Detección de OGM’s en Cultivos.

DETECCIÓN DE OGM’s EN CULTIVOS Dr. Luis Felipe Guzmán Rodríguez Dr. Juan Manuel Pichardo González Dr. Moisés Alberto Cortés Cruz Ing. Blanca Amalia Amaro González ILUSTRACIÓN Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Av. Progreso no. 5, Barrio Santa Catarina Alcaldía Coyoacán, C.P. 04010, Ciudad de México Centro Nacional de Investigación Disciplinaria Centro Nacional de Recursos Genéticos Tepatitlán de Morelos, Jalisco, México Publicación Especial No. MX-0-241502-52-15-00-14-01 Octubre 2019 ISBN: 978-607-37-1129-6 Registro de Derecho de Autor

Directorio Institucional SECRETARÍA DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL Dr. Víctor Manuel Villalobos Arámbula Secretario de Agricultura y Desarrollo Rural del Gobierno de México Dr. Miguel García Winder Subsecretario de Agricultura Ing. Víctor Suárez Carrera Subsecretario de Autosuficiencia Alimentaria Lic. David Monreal Ávila Coordinador General de Ganadería Dr. Salvador Fernández Rivera Coordinador General de Desarrollo Rural Lic. Ignacio Ovalle Fernández Titular del organismo Seguridad Alimentaria Mexicana INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES, FORESTALES, AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Dr. Fernando de la Torre Sánchez Director General Dr. José Antonio Cueto Wong Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación M.C. Jorge Fajardo Guel Coordinador de Planeación y Desarrollo Dr. José Humberto Corona Mercado Coordinador de Administración y Sistemas Dr. Dante Schiaffini Barranco Titular de la Unidad Jurídica CENTRO NACIONAL DE RECURSOS GENÉTICOS Dr. Ramón Ignacio Arteaga Garibay Director del Centro Nacional de Recursos Genéticos I

Detección de OGM’s en cultivos Dr. Luis Felipe Guzmán Rodríguez Investigador del Centro Nacional de Recursos Genéticos, INIFAP Programa de Recursos Genéticos Forestales, Agrícolas, Pecuarios y Microbianos Dr. Juan Manuel Pichardo González Investigador del Centro Nacional de Recursos Genéticos, INIFAP Programa de Recursos Genéticos Forestales, Agrícolas, Pecuarios y Microbianos Dr. Moisés Alberto Cortés Cruz Director de Investigación del Centro de Investigación Regional Pacífico Centro, INIFAP Programa de Recursos Genéticos Forestales, Agrícolas, Pecuarios y Microbianos Ing. Blanca Amalia Amaro González Técnico de laboratorio de ADN y Genómicas Centro Nacional de Recursos Genéticos, INIFAP Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Centro Nacional de Recursos Genéticos Tepatitlán de Morelos Jalisco, México Publicación Especial Núm. MX-0-241502-52-15-00-14-01 Octubre, 2019 II

Detección de OGM’s en cultivos Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina Alcaldía Coyoacán C.P. 04010, Ciudad de México Tel. (55) 3871-8700 www.gob.mx/inifap ISBN 978-607-37-1129-6 Primera Edición 2019 Editado en México No está permitida la reproducción total o parcial de esta publicación, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito a la Institución. III

CONTENIDO INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1 Objetivo................................................................................................................ 1 Abreviaturas......................................................................................................... 1 Liofilización de tejido foliar .................................................................................. 2 I. Liofilización de hojas de plantas de algodón y jitomate......................... 2 Material y equipos ................................................................................................ 2 Procedimiento ...................................................................................................... 2 Pulverización de tejido.......................................................................................... 5 II. Pulverización de tejido foliar de algodón y jitomate con mortero, pistilo y nitrógeno líquido .................................................................................... 5 Material ................................................................................................................ 5 Procedimiento ...................................................................................................... 5 III. Pulverización de semilla y tejido foliar liofilizado de maíz y soya .... 7 Preparación de las muestras para trituración con adaptadores de acero inoxidable. ............................................................................................................... 7 Material y equipo.................................................................................................. 7 Procedimiento ...................................................................................................... 7 Preparación de las muestras para trituración con adaptadores de 24 tubos....................................................................................................................... 10 Material y equipo................................................................................................ 10 Procedimiento .................................................................................................... 10 Extracción de ácidos nucleicos a partir de tejido foliar de algodón (Gossypium hirsutum) ........................................................................................ 12 Material y equipo................................................................................................ 12 Reactivos ........................................................................................................... 12 Procedimiento .................................................................................................... 13 Extracción de ácidos nucleicos a partir de tejido foliar de jitomate (Solanum lycopersicum) ...................................................................................................... 17 Material y equipo................................................................................................ 17 Reactivos ........................................................................................................... 17 Procedimiento .................................................................................................... 18 IV

Extracción de ácidos nucleicos a partir de semilla de maíz (Zea mays) y soya (Glycine max)....................................................................................................... 20 Material y equipo................................................................................................ 20 Reactivos ........................................................................................................... 20 Procedimiento .................................................................................................... 21 Cuantificación de ácidos nucleicos y verificación del grado de pureza ........ 24 Procedimiento .................................................................................................... 25 Estandarización de la concentración de ADN .................................................. 29 Procedimiento .................................................................................................... 29 Comprobación de la integridad de los ácidos nucleicos................................. 30 Procedimiento .................................................................................................... 30 Verificación de la funcionalidad......................................................................... 32 Material y equipo................................................................................................ 32 Procedimiento .................................................................................................... 32 Corrimiento electroforético para visualizar bandas de amplificado .................... 33 Detección cualitativa del promotor 35S en ADN de cultivos ........................... 35 Material y equipo................................................................................................ 35 Procedimiento .................................................................................................... 35 Análisis de resultados ........................................................................................ 39 Procedimiento .................................................................................................... 39 ANEXOS ............................................................................................................... 41 Anexo 1. Preparación de soluciones ..................................................................... 41 Bibliografía........................................................................................................... 45 Agradecimientos ................................................................................................. 45 V

