การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

ง33102 การดำรงชีวิตและครอบครัว3 การเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อ จัดทำโดย นางสาว เบญจศิริ เมืองสุวรรณ เลขที่ 17 ชั้นมัธยมศึกษาปีที่ 6/13 นางสาว ภัทชา กันทรดุษฎี เลขที่ 26 ชั้นมัธยมศึกษาปีที่ 6/13 เสนอ คุณครู กายทิพย์ แจ่มจันทร์ ภาคเรียนที่ 2 ปีการศึกษา 2565 โรงเรียนส่วนบุญโญปถัมภ์ ลำพูน

2 คำนำ หนังสืออิเล็กทรอนิกส์เล่มนี้ จัดทำขึ้นเพื่อเป็นส่วนหนึ่งของ รายวิชา ง33102 การดำรงชีวิตและครอบครัว3 โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อ ศึกษาความรู้ในเรื่องการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของพืช และได้ศึกษาค้นคว้า หาความรู้ซึ่งได้มาจาก หนังสือเรียน และเว็บไซต์ต่างๆ ในอินเทอร์เน็ต ที่มี ความเกี่ยวข้อง และมีความน่าเชื่อถือ เพื่อเป็นประโยชน์ต่อการเรียน และ ยังสามารถใช้เป็นสื่อสำหรับการเรียน การสอนให้แก่ นักเรียน คุณครูหรือ บุคคลทั่วไป ดังนั้นผู้จัดทำจึงได้มีความคาดหวังเป็นอย่างยิ่งว่า การจัดทำ หนังสืออิเล็กทรอนิกส์เล่มนี้ จะมีข้อมูลและความรู้เพียงพอให้ใช้ประโยชน์ ต่อผู้ที่มีความสนใจที่จะศึกษาเกี่ยวกับเรียนของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเป็น อย่างดี คณะผู้จัดทำ

3 สารบัญ 02 คำนำ 03 สารบัญ 04 ความหมายและความสำคัญ 05 การขยายพันธุ์พืช และการเจริญเติบโตของพรรณไม้ในขวด 07 ประเภทของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 10 ข้อดีและข้อเสียของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื้อ 11 รูปแบบการเจริญเติบโตและการพัฒนาของเนื้อเยื่อ 12 ขั้นตอนหลักในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 15 การเตรียมชิ้นส่วนพืช การฟอกฆ่าเชื้อ และการผ่าตัดเนื้อเยื่อ 18 บทสรุป 19 บรรณนุกรม

4 ความหมาย และความสำคัญ ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ค ว า ม ห ม า ย ข อ ง ก า ร เ พ า ะ เ ลี้ ย ง เ นื้ อ เ ยื่ อ ป ร ะ โ ย ช น์ ข อ ง ก า ร เ พ า ะ หมายถึง การนำเอาส่วนใดส่วนหนึ่งของพืช ไม่ เ ลี้ ย ง เ นื้ อ เ ยื่ อ ว่าจะเป็นอวัยวะเนื้อเยื่อเซลล์ หรือเซลล์ไม่มีผนัง มา เลี้ยงในอาหารเลี้ยงในสภาพปลอดเชื้อจุลินทรีย์ และ 1. การขยายพันธุ์พืช(micropropagation) อยู่ในสภาพควบคุมอุณหภูมิ แสงและความชื้นเพื่อให้ เพื่อให้ได้ต้นพืชจำนวนมากอย่างรวดเร็ว(rapid เซลล์พืชที่นำมาเพาะเลี้ยงนั้น ปราศจากการรบกวน asexual propagation) และทำลายการเจริญเติบโตของพืช 2. การผลิตพืชที่ปราศจากโรค เนื่องจากการเพาะ ค ว า ม เ ป็ น ม า ข อ ง เ ท ค นิ ค เลี้ยงเนื้อเยื่อจะต้องอยู่ในสภาวะปลอดเชื้อ ดังนั้น ก า ร เ พ า ะ เ ลี้ ย ง เ นื้ อ เ ยื่ อ พืชที่ได้จึงเป็นพืชปราศจากเชื้อใดๆ - ค.ศ.1920 Gottieb Haberlandt ประสบความ 3.การปรับปรุงพันธุ์พืช(plant provement) สำเร็จในการเลี้ยงเซลล์พืชบนอาหารสังเคราะห์ได้ - ค.ศ.1930 ได้มีการเลี้ยงเซลล์ที่แยกมาจากรากพืช ประโยชน์มหาศาลที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ หลายชนิดในสภาพปลอดเชื้อ - ค.ศ.1938 สามารถเลี้ยงอวัยวะพืชได้หลายชนิด พืช คือ การปรับปรุงและสร้างพันธุ์พืชตามความ - ปัจจุบันสามารถเลี้ยงเซลล์เดี่ยว โปรโตพลาสต์ (protoplat) และมีการนำมาประยุกต์ใช้ในสาขาต่างๆ ประสงค์ 4.การผลิตสารทุติยภูมิ(secondary metabolite) การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสมุนไพรต่างๆ แบบเซลล์ แขวนลอย(suspension culture) สามารถผลิต ต่างๆ เช่น ผลิตสารใช้เป็นยาฆ่าแมลง 5.การศึกษาทางชีวเคมี สรีรวิทยา และพันธุศาสตร์ เนื่องจากการเลี้ยงพืชในอาหารสังเคราะห์สามารถ สังเกตการเปลี่ยนแปลงได้ง่ายและชัดเจน 6.การอนุรักษ์เชื้อพันธุ์พืช(germplasm conservation , gene bank)เป็นการเก็บรักษา พันธุ์ พืช คือ เก็บแคลลัสของพืชที่อุณหภูมิ -196 C ํ (cryoperservation) ควบคุมโดยใช้ไนโตรเจนเหลว สามารถเก็บได้เป็นเวลานานและไม่มีการกลายพันธุ์

