.2.1 ปรมิ าณโลหะหนัก (คํานวณเปนตะกวั่ ) ตอ งไมเ กนิ 20 μg /g 5.3.2.2 ตะกว่ั ตองไมเ กิน 10 μg /g -3-

มอก. 531–2558 5.3.2.3 แคดเมียม ตองไมเกนิ 1 μg /g 5.3.2.4 ดีบกุ ตองไมเ กนิ 5 μg /g การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.13 5.4 คณุ ลักษณะทางชีวภาพ 5.4.1 ความเปนพษิ ตอเซลลเ น้ือเยื่อเพาะเลยี้ ง ตองไมเ ปน พษิ ตอเซลลเนอื้ เย่ือเพาะเลีย้ ง การทดสอบใหปฏิบัตติ ามขอ 8.14 5.4.2 สารไพโรเจน เม่ือทดสอบตามขอ 8.15 แลว ปรมิ าณแบคทเี รยี ลเอน็ โดท็อกซิน ตองไมเกิน 20.0 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอ ภาชนะพลาสติกตวั อยา ง 5.4.3 การซึมผานของจลุ นิ ทรีย ตองไมม ีการซมึ ผานของจลุ นิ ทรีย การทดสอบใหป ฏบิ ัตติ ามขอ 8.16 5.4.4 การทาํ ลายเม็ดเลือด ตองไมมีการทาํ ลายเม็ดเลือด การทดสอบใหป ฏบิ ตั ติ ามภาคผนวก ก. 5.5 ความคงทนของเครื่องหมายและฉลาก เม่ือทดสอบตามขอ 8.17 แลว ฉลากตองยังคงติดอยูที่ภาชนะพลาสติกตําแหนงเดิม และเคร่ืองหมายหรือ ขอความใดๆ ท่ีฉลากหรอื ที่ภาชนะพลาสติกตองอานไดช ัดเจน 6. เครอื่ งหมายและฉลาก 6.1 ภาชนะพลาสตกิ ที่ทําจากพอลเิ อทลิ ีนหรือพอลิโพรพิลีน หรือท้งั สองอยา ง ในเนื้อภาชนะพลาสติกทุกใบ อยางนอยตองมีเลข อักษร หรือเครื่องหมายแจงรายละเอียดตอไปน้ีใหเห็น ไดงาย ชดั เจน ถาวร (1) ชนดิ (2) ความจุ เปน มลิ ลิลติ ร พรอ มขดี บอกปริมาตร (3) ชื่อผูท าํ หรอื โรงงานทที่ ํา หรอื เคร่อื งหมายการคาที่จดทะเบยี น 6.2 ภาชนะพลาสตกิ ท่ที ําจากพอลิไวนิลคลอไรดห รือพลาสติกหลายช้นั ทภี่ าชนะพลาสตกิ ทกุ ใบ อยางนอ ยตอ งมีเลข อกั ษร หรอื เคร่ืองหมายแจง รายละเอียดตอไปน้ีใหเห็น ไดงาย ชดั เจน (1) ชนดิ -4-

มอก. 531–2558 (2) ความจุ เปน มลิ ลลิ ิตร (3) คําเตอื นวา ใช DEHP เปน สารเติมแตง (4) ช่อื ผทู ําหรอื โรงงานท่ที ํา หรอื เครือ่ งหมายการคา ท่ีจดทะเบยี น 6.3 ในกรณที ี่ใชภ าษาตา งประเทศ ตองมีความหมายตรงกับภาษาไทยทกี่ ําหนดไวขา งตน 7. การชักตัวอยางและเกณฑต ัดสนิ 7.1 การชักตวั อยา งและเกณฑตัดสินใหเปน ไปตามภาคผนวก ข. 8. การทดสอบ 8.1 ปริมาณพอลิไวนิลคลอไรดเรซนิ 8.1.1 เคร่อื งมือ อปุ กรณส ําหรบั วิธอี อกซเิ จนฟลาสกค อมบสั ชัน (oxygen flask combustion) ประกอบดว ยขวดแกว บอโรซิลิเกต รูปกรวย ขนาดประมาณ 500 ml ปดดว ยจกุ แกว ท่ยี ึดกับที่เสยี บตวั อยา งทาํ จากลวด แพลทินัมสานเปน ตาขา ย ขนาดประมาณ 1.5 cm x 2 cm (ดงั รูปท่ี 1) รูปท่ี 1 อปุ กรณส าํ หรบั วิธอี อกซิเจนฟลาสกค อมบสั ชัน (ขอ 8.1.1) 8.1.2 สารเคมี สารละลาย และวธิ เี ตรยี ม 8.1.2.1 สารละลายโซเดยี มไฮดรอกไซด 1 M 8.1.2.2 ไดบิวทิลแทเลต 8.1.2.3 กรดไนทริกเขม ขน (ความหนาแนน 1.40 g/ml ) 65% โดยมวล -5-

มอก. 531–2558 8.1.2.4 สารละลายเฟอรริกแอมโมเนียมซลั เฟต ละลายเฟอรริกแอมโมเนยี มซลั เฟต 100 g ในนา้ํ กลั่น 1 L 8.1.2.5 สารละลายซิลเวอรไนเทรต 0.1 M 8.1.2.6 สารละลายแอมโมเนียมไทโอไซยาเนต 0.05 M 8.1.3 วิธวี เิ คราะห 8.1.3.1 เติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด 20 ml ลงในคอมบัสชันฟลาสก 8.1.3.2 ช่งั ตัวอยาง 50.0 mg หอดว ยกระดาษกรองขนาด 30 mm x 40 mm พบั ใหไ ดข นาด 10 mm x 30 mm สอดหอตัวอยา งเขา ไปในทีเ่ สยี บตัวอยางทที่ าํ จากลวดแพลทนิ ัม 8.1.3.3 เผาหอตวั อยาง แลวใสเขาไปในขวดแกว รูปกรวย ปด จกุ แกว 8.1.3.4 เม่ือการเผาไหมสมบูรณแลว แกวงขวดแกว เพ่ือใหสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซดดูดซึมไอของ สารประกอบคลอไรดท ่ีเกดิ จากการเผาตวั อยา ง 8.1.3.5 นําจุกแกวและหอตัวอยางออก แลวเติมไดบิวทิลแทเลต 1 ml กรดไนทริก 2.5 ml สารละลายเฟอร รกิ แอมโมเนยี มซลั เฟต 5 ml สารละลายซิลเวอรไนเทรต 10.0 ml ลงในขวดแกวรูปกรวย 8.1.3.6 นาํ สารละลายที่ไดไทเทรตกบั สารละลายแอมโมเนียมไทโอไซยาเนต จนไดสารละลายสีเหลืองแดง สารละลายซิลเวอรไ นเทรต 0.1 M 1 ml สมมูลกับพอลไิ วนลิ คลอไรด 6.25 mg หาปริมาณพอลิไวนลิ คลอไรดเรซิน จากสตู ร ปรมิ าณพอลิไวนิลคอลไรดเรเซนิ = 10   M NH 4SMCNAgNVON3 H 4SCN    6.25 MAgNO3 เปน มิลลิกรมั    0.1   เม่ือ MNH4SCN คือ ความเขมขน ของสารละลายแอมโมเนยี มไทโอไซยาเนต เปนโมลาร VNH4SCN คอื ปรมิ าตรของสารละลายแอมโมเนยี มไทโอไซยาเนต เปน มลิ ลลิ ิตร MAgNO3 คือ ความเขม ขน ของสารละลายซิลเวอรไนเทรต เปนโมลาร 8.2 ปรมิ าณ DEHP 8.2.1 เคร่ืองมือ 8.2.1.1 อุปกรณสําหรับทําทินเลเยอรโครมาโทกราฟ ประกอบดวย แผนแกวท่ีเคลือบดวยซิลิกาเจลจีเอฟ 254 ซงึ่ ตอ ไปจะเรียกวา แผนรงคเลข 8.2.1.2 ตโู ครมาโทกราฟ 8.2.1.3 เครือ่ งใหแสงอัลตราไวโอเลตทีค่ วามยาวคลืน่ 254 nm 8.2.1.4 เคร่อื งอังนํ้า 8.2.1.5 เครอื่ งสกดั รีฟลักซค อนเดนเซอร -6-

มอก. 531–2558 8.2.2 สารเคมีและสารละลาย 8.2.2.1 โทลอู นี เปนวฎั ภาคเคล่ือนท่ี (mobile phase) 8.2.2.2 อีเทอร 8.2.2.3 สารละลายอางองิ ละลาย DEHP ในโทลอู นี 0.1 mg/ml 8.2.3 การเตรยี มสารละลายตัวอยา ง 8.2.3.1 ตดั ภาชนะพลาสติกตัวอยา งใหไดขนาดไมเ กนิ 1 cm นาํ ชิน้ ตวั อยา งมา 2.0 g เติมอีเทอรท ่ีปราศจาก เพอรออกไซด 200 ml ใหความรอ นภายใตร ฟี ลักซคอนเดนเซอร เปน เวลา 12 h 8.2.3.2 แยกกากและสารละลายออกจากกนั 8.2.3.3 นําสารละลายไประเหยจนแหงโดยการลดความดันดวยเครือ่ งองั น้าํ ทีอ่ ุณหภูมิ 30 °C 8.2.3.4 ละลายกากทเ่ี หลืออยูดว ยโทลอู นี 10 ml 8.2.4 วธิ วี ิเคราะห 8.2.4.1 หยอดสารละลายตัวอยาง 0.5 ml บนแผนรงคเลขใหไดแถบขนาด 30 mm x 3 mm และหยด สารละลายอางอิง 5 μl บนแผนรงคเลข ใหแยกออกจากกัน วางในตูโครมาโทกราฟ ท่ีอ่ิมตัวดวย โทลูอีน ใหโทลูอีนซึมผานสารเคลือบข้ึนไปเหนือเสนท่ีหยอดสารละลายตัวอยาง (solvent front) เปน ระยะ 15 cm 8.2.4.2 นําแผนรงคเลขออกจากตูโครมาโทกราฟ ปลอยใหแหงในอากาศ นําไปตรวจภายใตแสงอัตรา ไวโอเลต ท่ีความยาวคล่ืน 254 nm ระบุตาํ แหนง ของตัวอยา งทีส่ อดคลองกับสารละลายอา งองิ 8.2.4.3 ขูดซลิ ิกาเจลบริเวณทสี่ อดคลองกบั สารละลายอางองิ ไปเขยา กับอีเทอร 40 ml เปน เวลา 1 min 8.2.4.4 กรอง ลางดวยอีเทอร 10 ml 2 คร้ัง นําอีเทอรที่ไดทั้งหมดไประเหยใหแหง กากท่ีไดตองหนักไม เกนิ 40 mg 8.3 ปรมิ าณไวนิลคลอไรดโ มโนเมอร 8.3.1 เครอื่ งมือ 8.3.1.1 เฮดสเปซกา ซโครมาโทกราฟ 8.3.1.2 เครอื่ งอังนํ้า ท่ีควบคุมอณุ หภมู ิที่ (60+1) °C 8.3.1.3 เคร่อื งชงั่ ละเอยี ด 0.1 mg 8.3.2 สารเคมี 8.3.2.1 ไดเมทลิ อะเซตาไมด 8.3.2.2 อเี ทอร -7-

มอก. 531–2558 8.3.3 การเตรยี มสารละลายมาตรฐานภายใน ใชไมโครไซริงคดูดอีเทอร 10 μl จุมปลายเข็มลงในไดเมทิลอะเซตาไมด 20.0 ml แลวฉีดอีเทอรลงใน สารละลาย เจือจางสารละลายดว ยไดเมทลิ อะเซตาไมดใ หเจือจางลง 1 000 เทา ทนั ทีกอนใช 8.3.4 การเตรียมสารละลายทดสอบ ชั่งตัวอยาง 1.000 g ใสลงในไวแอลแกวขนาด 50 ml เติมสารละลายมาตรฐานภายใน 10.0 ml ปดจุก ไวแอลแกวใหสนิท เขยา หลีกเล่ียงไมใหของเหลวภายในสัมผัสกับจุกปด วางไวแอลแกวในเคร่ือง อังนํา้ ทอ่ี ุณหภูมิ (60+1) °C เปน เวลา 2 h 8.3.5 การเตรยี มสารละลายปฐมภมู ิไวนลิ คลอไรด ตองเตรยี มสารละลายนใ้ี นตอู ากาศไหลเวยี น (ventilated hood) 8.3.5.1 ใชปเปตตดูดไดเมทิลอะเซตาไมด 50.0 ml ใสลงในไวแอลแกวขนาด 50 ml ปดจุกไวแอลแกวให สนิท แลว ชั่งใหมคี วามละเอยี ดถึง 0.1 mg 8.3.5.2 ใชกระบอกฉีดยาท่ีทําดวยพอลิเอทิลีนหรือพอลิโพรพิลีนขนาดความจุ 50 ml ดูดกาซไวนิลคลอ ไรด 50 ml ใหกา ซคงอยใู นกระบอกฉีดยานานประมาณ 3 min แลว ดนั กานฉดี ไลกาซออก 8.3.5.3 ดูดกาซไวนิลคลอไรด 50 ml อีกครั้งหนึ่ง ตอเข็มฉีดยาเขากับกระบอกฉีดยา แลวลดปริมาตรกาซ ในกระบอกฉดี ยาจาก 50 ml ลงเหลือ 25 ml 8.3.5.4 ฉีดกาซไวนิลคลอไรดท่ีเหลือเขาในไวแอลแกวอยางชาๆ เขยาเบาๆ หลีกเล่ียงไมใหของเหลว ภายในสมั ผัสกับเขม็ ฉีดยา 8.3.5.5 ชั่งมวลไวแอลแกวอีกครั้งหนึ่ง มวลท่ีเพิ่มข้ึนจะไดประมาณ 60 mg (สารละลายที่ได 1 μl มีไวนิล คลอไรดประมาณ 1.2 μg) ตั้งไว 2 h เก็บสารละลายน้ีในตเู ยน็ 8.3.6 การเตรยี มสารละลายมาตรฐานไวนิลคลอไรด อตั ราสวนสารละลายปฐมภมู ิไวนลิ คลอไรด : ไดเมทลิ อะเซตาไมด เปน 1:3 โดยปรมิ าตร 8.3.7 การเตรยี มสารละลายอา งองิ 8.3.7.1 ใชป เปตตด ดู สารละลายมาตรฐานภายใน 10.0 ml ลงในไวแอลแกว ขนาด 50 ml จํานวน 6 ขวด ปด จกุ ไวแอลแกวใหส นิท 8.3.7.2 ฉีดสารละลายมาตรฐานไวนิลคลอไรดป รมิ าตร 1 μl 2 μl 3 μl 5 μl และ 10 μl ลงในไวแอลแกว 5 ขวด จะไดไวแอลแกวที่มีปริมาณไวนิลคลอไรดประมาณ 0.3 μg 0.6 μg 0.9 μg 1.5 μg และ 3 μg ตามลําดับ เขยา หลีกเล่ียงไมใหของเหลวภายในสัมผัสกับจุกปด วางไวแอลแกวในเคร่ืองอังน้ําที่ อุณหภูมิ (60+1) °C เปนเวลา 2 h 8.3.8 วิธีวิเคราะห วิเคราะหปริมาณไวนิลคลอไรดในสารละลายทดสอบ โดยใชเฮดสเปซกาซโครมาโทกราฟ ที่มีภาวะ เครอ่ื งดังน้ี -8-