Índice de figuras Figura 1. Equipo para liofilización de tejido foliar........................................................ 2 Figura 2. Plántulas de algodón (Gossypium hirsutum)............................................... 5 Figura 3.Trituración de tejido foliar con mortero, pistilo y NLiq. .................................. 6 Figura 4.Transferencia de tejido pulverizado a un tubo cónico de centrífuga.......... 6 Figura 5. Adaptadores de acero inoxidable con capacidad de 10 mL. ..................... 7 Figura 6. Equipo de pulverización mecánica............................................................... 8 Figura 7. Panel de control del equipo TissueLyser II.................................................. 8 Figura 8. Semilla de soya y pulverizado. ..................................................................... 9 Figura 9. Perforación de material vegetal liofilizado ................................................. 10 Figura 10. Colocación del tejido foliar en tubos de microcentrífuga, adaptadores para tubos, tapas de adaptadores y esferas de acero inoxidable............................ 11 Figura 11. Adición de solución buffer de extracción de ADN. ................................. 14 Figura 12. Muestras con SBE y SDS durante el mantenimiento en frío................. 14 Figura 13. Tubos en agitación constante durante la incubación a 65°C. ............... 14 Figura 14. Transferencia de sobrenadante................................................................ 15 Figura 15. Adición de isopropanol y mezcla suave................................................... 15 Figura 16. Pastilla de precipitado con etanol al 70%................................................ 16 Figura 17. Procedimiento para pesar el tejido pulverizado y adición de SBE........ 22 Figura 18. Mezclar vigorosamente con un agitador de vibración tipo vortex. ........ 22 Figura 19. Transferencia de la fase acuosa aun nuevo tubo de microcentrífuga.. 23 Figura 20. Equipo de espectrofotometría para cuantificación de ácidos nucleicos24 Figura 21. Gráfico de densidad óptica de ácidos nucleicos..................................... 24 Figura 22. Pantalla de inicio del programa Nanodrop software............................... 25 Figura 23. Pantalla de inicio de la medición .............................................................. 26 Figura 24. Limpieza del lector óptico.......................................................................... 26 Figura 25. Medición del blanco. .................................................................................. 27 Figura 26. Medición de las muestras. ........................................................................ 27 Figura 27. Procedimiento de corrimiento electroforético sobre gel de agarosa..... 31 Figura 28. Gráfica de amplificación de p35S y gen interno. .................................... 40 VI

Índice de cuadros Cuadro 1. Reactivos, concentraciones y volúmenes de la solución buffer de extracción de ácidos nucleicos de algodón ................................................................ 13 Cuadro 2. Reactivos, concentraciones y volúmenes de la solución buffer de extracción de ácidos nucleicos de jitomate ................................................................ 18 Cuadro 3. Reactivos, concentraciones y volúmenes de la solución buffer de extracción de ácidos nucleicos de maíz y soya ......................................................... 21 Cuadro 4. Mezcla de reacción para la amplificación del gen rbcL. ......................... 32 Cuadro 5. Condiciones para la amplificación del gen rbcL por PCR ...................... 33 Cuadro 6. Secuencia de nucleótidos de los iniciadores y sondas para la amplificación de p35S y genes internos específicos de especie. ............................ 37 Cuadro 7. Mezcla de reacción para la amplificación del p35S y gen interno......... 38 Cuadro 8. Condiciones de amplificación de p35S y gen interno. ............................ 39 VII

INTRODUCCIÓN Objetivo El objetivo de los protocolos presentados en el presente instructivo es realizar la detección de Organismos Genéticamente Modificados (OGM’s) a partir de ácidos nucleicos totales obtenidos de semilla y tejido foliar de algodón, jitomate, maíz y soya con concentración, pureza, integridad y funcionalidad adecuadas. Abreviaturas ADN Ácido desoxirribonucleico BME β-mercaptoetanol CTAB Bromuro de cetiltrimetilamonio DO Densidad óptica EDTA Ácido etilendiaminotetraacético g Gramos Hz Hertz M Molar MBS Metabisulfito de sodio mL Mililitros mV Milivoltios ng Nanogramos NLiq Nitrógeno líquido nm Nanómetros OGM Organismo Genéticamente Modificado pb Pares de bases PCR Reacción en cadena de la polimerasa PEG Polietilenglicol PVP Polivinilpirrolidona rpm Revoluciones por minuto SBE Solución buffer de extracción SDS Dodecil sulfato sódico TA Temperatura ambiente TE Tris-HCl y EDTA Tris Hidroximetilaminometano xg Gravedades μg Microgramos μL Microlitros μM Micromolar 1

MÉTODO Liofilización de tejido foliar I. Liofilización de hojas de plantas de algodón y jitomate Material y equipos  Aceite de bomba de vacío ultragrade 19  Equipo para liofilización  Muestras de tejido foliar congeladas  Ultracongelador de -80°C Procedimiento 1. Antes de encender el equipo, comprobar que las muestras estén completamente congeladas a temperatura de -80°C. 2. Revisar, con la bomba apagada, que el aceite de la bomba de vacío de la liofilizadora sea de color claro y el nivel esté entre la mitad y la línea de la marca superior. En el caso de que el nivel sea inferior, agregar aceite ultragrade 19 o aceite para bomba de vacío. Si se observa el aceite de color amarillento o café deberá ser drenado y reemplazado por nuevo aceite. 3. En cada proceso, limpiar el equipo antes y después del uso. 4. Colocar las muestras a liofilizar en los recipientes del equipo, como se observa en la Figura 1. Figura 1. Equipo para liofilización de tejido foliar. 2