5 การขยายพันธุ์โดย การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ PLANT TISSUE CULTURE การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช (Plant tissue culture หรือ micropropagation หรือ in vitroculture) คือ การสร้างสายต้น (clone) โดยการนำชิ้นส่วนพืช (explant) มาทำให้สะอาดปราศจากเชื้อโรคแล้ววาง เลี้ยงบนอาหารวิทยาศาสตร์ ซึ่งประกอบด้วยแร่ธาตุ น้ำตาล วิตามิน และสารควบคุมการเจริญเติบโตใน สภาพปลอดเชื้อจุลินทรีย์ (aseptic technique) ภายใต้สภาพแวดล้อมที่สามารถควบคุมได้ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช จัดเป็นพื้นฐานอันสำคัญ ของเทคโนโลยีชีวภาพ (biotechnology) เป็นการ เอาสิ่งมีชีวิตหรือชิ้นส่วนของสิ่งมีชีวิตมาปรับปรุง ทำให้ เกิดการเปลี่ยนแปลงที่มีประโยชน์เพิ่มขึ้น เช่น ในการ ปรับปรุงพันธุ์พืชโดยใช้เทคนิคการตัดต่อ-ย้ายยีนเพื่อ สร้างสายพันธุ์ใหม่ๆ จำเป็นต้องใช้เทคนิคการเพาะเลี้ยง เนื้อเยื่อเพื่อสายพันธุ์ใหม่ที่ได้ สามารถมี ชีวิตอยู่ได้และเจริญเติบโต พรรณไม้ในขวด...โตได้ อย่างไร \"ไม้ขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ\" หรือเรียกอีกอย่างหนึ่งว่า การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช เป็นวิธีการขยายพันธุ์พืชวิธี หนึ่ง แต่มีการปฏิบัติภายใต้สภาพแวดล้อมที่ควบคุม สภาพแวดล้อมที่ควบคุม คือ อุณหภูมิและแสง ที่สำคัญ อีกประการหนึ่งก็คือ เรื่องความสะอาดแบบปลอดเชื้อ และความใจเย็น ซึ่งเป็นหัวใจสำคัญสำหรับการผลิตไม้ ในขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ จากนั้นมาดูว่าส่วนไหนของพืช จะสามารถเติบโตในขวดแก้วได้บ้าง ซึ่งหลักการเพาะ เลี้ยงเนื้อเยื่อ จะเลือกส่วนของพืชที่มีชีวิตที่สามารถ เจริญและพัฒนาเป็นพืชต้นใหม่ได้ง่าย ยกตัวอย่างเช่น ส่วนยอด ส่วนตาข้าง เมล็ด เป็นต้น