มอก. 531–2558 1) คอลัมน 1.1) ทําดว ยเหลก็ กลาไรสนมิ ขนาดเสนผา นศูนยก ลางภายใน 3 mm ยาว 3 m 1.2) วัฏภาคคงที่ (stationary phase) ประกอบดวยไซเลไนสไดอาโตมาเชียสเอิรธ (silanised diatomaceous earth) ชั้นคุณภาพโครมาโทกราฟ ทําใหเอิบชุม (impregnate) ดวยสารละลาย ผสมของไดเมทิลสเตียริลเอไมด 5% เศษสวนโดยมวล และมาโครกอล 400 ความเขมขน 5% เศษสวนโดยมวล 2) กา ซตัวพา : ไนโตรเจน 3) อัตราการไหล : 30 ml/min 4) อณุ หภูมิ : - คอลัมน : 45 °C - ชอ งที่ฉดี เขา : 100 °C - ตวั ตรวจจับ : 150 °C 5) การตรวจจับ : เฟลมไอออไนเซชนั 6) การฉดี : เฮดสเปซ 1 ml หลงั จากไดโครมาโตแกรมแลว คํานวณหาปริมาณไวนลิ คลอไรดโมโนเมอร 8.4 รูรวั่ 8.4.1 เคร่ืองมือ เครอื่ งอัดอากาศท่มี มี าตรความดนั วดั ไดตงั้ แต 0 kPa ถงึ 5 kPa 8.4.2 วธิ ที ดสอบ 8.4.2.1 อัดอากาศเขาไปในภาชนะพลาสติกตัวอยางดวยเครื่องอัดอากาศจนความดันภายในภาชนะ พลาสตกิ ตัวอยางมคี า (1.5+0.15) kPa 8.4.2.2 จุมภาชนะพลาสติกตัวอยางท่ีอัดอากาศแลวลงในน้ํา ใหสวนบนสุดของภาชนะพลาสติกตัวอยาง อยูตํ่ากวาระดับผิวน้ํา (20+2) cm เปนเวลา (1.5+0.5) min สังเกตฟองอากาศ หากมีฟองอากาศปุด ขนึ้ มาแสดงวาภาชนะพลาสติกตวั อยางมรี รู ่ัว 8.5 ความทนตอการตกกระแทก (ยกเวน ภาชนะพลาสติกชนดิ พอลิไวนลิ คลอไรด) ใสนํ้าลงในภาชนะพลาสติกตัวอยางเทาความจุที่ระบุไว ปดใหสนิท ปลอยภาชนะพลาสติกตัวอยางจาก ระดับความสูงตามตารางท่ี 1 ใหตกอยางอิสระลงบนพ้ืนแข็งเรียบที่อุณหภูมิ 20 °C ถึง 30 °C แลวตรวจ พินจิ ภาชนะพลาสติกตัวอยา ง -9-

มอก. 531–2558 ตารางท่ี 1 ความจุระบุของภาชนะพลาสติกตัวอยา งและระดบั ความสงู ทีป่ ลอ ยภาชนะพลาสติกตัวอยา ง (ขอ 8.5) ความจรุ ะบุ ระดับความสูงทป่ี ลอย ภาชนะพลาสตกิ ตัวอยา ง ml นอยกวา 750 m 750 ถงึ 1 499 1.00 1 500 ถึง 2 499 0.75 ตั้งแต 2 500 0.50 0.25 8.6 ความสมํา่ เสมอของความหนา (เฉพาะภาชนะพลาสติกชนิดพอลไิ วนลิ คลอไรด) 8.6.1 เคร่อื งมือ เคร่ืองวัดความหนาทีว่ ดั ไดละเอียด 0.001 mm 8.6.2 วธิ ีวดั ตัดภาชนะพลาสตกิ ตวั อยาง แลว วดั ความหนาของภาชนะพลาสติกทีต่ าํ แหนง ตางๆ กัน 5 ตําแหนง (ยกเวน สว นทีเ่ ปนตะเข็บหรอื รอยนูน) แตล ะตําแหนงใหห า งกนั พอสมควร แลวรายงานผลตางระหวา ง ความหนาสงู สดุ กับความหนาต่ําสุดทวี่ ดั ได 8.7 ความทนความดนั (เฉพาะภาชนะพลาสตกิ ชนดิ พอลิไวนลิ คลอไรด) 8.7.1 เครอื่ งมือ เครื่องอดั ความดัน 8.7.2 สารละลาย สารละลายฟลอู อเรสซนี โซเดยี มในนา้ํ (1 g ในน้าํ 1 000 ml) 8.7.3 วิธีทดสอบ ใสส ารละลายฟลูออเรสซีนโซเดียมลงในภาชนะพลาสตกิ ตัวอยางจนเต็ม ปดดว ยจกุ ทต่ี อกบั เครอ่ื งอัด ความดนั แลว หุมใหทวั่ และสนิทดว ยกระดาษกรองสขี าว อัดความดนั ใสภ าชนะพลาสตกิ ตวั อยา งใหไ ด 6.9 N (0.7 kg)/cm2 ทอี่ ณุ หภมู ิ 20 °C เปน เวลา 10 min แลวตรวจพนิ ิจ 8.8 ความยืดหยนุ (เฉพาะภาชนะพลาสตกิ ชนดิ พอลิไวนลิ คลอไรด) แทงเข็มเจาะ (spike needle) เขาทางจกุ ยางของภาชนะพลาสตกิ ตวั อยางที่ผานการทดสอบในขอ 8.7 แลว สงั เกตการไหลของสารละลาย หมายเหตุ เข็มเจาะ หมายถงึ เขม็ เจาะภาชนะบรรจุขนาดเสนผา นศนู ยกลางภายนอก 5.0 mm - 5.3 mm ยาว 27 mm - 29 mm ของชดุ ใหสารละลายทางหลอดเลือดใชครงั้ เดียว -10-

มอก. 531–2558 8.9 การซมึ ผา นของไอนาํ้ 8.9.1 เครื่องมือ 8.9.1.1 ตูท ีค่ วบคมุ อณุ หภมู ิไดท ี่ (25+2) °C ความชน้ื สมั พัทธ (65+5)% 8.9.1.2 เครอื่ งชัง่ ละเอียด 0.1 mg 8.9.2 วธิ ีทดสอบ 8.9.2.1 ช่ังภาชนะพลาสตกิ ตวั อยางพรอมฝาปด ใหท ราบมวลแนน อน เปน m1 8.9.2.2 บรรจนุ า้ํ กลนั่ ลงในภาชนะพลาสติกตวั อยา งใหไ ดปรมิ าตรเทากบั ความจุที่ระบไุ ว ปดฝาใหส นทิ ช่งั มวล เปน m2 8.9.2.3 นําไปเก็บในตทู ี่ควบคมุ อุณหภูมไิ ดที่ (25+2) °C ความช้ืนสัมพทั ธ (65+5)% เปน เวลา (336+1) h เม่ือครบตามระยะเวลาทก่ี ําหนด นําไปช่งั มวล เปน m3 คาํ นวณหานํา้ ท่หี ายไป จากสตู ร นํา้ ทห่ี ายไป เปน รอ ยละ = mm22  mm13 × 100  เมือ่ m1 คอื มวลของภาชนะพลาสติกตวั อยา งพรอมฝาปด เปนกรมั m2 คือ มวลของภาชนะพลาสตกิ ตวั อยางท่บี รรจนุ ้าํ กล่นั กอ นทดสอบ เปนกรมั m3 คือ มวลของภาชนะพลาสตกิ ตวั อยา งที่บรรจนุ าํ้ กล่ันหลงั ทดสอบ เปน กรมั 8.10 ปริมาณกากทเ่ี หลอื จากการเผา 8.10.1 เคร่อื งมือ 8.10.1.1 เครอื่ งชั่งละเอยี ด 0.1 mg 8.10.1.2 เตาเผาไฟฟา ทป่ี รบั และควบคุมอณุ หภมู ิไดท ่ี (550+50) °C 8.10.1.3 ครูซิเบิลแพลทินัม ควอตซ หรือกระเบ้ืองเคลือบ ที่เผาท่ีอุณหภูมิ (550+50) °C และช่ังที่อุณหภูมิหอง จนไดมวลคงที่ เปน m1 8.10.1.4 เดซิกเคเตอร 8.10.2 สารเคมี กรดซลั ฟว รกิ เขม ขน ความหนาแนน 1.84 g/ml 8.10.3 วิธที ดสอบ 8.10.3.1 ตดั ภาชนะพลาสติกตวั อยา งทีต่ ําแหนง ตา งๆ กัน แตล ะใบใหม พี น้ื ท่ีเทา ๆ กัน นํามารวมกันตดั เปน ชิ้นเลก็ ๆ ผสมรวมกัน แบง มาประมาณ 5 g ชง่ั ใหท ราบมวลแนน อน เปน m2ใสล งในครูซเิ บลิ 8.10.3.2 หยดกรดซัลฟว รกิ เขมขน 2 หยดถงึ 3 หยด ลงในครูซิเบลิ เผาดว ยไฟออนๆ จนพลาสตกิ กลายเปน ถาน (carbonize) ทงิ้ ไวใ หเยน็ หยดกรดซัลฟวริกเขมขนลงไปอกี เล็กนอย เผาตอ ดว ยไฟออนๆจน หมดควนั แลว เผาตอในเตาเผาไฟฟาทอี่ ุณหภมู ิ (550+50) °C เปนเวลา 1 h นาํ ออกมาใสในเดซกิ เคเตอร ปลอยไวใหเ ยน็ ท่อี ุณหภมู หิ อง ช่ัง แลว เผาซาํ้ ครั้งละ 30 min จนไดม วลคงท่เี ปน m3 -11-

มอก. 531–2558 คํานวณปรมิ าณกากทเ่ี หลอื จากการเผา จากสูตร กากทีเ่ หลือจากการเผา เปนรอ ยละ = m3m2m1 x 100 เมือ่ m1 คอื มวลของครซู ิเบิล เปนกรัม m2 คอื มวลของภาชนะพลาสติกตวั อยาง เปน กรมั m3 คอื มวลของครซู ิเบลิ และกากท่เี หลอื จากการเผา เปน กรัม 8.11 ปรมิ าณอนภุ าคปนเปอ น 8.11.1 ภาวะทดสอบ ทาํ ในทีท่ ป่ี ราศจากฝนุ อปุ กรณแ ละเคร่อื งมือตอ งสะอาด 8.11.2 เครื่องมือ 8.11.2.1 เคร่ืองนบั จาํ นวนอนภุ าคท่ีทาํ งานดว ยวธิ กี ารกน้ั แสง (light blockage method) 8.11.2.2 น้าํ กลั่นสําหรบั ทาํ ยาฉดี (water for injection) ที่กรองผานเยอ่ื กรองที่มรี พู รนุ ขนาด 0.2 μm แลว 8.11.3 วิธีวิเคราะห ใสนํ้ากลั่นสําหรับทํายาฉีด ที่กรองผานเยื่อกรองที่มีรูพรุนขนาด 0.2 μm แลว ลงในภาชนะพลาสติก ตัวอยางเทาความจุที่ระบุไว นําไปผานกระบวนการทําใหปราศจากเช้ือ เก็บไวอยางนอย 12 h นํา สารละลายทไี่ ดไปนับจาํ นวนอนุภาค โดยเปรียบเทยี บกบั สารละลายแบลงก หมายเหตุ สารละลายแบลงก คอื น้าํ กลัน่ สําหรบั ทํายาฉดี ที่กรองผา นเยอ่ื กรองท่มี รี ูพรุนขนาด 0.2 μm 8.12 คุณลักษณะของสารละลายทีส่ กดั ได 8.12.1 การเตรียมตวั อยางรวม ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางทุกใบตรงบริเวณที่มีความหนาสม่ําเสมอและโคงนอยที่สุด ใหไดช้ิน พลาสติกพ้ืนท่ีเทาๆ กัน นํามารวมกันใหพ้ืนท่ีผิวทั้งสองดานรวมกันได 1 200 cm2 สําหรับพลาสติกที่มี ความหนาไมเกนิ 0.5 mm และ 600 cm2 สําหรบั พลาสตกิ ทมี่ คี วามหนาเกิน 0.5 mm 8.12.2 การเตรียมสารละลายท่ีสกัดไดแ ละสารละลายแบลงก 8.12.2.1 เคร่อื งมอื (1) หมอนงึ่ อัด ทคี่ วบคุมอณุ หภมู ิไดท่ี (121+2) °C (2) ตูอ บ ที่ควบคุมอุณหภมู ไิ ดท ่ี (70+2) °C (3) ภาชนะแกว บอโรซลิ เิ กตขนาด 300 ml พรอมฝาท่ีปดไดส นิท 8.12.2.2 วธิ เี ตรียม (1) สารละลายทีส่ กดั ได ตัดชิ้นพลาสตกิ ตามขอ 8.12.1 ออกเปน ชิน้ ยอย ขนาดกวา งประมาณ 0.5 cm และยาวประมาณ 1 cm ถึง 5 cm ลางดวยนา้ํ กลน่ั ปลอ ยไวใ หแ หงท่อี ณุ หภูมิหองในท่สี ามารถปองกนั การ -12-

มอก. 531–2558 ปนเปอ นได แลว ใสลงในภาชนะแกว บอโรซิลเิ กต เติมนํ้ากลนั่ ลงไป 200.0 ml ปดฝาใหสนทิ นําไปใสใ นหมอน่ึงอัดทอ่ี ณุ หภมู ิ (121+2) °C เปนเวลา 1 h ปลอ ยไวใหเยน็ จนถงึ อุณหภูมหิ อ ง สาํ หรับภาชนะพลาสติกทีท่ าํ จากพลาสติกหลายชั้น ใหเตมิ นา้ํ กล่ันลงในภาชนะพลาสติก ตัวอยางตามความจทุ ี่ระบไุ ว บนั ทกึ ปรมิ าตรน้ํากลั่นและพนื้ ทภี่ ายในภาชนะพลาสติกตวั อยาง ปด ใหสนทิ นาํ ไปใสใ นหมอ น่งึ อัดที่อณุ หภูมิ (121+2) °C เปนเวลา 1 h ถาภาชนะพลาสติกเปล่ียนแปลงรูปรางท่อี ุณหภมู ิ (121+2) °C ใหเ ตรยี มสารละลายตวั อยา งที่ อุณหภมู สิ งู สดุ ทภ่ี าชนะพลาสตกิ ไมเปล่ยี นแปลงรปู รา งโดยเลอื กใชภ าวะใดภาวะหนงึ่ ตอ ไปนี้ คือ ทอี่ ณุ หภูมิ (100+2) °C เปน เวลา (2+0.2) h หรือทีอ่ ุณหภูม(ิ 70+2) °C เปนเวลา (24+2) h หรือทอ่ี ุณหภูมิ (50+2) °C เปนเวลา (72+2) h หรอื ทอ่ี ณุ หภมู ิ(37+2) °C เปน เวลา (72+2) h (2) สารละลายแบลงก ใหเ ตรยี มโดยวธิ ีเดียวกบั การเตรียมสารละลายทส่ี กดั ได แตไ มต อ งใสต วั อยาง 8.12.2.3 ใหนาํ สารละลายทส่ี กดั ไดและสารละลายแบลงกไปทาํ การทดสอบตามขอ 8.12.3 ตอ ไป 8.12.3 วิธีทดสอบ 8.12.3.1 ลกั ษณะสารละลาย ตอ งใส ไมม ีสี จงึ จะวิเคราะหร ายการอ่ืนๆ ตอ ไป 8.12.3.2 การเกิดฟอง ใชป เปตตดดู สารละลายทีส่ กดั ได 5 ml ใสในหลอดแกว ขนาดเสนผา นศนู ยก ลางภายใน 15 mm ยาว 200 mm ปด ฝาใหส นทิ เขยา อยา งแรงเปนเวลา 3 min สงั เกตฟองท่เี กดิ ขน้ึ พรอ มจบั เวลา 8.12.3.3 ความเปนกรด-ดา ง (1) ใชปเปตตดดู สารละลายทีส่ กัดไดและสารละลายแบลงกอ ยางละ 20 ml ใสในบกี เกอรขนาด 25 ml อยางละใบ (2) เตมิ สารละลายโพแทสเซยี มคลอไรด 1 g/l ลงในบกี เกอรท ้ัง 2 ใบๆ ละ 1 ml วดั คา ความเปน กรด-ดางของสารละลายในบีกเกอรแ ตล ะใบดวยเครือ่ งวดั ความเปนกรด-ดา ง 8.12.3.4 ปริมาตรโพแทสเซียมเพอรแ มงกาเนตท่ใี ชทาํ ปฏิกิริยา (1) เครื่องมือ ขวดแกวรูปกรวยขนาด 100 ml พรอ มจกุ แกว จํานวน 2 ใบ (2) สารเคมี สารละลายและวิธเี ตรยี ม (2.1) สารละลายมาตรฐานโพแทสเซยี มเพอรแมงกาเนต 0.002 mol/l ละลายโพแทสเซยี มเพอรแมงกาเนต 31.6 mg ดว ยน้าํ กลนั่ จาํ นวนเล็กนอ ยในขวดแกว ปริมาตรขนาด 100 ml เติมนํา้ กลน่ั จนถึงขดี ปรมิ าตร เขยา ใหเ ขา กนั เกบ็ สารละลายที่ ไดในขวดสชี า -13-