5. Encender la liofilizadora, el botón de encendido se localiza en la parte lateral izquierda del equipo. Presionar el botón de refrigeración “manual”, esperar a que la temperatura del equipo descienda a -40ºC (duración aproximada de 10 a 15 minutos). La pantalla muestra la temperatura en ºC o ºF dependiendo la configuración (regularmente esta en ºC) y el encendido de las luces LED indican el descenso en la temperatura (las luces de color verde indican que se ha llegado a la temperatura programada). 6. Después, una vez alcanzada la temperatura de -40 ºC, activar la bomba de vacío presionando el botón “VACUUM”. 7. Verificar que las válvulas de la cámara de secado se encuentren en la posición de cerrado. Se coloca la primera muestra y cuando se encuentre sujeta de forma correcta, se cambia la válvula a la posición de abierto. Posteriormente se colocan las siguientes muestras, una a la vez y se abre la respectiva válvula. 8. Luego, esperar el tiempo requerido para la liofilización de las muestras, el cual dependerá del tipo de material. 9. Es importante tomar en cuenta el volumen total a liofilizar y la capacidad del equipo, el cual no debe exceder de 18 litros. La elevación de la temperatura indica saturación por volumen. 10. Una vez finalizado el proceso, se retiran las muestras liofilizadas. La válvula se coloca en la posición de “romper vacío” para que se libere la muestra y se retire de la cámara de desecado. 11. Después, abrir una válvula y apagar la bomba de vacío con el interruptor “VACUUM”, el foco LED correspondiente se apaga. 12. En seguida, apagar la refrigeración con el interruptor “REFRIGERATION MAN”, el foco LED correspondiente se apaga. 13. Encender el deshielo utilizando el interruptor “DEFROST”, se enciende el foco LED correspondiente. 14. Esperar a que la escarcha se desprenda del condensador, se puede quitar la tapa para acelerar el proceso. Posteriormente, drenar el agua en un recipiente. 15. Revisar el nivel de aceite de la bomba de vacío. En caso de requerirlo, rellenar el depósito con aceite. 3

16. Limpiar el equipo, especialmente la cámara de secado, el condensador y apagar el equipo. 4

Pulverización de tejido II. Pulverización de tejido foliar de algodón y jitomate con mortero, pistilo y nitrógeno líquido Material  Espátulas de plástico  Gradilla para tubos cónicos de 15 mL o tubos de microcentrífuga de 2 mL  Hielera de unicel  Mortero  Nitrógeno líquido  Pistilo  Tejido foliar de las muestras  Tubos cónicos de centrífuga de 15 mL o tubos de microcentrífuga de 2 mL  Vaso de unicel Procedimiento 1. El tejido foliar fresco o liofilizado se pulveriza con mortero, pistilo y NLiq (Figura 2). El nitrógeno líquido se vierte hasta la mitad del mortero, se agregan una o dos hojas de la muestra, dependiendo del tamaño de las hojas, sin exceder la capacidad del mortero. En el caso del algodón, triturar de cinco a seis hojas debido a que la extracción de ADN requiere mayor cantidad de tejido. Figura 2. Plántulas de algodón (Gossypium hirsutum) de las cuales, se obtiene el tejido foliar. 5

2. El tejido se tritura hasta obtener un polvo de color verde suave o pistache y de consistencia como el talco, en caso de que se evapore el NLiq, se puede agregar más, con cuidado que no se proyecte el tejido fuera del mortero, para evitar contaminación del área de trabajo (Figura 3). Figura 3.Trituración de tejido foliar con mortero, pistilo y NLiq. 3. Con uso de una espátula, enfriada previamente en NLiq, se toma el tejido y se transfiere a un tubo rotulado con el número de la muestra y se conserva en frio hasta el proceso de extracción de ADN (Figura 4). Figura 4.Transferencia de tejido pulverizado de algodón a un tubo cónico de 15 mL para centrífuga. 6

III.Pulverización de semilla y tejido foliar liofilizado de maíz y soya Preparación de las muestras para trituración con adaptadores de acero inoxidable. Material y equipo  Adaptadores de teflón  Equipo de pulverización mecánica marca TissueLyser II  Esfera de teflón  Espátula  Solución de HCl 0.4 M  Tubos de microcentrífuga de 2 mL Procedimiento 1. Colocar 300 mg aproximadamente de semilla o tejido foliar en los adaptadores de teflón de acero inoxidable y la esfera de teflón y cerrar perfectamente (Figura 5). Figura 5. Adaptadores de acero inoxidable con capacidad de 10 mL. 2. Insertar los adaptadores en posición horizontal en las abrazaderas del equipo TissueLyser II. Verificar que ambos adaptadores estén perfectamente ajustados en las muescas de las abrazaderas antes de continuar con el proceso (Figura 6). 7

Panel de control Cubierta de acrílico Seguro Muescas Figura 6. Equipo de pulverización mecánica. 3. Bajar la cubierta de acrílico y verificar que el equipo se encuentre conectado a una toma de corriente eléctrica de 110 V. 4. Encender el equipo con el interruptor de encendido/apagado ubicado en la parte posterior del dispositivo. 5. Comprobar que aparece la palabra ON en la pantalla MEMORY, en caso contrario, presionar la tecla PROG el número de veces necesarias hasta que se observe. 6. Programar un ciclo de 30 Hz en la pantalla Frecuencia 1/s y 2 minutos en la pantalla Tiempo min/sec con uso de los botones + y – (Figura 7). Figura 7. Panel de control del equipo TissueLyser II. A) Memoria, con los botones PROG y SET se crean y almacenan programas de parámetros de disrupción. B) Frecuencia 1/s, los botones – y + permiten ajustar la frecuencia de oscilación. C) Tiempo min/sec, con los botones – y + se ajusta el tiempo de disrupción. D) Los botones START y STOP permiten iniciar y detener la operación del equipo, respectivamente. 8

7. Presionar el botón START, el equipo comienza la operación. En la pantalla se observa el tiempo en cuenta regresiva. 8. Al finalizar el tiempo, el equipo se detiene. Levantar la cubierta de acrílico y retirar con cuidado los adaptadores. Tomar el tejido pulverizado con la ayuda de una espátula por muestra y colocarlo en un tubo de microcentrífuga de 2 mL previamente rotulado con el número de muestra (Figura 8). Figura 8. Semilla de soya y muestra pulverizada. 9. Limpiar el equipo con un paño húmedo, de manera cuidadosa. 10. Dejar las esferas de acero en una solución de ácido clorhídrico al 0.4 M durante un minuto a temperatura ambiente (TA), enjuagar con agua destilada y secar. 11. Apagar el equipo en el interruptor de encendido/apagado y desconectar el equipo de la corriente eléctrica. 9

Preparación de las muestras para trituración con adaptadores de 24 tubos. Material y equipo  Adaptadores de 24 tubos  Equipo de pulverización marca TissueLyser II  Esferas de acero inoxidable de 5 mm  Etanol al 70%  Perforadora de papel  Tapas de adaptadores  Tubos de microcentrífuga de 2 mL Procedimiento 1. Cortar 40 círculos de tejido liofilizado por muestra con una perforadora de papel (Figura 9). Limpiar la perforadora con etanol al 70% entre cada muestra para evitar contaminación cruzada. Figura 9. Perforación de material vegetal liofilizado. 2. Colocar los círculos de tejido en tubos de microcentrífuga de 2 mL, previamente rotulados (Figura 10a) y poner una esfera de acero de 5 mm. Tener cuidado de cerrar el tubo perfectamente. Después, colocar los tubos en los adaptadores (Figura 10b). 10