7 ประเภทของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ พืชประกอบไปด้วยอวัยวะต่างๆ มากมาย ซึ่งแต่ละอวัยวะประกอบด้วยเนื้อเยื่อหลายชนิด ประเภท ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อแบ่งตามส่วนของพืชนำมาขยายพันธุ์ได้ขยายพันธุ์ได้เป็น 7 ประเภท ดังนี้ 1 การเพาะเลี้ยงคัพภะ (embryo culture) หมายถึง การนำเอาคัพภะ หรือต้นอ่อนของพืช ที่เพิ่งเริ่มพัฒนาที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ จากถุงรังไข่ของพืชมาเพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ เพื่อให้เกิดเป็นแคลลัส หรือเกิดเป็น ต้นพืชโดยตรง รวมทั้งการชักนำให้เกิดคัพภะโดยตรง หรือชักนำให้เกิดแคลลัสแล้ว พัฒนา เป็นคัพกะต่อไป การเพาะเลี้ยงคัพภะ นำมาแก้ไขปัญหาอัตราความงอก ของเมล็ดที่ต่ำใน เมล็ดพืชบางชนิด หรือในเมล็ดของพืชที่เกิดจากการผสมข้ามชนิด หรือข้ามสกุลที่ยากต่อ การเจริญเติบโตและพัฒนา ในสภาพตามธรรมชาติรวมทั้งแก้ไขปัญหาการพักตัวที่ยาวนาน ของเมล็ดพืชบางชนิด 2 การเพาะเลี้ยงอวัยวะ (organ culture) การเพาะเลี้ยงส่วนต่างๆ ของอวัยวะพืชที่แยกออกมา เช่น ยอด ข้อ ปล้อง ราก ใบ ดอก และผล ในสภาพปลอดเชื้อ วิธีการเพาะเลี้ยงแบบนี้ทำได้ง่ายและรวดเร็ว 3 การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเจริญ (embryo culture) การเพาะเนื้อเยื่อเจริญเป็นการตัดเอาเนื้อเยื่อเจริญที่ปลาย ยอดมาเลี้ยง เนื้อเยื่อเจริญมีขนาดเล็กมากต้องทำการผ่าตัด ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เป็นการเพาะเลี้ยงเพื่อให้ได้ชิ้นส่วนที่ ปลอดไวรัสแล้วนำไปเพาะเลี้ยงเพิ่มปริมาณขยายพันธุ์ต่อไป

8 4 การเพาะเลี้ยงแคลลัส (callus culture) เป็นเซลล์พื้นฐานที่อยู่รวมกันเป็นกลุ่ม ยังไม่กำหนด ทิศทางการเปลี่ยนแปลงหรือพัฒนาไปเป็นเนื้อเยื่อหรือ อวัยวะใด เนื้อเยื่อพืชเกือบทุกชนิดสามารถนำมาชักนำการ สร้างแคลลัสได้ ซึ่งการชักนำการสร้างแคลลัสเริ่มต้นจาก การคัดเลือกเนื้อเยื่อพืช มาทำการเพาะเลี้ยงแคลลัสเริ่มต้น จากการคัดเลือกเนื้อเยื่อพืช มาทำการเพาะเลี้ยงบน สังเคราะห์ที่มีธาตุอาหารพืชร่วมกับสารควบคุมการเจริญ เติบโตในระดับที่เหมาะสมเนื้อเยื่อพืชจะเกิดการแบ่งเซลล์ พัฒนาเป็นแคลลัส แคลลัสเป็นเนื้อเยื่อพื้นฐานของระบบ การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช และนำมาใช้ประโยชน์หลายด้าน เช่น การขยายพันธุ์เพื่อชักนำให้เกิดต้นพืชปริมาณมาก ใช้ ในกระบวนการผลิตเซลล์ไร้ผนัง (protoplast) การผลิต สารเคมีการผลิตพืชให้ต้านทานต่อโรคแมลงศัตรูพืช และ ทนทานต่อสภาพแวดล้อมที่ไม่เหมาะสม รวมทั้งการใช้เป็น เนื้อเยื่อเป้าหมายในการเก็บรักษาเชื้อพันธุกรรม (cryoprescrvation) 5 การเพาะเลี้ยงโปรโตพลาสต์ (protoplast culture) โปรโตพลาสต์เป็นเซลล์ที่ปราศจากผนังเซลล์ (cell wall) เหลือแต่เยื่อหุ้มเซลล์ (cell mambrane) ห่อหุ้ม องค์ประกอบของเซลล์เอาไว้ สำหรับวิธีการกำจัดผนังเซลล์ ที่ใช้อยู่มีด้วยกัน 2วิธี คือ วิธีกล (mechanical method) โดยการสร้างบาดแผลหรือทำให้ผนังเซลล์ฉีก ขาดจากใบมีดที่ผ่านการฆ่าเชื้อ แล้วทำให้เซลล์ที่เหลือหลุด ออกจากผนังเซลล์ และวิธีย่อยด้วยเอนไซม์ (enzymatic method) เนื้อเยื่อที่มีความเหมาะสม นำมาสกัดเซลล์ไร้ ผนังได้แก่ เนื้อเยื่อที่มีอายุน้อย เช่น แคลลัส ใบอ่อน ราก อ่อน และละอองเกสรตัวผู้ประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงโปร โตพลาสต์ ได้แก่ การนำมาใช้กระบวนการปรับปรุงพันธุ์และ การสร้างพืชพันธุ์ใหม่จากพืชต่างสกุลโดยวิธีรวมโปรโต พลาสต์(protoplast fusion) รวมทั้งใช้เป็นเนื้อเยื่อเป้า หมายในระบบการส่งถ่ายยีน