มอก. 531–2558 (2.2) สารละลายกรดซัลฟวริก 5.7% โดยปรมิ าตร (2.3) สารละลายโซเดียมไทโอซัลเฟต 0.01 mol/l ละลายโซเดยี มไทโอซลั เฟต 2.6 g และโซเดยี มคารบ อเนต 20 mg ดว ยนา้ํ กล่ันที่เพงิ่ ตมเดือดและปลอยไวใ หเยน็ จาํ นวนเล็กนอ ยในขวดแกว ปรมิ าตรขนาด 1 000 ml เตมิ น้ํากลัน่ ทเี่ พง่ิ ตม เดอื ดและปลอ ยไวใ หเยน็ แลวจนถงึ ขีดปรมิ าตร เขยาใหเขากนั (2.4) อินดเิ คเตอรแปงทีเ่ ตรียมใหมๆ ละลายแปง (soluble starch) 1 g ดว ยน้าํ เยน็ 10 ml เทลงในนํ้าเดอื ด 200 ml อยา งชา ๆ และคนอยางสมํา่ เสมอ ตมสารละลายท่ีไดใหเ ดือดจนกระทัง่ มลี กั ษณะโปรง ใส (2.5) โพแทสเซียมไอโอไดด (3) วิธวี ิเคราะห (3.1) ใชปเปตตด ดู สารละลายทสี่ กดั ได 20 ml ใสในขวดแกวรปู กรวยใบทห่ี น่ึง เติม สารละลายมาตรฐานโพแทสเซยี มเพอรแมงกาเนต 20 ml และสารละลายกรด ซลั ฟว รกิ 1.0 ml แลวตม ใหเ ดอื ดเปน เวลา 3 min ปลอ ยไวใหเ ยน็ เติมโพแทสเซียมไอ โอไดด 0.10 g ปดจกุ ใหแนน เขยา ปลอยไวเปน เวลา 10 min เติมอนิ ดเิ คเตอรแ ปง 5 หยด แลว ไทเทรตกบั สารละลายโซเดยี มไทโอซัลเฟต (3.2) ทดลองตามขอ (3.1) โดยใชส ารละลายแบลงก 20 ml แทนสารละลายตวั อยา ง 8.12.3.5 ปรมิ าณกากทไี่ มร ะเหย (1) เครอ่ื งมือ (1.1) เคร่ืองช่ังละเอยี ด 0.1 mg (1.2) ตูอ บแบบอากาศหมุนเวียนทคี่ วบคมุ อณุ หภมู ิไดท่ี (105+2) °C (1.3) ครูซเิ บิลควอตซห รอื กระเบื้องเคลอื บ ทีอ่ บจนมวลคงทแ่ี ลว 2 ใบ (1.4) เครือ่ งอังไอนาํ้ (1.5) เดซิกเคเตอร (2) วิธีวเิ คราะห (2.1) ใชปเปตตดดู สารละลายท่สี กดั ได 20 ml ใสลงในครูซิเบลิ ใบท่หี น่งึ และสารละลาย แบลงกปรมิ าตรเทากนั ใสล งในครูซเิ บิลใบทีส่ อง นําไประเหยใหแ หง บนเครอ่ื งองั ไอนาํ้ (2.2) อบครูซิเบิลทั้ง 2 ใบในตูอบที่อุณหภมู ิ (105+2) °C เปน เวลา 1 h นาํ ออกมาใสใ น เดซิกเคเตอร ปลอ ยไวใ หเ ยน็ ทีอ่ ณุ หภูมหิ อ ง นําไปชั่งแลวอบซ้ําเปนเวลาครงั้ ละ 1 h จนไดมวลคงที่ ผลตา งของมวลของกากในครซู เิ บิลใบที่หนึง่ และใบทีส่ องตองไมเ กนิ 1.0 mg -14-

มอก. 531–2558 8.12.3.6 การดดู กลนื แสง (1) เครอื่ งมอื สเปกโทรโฟโตมเิ ตอรท ี่วดั คา การดดู กลนื แสงในชวงความยาวคลื่น 220 nm ถึง 350 nm (2) วิธวี เิ คราะห นําสารละลายที่สกัดไดไปวัดคาการดูดกลืนแสงโดยใชสเปกโทรโฟโตมิเตอรในชวงความ ยาวคลื่น 220 nm ถึง 240 nm และในชวงความยาวคลื่น 241 nm ถึง 350 nm โดยเปรียบเทียบ กบั สารละลายแบลงก 8.13 ปรมิ าณโลหะหนัก 8.13.1 ปรมิ าณโลหะหนกั (คํานวณเปน ตะก่วั ) 8.13.1.1 การเตรยี มตัวอยาง ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางทุกใบตรงบริเวณที่มีความหนาสมํ่าเสมอและโคงนอยที่สุด ใหไดช้ิน พลาสติกพ้ืนท่ีเทาๆ กัน นํามารวมกันใหไดมวลประมาณ 10 g ลางดวยนํ้ากล่ัน ปลอยไวใหแหงท่ี อุณหภูมิหอ ง แลว ตดั เปน ช้ินเลก็ ๆ 8.13.1.2 เครื่องมอื (1) เครอื่ งชั่งละเอียด 0.1 mg (2) ครูซิเบิลควอตซหรือกระเบ้อื งเคลือบ พรอ มฝาปด (3) เตาเผาไฟฟาทค่ี วบคมุ อุณหภมู ิไดท ี่ 500 °C ถึง 600 °C (4) เคร่อื งอังนํ้า (5) หลอดเทยี บสี ขนาด 50 ml จาํ นวน 2 หลอด 8.13.1.3 สารเคมี สารละลายและวธิ เี ตรียม (1) กรดไนทริก ความหนาแนน 1.42 g/ml (2) กรดซัลฟว ริก ความหนาแนน 1.84 g/ml (3) กรดไฮโดรคลอริก ความหนาแนน 1.18 g/ml (4) สารละลายฟน อลฟทาลนี ละลายฟนอลฟ ทาลีน 1 g ในเอทานอล 100 ml (5) สารละลายแอมโมเนยี ใชปเปตตดูดสารละลายแอมโมเนีย 0.908 g/ml ปริมาตร 400 ml เติมน้ํากลั่นจนสารละลายมี ปรมิ าตร 1 000 ml (6) สารละลายกรดแอซีตกิ เจอื จาง เจือจางกรดแอซตี กิ 6 g ดวยน้าํ กลัน่ แลวเตมิ นาํ้ กล่นั จนสารละลายมปี ริมาตร 100 ml -15-

มอก. 531–2558 (7) สารละลายโซเดยี มซลั ไฟด ละลายโซเดยี มซัลไฟด 1 g ในนา้ํ กลนั่ แลว เตมิ นํา้ กลั่นจนสารละลายมปี ริมาตร 10 ml เตรียม สารละลายนีใ้ หมๆ กอ นใช (8) สารละลายกรดไนทริกเจือจาง เจือจางกรดไนทรกิ (ความหนาแนน 1.42 g/ml) ปรมิ าตร 10.5 ml ดวยน้ํากลัน่ แลว เตมิ นาํ้ กลั่นจนสารละลายมปี ริมาตร 100 ml (9) สารละลายมาตรฐานตะกวั่ ช่ังตะก่ัว (II) ไนเทรต 159.8 mg ใหทราบมวลแนนอน ละลายในกรดไนทริกเจือจาง 10 ml เจือจางดวยนํ้ากล่ันจนสารละลายมีปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกวปริมาตร เตรียมและเก็บ สารละลายนีใ้ นภาชนะแกว ท่ปี ราศจากเกลือของตะกว่ั ทล่ี ะลายได ใชป เปตตดูดสารละลายท่ไี ด 10.0 ml แลวเจือจางดวยน้ํากลั่นจนสารละลายมีปริมาตร 100 ml ในขวดแกวปรมิ าตร สารละลายน้ี 1 ml มตี ะกั่ว 0.01 mg ตองเตรียมสารละลายนใี้ หมท ุกครงั้ กอ นใช 8.13.1.4 วธิ วี ิเคราะห (1) การเตรียมสารละลายตัวอยาง (1.1) ชัง่ ชิ้นตวั อยา ง 1.0 กรัม ใสใ นครูซิเบิลควอตซหรือกระเบอ้ื งเคลอื บ ปดฝาครูซิเบิล ไม ตองปด ฝาสนิท เผาดว ยไฟออ นๆ จนเปนถา น ปลอ ยไวใ หเยน็ (1.2) เตมิ กรดไนทรกิ 2 ml และกรดซลั ฟวรกิ 5 หยด เผาตอ อยา งระมดั ระวงั จนกระท่งั ควนั สขี าวหมดไป แลว เผาตอ ในเตาเผาไฟฟาทอี่ ณุ หภมู ิ 500 °C ถึง 600 °C จนเปนเถา ปลอยไวใ หเ ยน็ (1.3) เติมกรดไฮโดรคลอรกิ 2 ml ระเหยใหแ หงในเครือ่ งอังนํ้า (1.4) ทาํ ใหช น้ื ดวยสารละลายกรดไฮโดรคลอริก 3 หยด เตมิ นํ้ารอ น 10 ml อุน เปน เวลา 2 min (1.5) เติมสารละลายฟนอลฟทาลนี 1 หยด แลว เตมิ สารละลายแอมโมเนียทลี ะหยด จนกระท่งั สารละลายเปลีย่ นสีเปน สแี ดงออนๆ (1.6) เติมสารละลายกรดแอซีติกเจือจาง 2 ml กรอง (ถาจําเปน) ลางดวยนํ้ากล่ัน 10 ml ถายสารละลายที่กรองไดและนํ้าที่ใชลางลงในหลอดเทียบสี เติมนํ้ากลั่นจน สารละลายมีปริมาตร 50 ml (2) การเตรยี มสารละลายควบคมุ (2.1) เติมกรดไนทริก 2 ml กรดซัลฟวริก 5 หยด และกรดไฮโดรคลอริก 2 ml ลงใน ครูซิเบิลควอตซหรือกระเบ้ืองเคลือบ ระเหยในเคร่ืองอังนํ้า แลวระเหยใหแหงใน อา งทราย -16-

มอก. 531–2558 (2.2) ทาํ ใหชื้นดว ยกรดไฮโดรคลอริก 3 หยด เตมิ นา้ํ รอ น 10 ml อุนเปน เวลา 2 min (2.3) เติมสารละลายฟนอลฟทาลีน 1 หยดแลวเติมสารละลายแอมโมเนียทีละหยด จนกระทง่ั สารละลายเปล่ยี นสเี ปน สีแดงออ นๆ (2.4) เตมิ สารละลายกรดแอซีติกเจือจาง 2 ml กรอง (ถาจําเปน) ลางดวยนํ้ากล่ัน 10 ml ถาย สารละลายท่กี รองไดแ ละน้ําทีใ่ ชลางลงในหลอดเทียบสี (2.5) ใชปเปตตดูดสารละลายมาตรฐานตะกั่ว 2.0 ml ใสลงในหลอดเทียบสี แลวเติมน้ํา กลั่นจนสารละลายมปี รมิ าตร 50 ml (3) เติมสารละลายโซเดียมซัลไฟดลงในหลอดสารละลายตัวอยางและสารละลายควบคุมหลอด ละ 1 หยด เขยาใหเขากัน ตั้งไว 5 min เปรียบเทียบสีท่ีเกิดขึ้น โดยตั้งหลอดเทียบสีบนพ้ืนขาว แลวมองตรงจากดานบนลงมา สีของสารละลายตัวอยางตองไมเขมกวาสีของสารละลาย ควบคุม 8.13.2 ปริมาณตะกั่ว แคดเมยี ม และดีบุก 8.13.2.1 การเตรยี มตวั อยาง ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางทุกใบใหไดขนาดประมาณกวาง x ยาว เปน 5 mm x 5 mm นํามา รวมกันใหไ ดน ํา้ หนกั ประมาณ 500 mg 8.13.2.2 เครือ่ งมือ (1) เคร่อื งช่งั ละเอียด 0.1 mg (2) เครอื่ งยอ ยสลายสารดวยคลืน่ ไมโครเวฟพรอ มภาชนะใสต ัวอยา ง (3) อะตอมิกแอบซอรป ชันสเปกโทรมเิ ตอรหรอื เครอ่ื งมอื อน่ื ที่เทยี บเทา 8.13.2.3 สารเคมี สารละลาย และวธิ ีเตรียม (1) กรดไนทรกิ เขม ขน (ความหนาแนน 1.40 g/ml ) 65% โดยมวล (2) กรดไฮโดรคลอรกิ (ความหนาแนน 1.18 g/ml ) 37% โดยมวล (3) กรดไนทริกเจอื จาง ละลายกรดไนทริก 1 สวนในนาํ้ กล่ัน 3 สว น (4) กรดไฮโดรคลอริกเจือจาง ละลายกรดไฮโดรคลอริก 1 สว นในนา้ํ กลนั่ 5 สวน (5) สารละลายมาตรฐานตะกั่ว 10 μg /ml ช่งั ตะกวั่ (II) ไนเทรต 159.8 mg ใหทราบมวลแนน อน ละลายในกรดไนทริกเจอื จาง 10 ml เจอื จางดว ยนํ้ากลน่ั จนสารละลายมีปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกว ปริมาตร เตรียมและเกบ็ สารละลายนใี้ นภาชนะแกวทปี่ ราศจากเกลอื ของตะกว่ั ที่ละลายได -17-

มอก. 531–2558 ใชปเปตตดดู สารละลายทีไ่ ด 10.0 ml แลว เจอื จางดว ยน้ํากลน่ั จนสารละลายมีปรมิ าตร 100 ml ในขวดแกว ปรมิ าตร ตอ งเตรียมสารละลายนี้ใหมทกุ คร้ังกอ นใช (6) สารละลายมาตรฐานแคดเมยี ม 1 μg /ml ชง่ั แคดเมยี มบริสุทธิ์ 1.000 g ใหท ราบมวลแนน อน ละลายในกรดไนทรกิ เจือจาง 100 ml ให ความรอ นออ นๆ ทําใหเยน็ แลวเจอื จางดวยกรดไนทริกเจอื จางจนสารละลายมีปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกวปรมิ าตร ใชป เ ปตตดดู สารละลายทีไ่ ด 10 ml แลว เจอื จางดว ยกรดไนทรกิ เจือจางจนสารละลายมี ปรมิ าตร 1 000 ml ในขวดแกว ปริมาตร ใชป เ ปตตด ดู สารละลายทีไ่ ด 10 ml แลว เจอื จางดวย กรดไนทรกิ เจอื จางจนสารละลายมปี ริมาตร 100 ml ในขวดแกว ปรมิ าตร (7) สารละลายมาตรฐานดบี กุ 5 μg /ml ชง่ั ดบี ุก 0.250 g ใหท ราบมวลแนน อน ละลายในกรดซัลฟวรกิ 10 ml ใหค วามรอ น ทาํ ใหเย็น ถายสารละลายนกี้ บั กรดไฮโดรคลอรกิ เจือจาง 400 ml ลงในขวดแกว ปรมิ าตร แลวเจือจางดว ย กรดไฮโดรคลอรกิ เจอื จาง จนสารละลายมีปรมิ าตร 500 ml ใชปเ ปตตดดู สารละลายทไ่ี ด 10 ml เจือจางดว ยกรดไฮโดรคลอรกิ เจอื จางจนสารละลายมี ปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกว ปริมาตร (8) สารละลายแบลงกข องสารละลายมาตรฐาน (Standard blank) 8.13.2.4 วิธเี ตรียมสารละลายตวั อยาง (1) ช่งั ตวั อยาง 200 mg ใสภ าชนะใสต วั อยาง เตมิ กรดไนทริก 5 ml ปดฝา แลว ใสใ นเครื่องยอย สลายสารดว ยคล่ืนไมโครเวฟ เตรียมรเี อเจนตแ บลงกโ ดยไมต อ งใสต วั อยาง (2) ยอ ยตวั อยางตามโปรแกรมทตี่ ้งั ไวต ามคูมอื ของเครอ่ื ง แลว ปลอยใหเยน็ (3) ถา ยสารละลายทีไ่ ดใ นขวดวดั ปริมาตรขนาด 50 ml เตมิ นา้ํ ปราศจากไอออนใหถงึ ขดี วดั ปริมาตร (4) นําสารละลายท่ีไดไปวิเคราะหดวยอะตอมิกแอบซอรปชันสเปกโทรโฟโตมิเตอร หรือ เคร่ืองมืออื่นที่เทียบเทา 8.13.2.5 วธิ วี เิ คราะห (1) การเตรยี มกราฟมาตรฐานสอบเทียบ (1.1) เตรยี มสารละลายมาตรฐานตะกว่ั สารละลายมาตรฐานแคดเมยี ม และสารละลาย มาตรฐานดีบุก ใหค รอบคลมุ ความเขม ขนของสารละลายตัวอยา ง (1.2) เตรยี มสารละลายแบลงกของสารละลายมาตรฐาน (1.3) วัดคา การดูดกลนื แสง ของสารละลายมาตรฐานตะก่ัว สารละลายมาตรฐานแคดเมียม และสารละลายมาตรฐานดีบุก แตละความเขมขนเทียบกับสารละลายแบลงกของ สารละลายมาตรฐาน -18-