Fig. 5. A Tubo con material vegetal. B adaptadores para 24 tubos de 1.5 a 2 mL Figura 10. A) Colocación del tejido foliar en tubos de microcentrífuga. B) Adaptadores para tubos, tapas de adaptadores y esferas de acero inoxidable. 3. Cubrir los adaptadores con la tapa. Colocar los adaptadores en las abrazaderas del equipo y verificar que se encuentren ajustados en las muescas de las abrazaderas (Figura 6). 4. Bajar la cubierta de acrílico y verificar que el equipo se encuentre conectado a una toma de corriente eléctrica de 110 V. 5. Encender el equipo con el interruptor de encendido/apagado ubicado en la parte posterior del dispositivo. 6. Comprobar que aparece la palabra ON en la pantalla MEMORY, en caso contrario, presionar la tecla PROG el número de veces necesarias hasta que se observe la palabra ON. 7. Programar dos ciclos de 30 Hz en la pantalla Frecuencia 1/s y 2 minutos en la pantalla Tiempo min/sec con uso de los botones + y – (Figura 7). 8. Presionar el botón START, el equipo comienza la operación. En la pantalla se observa el tiempo en cuenta regresiva. 9. Al finalizar el tiempo, el equipo se detiene. Levantar la cubierta de acrílico, remover con cuidado los adaptadores y retirar los tubos con las muestras pulverizadas. 10. Limpiar el equipo con un paño húmedo, de manera cuidadosa. 11. Dejar las esferas de acero en una solución de ácido clorhídrico al 0.4 M durante un minuto a TA, enjuagar con agua destilada y dejar secar. 12. Apagar el equipo en el interruptor de encendido/apagado y desconectar el equipo de la corriente eléctrica. 11

Extracción de ácidos nucleicos a partir de tejido foliar de algodón (Gossypium hirsutum) Material y equipo  Agitador a vibración tipo vortex  Centrifuga con sistema de refrigeración  Equipo de agitación  Equipo de refrigeración a -20°C  Espátulas de plástico  Frasco de vidrio de 500 mL  Incubadora  Plancha de calentado u horno de microondas  Tubos cónicos para centrífuga de 15 mL  Tubos de microcentrifuga de 1.5 mL Reactivos  Acetato de potasio, pH= 8.0* 5 M  Acetato de sodio, pH= 5.2* 3 M  ddH2O esterilizada  Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 20% (w/v)  EDTA 0.5 M  Etanol al 70% a -20°C  Isopropanol a -20°C  Metabisulfito de sodio (MBS)  NaCl 5 M  Polietilenglicol (PEG)  Polivinil pirrolidona (PVP)  RNAasa [10 mg/mL]  Solución buffer TE 1X  Tris-HCl 1 M * si es necesario, ajustar pH de la solución con ácido acético glacial. 12

Procedimiento 1. Preparar la solución buffer de extracción (SBE) en un frasco de 500 mL con los reactivos y en las concentraciones que se observan en el cuadro 1. Se debe preparar el volumen suficiente de solución para la cantidad de muestras a procesar. Por ejemplo, los cálculos de los volúmenes de reactivos para una y 50 muestras se observan en el cuadro 1. Debe considerarse un volumen extra para una o dos muestras más, por motivos de imprecisión de pipeteo y evitar así que la SBE sea insuficiente. Cuadro 1. Reactivos, concentraciones y volúmenes de la solución buffer de extracción de ácidos nucleicos (Youssef et al., 2015). Reactivo Concentración Concentración Cantidad para Cantidad para una muestra 50 muestras inicial final Tris-HCl 1.0 M 100 mM 0.7 mL 35.0 mL NaCl 5.0 M 1.5 M 2.1 mL 105.0 mL EDTA 0.5 M 50 mM 0.7 mL 35.0 mL PEG - 1.0 % 0.070 g 3.50 g MBS - 0.5 % 0.035 g 1.75 g PVP - 2.0 % 0.140 g 7.00 g ddH2O - - Aforar a 7 mL Aforar a 350 mL 2. Calentar la solución a 65°C en una plancha o bien, en un horno de microondas. 3. Transferir 700 mg de tejido fresco recién pulverizado con mortero, pistilo y nitrógeno líquido (en caso de formación de metabolitos secundarios durante la pulverización, la cual se observa por coloración oscura del tejido, se recomienda agregar PVP al mortero), a un tubo cónico de 15 mL para centrífuga frío y mantener en hielo hasta que todas las muestras hayan sido pulverizadas. 4. Agregar 7 mL de SBE a 65°C (Figura 11), mezclar vigorosamente con agitador a vibración tipo vortex y posteriormente, adicionar 700 µL de SDS al 20% y mezclar nuevamente. 13

Figura 11. Adición de solución buffer de extracción de ADN. 5. Mantener en hielo hasta terminar de transferir la SBE en todas las muestras (Figura 12). Figura 12. Muestras con SBE y SDS durante el mantenimiento en frío. 6. Colocar los tubos en posición horizontal dentro de la incubadora a 65°C durante 30 min. Mantener las muestras en agitación constante con un equipo de agitación a 20 rpm (Figura 13). Figura 13. Tubos en agitación constante durante la incubación a 65°C. 14

7. Después, retirar los tubos de la incubadora y dejar a TA durante 5 min. Agregar 4 mL de acetato de potasio (5 M, pH=8.0), mezclar por inversión e incubar en hielo durante 30 min. 8. Centrifugar los tubos a 4,500 x g durante 40 min a 10°C de temperatura. Después, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 15 mL para centrifuga (Figura 14) y adicionar 35 µL de RNAasa [10 mg/mL]. Incubar a 37°C durante 30 min. Figura 14. Transferencia de sobrenadante. 9. Agregar 5 mL de isopropanol frío, mezclar gentilmente por inversión e incubar a -20°C durante una hora (Figura 15). Figura 15. Adición de isopropanol y mezcla por inversión. 15