9 6 การเพาะเลี้ยงอับเรณูและละอองเรณู (anther and pollen culture) อับเรณูที่ยังเจริญที่ไม่เต็มที่ (immature anther) หรือ ละอองเรณู (microspore) ซึ่งผ่านการแบ่งตัว แบบไมโอซิสมาแล้วสามารถนำมาเพาะเลี้ยงให้เกิดเป็นพืช ต้นใหม่ได้ ซึ่งดันพืชที่ได้จะมีโครโมโซมเป็นแฮพลอยด์(n) สามารถนำมาทำหารเพิ่มจำนวนโครโมโซมวิธีการนี้ทำให้ เกิดพืชพันธุ์แท้ (homozygous) 7 การเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอย (cell suspension culture) เซลล์แขวนลอยเป็นเซลล์เดี่ยวๆ หรือกลุ่มเซลล์ขนาดเล็กที่ ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชในอาหารเหลวบนเครื่อง หมุนเหวี่ยงอาหารเนื้อเยื่อที่เหมาะสมต่อการชักนำให้เกิด เซลล์ที่มีการเกาะตัวหลวมๆ ง่ายต่อการกระจายออกเป็น เซลล์เดี่ยวๆ การเพาะเลี้ยงเซลล์แขวนลอยถูกนำมาใช้ ศึกษาการทำงานของเอนไซม์และการแสดงออกของยีน ตลอดจนเพื่อการผลิตเซลล์ไร้ผนังและคัพภะเพื่อนำไปใช้ ประโยชน์ต่อไป