มอก. 531–2558 (1.4) สรา งกราฟมาตรฐานสอบเทียบระหวางความเขมขนของสารละลายมาตรฐานของแต ละธาตุกบั คาการดูดกลืนแสง (2) การวเิ คราะหสารละลายตวั อยาง วัดคาการดูดกลืนแสงของสารละลายรีเอเจนตแบลงกและสารละลายตัวอยาง แลวอานคา ความเขมขนของตะกั่ว แคดเมยี ม และดีบกุ จากกราฟมาตรฐานสอบเทยี บเปน มิลลกิ รัมตอลิตร 8.13.2.6 การคาํ นวณ ปริมาณตะกว่ั แคดเมียม หรอื ดีบุก เปน ไมโครกรมั ตอ กรัม = A1  A2 ×V m เมอื่ A1 คือ ความเขมขนของตะก่ัว แคดเมียม หรือดีบุกในสารละลายตัวอยาง เปนมิลลิกรัม ตอ ลิตร A2 คอื ความเขมขนของตะกั่ว แคดเมียม หรือดีบุกในรีเอเจนตแบลงก เปนมิลลิกรัม ตอลติ ร V คือ ปริมาตรของสารละลายตัวอยา ง เปนมลิ ลิลิตร m คือ มวลของตัวอยา ง เปนกรัม 8.14 ความเปน พษิ ตอ เซลลเ น้อื เยื่อเพาะเลยี้ ง 8.14.1 เคร่อื งมอื และอปุ กรณ 8.14.1.1 เคร่ืองมือและอุปกรณท่ีจําเปนสําหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือ ไดแก ตูลามินารแอรโฟลว ตูอบเพาะเชื้อ ชนิดคารบอนไดออกไซดที่สามารถควบคุมปริมาณกาซคารบอนไดออกไซดท่ี (5+1)% กลอง จุลทรรศน ชนิดอนิ เวอเตด (inverted microscope) 8.14.1.2 อปุ กรณฆาเชอ้ื ไดแก หมอน่งึ อดั ตูอ บรอน (hot air oven) 8.14.1.3 ถาดเลี้ยงเซลลขนาด 6 หลมุ 8.14.1.4 ขวดแกวฝาเกลียวสําหรับเตรยี มตัวอยา ง 8.14.1.5 ขวดเพาะเล้ียงเซลลเ นือ้ เยื่อ (tissue culture flask) ขนาดพ้นื ท่ี 75 cm2 8.14.2 สารละลายและวธิ ีเตรยี ม 8.14.2.1 สารละลายฟอสเฟตบฟั เฟอรท ีป่ ราศจากเชอื้ ละลายโพแทสเซยี มคลอไรด 0.2 g โพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต 0.2 g โซเดยี มคลอไรด 8.0 g และไดโซเดยี มไฮโดรเจนฟอสเฟตแอนไฮดรัส 1.15 g ในนํ้ากลน่ั เตมิ นา้ํ กลน่ั จนปริมาตร เปน 1 000 ml ทาํ ใหป ราศจากเชอ้ื โดยการน่ึงฆาเช้ือในหมอ นึง่ อดั ที่อณุ หภูมิ (121+2) ºC เปน เวลา 15 min หรือกรองผานแผนกรองขนาด 0.22 μm 8.14.2.2 สารละลายโซเดียมไบคารบอเนต 100 g/l ทีป่ ราศจากเช้อื 8.14.2.3 สารละลายทรปิ ซนิ (trypsin) 0.5 g/l ถึง 5.0 g/l ที่ปราศจากเชอ้ื 8.14.2.4 สารละลายกลทู ามีน (glutamine) 29.2 g/l ทปี่ ราศจากเชอื้ -19-

มอก. 531–2558 8.14.2.5 อาหารเลี้ยงเซลลอีเกลิ ลเอม็ อเี อ็ม (Eagle's MEM) 8.14.2.6 อาหารเลยี้ งเซลลสําหรับการเจริญเตบิ โต และอาหารเลีย้ งเซลลส าํ หรบั สกดั ตวั อยาง เติมสารละลายกลูทามีน 1 ml สารละลายโซเดียมไบคารบอเนต 1.2 ml และเซรุมฟทัลโบไวน (fetal bovine serum) 5 ml ลงในอาหารเลี้ยงเซลลอีเกิลลเอ็มอีเอ็ม 100 ml โดยวิธีปราศจากเช้ือ เก็บ ไวในขวดแกวฝาเกลียวทีอ่ ณุ หภมู ิ 2 ºC ถึง 8 ºC เกบ็ ไวไ ดไมเ กิน 1 สัปดาห 8.14.2.7 สารละลายฟอรมาลิน-ครสิ ทัลไวโอเลต (formalin-crystal violet) ละลายครสิ ทัลไวโอเลต 500 mg ดวยสารละลายฟอรม าลดไี ฮด 10 ml และสารละลายฟอสเฟต บฟั เฟอร 90 ml เก็บไวทอี่ ณุ หภมู หิ อง 8.14.2.8 สียอ มทรปิ แพนบลู (trypan blue stain) 4.0 g/l เตรียมโดยละลายทริปแพนบลใู นสารละลายโซเดียมคลอไรด 0.9% 8.14.2.9 การควบคุมเชงิ บวก วัสดุควบคุมเชิงบวก (positive material control) เชน แผนพอลิไวนิลคลอไรดท่ีมีซิงกไดเอทิลได ไทโอคารบาเมต 0.1% หรือแผนยูเอสพีโพสิทีฟไบโอรีแอกชั่นอารเอส (USP Positive Bioreaction RS) 8.14.2.10 การควบคุมเชงิ ลบ วัสดุควบคุมเชิงลบ (negative material control) เชน แผนพลาสติกมาตรฐานพอลิเอทิลีน ความหนาแนนสูง (USP high density polyethylene RS) 8.14.3 การเตรยี มเซลลเ นอ้ื เยื่อเพาะเลย้ี ง 8.14.3.1 การเตรยี มสารแขวนลอยของเซลลเ น้ือเยอื่ (cell suspension) นําเซลลเน้ือเยื่อ L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929) ที่เพาะเล้ียงไวในขวดเพาะเลี้ยง เซลลขนาดพื้นท่ี 75 cm2มาลางดวยสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร เติมสารละลายทริปซิน 1 ml และ อบในตูอบเพาะเชื้อชนิดคารบอนไดออกไซดที่อุณหภูมิ (37 + 1) °C เปนเวลา 3 min ถึง 5 min เคาะขวดเบาๆ จนเซลลหลุดรอนจากพ้ืนผิวขวด แลวจึงเติมอาหารเล้ียงเซลลสําหรับการ เจริญเติบโต 5 ml ลงในขวด เขยาขวดใหไดสารแขวนลอยของเซลลเปนเนื้อเดียวกัน นําสาร แขวนลอยท่ีไดน้ีไปวัดความเขมขนของเซลล โดยดูดสารแขวนลอยของเซลล 0.1 ml มาผสมกับสี ยอมทริปแพนบลู 0.1 ml ทิ้งไว 1 min แลวนับจํานวนเซลลที่มีชีวิตพรอมท้ังคํานวณความเขมขน ของเซลลในสารแขวนลอยโดยใชเครื่องนับเม็ดเลือด เจือจางสารแขวนลอยของเซลลนี้ดวยอาหาร เลี้ยงเซลลสําหรับการเจรญิ เตบิ โตใหไดค วามเขมขน 2×105 เซลลตอ 1 ml 8.14.3.2 นาํ เซลลเ นอื้ เยอ่ื เพาะเลย้ี งท่ีมคี วามเขม ขน 2×105 เซลลตอ 1 ml เตมิ ลงในถาดเล้ยี งเซลลข นาด 6 หลุม หลมุ ละ 3 ml แลว นําไปอบในตอู บเพาะเชอ้ื ชนดิ คารบอนไดออกไซดท ่ีอณุ หภมู ิ (37 + 1) ºC เปนเวลาไมนอยกวา 1 วัน จนเซลลโ ตเปน ชัน้ เดยี่ ว (monolayer) อยางนอย 80% ของพ้ืนทีเ่ ลี้ยงเซลล -20-

มอก. 531–2558 8.14.4 วิธีทดสอบ (1) การเตรยี มชิ้นพลาสตกิ ตวั อยางและวสั ดุควบคมุ (1.1) การเตรยี มชน้ิ พลาสตกิ ตวั อยาง ตดั ภาชนะพลาสตกิ ตัวอยางอยา งนอ ย 2 ชน้ิ ใหมพี น้ื ทีผ่ วิ ชน้ิ ละไมน อยกวา 100 mm2 ใส ลงในขวดแกว ฝาเกลยี ว ลางและนึ่งฆาเชื้อในหมอนง่ึ อัด หรอื โดยวธิ อี นื่ ท่ไี มท าํ ให ตัวอยา งเสยี สภาพ (1.2) การเตรยี มวสั ดคุ วบคมุ เตรียมวัสดคุ วบคมุ เชิงบวกและวสั ดคุ วบคมุ เชิงลบ ตามวธิ ีในขอ 8.14.4 (1.1) (2) ดูดอาหารเลยี้ งเซลลใ นถาดเลยี้ งเซลลแตล ะหลมุ ออก (3) เติมอาหารเล้ยี งเซลลส าํ หรบั การเจรญิ เตบิ โต หลุมละ 0.8 ml (3.1) วางชน้ิ ตวั อยางทดสอบ 2 หลมุ ๆ ละ 1 ช้นิ (3.2) วางวสั ดุควบคมุ เชงิ บวก 2 หลุมๆ ละ 1 ช้นิ (3.3) วางวัสดุควบคมุ เชงิ ลบ 1 หลุมๆ ละ 1 ชน้ิ (3.4) เตมิ อาหารเลีย้ งเซลลส ําหรับการเจริญเตบิ โตเพ่อื ใชเ ปน แบลงก 1 หลุม (4) นาํ ถาดเล้ียงเซลลไ ปอบในตอู บเพาะเชอื้ ชนดิ คารบ อนไดออกไซดท่อี ณุ หภูมิ (37 + 1) °C เมือ่ ครบ ระยะเวลา 24 h ใหประเมนิ ผลตามวธิ ใี นขอ 8.14.5 8.14.5 การประเมินผล หลังจากปลอ ยใหเ ซลลเ นอ้ื เย่ือเพาะเลีย้ งในถาดเล้ยี งเซลลส ัมผัสกบั ชนิ้ พลาสติกตัวอยาง ชิน้ วัสดุควบคุม และแบลงก เปนเวลา 24 h ดูความเปนพิษท่ีเกิดกับเซลล การเปลี่ยนแปลงรูปราง (morphological change) และความหนาแนนของเซลลท ่มี ชี วี ิต (cell density) ดวยกลอ งจุลทรรศนชนิดอินเวอเตด บันทึก การตายของเซลลโดยดูลักษณะของเซลลและวงท่ีเกิดข้ึนจากปฏิกิริยา แลวประเมินผลตามตารางที่ 2 หลังจากบันทึกผลที่ 24 h แลว ถาตองการเก็บเซลลบนถาดเล้ียงเซลลไวเปนเวลานาน ใหยึด (fix) และ ยอมสีเซลลติดบนถาดเลี้ยงเซลล ดวยสารละลายฟอรมาลิน-คริสทัลไวโอเลต เพื่อเก็บไวเปนหลักฐาน สําหรับการตรวจสอบ -21-

มอก. 531–2558 ตารางที่ 2 การประเมินระดับความเปน พิษตอ เซลลเน้ือเยื่อเพาะเล้ยี ง (ขอ 8.14.5) ระดับ ปฏกิ ิริยา ลักษณะของวงท่เี กิดขน้ึ จากปฏกิ ิรยิ า (grade) (reactivity) (description of reactivity zone) 0 ไมม พี ษิ ไมพบวงรอบๆ หรือภายใตช ิ้นพลาสตกิ ตวั อยา ง (none) 1 เปนพิษนอยมาก พบเซลลม ีรูปรา งผิดปกติภายใตช นิ้ พลาสติกตวั อยาง (slight) 2 เปนพษิ นอ ย มเี ซลลตายเปนวงจาํ กัดอยใู นพน้ื ท่ใี ตชน้ิ พลาสตกิ ตวั อยา ง (mild) 3 เปน พษิ ปานกลาง มเี ซลลตายเปนวงแผข ยายออกจากช้ินพลาสติกตวั อยาง (moderate) ไมเ กิน 1.0 cm 4 เปนพิษรนุ แรง มีเซลลตายเปน วงแผข ยายออกจากชน้ิ พลาสตกิ ตวั อยา ง (severe) มากกวา 1.0 cm 8.14.6 การแปลผล (1) การทดสอบจะมผี ลเชือ่ ถือไดต อเมือ่ (1.1) แบลงกแ ละวสั ดคุ วบคมุ เชงิ ลบ ไมเปน พษิ ตอเซลล (ความเปน พิษระดบั 0) (1.2) วัสดคุ วบคมุ เชงิ บวก มีความเปนพิษตอเซลลระดับ 3 ข้ึนไป (2) เกณฑการตัดสนิ ผลการทดสอบจะถือวาตัวอยางไมเปนพิษตอเซลลเน้ือเย่ือเพาะเลี้ยงเมื่อช้ินพลาสติกตัวอยางมี ความเปนพิษตอ เซลลไมมากกวาระดบั 2 8.14.7 กรณีไมส ามารถทดสอบโดยวิธขี างตนได ใหท าํ การทดสอบโดยวธิ ตี อ ไปน้ี 8.14.7.1 วิธีทดสอบ (1) การเตรยี มสารละลายทดสอบ (1.1) ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางแตละหนวยตรงบริเวณที่มีความหนาสม่ําเสมอและโคง นอยที่สุดใหไดช้ินพลาสติกพื้นท่ีเทาๆ กัน นํามารวมกันใหพื้นท่ีผิวทั้งสองดาน รวมกันได 120 cm2 สําหรับภาชนะพลาสติกหนานอยกวา 0.5 mm หรือ 60 cm2 สําหรับภาชนะพลาสติกหนาเทากับหรือมากกวา 0.5 mm แลวนํามาตัดออกเปนชิ้น ยอยขนาดกวางประมาณ 0.1 cm ถึง 0.3 cm และยาวประมาณ 1 cm ถึง 5 cm ใสใน -22-