10. Centrifugar los tubos a 4,500 x g durante 30 min a 4°C de temperatura. 11. Descartar el sobrenadante y lavar la pastilla de precipitado dos veces con 3.5 mL de etanol frío al 70%, centrifugar a 4,500 x g durante 5 min a TA (Figura 16). Figura 16. Pastilla de precipitado con etanol al 70%. 12. Dejar secar completamente la pastilla del precipitado a 45°C y disolver con 420 µL de solución buffer TE 1X. 13. Centrifugar los tubos a 4,500 x g durante 15 min a 10°C de temperatura. 14. Después, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mL, adicionar un volumen equivalente de isopropanol frío más 1/10 de volumen de acetato de sodio (3 M, pH=5.2), mezclar gentilmente e incubar a -20°C durante una hora. 15. Luego, centrifugar a 4,500 x g durante 40 min a 4°C de temperatura. 16. Descartar el sobrenadante y lavar la pastilla dos veces con 500 µL de etanol frío al 70%, centrifugar a 4,500 x g durante 5 min a TA. 17. Dejar secar completamente la pastilla a TA y disolver con 100 µL de solución buffer TE 1X hasta la verificación de la concentración y calidad de los ácidos nucleicos. 16

Extracción de ácidos nucleicos a partir de tejido foliar de jitomate (Solanum lycopersicum) Material y equipo  Balanza  Charolas  Equipo de agitación constante  Espátulas de plástico  Frasco de 100 mL  Microcentrífuga  Plancha de calentado u horno de microondas  Puntas de micropipeta de 1000, 200 y 10 µL  Tubos de microcentrífuga de 2.0 mL y 1.5 mL Reactivos  Acetato de amonio  Alcohol isoamílico  β-mercaptoetanol (BME) 14 M  Cloroformo  CTAB  EDTA 0.5 M  Etanol al 76%  Isopropanol  NaCl 5 M  PVP  RNAsa  Solución buffer TE 1X  Tris-HCl 1 M 17

Procedimiento 1. Preparar la solución buffer de extracción con los reactivos y a las concentraciones que se observan en el cuadro 2 y calentar a 65°C en una plancha o bien, en un horno de microondas. Se debe preparar el volumen suficiente de solución para la cantidad de muestras a procesar. Por ejemplo, los cálculos de los volúmenes de reactivos para una y 50 muestras se observan en el cuadro 2. Debe considerarse un volumen extra para una o dos muestras más, por motivos de imprecisión de pipeteo y evitar así que la SBE sea insuficiente. La SBE puede prepararse con uno o más días de antelación, no obstante, los reactivos CTAB, BME y PVP deben agregarse a la solución el mismo día que se realiza el procedimiento de extracción de ADN. Cuadro 2. Reactivos, concentraciones y volúmenes de la solución buffer de extracción de ácidos nucleicos (Doyle y Doyle, 1990). Reactivo Concentración Concentración Cantidad para Cantidad para inicial final una muestra 50 muestras Tris-HCl 1.0 M 100 mM 80 µL 4.0 mL NaCl 5.0 M 700 mM 112 µL 5.6 mL EDTA 0.5 M 50 mM 80 µL 4.0 mL CTAB* - 2.5 % 20 mg 1.0 mg BME* 14.0 M 280 mM 16 µL 0.8 mL PVP* - 2.5 % 20 mg 1.0 mg ddH2O - - 512 μL 25.6 mL Total - - 800 µL 40.0 mL *Se agregan a la solución el mismo día que se realiza la extracción. 2. En un tubo de microcentrífuga de 2 mL, transferir con la espátula 200 mg de tejido foliar de jitomate pulverizado y mezclar con 800 µL de SBE. 3. Incubar las muestras a 65°C en un equipo de incubación con agitación constante durante una hora. 18

4. Después, destapar los tubos y dejar a TA por 5 minutos. 5. A cada tubo se le añaden 800 µL de solución cloroformo-isoamílico (24:1), mezclar por inversión y se centrifugar a 18,800 x g a TA por 10 minutos. 6. Transferir el sobrenadante a tubos de 1.5 mL con 10 µL de solución de RNAsa [10 ng/μL] e incubar a 37°C por 30 minutos. 7. Luego, agregar a cada tubo 700 µL de isopropanol frío, mezclar por inversión y centrifugar a 1,500 x g por 2 minutos. 8. Decantar los tubos con cuidado para evitar que se pierda la pastilla, después añadir 500 µL de solución buffer de lavado (etanol al 76% y acetato de amonio 10 mM) y enfriar a -20°C por 20 minutos. 9. Centrifugar a 600 x g por 2 minutos, después, descartar el sobrenadante, dejar secar los tubos de manera invertida sobre un papel filtro a TA hasta eliminar todo el líquido y resuspender con 200 µL de solución buffer TE 1X (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM). 10. Después, añadir 35 µL de agua grado molecular estéril más 6.5 µL de solución de acetato de amonio 7.5 M y mezclar suavemente por inversión. 11. Agregar 800 µL de etanol absoluto frío, mezclar hasta precipitación de ADN, luego, centrifugar a 1,900 x g por 5 minutos y descartar el sobrenadante. 12. El precipitado se lava con 1 mL de etanol al 70%, despegar la pastilla y mezclar suavemente por inversión, durante 5 minutos. 13. Centrifugar a 600 x g durante 2 minutos, descartar el sobrenadante y dejar secar los tubos de manera invertida sobre un papel filtro a TA hasta eliminar todo el líquido. 14. Resuspender el ADN con 100 μL de solución buffer TE 1X y conservar a 4°C hasta la verificación de la concentración y calidad de los ácidos nucleicos. 19

Extracción de ácidos nucleicos a partir de semilla de maíz (Zea mays) y soya (Glycine max) Material y equipo  Agitador a vibración tipo vortex  Balanza  Espátulas de plástico  Frasco de 100 mL  Incubadora  Microcentrífuga  Plancha de calentado u horno de microondas  Puntas de micropipeta de 1000, 200 y 10 µL  Sistema de refrigeración a -20°C  Tubos de microcentrífuga de 2.0 mL y 1.5 mL Reactivos  Acetato de potasio 3 M, pH=5.2  Alcohol isoamílico  Cloroformo  EDTA 0.5 M  Etanol al 90%  Fenol  Proteinasa K [10 mg/mL]  RNAsa [10 mg/mL]  SDS  Solución buffer TE 1X  Tris-HCl 1 M 20