10 ข้อดีข้อเสีย ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ข้อดี ข้อเสีย - สามารถเพิ่มปริมาณพันธุ์พืชที่ต้องการได้ใน - มีขั้นตอนและวิธีการปลูกที่ยุ่งยาก เวลาอันสั้น - มีต้นทุนสูงกว่าการขยายพันธุ์พืชวิธีอื่นๆ - เสี่ยงต่อความเสียหายจากศัตรูพืช เนื่องจาก - ต้นกล้าที่ได้มีลักษณะที่สม่ำเสมอ (genetic uniformity) พืชต้นใหม่ที่ได้จำนวนมากและลักษณะทาง พันธุกรรมเหมือนกัน ทำให้เกิดการระบาด - ต้นพืชที่ได้ปราศจากเชื้อแบคทีเรียและเชื้อรา ของโรคและแมลงศัตรูพืชเกิดได้ง่าย - ผลิตต้นกล้าได้ทั้งปี โดยไม่ต้องคำนึงถึงสภาพ - การแปรปรวนทางพันธุกรรม (somatic variation) อาจเกิดได้ เนื่องจากการเพาะ ดินฟ้าอากาศหรือฤดูกาลใน การเพาะปลูก จึง เลี้ยงในอาหารสังเคราะห์ซึ่งมีธาตุอาหาร ทำให้เกษตรกรมีรายได้ตลอดปี ฮอร์โมนอยู่สูง ต้นพืชอาจมีการแปรปรวนกลับ - ช่วยในการขยายพันธุ์พืชที่ขยายเองได้ยากใน ให้ผลดีทางด้านำพันธุ์แปลกใหม่ เกิดการกลาย สภาพปกติในธรรมชาติ เช่น กล้วยไม้และสน พันธุ์ของไม้ดอกไม้ประดับ เช่น กล้วยไม้แคระ - ใช้ในการผลิตยาและสารเคมีจากพืช พืชบาง ชนิดสามารถผลิตสารที่มี คุณสมบัติทางยา หรือประโยชน์ทางด้านอุตสาหกรรม เช่น น้ำมัน หอมระเหย โดยปกติเนื้อสาร ออกฤทธิ์ที่ ต้องการจะมีอยู่ปริมาณที่น้อยมาก โดยใช้ชิ้น ส่วนพืชจำนวนมากนำมาสกัดแยก - ใช้ศึกษาทางชีวเคมี สรีรวิทยาและพันธุศาสตร์ ต้นพืชที่เลี้ยงในหลอด ทดลองสามารถติดตาม การพัฒนาและเปลี่ยนแปลงได้ง่าย ชัดเจน และ ถูกต้องแม่นยำ ที่สำคัญคือ สามารถควบคุม แปลต่างๆ ในหลอดทดลองได้ง่ายกว่าการปลูก ในสภาพปกติที่แปลงปลูก

11 รูปแบบการเจริญเติบโต และการพัฒนาของเนื้อเยื่อ การเจริญเติบโตและการพัฒนาของชิ้นส่วนพืชที่น ามาเพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ เพื่อให้เกิดเป็น ต้นพืชที่สมบูรณ์ พบว่าเนื้อเยื่อมีกระบวนการเปลี่ยนแปลงเกิดขึ้นในลักษณะต่างๆ ได้ 3 แบบ ดังนี้ 1 เกิดแคลลัส (callus formation) แคลลัสเป็นกลุ่มเซลล์พาเรนไคมาที่ยังไม่มีการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์ไป เป็นรากหรือลำต้น อาจจะ อยู่กันหลวมๆ หรือ เกาะกันแน่น แคลลัสอาจเกิดจากเซลล์หรืออวัยวะอื่น เช่น ใบเลี้ยง ช่อดอกอ่อน และเมล็ด อ่อน เป็นต้น 2 เกิดอวัยวะ หรือออร์แกโนจีเนซิส (organogenesis) ออร์แกโนเจเนซีส (organogenesis) คือ กระบวนการเปลี่ยนแปลงจนกระทั่งได้ เป็นอวัยวะหรือ เป็นการพัฒนาเป็นพืชต้นใหม่โดยตรง โดยการสร้างยอดหรือราก การเปลี่ยนแปลง เป็นอวัยวะต่างๆ เป็นผล ของฮอร์โมนต่อกลุ่มของเซลล์ อาจเป็นอิทธิพลของฮอร์โมนชนิดเดียว หรือ หลายชนิดก็ได้ เมื่อมีการผันแปร ระหว่างฮอร์โมนออกซินและไซโทไคนิน พบว่าโดยถ้าสัดส่วนของ ออกซินมากกว่าไซโตไคนินจะชักน าให้เกิด ราก ในทางกลับกันถ้ามีไซโตไคนินมากกว่าออกซินจะ พัฒนาไปเป็นยอด การเชื่อมต่อระหว่างยอดและรากใน การเกิดอวัยวะเป็นขบวนการ ที่เป็นอิสระต่อกัน 3 เกิดคัพภะ หรือเอ็มบริโอจีเนซิส (embryogenesis) คัพภะของพืชที่ขยายพันธุ์โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ คือ เอ็มบริออยด์ (embryoid) เกิดจากเซลล์มีการ เปลี่ยนแปลงและพัฒนาเหมือนกับการพัฒนาของไข่ที่ได้รับการ ปฏิสนธิแต่เอ็มบริออยด์มีจุดก าเนิดจาก เซลล์ร่างกาย หลังจากนั้นจะพัฒนาเป็นขั้นตอนต่างๆเป็น ต้นกล้าซึ่งมียอดและรากติดต่อกัน จึงมีท่อน า้ ท่อ อาหารเชื่อมต่อกัน