มอก. 531–2558 ขวดแกวฝาเกลียวสําหรับสกัดตัวอยาง ลางและนึ่งฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดความดันหรือ โดยวธิ ีอ่นื ทไ่ี มท าํ ใหต วั อยางเสียสภาพ (1.2) เติมอาหารเล้ียงเซลลสําหรับสกัดตัวอยาง ปริมาตร 20 ml แลวนําไปบมในตูอบเพาะ เชือ้ ชนิดคารบ อนไดออกไซด ท่ี (37+1)°C เปน เวลา (24+1) h เขยาขวดเปน ระยะ (2) การเตรยี มสารละลายควบคุม (เลือกขอ ใดขอ หนง่ึ ) (2.1) เตรียมสารละลายวัสดุควบคุมเชิงบวกและสารละลายวัสดุควบคุมเชิงลบ โดยสกัด วัสดุควบคมุ เชิงบวกและวัสดุควบคมุ เชงิ ลบ ตามวธิ ใี นขอ (1.1) (2.2) เตรียมสารเคมีควบคุมเชิงบวกและสารเคมีควบคุมเชิงลบ โดยเตรียมสารละลายซิงก แอซิเทตในอาหารเล้ียงเซลลสําหรับสกัดตัวอยางท่ีความเขมขน 8 mg/l และ 2 mg/l ตามลําดบั (3) ดูดอาหารเลี้ยงเซลลในถาดเลย้ี งเซลลแตล ะหลมุ ออก (4) เติมสารละลายทดสอบและสารละลายควบคุมดังตอไปน้ีลงสัมผัสกับเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง หลมุ ละ 3 ml (4.1) สารละลายทดสอบ โดยเตมิ 2 หลุม (4.2) สารละลายวัสดุควบคุมเชิงบวก และ/หรือสารละลายซิงกแอซีเทต 8 mg/l โดยเติม 2 หลมุ (4.3) สารละลายวัสดุควบคุมเชิงลบ และ/หรือสารละลายซิงกแอซีเทต 2 mg/l โดยเติม 1 หลมุ (4.4) อาหารเล้ียงเซลลส ําหรับสกดั ตัวอยา งเพอื่ ใชเ ปนแบลงก โดยเตมิ 1 หลุม (5) นําถาดเลี้ยงเซลลไปอบในตูอบเพาะเช้ือชนิดคารบอนไดออกไซดที่อุณหภูมิ (37+1) °C เมื่อ ครบระยะเวลา 48 h ใหประเมินผลตามวธิ ีในขอ (6) (6) การประเมนิ ผล หลังจากปลอยใหเซลลเน้ือเย่ือเพาะเล้ียงในถาดเล้ียงเซลลสัมผัสกับสารละลายทดสอบ สารละลายควบคุมและแบลงก เปนเวลา 48 h แลว ดูความเปนพิษที่เกิดกับเซลล โดยดู ลักษณะของเซลลดวยกลองจุลทรรศน บันทึกการตายของเซลล การเปล่ียนแปลงรูปราง (morphological change) และความหนาแนนของเซลลที่มีชีวิต (cell density) แลวประเมินผล ตามตารางท่ี 3 หลังจากบันทึกผลท่ี 48 h แลวและตองการเก็บเซลลบนถาดเลี้ยงเซลลไวเปน เวลานาน ใหยึด (fix) และยอมสีเซลลใหติดบนถาดเล้ียงเซลลดวยสารละลายฟอรมาลิน-คริสทัลไว โอเลต -23-

มอก. 531–2558 (7) การแปลผล (7.1) การทดสอบจะมีผลเช่อื ถอื ไดต อเม่ือ (7.1.1) แบลงก สารละลายซิงกแอซีเทตความเขมขน 2 mg/l หรือสารละลายวัสดุ ควบคุมเชงิ ลบ ไมเปน พษิ ตอ เซลล (ความเปนพษิ ระดับ 0) (7.1.2) สารละลายซิงกแอซีเทตความเขมขน 8 mg/l หรือสารละลายวัสดุควบคุม เชิงบวก มคี วามเปนพษิ ตอ เซลลระดับ 3 ขน้ึ ไป (7.2) เกณฑตัดสนิ ผลการทดสอบจะถือวาตัวอยางไมเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงเมื่อสารละลาย ทดสอบมีความเปนพษิ ตอ เซลลไ มม ากกวา ระดับ 2 ตารางที่ 3 การประเมินระดบั ความเปน พษิ ตอ เซลลเน้อื เยื่อเพาะเลย้ี ง (ขอ 8.14.7.1(6)) ระดบั ปฏกิ ิรยิ า สภาพของเซลลเ น้ือเยือ่ (grade) (reactivity) (conditions of cell cultures) 0 ไมเปน พษิ พบเซลลแผเ ปน ช้นั เดยี่ ว มเี มด็ อินทราไซโตพลาสมิก (none) (intracytoplasmic granule) กระจายอยใู นเซลลตามปกติ ไมพบ การแตกทาํ ลายของเซลล 1 เปนพษิ นอ ยมาก พบเซลลมีลักษณะกลมใกลห ลดุ ออกจากพน้ื ผวิ ไมเ กนิ 20% (slight) อาจพบการแตกทาํ ลายของเซลลไ ดบาง 2 เปน พิษนอ ย พบเซลลม ลี ักษณะกลมไมเ กิน 50% อาจพบการแตกทาํ ลายของ (mild) เซลลแ ตไ มรนุ แรง และไมพ บชอ งวา งระหวางเซลลช้นั เดย่ี ว 3 เปนพษิ ปานกลาง พบเซลลม ีลกั ษณะกลม หรอื พบการแตกทําลายของเซลลไมเ กิน (moderate) 70% 4 เปนพิษรนุ แรง (severe) พบการทําลายของเซลลชน้ั เดยี่ วเกอื บทั้งหมดหรอื ทง้ั หมด 8.15 สารไพโรเจน ใหใ ชว ธิ ที ดสอบท่ีกาํ หนดตอ ไปนี้ ซึง่ ปฏบิ ตั ิตามหลักการใน USP35 หวั ขอ Bacterial Endotoxins Test โดย มีวธิ ีการทดสอบ 2 วธิ ี คอื เจลคล็อตเทคนิค (gel-clot technique) และโฟโตเมทรกิ เทคนคิ (photometric technique) สามารถเลือกทดสอบดวยวธิ ีใดวิธีหนง่ึ -24-

มอก. 531–2558 8.15.1 เครื่องมอื และอปุ กรณ เคร่อื งมือและอุปกรณท ุกชนดิ ตองปราศจากสารไพโรเจน สําหรับอปุ กรณท่ีทนความรอ นใหทําลาย สาร ไพโรเจนดว ยความรอ นแหง (dry heat sterilization) ในกรณีอปุ กรณท ใ่ี ชเปนพลาสตกิ หรอื ไมส ามารถ ทนความรอ นสูงได ตอ งเลือกใชเ ฉพาะผลิตภัณฑทปี่ ราศจากสารไพโรเจน 8.15.1.1 ตูอบเพาะเช้อื ควบคมุ อุณหภมู ิไดท่ี (37 +1) °C 8.15.1.2 ลมิ ูลสั อะมโี บไซตไลเสตรเี อเจนต (Limulus Amebocyte Lysate (LAL) reagent) 8.15.1.3 สารมาตรฐานเอ็นโดทอ็ กซิน 8.15.1.4 แอลเอแอลรีเอเจนตว อเตอร (LAL reagent water) เอ็นโดทอ็ กซินไมเ กิน 0.005 หนว ยเอน็ โดท็อก ซนิ ตอ มิลลลิ ติ รหรือนอ ยกวาความไวของแอลเอแอลรีเอเจนตท ใ่ี ช 8.15.1.5 นํา้ กลนั่ สาํ หรบั ทาํ ยาฉดี ทไ่ี ดผ า นการตรวจแบคทเี รียลเอน็ โดทอ็ กซนิ แลว 8.15.1.6 หลอดแกว ขนาด 10 mm x 75 mm เปน หลอดทําปฏิกริ ิยา (reaction tube) สาํ หรบั เจลคล็อตเทคนคิ 8.15.1.7 หลอดแกว ขนาด 16 mm x 125 mm หรือ 13 mm x 100 mm เปนหลอดสาํ หรับเจือจาง (dilution tube) 8.15.1.8 ถาดเลี้ยงเซลลข นาด 96 หลมุ ชนดิ พอลิสไตรนี ปราศจากเชอ้ื และสารไพโรเจนสาํ หรบั โฟโทเมตรกิ เทคนคิ 8.15.1.9 ไมโครปเ ปตตและทปิ 8.15.1.10 เครื่องผสม (vortex mixer) 8.15.1.11 นาฬิกาจับเวลา 8.15.1.12 เตาหลุมไฟฟา หรอื อางนํ้ารอ นสาํ หรบั เจลคลอ็ ตเทคนิค 8.15.1.13 เครอ่ื งอานผลวเิ คราะหถ าดเลีย้ งเซลล (microplate reader) ท่สี ามารถควบคมุ อุณหภมู ิที่ (37+1) °C พรอ มโปรแกรมตรวจหาสารเอ็นโดท็อกซินสําหรบั โฟโทเมตริกเทคนคิ 8.15.2 การเตรยี มสารละลายทดสอบ ใชภาชนะพลาสติกตัวอยางจํานวน 3 ใบ ถึง 10 ใบ สําหรับการทดสอบในแตละครั้ง ลางภายในภาชนะ พลาสติกตวั อยา งดว ยน้ํากล่นั สําหรบั ทาํ ยาฉีดจาํ นวนไมนอ ยกวา 20% ของความจุ เขยาใหนํ้ากล่ันสัมผัส ผิวภายในจนท่ัว แลวเททิ้ง ทําซ้ําอีกคร้ัง แลวเติมน้ํากล่ันสําหรับทํายาฉีดจํานวนเทากับความจุของ ภาชนะพลาสติกตัวอยาง นําไปอบในตูอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ (37+1) °C เปนเวลาไมนอยกวา 1 h นํา สารละลายสกดั จากภาชนะพลาสติกตวั อยางทั้งหมดมาผสมรวมกนั สาํ หรับการทดสอบ -25-

มอก. 531–2558 8.15.3 การคาํ นวณคา การเจือจางใชไดสูงสุด (maximum valid dilution, MVD) (1) คํานวณปริมาณขดี จํากดั เอ็นโดทอ็ กซิน KxN V ปรมิ าณขดี จาํ กดั เอ็นโดทอ็ กซินของสารละลายทดสอบ = เม่ือ K คอื ปริมาณขีดจํากัดเอ็นโดท็อกซินของอุปกรณการแพทยตามมาตรฐาน USP เทากบั 20 หนว ยเอ็นโดทอ็ กซินตออปุ กรณ N คือ จาํ นวนช้ินตัวอยา งท่ีใชในการทดสอบ V คอื ปริมาตรรวมของสารสะลายทดสอบ (2) คํานวณคา การเจอื จางใชไดส งู สดุ (MVD) MVD = ปริมาณขีดจำกดั เอน็ โดท็อกซนิ ( จากขอ 8.15.3(1))  เม่ือ  คอื ความไวของแอลเอแอลรเี อเจนต 8.15.4 สารละลายและวธิ เี ตรยี ม สารละลายท่ีเตรียมตอไปน้ี ตองทําการเตรียมในวันที่ทําการทดสอบ และไมควรนําสารละลายท่ีเหลือ หลังจากเสร็จสิ้นการทดสอบแลวกลับมาใชอีก ยกเวนสารละลายเขมขนเอ็นโดท็อกซิน สามารถเก็บไว ในตเู ยน็ ที่อุณหภูมิ 2 °C ถึง 8 °C ไดไ มเกิน 4 สัปดาห 8.15.4.1 สารละลายเขม ขนเอ็นโดท็อกซิน ปเปตตแอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอร ตามปริมาตรที่ระบุโดยผูทํา ลงในผงแหงของสารมาตรฐาน เอ็นโดท็อกซิน และผสมโดยใชเครื่องผสม เปนเวลา 30 min หรือตามท่ีผูทําระบุ จะไดสารละลาย เอน็ โดท็อกซนิ มีความแรงตามท่ีระบใุ นใบรบั รองของผทู ํา 8.15.5 วธิ ที ดสอบ สารละลายทดสอบตองผานการทดสอบฤทธิ์ยับย้ังหรือกระตุนการเกิดปฏิกิริยา (test for interfering factors หรือ inhibition/enhancement test) ตามหลักการท่ีระบุใน USP ถาพบวาสารละลายทดสอบมี ฤทธ์ิยับยั้งหรือกระตุนการเกิดปฏิกิริยา ใหเจือจางสารละลายทดสอบดวยแอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอร กอนนํามาทาํ การทดสอบโดยคา การเจือจาง ตอ งไมเกนิ คา MVD 8.15.5.1 วธิ เี จลคลอ็ ตเทคนคิ (1) การทดสอบยนื ยันความไวของสารละลายลมิ ลู ัสอะมีโบไซตไลเสตรเี อเจนต เปนการทดสอบเพื่อยืนยันความไวของของสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนต ตามท่รี ะบุไวใ นฉลาก ซึง่ ตอ งทําการทดสอบทุกครั้งเม่อื มีการเปล่ียนรุนการผลิต (1.1) นําสารละลายเขมขนเอ็นโดท็อกซินท่ีเตรียมตาม 8.15.4.1 มาทําการเจือจางตอดวย แอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอร ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินท่ีมีความแรงครอบคลุม ความไวของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต (Lysate sensitivity) ที่ 2 1 0.5 และ 0.25 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับการเจือจาง ตองนํา -26-

มอก. 531–2558 สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเคร่ืองผสมอยางนอย 1 min กอนนําไป ทําการเจือจางตอไป (1.2) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปน้ีลงในหลอดทําปฏิกิริยาโดยเติม สารละลายแตล ะชนดิ ปรมิ าตร 100 μl ตอ หลอด ชนดิ ละ 4 หลอด (1.2.1) สารละลายควบคุมเชิงลบ (negative control) ใหเติมแอลเอแอลรีเอเจนต วอเตอร (1.2.2) สารละลายมาตรฐานเอน็ โดทอ็ กซินที่มคี วามแรง 2 1 0.5 และ 0.25 หนว ยเอ็นโดทอ็ กซินตอมลิ ลลิ ิตร (1.3) นําหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดไปอุนในเตาหลุมไฟฟาหรืออางน้ํารอนท่ีอุณหภูมิ (37  1) °C เปน เวลาประมาณ 10 min (1.4) เติมแอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอรลงในผงแหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนต ตามปริมาตรท่ีระบุบนฉลากหรือใบรับรองที่มาพรอมกับชุดน้ํายา ผสมเบาๆจนผง แหง ของลิมลู สั อะมีโบไซตไ ลเสตละลายหมด (1.5) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 μl ลงในหลอดทําปฏิกิริยาแต ละหลอด แกวงหลอดเบาๆ ระวังอยาใหเกิดฟอง เริ่มทําการจับเวลาต้ังแตเติม สารละลายลมิ ูลสั อะมโี บไซตไลเสตลงในหลอดทาํ ปฏกิ ิริยาหลอดแรกเสรจ็ (1.6) บม หลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดในเตาหลุมไฟฟาหรืออางนํ้ารอนท่ีอุณหภูมิ (37 1) °C เปน เวลา (60  2) min หลีกเล่ียงการวางในบรเิ วณท่สี ่ันสะเทือน (1.7) ดูผลการเกิดเจลในหลอดทําปฏิกิริยา โดยคว่ําหลอด 180๐ ถาเจลที่เกิดข้ึนคงสภาพ โดยไมไหลลงมาจากกนหลอด ใหบันทึกเปนผลบวก แตถาไมเกิดเจล หรือเจลเสีย สภาพไหลลงมา ใหบันทึกเปนผลลบ การยกหลอดขึ้นดูผลตองทําดวยความ ระมัดระวัง เพราะเจลท่เี กิดขน้ึ คอ นขา งเปราะและแตกงา ย (1.8) การประเมินผล (1.8.1) บันทึกคาจุดยุติ (endpoint) คือ ความเขมขนตํ่าสุดของสารละลายเอ็นโด ทอ็ กซินทใ่ี หผลบวก (1.8.2) คํานวณคามัชฌิมเรขาคณิตของจุดยุติ (geometric mean endpoint)โดย แปลงคาจุดยุติแตละคาเปน log10 endpoint แลวหาคาเฉล่ีย คาแอนตี้ล็อก (antilog) ของคาเฉลยี่ คอื คามชั ฌมิ เรขาคณิตของจดุ ยุติ (1.8.3) ความไวของนํ้ายาลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตนํามาใชได ถาคามัชฌิม เรขาคณติ ของจุดยุติ อยใู นชว ง 0.5 ถึง 2 -27-