Procedimiento 1. Preparar la SBE en un frasco de 100 mL con los reactivos y a las concentraciones que se observan en el cuadro 3. Calentar la solución a 65°C en una plancha o bien, en un horno de microondas. Se debe preparar el volumen suficiente de solución para la cantidad de muestras a procesar. Por ejemplo, los cálculos de los volúmenes de reactivos para una y 50 muestras se observan en el cuadro 3. Debe considerarse un volumen extra para una o dos muestras más, por motivos de imprecisión de pipeteo y evitar así que la SBE sea insuficiente. Cuadro 3. Reactivos, concentraciones y volúmenes de la solución buffer de extracción de ácidos nucleicos (Pérez-Urquiza, et al., 2013). Reactivo Concentración Concentración Cantidad para Cantidad 50 inicial final una muestra muestras Tris-HCl 1.0 M 50 mM 80 µL 4.0 mL EDTA 0.5 M 50 mM 160 µL 8.0 mL SDS 48 mg ddH2O - 3% 1504 µL 2.4 g Total - - 1,600 µL 75.2 mL - - 80.0 mL 2. En un tubo de microcentrifuga de 2 mL con 0.25 g de tejido pulverizado adicionar 1.6 mL de SBE más 25 µL de solución de proteinasa K [10 mg/mL] e incubar a 65°C durante 90 minutos (Figura 17). 21

Figura 17. Procedimiento para pesar el tejido pulverizado y adición de SBE. El tubo vacío se pesa, después la balanza se tara y se agrega el tejido hasta que en la pantalla del equipo se observe 0.25 g. 3. Retirar los tubos de la incubadora y dejarlos a TA durante 5 min. Después, adicionar 20 µL de solución de RNAsa [10 mg/mL]. 4. Centrifugar los tubos a 5,000 x g durante 30 min a TA. Luego, recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo de microcentrífuga de 2 mL, adicionar 800 µL de fenol y mezclar vigorosamente con un agitador a vibración tipo vortex (Figura 18). Figura 18. Mezclar vigorosamente con un agitador de vibración tipo vortex. 5. Centrifugar los tubos a 10,000 x g durante 5 min a TA. Después, recuperar la fase acuosa de la parte superior, en un tubo nuevo de microcentrífuga de 2 mL (Figura 19). 22

Figura 19. Transferencia de la fase acuosa a un nuevo tubo de 2 mL microcentrífuga. 6. Adicionar 600 µL de solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y mezclar en un agitador a vibración tipo vortex. 7. Centrifugar 10,000 x g durante 10 minutos a TA. Luego, recuperar la fase acuosa de la parte superior en un tubo nuevo de microcentrífuga de 2 mL. 8. Adicionar 600µL de solución cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) al sobrenadante y mezclar. Centrifugar a 10,000 x g durante 5 minutos a TA. Recuperar la fase acuosa de la parte superior en un tubo nuevo de microcentrífuga de 2 mL. 9. Después, agregar al sobrenadante 30 µL de solución de acetato de potasio 3 M, pH=5.2 más 750 µL de etanol al 90% y mezclar por inversión. 10. Incubar a -20°C durante 30 minutos. 11. Centrifugar los tubos a 10,000 x g durante 15 minutos a TA, después, descartar el sobrenadante. 12. Lavar la pastilla con 1 mL de etanol al 70%, centrifugar los tubos a 10,000 xg durante 5 minutos a TA, después, descartar el sobrenadante. 13. Dejar secar la pastilla de ADN y disolver en 100 µL de solución buffer TE 1X hasta la verificación de la concentración y calidad de los ácidos nucleicos. 23

Cuantificación de ácidos nucleicos y verificación del grado de pureza La determinación de la cantidad de ADN obtenido se realiza por espectrofotometría UV con un equipo Nanodrop 2000 (López-Mora et al., 2011) (Figura 20). Figura 20. Equipo de espectrofotometría para cuantificación de ácidos nucleicos. La lectura de la densidad óptica (DO) se lleva a cabo a 260 nm de longitud de onda, en la cual se obtiene el pico más alto de la curva (Figura 21). Figura 21. Gráfico de densidad óptica de ácidos nucleicos. El coeficiente de extinción (CE) del ADN de doble cadena equivale a 50 porque, una densidad óptica a 260 nm corresponde a 50 μg de ADN genómico. La concentración en μg/mL o ng/μL se determina con el producto de la lectura a 260 nm por el CE. El 24

programa del equipo realiza el cálculo de manera automática y proporciona los valores de concentración. El grado de pureza del ADN se verifica mediante dos valores, a) la relación A260/280 y b) la relación A260/230. La relación A260/280 se determina mediante el cociente de las lecturas de la densidad óptica 260 nm entre 280 nm, mientras que, la relación A260/230 con el cociente de las lecturas 260 nm entre 230 nm (López-Mora et al., 2011). En la relación A260/280, los valores entre 1.70 a 2.00 se considera ADN de alta pureza; valores entre 1.40 a 1.69 indican una pureza aceptable y valores menores a 1.40 se considera pureza de regular a mala. En la relación A260/230, los valores entre 2.0 a 2.2 indican un grado de pureza alto; valores entre 1.5 a 2.0 se considera pureza aceptable y valores menores a 1.5 indican la presencia de contaminantes en la muestra. Procedimiento 1. Abrir el programa Nanodrop software, seleccionar medición de ácidos nucleicos y elegir ADN (Figura 22). Figura 22. Pantalla de inicio del programa Nanodrop software. El equipo realiza un proceso breve de revisión y ajuste, a continuación, está listo para comenzar la operación de medición (Figura 23). 25

Figura 23. Pantalla de inicio de la medición. Limpiar el lector óptico aplicando 2 µL de agua grado molecular y secar con un paño para tareas delicadas que no dejan fibras (Figura 24a y 24b). a) b) Figura 24. Limpieza del lector óptico. 2. Colocar 1 µL de solución buffer TE 1X en el lector para determinar la absorbancia del blanco. En el caso de que las muestras de ADN estén disueltas en un solvente diferente, utilizar tal solvente para la determinación del blanco. Después, hacer clic en “Blank” o presionar F3 (Figura 25). 26