12 ขั้นตอนหลัก ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 1 ขั้นตอนการเตรียมต้นแม่พันธุ์ (preparative stage) การเพาะเลี้ยงต้นแม่พันธุ์(stock plant) ที่ต้องการในสภาพแวดล้อมที่ค่อนข้างสะอาด เพื่อจะได้ต้นแม่พันธุ์ที่สะอาดและสมบูรณ์เต็มที่ 2 ขั้นตอนเริ่มต้น (initiation stage) การนำชิ้นส่วนของพืชที่เตรียมความพร้อมในขั้น ตอนการเตรียมต้นแม่พันธุ์มาทำการฟอกฆ่าเชื้อ จุลินทรีย์ที่ติดอยู่กับผิวพืช แล้วทำการผ่าตัดเนื้อเยื่อใน สภาพปลอดเชื้อภายในตู้ ย้ายเนื้อเยื่อ เลี้ยงบนอาหาร วิทยาศาสตร์ที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว จนได้ต้นพืชที่ต้องการ 3 ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณ (multiplication) ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณทำ เมื่อเนื้อเยื่อพืชในขั้นตอนที่ 2 โตพอสมควรแล้ว จะทำการเพิ่มปริมาณโดยการตัด แบ่งเนื้อเยื่อของออกเป็นชิ้น และแยกไปเลี้ยงในอาหาร ใหม่ เรียกว่า การตัดแบ่ง (sub cultures) ทำการตัด แบ่งไปได้เรื่อยๆ จนกว่าจะได้ปริมาณที่ต้องการ

13 4 ขั้นตอนการชักนำให้เกิดราก (root induction) การนำชิ้นส่วนของพืชที่เตรียมความพร้อมในขั้น ตอนการเตรียมต้นแม่พันธุ์มาทำการฟอกฆ่าเชื้อ จุลินทรีย์ที่ติดอยู่กับผิวพืช แล้วทำการผ่าตัดเนื้อเยื่อใน สภาพปลอดเชื้อภายในตู้ ย้ายเนื้อเยื่อ เลี้ยงบนอาหาร วิทยาศาสตร์ที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว จนได้ต้นพืชที่ต้องการ 5 ขั้นตอนการเตรียมออกขวดและการย้ายออกปลูก (acclimatization) ต้นกล้าในขวดที่ทำการย้ายออกสู่สภาพภายนอกขวด มักมีเปอร์เซ็นต์รอดต่ำ เพราะถูกเลี้ยงในสภาพปลอดเชื้อ และถูกเลี้ยงในสภาพที่แสงและอุณหภูมิค่อนข้างต่ำกว่า สภาพภายนอกมาก ดังนั้นก่อนการการย้ายออกนอก ขวดเพาะจึงต้องมีการเพิ่มความเข้มแสง ปรับ อุณหภูมิ พอต้นกล้ามีความพร้อมแล้วก็ทำการย้ายออกนอกขวด นำไปเลี้ยงในโรงเรือนต่อไป