มอก. 531–2558 (2) การทดสอบฤทธิ์ยับยงั้ หรอื กระตนุ การเกิดปฏิกิรยิ าของสารละลายทดสอบ (2.1) เตรียมตัวอยา งโดยการเจอื จางใหไดค วามเขม ขนทจี่ ะทดสอบ แตต อ งไมเ กนิ MVD (2.2) นําสารละลายเขมขนเอ็นโดท็อกซินท่ีเตรียมตาม 8.15.4.1 มาเจือจางตอดวย สารละลายตัวอยางที่เตรียมในขอ (2.1) ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง 2 1 0.5 และ 0.25 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับการเจือ จาง ตอ งนําสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเครื่องผสมอยางนอย 1 min กอนนาํ ไปทาํ การเจือจางตอ ไป (2.3) นําสารละลายเขมขนแบคทีเรียลเอ็นโดท็อกซินท่ีเตรียมตาม 8.15.4.1 มาทําการเจือ จางตอดวยแอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอร ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินท่ีมีความแรง 2 1 0.5 และ 0.25 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับการเจือ จาง ตองนาํ สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเครื่องผสมอยางนอย 1 min กอ นนําไปทําการเจอื จางตอ ไป (2.4) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปนี้ลงในหลอดทําปฏิกิริยาโดยเติม สารละลายแตล ะชนดิ ปรมิ าตร 100 μl ตอหลอด ชนดิ ละ 2 หลอด (2.4.1) สารละลายควบคุมเชิงลบ (negative control) ใหเติมแอลเอแอลรีเอเจนต วอเตอร (2.4.2) สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินท่ีเจือจางดวยแอลเอแอลรีเอเจนต วอเตอรท่ีมีความแรง 2 1 0.5 และ 0.25 หนวยเอ็นโดท็อกซิน ตอ มิลลลิ ติ ร (2.5) เติมสารละลายตอ ไปนล้ี งในหลอดทําปฏิกิริยาโดยเติมสารละลายแตล ะชนิด ปริมาตร 100 μl ตอ หลอด ชนิดละ 4 หลอด (2.5.1) สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินท่ีเจือจางดวยสารละลายตัวอยางท่ีมี ความแรง 2 1 0.5 และ 0.25 หนว ยเอน็ โดทอ็ กซินตอมิลลลิ ติ ร (2.5.2) สารละลายตัวอยาง (2.6) นําหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดไปอุนในเตาหลุมไฟฟาหรืออางนํ้ารอนท่ีอุณหภูมิ (37  1) °C เปนเวลาประมาณ 10 min (2.7) เติมแอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอรลงในผงแหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนต ตามปริมาตรท่ีระบุบนฉลากหรือใบรับรองท่ีมาพรอมกับชุดน้ํายา ผสมเบาๆจนผง แหง ของลิมลู สั อะมโี บไซตไลเสตละลายหมด -28-

มอก. 531–2558 (2.8) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 μl ลงในหลอดทําปฏิกิริยาแต ละหลอด แกวงหลอดเบาๆ ระวังอยาใหเกิดฟอง เริ่มทําการจับเวลาตั้งแตเติม สารละลายลมิ ลู สั อะมโี บไซตไ ลเสตลงในหลอดทาํ ปฏิกิริยาหลอดแรกเสร็จ (2.9) บมหลอดทําปฏิกิริยาท้ังหมดในเตาหลุมไฟฟาหรืออางนํ้ารอนท่ีอุณหภูมิ (371) °C เปน เวลา (60  2) min หลกี เล่ยี งการวางในบรเิ วณทสี่ ัน่ สะเทอื น (2.10) ดูผลการเกิดเจลในหลอดทําปฏิกิริยา โดยคว่ําหลอด 180๐ ถาเจลท่ีเกิดข้ึนคงสภาพ โดยไมไหลลงมาจากกนหลอด ใหบันทึกเปนผลบวก แตถาไมเกิดเจลหรือเจลเสีย สภาพไหลลงมา ใหบันทึกเปนผลลบ การยกหลอดข้ึนดูผลตองทําดวยความ ระมัดระวงั เพราะเจลทเ่ี กดิ ขนึ้ คอ นขา งเปราะและแตกงาย (2.11) การประเมินผล (2.11.1) บันทึกคาจุดยุติ คือ ความเขมขนต่ําสุดของสารละลายเอ็นโดท็อกซินที่ให ผลบวก (2.11.2) คํานวณคามัชฌิมเรขาคณิตของจุดยุติ โดยแปลงคาจุดยุติแตละคาเปน log10 endpoint แลวหาคาเฉลี่ย คาแอนต้ีล็อกของคาเฉลี่ย คือ คามัชฌิม เรขาคณิตของจุดยตุ ิ (2.11.3) ตัวอยางที่ความเขมขนท่ีทดสอบ ไมมีฤทธ์ิยับยั้งหรือกระตุนปฏิกิริยา (interfering factor) ถาคามัชฌิมเรขาคณิตของจุดยุติของสารละลายเอ็น โดท็อกซินที่เจือจางดวยดวยสารละลายตัวอยางอยูในชวง 0.5 ถึง2 หนว ยเอน็ โดท็อกซนิ ตอ มิลลลิ ิตร (2.11.4) ตัวอยางที่ความเขมขนที่ทดสอบ มีฤทธ์ิยับย้ังปฏิกิริยา ถาคามัชฌิม เรขาคณิตของจุดยุติของเอ็นโดทอกซินในตัวอยางมากกวา 2 หนวย เอ็น โดท็อกซินตอ มลิ ลิลิตร (2.11.5) ตัวอยางที่ความเขมขนที่ทดสอบ มีฤทธ์ิกระตุนปฏิกิริยา ถาคามัชฌิม เรขาคณิตของจุดยุติของเอ็นโดท็อกซินในตัวอยางตํ่ากวา 0.5 หนวย เอ็น โดท็อกซินตอ มลิ ลิลติ ร (3) การทดสอบหาการปนเปอ นของแบคทีเรยี ลเอ็นโดท็อกซนิ ของสารละลายทดสอบ (3.1) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปนี้ลงในหลอดทําปฏิกิริยาโดยเติม สารละลายแตละชนดิ ปริมาตร 100 μl ตอหลอด ชนดิ ละ 2 หลอด (3.1.1) สารละลายควบคุมเชิงลบ ใหเ ตมิ แอลเอแอลรเี อเจนตวอเตอร (3.1.2) สารละลายควบคุมเชิงบวก (positive control) ใหเติมสารละลายมาตรฐาน เอ็นโดทอ็ กซนิ ทมี่ ีความแรง 2 หนวยเอ็นโดทอ็ กซินตอ มิลลิลติ ร -29-

มอก. 531–2558 (3.1.3) สารละลายทดสอบ (sample tested) ใหเติมสารละลายทดสอบหรือ สารละลายทดสอบท่ีเจอื จาง (3.1.4) สารละลายทดสอบเชิงบวก (positive product control) ใหเติมสารละลาย มาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง 2 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอ มิลลิลิตร ซ่ึงเตรียมโดยการเจือจางในสารละลายทดสอบหรือสารละลาย ทดสอบทเี่ จือจาง (3.2) นําหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดไปอุนในเตาหลุมไฟฟาหรืออางนํ้ารอนที่อุณหภูมิ (37  1) °C เปนเวลาประมาณ 10 min (3.3) เติมแอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอรลงในผงแหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนต ตามปริมาตรที่ระบุบนฉลากหรือใบรับรองท่ีมาพรอมกับชุดนํ้ายา ผสมเบาๆจนผง แหงของลมิ ูลัสอะมีโบไซตไลเสตละลายหมด (3.4) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 μl ลงในหลอดทําปฏิกิริยาแต ละหลอด แกวงหลอดเบาๆ ระวังอยาใหเกิดฟอง เริ่มทําการจับเวลาตั้งแตเติม สารละลายลิมลู ัสอะมโี บไซตไ ลเสตลงในหลอดทําปฏกิ ิริยาหลอดแรกเสรจ็ (3.5) บมหลอดทําปฏิกิริยาท้ังหมดในเตาหลุมไฟฟาหรืออางน้ํารอนท่ีอุณหภูมิ (371) °C เปนเวลา (60  2) min หลกี เล่ยี งการวางในบริเวณทีส่ นั่ สะเทอื น (3.6) ดูผลการเกิดเจลในหลอดทําปฏิกิริยา โดยควํ่าหลอด 180๐ ถาเจลที่เกิดขึ้น คงสภาพ โดยไมไหลลงมาจากกนหลอด ใหบันทึกเปนผลบวก แตถาไมเกิดเจล หรือเจลเสีย สภาพไหลลงมา ใหบันทึกเปนผลลบ การยกหลอดข้ึนดูผลตองทําดวยความ ระมัดระวงั เพราะเจลทเี่ กดิ ข้นึ คอนขางเปราะและแตกงาย (3.7) การประเมินผล ผลการทดสอบจะมผี ลเชอื่ ถอื ไดเ ม่อื (3.7.1) ผลการทดสอบของสารละลายควบคุมเชงิ ลบไดผลลบ (3.7.2) ผลการทดสอบของสารละลายควบคุมเชิงบวกไดผ ลบวก (3.7.3) ผลการทดสอบของสารละลายทดสอบเชงิ บวกไดผ ลบวก (4) เกณฑการตดั สนิ ผลการทดสอบจะถือวา ตัวอยางเปน ไปตามมาตรฐาน ถามีปริมาณสารเอ็นโดท็อกซินนอยกวา ปริมาณขีดจาํ กัดเอ็นโดท็อกซนิ -30-

มอก. 531–2558 8.15.5.2 วธิ โี ฟโตเมทริกเทคนคิ ประกอบดวยวิธีเทอบิไดเมตริก (Turbidimetric) และโครโมเจนิค (Chromogenic) ซึ่งนํ้ายาท่ีใชใน การทดสอบจะมีรายละเอียดบางสวนของวิธีการทดสอบท่ีแตกตางกันไปตามบริษัทผูทํากําหนด ผู วิเคราะหสามารถปรับข้ันตอนการทดสอบบางสวนใหไดตามความเหมาะสมกับน้ํายาท่ีใชวิธี ทดสอบท่กี าํ หนดตอ ไปนี้ เปน ไปตามขั้นตอนพืน้ ฐานที่ระบใุ น USP (1) การทดสอบยนื ยนั ความไวของสารละลายลมิ ูลสั อะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนต เปนการทดสอบเพ่ือยืนยันความไวของของสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนต ตามท่รี ะบไุ วใ นฉลาก ซึ่งตอ งทาํ การทดสอบทกุ คร้งั เม่อื มีการเปล่ยี นรนุ การผลิต (1.1) ปอ นขอมูลน้าํ ยาทีใ่ ชใ นการทดสอบ และกาํ หนดตําแหนงของสารละลายควบคุมและ สารละลายเอ็นโดท็อกซินในแผนแบบถาดเลี้ยงเซลล (microplate template) ลงใน โปรแกรมตรวจหาสารเอ็นโดทอ็ กซนิ (1.2) นําสารละลายเขมขนแบคทีเรียลเอ็นโดท็อกซินท่ีเตรียมตาม 8.15.4.1 มาทําการเจือ จางตอดวยแอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอร ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินท่ีมีความแรง ครอบคลุมความไวของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต (Lysate sensitivity) ที่ 1 10 100 และ 1 000 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับการเจือจาง ตองนําสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเคร่ืองผสมอยางนอย 1 min กอ นนําไปทาํ การเจอื จางตอ ไป (1.3) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปนี้ลงในหลุมของถาดเลี้ยงเซลล โดยเติม สารละลายแตละชนิด ปริมาตร 100 μl ตอหลุม ชนิดละ 3 หลุม ตามตําแหนงที่ กาํ หนดในแผนแบบถาดเลี้ยงเซลล (1.3.1) สารละลายควบคุมเชิงลบ (negative control) ใหเติมแอลเอแอลรีเอเจนตวอ เตอร (1.3.2) สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง 1 10 100 และ 1 000 หนว ยเอน็ โดท็อกซินตอมิลลิลติ ร (1.4) นําถาดเล้ียงเซลลไปอุนในเครื่องอานผลวิเคราะหถาดเล้ียงเซลลที่อุณหภูมิ (37 1) °C เปน เวลาประมาณ 10 min (1.5) เติมแอลเอแอลรีคอนสติติวช่ันบัฟเฟอร (LAL Reconstitution Buffer) หรือตัวทํา ละลายที่ผูทํากําหนด ตามปริมาตรท่ีระบุบนฉลาก หรือใบรับรองที่มาพรอมกับชุด นํ้ายา ลงในผงแหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนต ผสมเบาๆจนผงแหงของ ลมิ ลู ัสอะมีโบไซตไลเสตรเี อเจนตละลายหมด -31-

มอก. 531–2558 (1.6) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 μl ลงในหลุมทําปฏิกิริยาทุก หลุมจนครบ แลว เริ่มการทํางานของโปรแกรมตรวจหาสารเอ็นโดทอ็ กซนิ (1.7) เมื่อส้ินสุดการทดสอบ โปรแกรมจะทําการสรางกราฟมาตรฐานและคํานวณ คา พารามเิ ตอรต า งๆใหโดยอตั โนมตั ิ (1.8) การประเมนิ ผล (1.8.1) คาสัมบูรณ (absolute value) ของคาสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ (Correlation Coefficient, r) ของกราฟมาตรฐานตองมากกวาหรือเทา กบั 0.980 (1.8.2) คาของเวลาที่ทําปฏิกิริยา (reaction time) ท่ีวัดไดจากสารละลายมาตรฐาน เอน็ โดทอ็ กซินแตล ะความเขม ขน ตองมี % CVนอยกวา 10% (2) การทดสอบหาการปนเปอนของแบคทเี รยี ลเอน็ โดทอ็ กซินของสารละลายทดสอบ (2.1) ปอนขอมูลนํ้ายาท่ีใชในการทดสอบ และกําหนดตําแหนงของสารละลายควบคุม สารละลายทดสอบและสารละลายเอ็นโดท็อกซินในแผนแบบถาดเล้ียงเซลลลงใน โปรแกรมตรวจหาสารเอ็นโดท็อกซนิ (2.2) นําสารละลายเขมขนแบคทีเรียลเอ็นโดท็อกซินท่ีเตรียมตาม 8.15.4.1 มาทําการเจือ จางตอดวยแอลเอแอลรีเอเจนตวอเตอร ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินท่ีมีความแรง ครอบคลุมความไวของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตท่ี 1 10 100 และ1 000 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับการเจือจาง ตองนําสารละลาย มาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเครื่องผสมอยางนอย 1 min กอนนําไปทําการเจือ จางตอ ไป (2.3) เตรียมตัวอยางโดยการเจือจางใหไดความเขม ขน ทจี่ ะทดสอบ แตตองไมเกิน MVD (2.4) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปน้ีลงในหลุมของถาดเล้ียงเซลล โดยเติม สารละลายแตละชนิด ปริมาตร 100 μl ตอหลุม ชนิดละ 3 หลุม ตามตําแหนงท่ี กําหนดในแผนแบบถาดเลยี้ งเซลล (2.4.1) สารละลายควบคุมเชงิ ลบ ใหเ ติมแอลเอแอลรีเอเจนตว อเตอร (2.4.2) สารละลายควบคุมเชิงบวก เติมสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มี ความแรง 1 10 100 และ 1 000 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร เพ่ือใชสรางกราฟมาตรฐาน (2.4.3) สารละลายทดสอบ (sample tested) ใหเติมสารละลายทดสอบหรือ สารละลายทดสอบทเี่ จอื จาง -32-