Figura 25. Medición del blanco. 3. Iniciar las mediciones con la aplicación de 1 µL de marcador λDNA [10 ng/µL], el cual se utiliza como referencia. Después, hacer clic en medir o presionar F1. La medición aparecerá en un recuadro. Limpiar el lector con el paño para tareas delicadas y continuar con la medición de las muestras. 4. Aplicar 1 µL de ADN genómico (Figura 26 a), hacer clic en “Measure” o presionar F1 y ver la medición (Figura 26 b). Limpiar el lector y repetir el proceso con el resto de las muestras a) b) Figura 26. Medición de las muestras. 27

5. Se recomienda medir el marcador λDNA entre cada 20 muestras para verificar que las lecturas del equipo se mantienen adecuadas. 6. Al terminar de medir todas las muestras, limpiar el lector con 1 μL de agua grado molecular y secar con un paño para tareas delicadas. 7. El archivo se guarda en la computadora y se exporta un archivo Excel con los resultados de las mediciones y las concentraciones de ácidos nucleicos. 28

Estandarización de la concentración de ADN Procedimiento Después de cuantificar los ácidos nucleicos, las muestras se estandarizan a 100 ng/μL de concentración agregando solución buffer TE 1X. La cantidad necesaria de solución buffer TE 1X se determina con la siguiente fórmula: VA= V2 - V1 V2= C1*V1 C2 VA= Volumen a agregar C2= Concentración final C1= Concentración inicial V2=Volumen final V1= Volumen inicial Ejemplo: Se tienen 215 ng/μL de ADN disueltos en 150 μL de solución buffer TE 1X y se requiere estandarizar a 100 ng/μL de concentración, ¿qué volumen de solvente se tiene que agregar? VA= ? V2=? C1= 215 ng/μL C2= 100 ng/μL V1= 150 μL V2= (215 ng/μL) (150 μL) = 322.5 μL 100 ng/μL VA= 322.5 μL - 150 μL = 172.5 μL Se agregan 172.5 μL de solución buffer TE 1X. 29

Comprobación de la integridad de los ácidos nucleicos La integridad del ADN se evalúa por corrimiento electroforético sobre gel de agarosa al 1% a 100 mV durante 30 min. Procedimiento 1. Acomodar el molde sobre la cámara de electroforesis horizontal y colocar el peine, a aproximadamente 1 cm del extremo (Figura 27 a). 2. Para preparar el gel, en un matraz Erlenmeyer con 60 mL de solución buffer TEB 1X, agregar 600 mg de agarosa. Calentar en microondas y mezclar para disolver hasta que la disolución esté completamente trasparente. Evitar que la disolución hierva o se proyecte (Figura 27 b). 3. Confirmar visualmente que no se observen grumos ni burbujas en la disolución. Dejar enfriar a TA durante 5 minutos, agregar 3 µL de Gel-Red (1:60) (Figura 27 c y 27 d), mezclar hasta disolver, después, verter en el molde con la precaución de evitar la formación de burbujas y dejar gelificar a TA durante aproximadamente 20 a 30 minutos (Figura 27 e). 4. Remover el peine, colocar el gel en la cámara y cubrir con solución buffer TEB 1X hasta la marca (Figura 27 f). 5. Mezclar 3 µL de ADN a una concentración de 10 ng/µL más 2 µL de solución buffer de carga SGB y aplicar en los pozos. En el primer y último pozos, aplicar 3 µL de λ DNA [10 ng/µL] como marcador de peso molecular (Figura 27g y 27h). 6. Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder y encender el equipo. El corrimiento se programa a 100 mV durante 30 minutos. Comprobar que migre en dirección al cátodo (Figura 27 i). 7. La observación de las bandas del gel se realiza mediante luz UV con uso de un equipo transiluminador y capturar la imagen con un equipo fotodocumentador (Figura 27 j). 30

a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) Figura 27. Procedimiento de corrimiento electroforético sobre gel de agarosa. 31

Verificación de la funcionalidad La funcionalidad de los ácidos nucleicos se lleva a cabo con amplificación por PCR punto final del gen rbcL. La secuencia del iniciador sentido es 5’-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3’, mientras la secuencia del iniciador antisentido es 5’-gaaacggtctctccaacgcat-3’ (Levin et al., 2003). La mezcla de reacción se prepara con 1 μL de ADN más 4 μL de PCR mix (cuadro 4) y las condiciones de amplificación se observan en el cuadro 5. Material y equipo  Micropipetas de 0.2 a 2 μL, 2 a 20 μL y 20 a 200 μL  Puntas de 10 y 200 μL  Tubo de microcentrífuga de 1.5 mL  Termociclador punto final  Placa de PCR de 100 μL Procedimiento 1. En un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL preparar la mezcla de reacción de acuerdo con los reactivos observados en el cuadro 4. Realizar el cálculo de los volúmenes a pipetear acuerdo con la cantidad de muestras de ADN. En el cuadro 4 se incluye un ejemplo del cálculo de los volúmenes para 100 muestras. Cuadro 4. Mezcla de reacción para la amplificación del gen rbcL. Reactivos Concentración final Volumen para una Volumen para 100 - reacción (µL) reacciones (µL) ddH2O REDTaq Ready mix PCR 1.64 164 reaction mix 2X Iniciador sentido 10 mM 0.80 X 2.00 200 Iniciador antisentido 10 mM 0.35 mM 0.18 18 Total 0.35 mM 0.18 18 4.00 - 400 32