15 การเตรียมชิ้นส่วนพืช การฟอกฆ่าเชื้อ และการผ่าตัดเนื้อเยื่อ 1 การเลือกชิ้นส่วนของพืชที่จะนำมาเพาะเลี้ยง ชิ้นส่วนของจะสามารถพัฒนาไปเป็นต้นพืชได้หลังจากการขยายพันธุ์ด้วยวิธี เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อนั้นขึ้น อยู่กับอายุหรือระยะของพืชที่นำมาเลี้ยงชิ้นส่วนพืชที่นำมาเลี้ยงควรเลือก ที่เป็นข้อปลายยอด ตายอด ตา ข้าง เนื่องจากจะสามารถชักนำยอดได้จำนวนมาก 2 เทคนิคการฟอกฆ่าเชื้อ การฟอกฆ่าเชื้อบริเวณผิวพืช เพื่อทำให้ชิ้นส่วนพืชปลอดโรคเป็นการกำจัดเชื้อจุลินทรีย์ที่ติดมากับชิ้นส่วน พืชไม่ให้มามีผลยับยั้งการเจริญและพัฒนาการของชิ้นส่วนพืช เมื่อเลือกส่วนของพืชที่จะนำมาใช้ในการขยาย พันธุ์ได้แล้ว ตามความต้องการให้ตัดแต่งชิ้นส่วนพืชให้มีขนาดที่เหมาะสมนำมาทำการล้างทำความสะอาด โดยการฟอกฆ่าเชื้อที่ผิวของเนื้อเยื่อเพื่อให้ ปราศจากเชื้อจุลินทรีย์ทำได้หลายวิธีขึ้นอยู่กับลักษณะของ เนื้อเยื่อพืช เช่น เนื้อเยื่อพืชที่อ่อนนิ่ม 162 และบาง ให้แช่เนื้อเยื่อพืชลงในสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรท์ (NaOCl) ความเข้มข้น 0.5 เปอร์เซ็นต์หรือคลอร็อกซ์ 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10-15 นาทีเมื่อครบกำหนด เวลาให้ล้างด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 3 ครั้ง สำหรับเนื้อเยื่อพืชที่ผิวนอกแข็ง เช่น ไม้เนื้อแข็ง ฝักกล้วยไม้ ให้นำเนื้อเยื่อไปล้างด้วยน้ำยาซักฟอกและน้ำแล้วจุ่มเนื้อเยื่อลงใน 95 เปอร์เซ็นต์เอทิลแอลกอฮอล์และลนไฟ ส่วนเนื้อเยื่อพืชที่มีสารประเภทขี้ผึ้งหรือขนปกคลุมให้จุ่มเนื้อเยื่อลงใน 70-95 เปอร์เซ็นต์ เอทิลแอลกอฮอล์ นาน 30 วินาที- 1 นาทีแล้วจึงนำไปแช่ในสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรท์ ความเข้มข้น 0.5% หรือคลอร็อกซ์ 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10 - 15 นาทีเมื่อครบกำหนดเวลาให้ ล้างด้วยน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว 3 ครั้ง

3 การผ่าตัดเนื้อเยื่อพืช 16 การตัดชิ้นส่วนของพืชที่จะนำมาเลี้ยง เริ่มจากต้องนำชิ้นส่วนพืชมาล้างน้ำให้สะอาด และตัดส่วน ที่ไม่ต้องการใช้ออกให้มากที่สุด นำชิ้นส่วนพืชที่ล้างแล้วมาตัดให้มีขนาดพอประมาณ แล้วนำมา ฟอกฆ่าเชื้อที่ผิวตามขั้นตอน จากนั้นจึงตัดเนื้อเยื่อออกเป็นชิ้นเล็กๆ ให้มีขนาดตามต้องการ นำ ไปเลี้ยงในอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ขนาดและรูปร่างของเนื้อเยื่อที่นำมาเลี้ยงขึ้นอยู่กับลักษณะ วัตถุประสงค์และความพอใจของผู้ปฏิบัติงาน ถ้าตัดเนื้อเยื่อชิ้นใหญ่ เนื้อเยื่อมีโอกาสรอดชีวิตสูง แต่ก็มีโอกาสปนเปื้ อนสูง ถ้าตัดเนื้อเยื่อชิ้นเล็กก็มีโอกาสรอดชีวิตต่ำแต่ มีโอกาสปนเปื้ อนน้อย ก่อนนำเนื้อเยื่อที่ฟอกฆ่าเชื้อแล้วลงในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อควรเช็ดขวดอาหารเพื่อฆ่าเชื้อด้วย เอททิลแอลกอฮอล์ 70 เปอร์เซ็นต์ ก่อนนำเข้าตู้ตัดเนื้อเยื่อ เมื่อจะย้าย เนื้อเยื่อลงขวดให้เปิดฝา และลนไฟที่คอขวด ใช้ปากคีบที่ลนไฟฆ่าเชื้อและทิ้งให้เย็นแล้วคีบเนื้อเยื่อใส่ขวด ควรกดเนื้อเยื่อ ให้จมลงในอาหารเล็กน้อยแล้วจึงปิดฝาตามเดิม