มอก. 531–2558 (2.4.4) สารละลายทดสอบเชิงบวก (positive product control) ใหเติมสารละลาย มาตรฐานเอ็นโดท็อกซินท่ีมีความแรง 100 หนวยเอ็นโดท็อกซินตอ มิลลิลิตร ปริมาตร 11 μl ลงในกนหลุมของถาดเล้ียงเซลล แลวเติม สารละลายทดสอบหรือสารละลายทดสอบท่ีเจือจาง ปริมาตร 100 μl ลงใน หลุมเดยี วกนั (2.5) เม่ือเติมสารละลายขางตนครบตามแผนแบบถาดเล้ียงเซลลแลว ใหนําถาดเลี้ยงเซลล ไปอุนในเครื่องอานผลวิเคราะหถาดเลี้ยงเซลลที่อุณหภูมิ (37  1) °C เปนเวลา ประมาณ 10 min (2.6) เติมแอลเอแอลรีคอนสติติวช่ันบัฟเฟอร (LAL Reconstitution Buffer) หรือตัวทํา ละลายท่ีผูทํากําหนด ตามปริมาตรที่ระบุบนฉลาก หรือใบรับรองที่มาพรอมกับชุด นํ้ายา ลงในผงแหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนต ผสมเบาๆจนผงแหงของ ลิมลู สั อะมีโบไซตไลเสตรเี อเจนตล ะลายหมด (2.7) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 μl ลงในหลุมทําปฏิกิริยาทุก หลมุ จนครบ แลวเรม่ิ การทาํ งานของโปรแกรมตรวจหาสารเอน็ โดท็อกซนิ (2.8) เม่ือส้ินสุดการทดสอบ โปรแกรมจะทําการสรางกราฟมาตรฐานและคํานวณคา พารามิเตอรต า งๆใหโดยอัตโนมตั ิ (2.9) การประเมินผล (2.9.1) ผลการทดสอบจะมผี ลเชือ่ ถือไดเ มื่อ (2.9.1.1) ผลการทดสอบของสารละลายควบคมุ เชิงลบไดผลลบ (2.9.1.2) ผลการทดสอบของสารละลายควบคุมเชิงบวกไดผลบวก (2.9.2) คา สัมบรู ณข องคาสัมประสิทธส์ิ หสัมพนั ธของกราฟมาตรฐานตองมากกวา หรือเทากบั 0.980 (2.9.3) คาของเวลาท่ีทําปฏิกิริยาท่ีวัดไดจากสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซิน แตล ะความเขมขน ตอ งมี % CV นอยกวา 10% (2.9.4) ตัวอยางท่ีความเขมขนที่ทดสอบ ไมมีฤทธ์ิยับยั้งหรือกระตุนปฏิกิริยาถา % PPC Recovery ของสารละลายทดสอบเชงิ บวกอยูในชวง 50% ถงึ 200% -33-

มอก. 531–2558 8.16 การซมึ ผา นของจุลินทรยี  8.16.1 จลุ นิ ทรียท ่ใี ชท ดสอบ ใชเชอื้ บาซิลลสั ซบั ทลิ ิส ATCC 6633 (Bacillus subtilis ATCC 6633) และเชอื้ ซาลโมเนลลา คอเลอเรซูอิส ATCC 10708 (Salmonella Choleraesuis ATCC 10708 ) 8.16.2 อาหารเลยี้ งเชอื้ อาจเตรยี มจากอาหารเลีย้ งเชอื้ สาํ เรจ็ รูปหรือเตรียมตามวธิ ีตอ ไปน้ี (1) ฟลูอดิ ไทโอไกลโคเลตมีเดยี ม แอล-ซีสทนี 0.5 g โซเดยี มคลอไรด 2.5 g เดกซโทรส 5.5 g อะการ 0.75 g ยสี ตเ อกซแ ทรกต 5.0 g เคซนี ท่ีถกู ยอยดวยเอนไซมจากตับออ น (pancreatic digest of casein) 15.0 g โซเดยี มไทโอไกลโคเลต (หรือกรดไทโอไกลโคลกิ 0.3 ml) 0.5 g สารละลายเรซาซรู ินโซเดยี ม (resazurin sodium solution) 0.1% โดยปรมิ าตรท่เี ตรยี มขนึ้ ใหม 1.0 ml นํา้ กลั่น 1L นําแอล-ซีสทีน โซเดยี มคลอไรด เดกซโ ทรส อะการ ยสี ตเ อกซแทรกต และเคซีนทีถ่ ูกยอยดว ย เอนไซมจ ากตบั ออ น มาผสมรวมกนั ในโกรงและบดใหเ ขา กัน เตมิ น้าํ กล่นั ลงไปเลก็ นอย คนให เขากนั แลว เทสารละลายทีไ่ ดใ สใ นบกี เกอร ลา งโกรงดว ยนาํ้ กลั่นจํานวนทเ่ี หลอื เทรวมกนั ใน บกี เกอรนําไปทาํ ใหรอน เติมโซเดยี มไทโอไกลโคเลตหรือกรดไทโอไกลโคลิกลงไป ปรับความ เปน กรด-ดา งใหมคี า (7.1+0.2) ดว ยสารละลายโซเดยี มไฮดรอกไซด 1 mol/l (ถา จาํ เปน ตองกรอง ใหนําสารละลายท่ีไดม าทําใหรอนแตไ มใ หเ ดือด แลวกรองในขณะรอนผา นกระดาษกรองท่เี ปย ก ชื้น) เติมสารละลายเรซาซรู ินโซเดยี ม ผสมใหเขากนั แลว ฆาเชอื้ ในหมอนึ่งอดั ท่ีอณุ หภมู ิ 121 °C ความ ดัน 15 ปอนดตอ ตารางนิ้ว เปนเวลา 15 min (2) ซอยบีนเคซีนไดเจสตมีเดียม เคซีนทีถ่ ูกยอยดว ยเอนไซมจากตับออ น 17.0 g ซอยบนี มีลทีถ่ ูกยอ ยดว ยเอนไซมป าเปน (papaic digest soybean meal) 3.0 g โซเดียมคลอไรด 5.0 g ไดเบสกิ โพแทสเซียมฟอสเฟต 2.5 g -34-

มอก. 531–2558 เดกซโทรส 2.5 g นาํ้ กล่นั 1L ผสมสวนผสมทั้งหมดเขาดวยกัน ตมใหละลาย แลวปลอยไวใหเย็นลงจนถึงอุณหภูมิหอง ปรบั ความเปน กรด-ดา งใหเ ปน (7.3+0.2) ดว ยสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด 1 mol/l กรอง แลว ฆาเชือ้ ในหมอ น่ึงอัดท่ีอุณหภูมิ 121 °C ความดนั 15 ปอนดตอ ตารางน้ิว เปนเวลา 15 min 8.16.3 การเตรียมเช้ือเผอ่ื ใช (stock culture) (1) การเตรยี มเชอ้ื บาซิลลสั ซับทิลสิ ใหเ พาะลงบนอะการผวิ เอยี งของซอยบีนเคซนี ไดเจสตอ ะการ นําไปอบเพาะเชื้อท่ีอุณหภูมิ 30 °C ถึง 35 °C เปน เวลา 24 h แลว เก็บไวท ีอ่ ณุ หภมู ิ 2 °C ถงึ 8 °C (2) การเตรียมเชอ้ื ซาลโมเนลลา คอเลอเรซอู สิ ใหเพาะลงบนอะการผิวเอียงของซอยบีนเคซีนไดเจสตอะการนําไปอบเพาะเช้ือที่อุณหภูมิ 30 °C ถึง 35 °C เปนเวลา 24 h แลว เกบ็ ไวที่อณุ หภมู ิ 2 °C ถึง 8 °C (3) การเตรยี มเชอื้ เผือ่ ใชอ าจเตรียมโดยวิธีการอืน่ ที่เหมาะสม 8.16.4 การเตรยี มเชื้อทดสอบ (inoculum) (1) ถายเชื้อบาซิลลัส ซับทิลิส จากเช้ือเผ่ือใช (ขอ 8.16.3) ลงในขวดหรือหลอดที่มีฟลูอิดไทโอไกล โคเลตมเี ดยี ม (2) ถายเชื้อซาลโมเนลลา คอเลอเรซูอิส จากเช้ือเผ่ือใช (ขอ 8.16.3) ลงในขวดหรือหลอดที่มีซอย บีนเคซนี ไดเจสตมีเดียม (3) นาํ ขวดหรือหลอดในขอ (1) และขอ (2) ไปอบเพาะเชอื้ ที่อณุ หภูมิ 30 °C ถึง 35 °C เปนเวลา 24 h 8.16.5 วธิ ีวิเคราะห (1) ใสฟ ลอู ดิ ไทโอไกลโคเลตมีเดยี มและซอยบีนเคซีนไดเจสตมีเดียม ลงในภาชนะพลาสติกตัวอยาง ตามจํานวนที่กําหนดในตารางที่ 4 สดมภท่ี 2 ใหไดปริมาณเทากับความจุที่ระบุไวของภาชนะ พลาสติกตวั อยางนั้น แลวปดใหสนิท (2) วางภาชนะพลาสติกตัวอยางตามขอ (1) ลงในภาชนะท่ีเหมาะสม (เชน บีกเกอรขนาดใหญ อาง แกว) ท่ีบรรจุอาหารเลี้ยงเช้ือชนิดเดียวกันกับท่ีมีอยูในภาชนะพลาสติกตัวอยางโดยใหพื้นที่ผิว ภายนอกของภาชนะพลาสติกตัวอยางแตละใบจมอยูใตผิวหนาของอาหารเลี้ยงเช้ือไมนอยกวา 60% (3) เติมเชอื้ บาซิลลัส ซบั ทลิ ิส ท่ีใชท ดสอบ ลงในบีกเกอรขนาดใหญที่บรรจุฟลูอิดไทโอไกลโครเลต มเี ดยี ม 20 ml ตออาหารเลีย้ งเชื้อ 1 L ผสมใหเ ขากันแลว ปด ปากภาชนะดว ยกระจก (4) เติมเชื้อซาลโมเนลลา คอเลอเรซูอิส ท่ีใชทดสอบ ลงในบีกเกอรขนาดใหญท่ีบรรจุซอยบีนเคซีน ไดเจสตมเี ดยี ม 20 ml ตออาหารเลยี้ งเชื้อ 1 L ผสมใหเขากันแลวปด ปากภาชนะดว ยกระจก -35-

มอก. 531–2558 (5) นาํ ภาชนะในขอ (3) และขอ (4) ไปอบเพาะเชือ้ ทีอ่ ณุ หภูมิ 30 °C ถงึ 35 °C เปนเวลา 7 วนั (6) เมื่อครบตามเวลาท่ีกําหนด ทําความสะอาดภาชนะดานบนท่ีอยูเหนืออาหารเล้ียงเช้ือโดยการลาง ดวยสารละลายโพรพานอล 60% โดยปริมาตร เปนเวลา 120 s และลางดวยนํ้าที่ปราศจากเชื้ออีก คร้ัง (7) ใชแทงแกวรอนแดง ขนาดเสนผานศูนยกลางประมาณ 5 mm เจาะผนังภาชนะพลาสติกตัวอยาง (ขอ(6)) บรเิ วณเหนอื ผวิ หนาของอาหารเลี้ยงเช้ือท่ีอยภู ายในทนั ทีแลวใชกระบอกฉีดยาพรอมเข็ม ฉีดยาท่ีปราศจากเช้ือดูดอาหารเล้ียงเช้ือจากภาชนะพลาสติกตัวอยางแตละใบตามปริมาณท่ี กาํ หนดในตารางที่ 4 สดมภท ่ี 4 (8) แบง อาหารเลีย้ งเช้อื ที่ดดู เอาไวจ ากภาชนะพลาสตกิ ตัวอยางแตละใบ(ขอ(7))ใสล งในขวดเพาะเชอื้ ซึ่งบรรจุอาหารเลี้ยงเช้ือชนิดเดียวกันขวดละ 10.0 ml ตามจํานวนท่ีกําหนดในตารางท่ี 4 สดมภท่ี 5 นําขวดเพาะเชื้อทั้งหมดไปอบเพาะเช้ือท่ีอุณหภูมิ 30 °C ถึง 35 °C เปนเวลา 10 วัน เมื่อครบ ตามเวลาที่กําหนด สังเกตดูวา มีการเจรญิ ของจุลนิ ทรยี ในขวดเพาะเชอ้ื แตละใบหรือไม 8.16.6 การประเมนิ ผล ใหถือวา ภาชนะพลาสติกตวั อยางไมม กี ารซึมผา นของจุลินทรยี เมอ่ื ขวดเพาะเชอ้ื ทุกใบไมมีการเจริญของ จุลนิ ทรยี  ตารางท่ี 4 การทดสอบการซมึ ผานของจลุ นิ ทรีย (ขอ 8.16.5) ความจุของภาชนะ จาํ นวนภาชนะพลาสติก ปรมิ าณอาหารเลี้ยงเช้อื จาํ นวนขวดเพาะเชอ้ื พลาสติกตัวอยา ง ตวั อยางท่ีใชท ดสอบ ท่ดี ูดจากภาชนะพลาสติก ทใี่ ชท ดสอบตอ อาหารเลี้ยงเชอ้ื ชนดิ ละ รวม ml ตวั อยางแตละใบ ภาชนะพลาสตกิ ตัวอยาง ไมเกนิ 100 ใบ ใบ ใบ 5 10 1 % โดยปริมาตรของความจุ 1 101 ถึง 500 แตต องไมน อยกวา 0.1 ml เกนิ 500 36 1 % โดยปริมาตรของความจุ 2 12 1 % โดยปรมิ าตรของความจุ 5 แตไ มเ กิน 25 ml -36-

มอก. 531–2558 8.17 ความคงทนของเครือ่ งหมายและฉลาก 8.17.1 เครอ่ื งมือ เคร่อื งองั น้ําท่ีควบคุมอุณหภมู ิไดท่ี 20°C ถึง 30°C 8.17.2 วธิ ีทดสอบ นําภาชนะพลาสติกตัวอยางที่บรรจุน้ํากล่ันจนถึงปริมาตรบรรจุและปดผนึกเรียบรอย แชในน้ําอุณหภูมิ 20 °C ถึง 30 °C เปนเวลา 24 h แลวตรวจพินิจสภาพของเครื่องหมายและฉลากบนภาชนะพลาสติก ตัวอยางแลว ตอ งไมห ลุด -37-

มอก. 531–2558 ภาคผนวก ก. การทําลายเม็ดเลอื ด (ขอ 5.4.4) ก.1 การทาํ ลายเมด็ เลอื ด ก.1.1 เคร่ืองมือ (1) ตูอ บท่คี วบคมุ อณุ หภูมิไดท่ี (70 + 2) °C (2) สเปกโทรโฟโตมเิ ตอรท ี่มคี วามยาวคลืน่ 540 nm (3) เครอื่ งหมนุ เหว่ียง (4) หมอ นงึ่ อัด (5) ตูอบเพาะเช้ือ (incubator) ทคี่ วบคุมอุณหภมู ิไดท ่ี (37 + 1) °C ก.1.2 สารเคมี สารละลาย และวธิ เี ตรยี ม (1) สารละลายโซเดียมคลอไรด 0.9% โดยมวล ที่ปราศจากเชือ้ (2) สารมาตรฐานอางอิงฮีโมโกลบิน (hemoglobin reference standard) 6 mg/ml (3) สารละลายแดรบคิน (Drabkin's solution) ละลายโซเดยี มไบคารบอเนต 1 g โพแทสเซียมไซยาไนด 0.05 g และโพแทสเซยี มเฟอริไซยา ไนด 0.2 g ในน้ํากลนั่ และเตมิ นํ้ากล่ันจนปรมิ าตรเปน 1 000 ml (4) การควบคมุ เชงิ บวก (positive control) เชน นํา้ กลัน่ สาํ หรบั ทาํ ยาฉดี (5) การควบคุมเชงิ ลบ (negative control) เชน แผน พลาสตกิ มาตรฐานพอลเิ อทิลนี ความหนาแนน สงู ก.1.3 การเตรยี มเลือดกระตาย เจาะเลือดกระตายอยางนอย 3 ตัว ผสมกับสารปองกันการแข็งตัวของเลือด เชน นํ้ายาเอซีดี (anticoagulant citrate dextrose solution, ACD) น้ํายาซีพีดี (anticoagulant citrate phosphate dextrose solution, CPD) ถาไมนํามาใชทันที ใหแยกเก็บในภาชนะเก็บเลือดของกระตายแตละตัวท่ีอุณหภูมิ (4+2) °C แตต อ งนํามาใชท าํ การทดสอบภายในเวลา 96 h ก.1.4 การเตรียมสารละลายทดสอบ (1) ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางแตละหนวยตรงบริเวณที่มีความหนาสมํ่าเสมอและโคงนอยท่ีสุดให ไดช้ินพลาสติกพ้ืนท่ีเทาๆกัน นํามารวมกันใหพื้นท่ีผิวสองดานรวมกันได 120 cm2 สําหรับ ภาชนะพลาสติกหนานอยกวา 0.5 mm และ 60 cm2 สําหรับภาชนะพลาสติกท่ีหนาเทากับหรือ มากกวา 0.5 mm แลวนํามาตัดออกเปนชิ้นยอยขนาดกวางประมาณ 0.1 cm ถึง 0.3 cm และยาว ประมาณ 1 cm ถงึ 5 cm ในกรณที ไี่ มสามารถตดั ภาชนะพลาสติกตัวอยางใหไดขนาดดังกลาว ให ตัดตัวอยางเปนชิ้นเล็กๆ แลวชั่งนํ้าหนัก 4 g จากน้ันนําตัวอยางที่เตรียมไวใสลงในขวดแกวฝา เกลยี วสาํ หรบั สกัดตวั อยา ง -38-

มอก. 531–2558 (2) ลางภาชนะพลาสติกตัวอยางดวยน้ํากล่ันสําหรับทํายาฉีดอยางนอย 2 คร้ัง ปลอยใหแหงท่ี อุณหภมู ิหอ ง (3) สกดั ชน้ิ พลาสติกตัวอยางดวยสารละลายโซเดียมคลอไรด 0.9% โดยมวลที่ปราศจากเชื้อปริมาตร 20 ml เตรียมแผนพลาสติกท่ีใชสําหรับการควบคุมเชิงลบเชนเดียวกับพลาสติกตัวอยาง สวนน้ํากล่ัน สําหรับทํายาฉีดที่ใชสําหรับการควบคุมเชิงบวก และสารละลายโซเดียมคลอไรด 0.9% โดยมวล ทีป่ ราศจากเชอ้ื ใชเปนแบลงก ใหใสลงในขวดแกวฝาเกลียว แลว ปด ฝาใหสนิท (4) นําภาชนะสําหรับสกัดทั้งหมดจากขอ (3) ใสในหมอน่ึงอัดท่ีอุณหภูมิ (121 + 2) °C เปนเวลา 1 h หรือใสในตูอบท่ีอุณหภูมิ (70 + 2) °C เปนเวลา 24 h หรือที่อุณหภูมิ(50 + 2) °C เปนเวลา 72 h แลวนําออกมาปลอยไวใหเย็นท่ีอุณหภูมิหอง (20 °C ถึง 30 °C) เขยาอยางแรง แลวเทสารละลาย สกัดท่ีไดลงในภาชนะที่สะอาด แหง และปราศจากเชื้อทันที นําไปเก็บไวในท่ีซ่ึงมีอุณหภูมิ 20 °C ถงึ 30 °C และตองนาํ ไปทดสอบตอไปภายในเวลา 24 h หลังจากที่เตรียมได ก.1.5 วธิ ที ดสอบ (1) การเตรียมกราฟสอบเทียบ (1.1) เตรียมสารละลายสอบเทียบ โดยใชป เ ปตตดดู สารละลายมาตรฐานอางองิ ฮีโมโกลบิน 10 ml 5 ml 2 ml 1 ml และ 0.5 ml ใสล งในขวดแกว ปริมาตรขนาด 100 ml จํานวน 5 ใบ ตามลาํ ดับ เจอื จางดว ยสารละลายแดรบคินจนถงึ ขดี ปรมิ าตร สารละลายท่ีไดจ ะมคี วาม เขมขน 0.6 mg/ml 0.3 mg/ml 0.12 mg/ml 0.06 mg/ml และ 0.03 mg/ml ตามลําดับตัง้ ไว 5 min (1.2) วัดคาการดดู กลืนแสงของสารละลายสอบเทยี บแตละความเขม ขนท่คี วามยาวคลนื่ 540 nm โดยใชส ารละลายแดรบคนิ เปน แบลงก (1.3) สรางกราฟสอบเทียบระหวางความเขมขนของฮีโมโกลบินมาตรฐานเปนมิลลิกรัมตอ มิลลิลติ รกบั คาการดดู กลนื แสง (2) การตรวจหาระดับพลาสมาฮโี มโกลบนิ ในเลอื ด (2.1) นําเลือดกระตายแตละภาชนะบรรจตุ ามขอ ก.1.3 ปรมิ าตร 1 ml ใสล งในหลอดหมุนเหว่ียง และนาํ ไปหมุนเหว่ียงในแนวระดบั ดว ยอัตราเรว็ 700 G ถึง 800 G นาน 15 min (2.2) ดูดสวนใสดานบน (พลาสมา) 100 μl เติมลงในสารละลายแดรบคิน 5.0 ml ตั้งทิ้งไว 15 min แลวนําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 540 nm โดยใชสารละลายแดรบคิน เปนแบลงก (2.3) นาํ คา การดูดกลืนแสงท่ีไดไปเทียบกับกราฟสอบเทียบ หาปริมาณฮีโมโกลบินในพลาสมา ของเลือดกระตา ยแตล ะตัว เปนมิลลิกรมั ตอมิลลิลิตร -39-

มอก. 531–2558 (2.4) ถาเลือดกระตายตัวใดมีปริมาณฮีโมโกลบินในพลาสมาเกิน 1.0 mg/ml จะไมนําเลือด กระตายตัวนั้นมาใชในการทดสอบตอ ไป และตองใชเลือดกระตาย 3 ตวั ในการทดสอบ (3) การเจอื จางเลือด (3.1) นําเลือดกระตายแตละตัวที่ผานการทดสอบหาปริมาณฮีโมโกลบินในพลาสมาแลว 20 μl เติมลงในสารละลายแดรบคิน 5.0 ml ต้ังทิ้งไว 15 min (3.2) นําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคล่ืน 540 nm โดยใชสารละลายแดรบคินเปน แบลงก นําคาการดูดกลืนแสงที่ไดไปเทียบกับกราฟสอบเทียบ หาปริมาณฮีโมโกลบินใน เลือด (3.3) เจือจางเลือดกระตายแตละตัวดวยสารละลายโซเดียมคลอไรด 0.9% (โดยมวล) ที่ ปราศจากเชื้อใหมีปริมาณฮีโมโกลบินอยูในชวง (25.0 + 2.5) mg/ml เปนคาฮีโมโกลบิน ปรากฎ (hemoglobin present) (4) การทดสอบตวั อยาง (4.1) นําเลือดท่ีไดจากขอ ก.1.5 (3.3) มาตัวละ 5.0 ml เติมสารละลายทดสอบ 4.0 ml นําไปบม ในตูอบท่อี ุณหภูมิ (37 + 1) °C เปน เวลา 4 h (4.2) เมื่อครบเวลานําไปหมุนเหวี่ยงในแนวระดับดวยอัตราเร็ว 100 G ถึง 200 G เปนเวลา 15 min (4.3) ดูดสวนใสดานบนใสในหลอดหมุนเหว่ียงหลอดใหม แลวนําไปหมุนเหวี่ยงดวยอัตราเร็ว 700 G ถึง 800 G เปนเวลา 5 min ดูดสว นใสดานบนใสในหลอดแกวใหม แลวนําไปหาคา ดชั นกี ารแตกตวั ของเม็ดเลือด (5) การหาคาดชั นกี ารแตกตวั ของเม็ดเลอื ด (5.1) นําสวนใสจากขอ ก.1.5 (4.3) มา 1.0 ml เติมลงในสารละลายแดรบคิน 3.0 ml ตั้งท้ิงไว 15 min (5.2) นําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคล่ืน 540 nm โดยใชสารละลายแดรบคินเปน แบลงก นาํ คา การดดู กลนื แสงทไ่ี ดไปเทียบกบั กราฟสอบเทียบ หาปริมาณฮีโมโกลบินเปน คา ฮีโมโกลบินปลดปลอ ย (hemoglobin released) (5.3) คาํ นวณคา ดชั นีการแตกตวั ของเมด็ เลือดจากสตู ร ดัชนกี ารแตกตวั ของเม็ดเลือด = ฮีโมโกลบินปลดปลอ ย x 100 ฮีโมโกลบินปรากฏ (5.4) คํานวณคาเฉลี่ยของดัชนีการแตกตัวของเม็ดเลือด แลวเทียบหาระดับการแตกตัวของเม็ด เลอื ดตามตารางที่ 5 -40-

มอก. 531–2558 ตารางที่ 5 ระดบั การแตกตัวของเมด็ เลือด (ขอ ก.1.5(5.4)) ดชั นีการแตกตวั ของเม็ดเลือด ระดับการแตกตวั ของเมด็ เลอื ด 0 ถงึ นอ ยกวา 2 ไมม กี ารแตกตวั 2 ถึง นอ ยกวา 10 10 ถงึ นอ ยกวา 20 มกี ารแตกตวั เลก็ นอย 20 ถึง นอยกวา 40 มีการแตกตวั ปานกลาง 40 ขนึ้ ไป มกี ารแตกตวั อยางเหน็ ไดช ดั มีการแตกตวั อยา งรนุ แรง -41-

มอก. 531–2558 ภาคผนวก ข. การชักตัวอยางและเกณฑตัดสิน (ขอ 7.1) ข.1 รุน ในที่นี้ หมายถึง ภาชนะพลาสตกิ ชนดิ เดียวกนั ทีท่ าํ โดยกรรมวิธีเดยี วกันและในคราวเดยี วกนั หรือทีท่ ํา หรือสง มอบหรอื ซ้ือขายในระยะเวลาเดียวกนั ข.2 การชกั ตวั อยางและการยอมรบั ใหเปน ไปตามแผนการชกั ตัวอยา งท่ีกาํ หนดตอไปนี้ หรอื อาจใชแ ผนการชัก ตวั อยา งอื่นทีเ่ ทียบเทา กนั ทางวิชาการกบั แผนท่ีกาํ หนดไว ข.2.1 การชกั ตัวอยา งและการยอมรับสาํ หรบั การทดสอบลกั ษณะทวั่ ไป ความสมา่ํ เสมอของความหนา ความ ยดื หยนุ และเคร่ืองหมายและฉลาก ข.2.1.1 ใหชกั ตวั อยา งโดยวธิ สี มุ จากรนุ เดยี วกนั ตามจาํ นวนที่กาํ หนดในตารางที่ ข.1 ข.2.1.2 จํานวนตัวอยางที่ไมเปนไปตามขอ 5.1 ขอ 5.2.3 ขอ 5.2.5 และขอ 6. ตองไมเกินเลขจํานวนท่ี ยอมรบั ทกี่ ําหนดในตารางท่ี ข.1 จึงจะถือวา ภาชนะพลาสตกิ รุนน้ันเปนไปตามเกณฑทก่ี าํ หนด ตารางท่ี ข.1 แผนการชักตวั อยา งสาํ หรับการทดสอบลกั ษณะทั่วไป ความสมํ่าเสมอของความหนา ความยืดหยนุ และเครอื่ งหมายและฉลาก (ขอ ข.2.1) ขนาดรนุ ขนาดตัวอยาง เลขจาํ นวนทยี่ อมรบั ใบ ใบ 20 2 ไมเกนิ 1 200 32 3 1 201 ถงึ 10 000 50 5 เกนิ 10 000 ข.2.2 การชกั ตัวอยางและการยอมรบั สําหรบั การทดสอบรูรวั่ ความทนตอ การตกกระแทก ความทนความดนั และปรมิ าณอนุภาคปนเปอ น ข.2.2.1 ใหช กั ตวั อยางโดยวิธีสมุ จากรุนเดยี วกนั จาํ นวน 20 ใบ ข.2.2.2 ตัวอยางทกุ ตวั อยา งตองเปน ไปตามขอ 5.2.1 ขอ 5.2.2 ขอ 5.2.4 และขอ 5.2.8 จงึ จะถอื วา ภาชนะ พลาสติกรนุ นน้ั เปนไปตามเกณฑทก่ี ําหนด -42-

มอก. 531–2558 ข.2.3 การชกั ตัวอยา งและการยอมรบั สาํ หรับการทดสอบพอลไิ วนิลคลอไรดเ รซนิ ได(2-เอทิลเฮกซลิ )แทเลต ไวนิลคลอไรดโ มโนเมอร ปรมิ าณกากทเ่ี หลือจากการเผา คณุ ลกั ษณะของสารละลายท่สี กดั ได และ ปริมาณโลหะหนัก ข.2.3.1 ใหชักตวั อยา งโดยวิธสี ุม จากรนุ เดยี วกนั ตามจาํ นวนที่กาํ หนดในตารางที่ ข.2 ข.2.3.2 ตัวอยางตองเปน ไปตามขอ 4.3.1 ขอ 4.3.2 ขอ 4.3.3 ขอ 5.2.7 ขอ 5.3.1 และขอ 5.3.2 จึงจะถอื วา ภาชนะพลาสตกิ รุน นั้นเปนไปตามเกณฑท กี่ าํ หนด ตารางที่ ข.2 แผนการชกั ตัวอยางสําหรับการทดสอบพอลิไวนิลคลอไรดเ รซนิ ได(2-เอทลิ เฮกซลิ )แทเลต ไวนลิ คลอไรดโมโนเมอร ปรมิ าณกากที่เหลือจากการเผา คณุ ลักษณะของสารละลายทสี่ กัดได และปริมาณโลหะหนัก (ขอ ข.2.3) ขนาดรุน ขนาดตวั อยา ง ใบ ใบ 20 ไมเ กนิ 1 200 32 1 201 ถงึ 10 000 50 เกิน 10 000 ข.2.4 การชักตัวอยางและการยอมรับสําหรับการทดสอบการซึมผานของไอนํ้า และความคงทนของ เครื่องหมายและฉลาก ข.2.4.1 ใหช กั ตวั อยา งโดยวธิ สี ุมจากรนุ เดยี วกนั ตามจาํ นวนท่ีกาํ หนดในตารางที่ ข.3 ข.2.4.2 จํานวนตวั อยางที่ไมเปนไปตามขอ 5.2.6 และขอ 5.5 ตองไมเกินเลขจาํ นวนทีย่ อมรับทกี่ าํ หนดใน ตารางที่ ข.3 จึงจะถือวา ภาชนะพลาสตกิ รนุ นัน้ เปน ไปตามเกณฑท ก่ี าํ หนด ตารางท่ี ข.3 แผนการชักตัวอยางสาํ หรับการทดสอบการซมึ ผานของไอน้ํา และความคงทนของเคร่ืองหมายและฉลาก (ขอ ข.2.4) ขนาดรุน ขนาดตวั อยา ง เลขจาํ นวนทย่ี อมรับ ใบ ใบ 13 1 ไมเ กิน 1 200 20 2 1 201 ถงึ 10 000 32 3 เกนิ 10 000 -43-

มอก. 531–2558 ข.2.5 การชักตวั อยา งและการยอมรบั สาํ หรับการทดสอบคณุ ลกั ษณะทางชวี ภาพ ข.2.5.1 ใหช กั ตวั อยางโดยวธิ สี ุมจากรนุ เดยี วกนั ตามจํานวนทีก่ าํ หนดในตารางที่ ข.4 ข.2.5.2 จํานวนตัวอยางตองเปนไปตามขอ 5.4 จึงจะถือวาภาชนะพลาสติกรุนน้ันเปนไปตามเกณฑ ทกี่ าํ หนด ตารางท่ี ข. 4 แผนการชักตัวอยางสําหรับการทดสอบคณุ ลักษณะทางชวี ภาพ (ขอ ข.2.5) ขนาดความจุภาชนะพลาสตกิ ขนาดตวั อยา ง ml  ใบ 80 นอยกวา 100 60 100 ถึง 499 40 ตั้งแต 500 ข.3 เกณฑตดั สนิ ตัวอยางภาชนะพลาสติกตองเปนไปตามขอ ข.2.1.2 ขอ ข.2.2.2 ขอ ข.2.3.2 ขอ ข.2.4.2 และขอ ข.2.5.2 ทุกขอ จงึ จะถือวาภาชนะพลาสติกรนุ นนั้ เปนไปตามมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้ _________________________ -44-