บทสรุป 18 การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเป็นความเจริญก้าวหน้าในด้าน เกษตรเกี่ยวกับพืชที่มีการ พัฒนาเทคนิคในการขยายพันธุ์ที่ ทำให้ได้พืชต้นใหม่จำนวนมากอย่างรวดเร็วในเวลาอันจำกัด และมีคุณภาพดีเหมือนเดิม วิธีการนี้ทำโดยนำเอาส่วนใดส่วน หนึ่งของพืช ไม่ว่าจะเป็นอวัยวะเนื้อเยื่อ เซลล์หรือเซลล์ไม่มี ผนัง มาเลี้ยงในอาหารเลี้ยงในสภาพปลอดเชื้อจุลินทรีย์ และ อยู่ในสภาพ ควบคุมอุณหภูมิแสงและความชื้นเพื่อให้เจริญ เติบโตได้ดีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสามารถทำการเพาะได้จาก ทุกส่วนของพืช ได้แก่ คัพภะ อวัยวะ เนื้อเยื่อเจริญ แคลลัส โปรโตพลาสต์ เซลล์แขวนลอย อับเรณูและละออง เรณูชิ้นส่วนของพืชที่นำมาขยายพันธุ์จะมีรูปแบบการ เจริญ เติบโตและการพัฒนาของเนื้อเยื่อได้ 3 แบบ คือ เกิดเป็น แคลลัส เกิดอวัยวะหรือออร์แกโนจีเนซิส หรือเกิดเกิดคัพภะ หรือเอ็มบริโอจีเนซิส การที่พืชจะเจริญไปเป็นแบบใดนั้นขึ้นอยู่ กับปัจจัยหลายประการ ขั้นตอนหลักในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อประกอบไปด้วย การเตรียมต้นแม่พันธุ์ให้ พร้อมก่อนนำมาขยายพันธุ์ การฟอก ฆ่าเชื้อชิ้นส่วนพืชที่จะเพาะเลี้ยง การเพิ่มปริมาณต้นกล้า และ การชักนำให้ต้นกล้าเกิดราก แล้วจึงทำการปรับสภาพ ต้นกล้าเพื่อย้ายออกปลูก การเพาะเลี้ยง เนื้อจำเป็นต้องทำใน ห้องที่ปลอดเชื้อ อาหารที่ใช้เลี้ยงเนื้อเยื่อพืชประกอบไปด้วย ธาตุอาหารต่างๆ ที่พืชต้องการ ชิ้นส่วนพืชที่จะนำมาเพาะเลี้ยง ต้องมีการฟอกฆ่าเชื้อก่อนท าการผ่าตัดเนื้อเยื่อพืชนั้น ความสำเร็จในการขยายพันธุ์พืชด้วยวิธีนี้ขึ้นอยู่กับชนิดของ พืช วิธีการเพาะเลี้ยง อาหารที่ใช้เลี้ยง สภาพแวดล้อม และการ ดูแลรักษา

19 บรรณานุกรม จิรา ณ หนองคาย. (2551). หลักและเทคนิคการขยายพันธุ์พืชในประเทศไทย. กรุงเทพฯ: โอเดียนสโตร์. ธัญญา ทะพิงค์แก. (2554). ภาพประกอบวิชาหลักการขยายพันธุ์พืช. [Online]. Available: http://www.facagri.cmru.ac.th/plant. (20 กันยายน 2554) บุญหงษ์ จงคิด. (2548). หลักและเทคนิคการปรับปรุงพันธุ์พืช. กรุงเทพฯ: โรงพิมพ์ มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์. ประศาสตร์ เกื้อมณี. (2536). เทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช. กรุงเทพฯ: ภาควิชา พฤกษศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. พรชัย จุฑามาศ. (2544). เนื้อเยื่อพืช. [Online]. Available: http://www.ku.ac.th/e-magazine /july44/agri/plant1.html. (2 มกราคม 2550) สมพร ประเสริฐส่งสกุล. (2549). การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อกับการปรับปรุงพันธุ์ พืช. กรุงเทพฯ: โฟร์เพซ. อภิชาติ วรรณวิจิตร. (2550). การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช. [Online]. Available: http://guru.sanook.com/encyclopedia. (2 มกราคม 2550)