2. Pipetear 4 µL de PCR mix y aplicarlo en cada pozo de la placa. Después, pipetear 1 μL de ADN [10 ng/μL], aplicarlo en el pozo y mezclarlo por pipeteo 5 o 6 veces con el PCR mix. 3. Tapar la placa con una tapa de plástico, centrifugar la placa durante 10 segundos para bajar todo el volumen de los pozos y luego ponerla en el termociclador. 4. Programar el termociclador de acuerdo a las condiciones observadas en el cuadro 5. Cuadro 5. Condiciones para la amplificación del gen rbcL por PCR (Levin et al., 2003). Etapa Temperatura (°C) Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 95 1 min 1 Desnaturalización 95 40 s Alineamiento 55 40 s 35 Extensión 72 1 min Extensión final 72 6 min 1 5. Iniciar el proceso de termociclado. 6. Una vez que el equipo termociclador ha concluido con el proceso, la placa se retira y se verifica la amplificación por corrimiento electroforético en gel de agarosa al 2%. Separación por electroforesis de fragmentos de ADN amplificado 1. Acomodar el molde sobre la cámara de electroforesis horizontal y colocar el peine, a aproximadamente 1 cm del extremo (Figura 27 a). 2. Para preparar el gel, en un matraz Erlenmeyer con 60 mL de solución buffer TEB 1X, agregar 1.2 g de agarosa. Calentar en microondas y mezclar para disolver hasta que la disolución esté completamente trasparente. Evitar que la disolución hierva o se proyecte (Figura 27 b). 3. Confirmar visualmente que no se observen grumos ni burbujas en la disolución. Dejar enfriar a TA durante 5 minutos, agregar 3.5 µL de Gel-Red (1:60), mezclar hasta disolver (Figura 27 c y 27 d), después, verter en el molde con la precaución de evitar la formación de burbujas y dejar gelificar a TA durante aproximadamente 20 a 30 minutos (Figura 27 e). 33

4. Remover el peine, colocar el gel en la cámara y cubrir con solución buffer TEB 1X hasta la marca (Figura 27 f). 5. Cargar en los pozos 3 µL del producto del amplificado de cada muestra. En el primer y último pozos, aplicar 3 µL de marcador de peso molecular escalera 100 pb (Figura 27 g y 27 h). 6. Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder y encender el equipo. El corrimiento se programa a 100 mV durante 50 minutos. Comprobar que migre en dirección al cátodo (Figura 27 i). 7. La observación de las bandas del gel se realiza mediante luz UV con uso de un equipo transiluminador y capturar la imagen con un equipo fotodocumentador. 8. El producto del amplificado esperado corresponde a una banda de aproximadamente 600 pb (Figura 27 j). 34

Detección cualitativa del promotor 35S en ADN de cultivos La detección del promotor 35S (p35S) se realiza con amplificación mediante PCR tiempo real con la secuencia de los iniciadores y sondas reportadas previamente del p35S (Pérez-Urquiza et al., 2013) y del gen interno específico de especie (Pérez- Urquiza et al., 2013; Nardini, 2012; Yang et al., 2008) cuadro 6. Material y equipo  Centrifuga de placas  Cubierta óptica para placa  Microcentrífuga  Micropipetas de 0.2 a 2 μL, 2 a 20 μL y 20 a 200 μL  Placa de qPCR de 100 μL  Puntas de 10 y 200 μL  Termociclador StepOne Plus  Tubo de microcentrífuga de 1.5 mL Procedimiento 1. En un tubo de microcentrifuga de 1.5 mL preparar la mezcla de reacción de acuerdo con los reactivos observados en el cuadro 7. Realizar el cálculo de los volúmenes a pipetear acuerdo con la cantidad de muestras de ADN. En el cuadro 7 se incluye un ejemplo del cálculo de los volúmenes para 100 muestras. 2. Pipetear 9 µL de la mezcla de reacción y aplicarlo en cada pozo de la placa. Después, pipetear 1 μL de ADN [100 ng/μL], aplicarlo en el pozo y mezclarlo por pipeteo 5 o 6 veces con la mezcla de reacción. 3. Incluir en la placa dos controles positivos, dos controles negativos y dos controles sin templado. El control positivo es ADN de la especie a estudiar, además, contiene el promotor 35S. El control negativo es ADN de la especie a estudiar, pero, no contiene el p35S. El control sin templado es agua sin ADN. 4. Tapar la placa con una cubierta óptica, centrifugar la placa durante 10 segundos para bajar todo el volumen de los pozos y colocarla dentro del termociclador. 5. Programar el termociclador de acuerdo a las condiciones observadas en el cuadro 8 e iniciar el proceso de termociclado. 35

6. Una vez que el equipo termociclador ha concluido con el proceso, retirar la placa y analizar los resultados obtenidos. 36

Cuadro 6. Secuencia de nucleótidos de los iniciadores y sondas pa especie. Gen Oligonucleótido Nombre Promotor 35S Iniciador sentido p35S-F Alcohol Iniciador antisentido p35S-R deshidrogenasa C Sonda p35S-P LAT52 Iniciador sentido AdhC-F Iniciador antisentido AdhC-R Hidroximetilglutaril A Sonda AdhC-P Iniciador sentido LAT52-F Lectina Iniciador antisentido LAT52-R Sonda LAT52-P Iniciador sentido hmgA-F Iniciador antisentido hmgA-R Sonda hmgA-P Iniciador sentido Lec-F Iniciador antisentido Lec-R Sonda Lec-P

ara la amplificación de p35S y genes internos específicos de Secuencia Especie 5’-cgtcttcaaagcaagtggattg-3’ OGM 5’- tcttgcgaaggatagtgggatt-3’ 5’-FAM-tctccactgacgtaagggatgacgca-TAMRA-3’ Algodón 5’- cacatgacttagcccatctttgc-3’ Jitomate 5’- cccacccttttttggtttagc-3’ 5’- VIC-tgcaggttttggtgccactgtgaatg-TAMRA-3’ Maíz 5’- agaccacgagaacgatatttgc-3’ Soya 5’- ttcttgccttttcatatccagaca-3’ 5’- HEX-ctctttgcagtcctcccttgggct-BHQ1-3’ 5’- ttggactagaaatctcgtgctga-3’ 5’- gctacatagggagccttgtcct-3’ 5’-HEX-caatccacacaaacgcacgcgta-TAMRA-3’ 5’-ccagcttcgccgcttccttc-3’ 5’-gaaggcaagcccatctgcaagcc-3’ 5’-HEX-cttcaccttctatgcccctgacac-TAMRA-3’ 37

Cuadro 7. Mezcla de reacción para la amplificación del p35S y gen Reactivos Concentración Con inicial H20 libre de nucleasas - TaqMan Fast Advanced Master Mix 2X Iniciador sentido p35S-F 10 µM Iniciador antisentido p35S-R 10 µM Sonda p35S-P 5 µM Iniciador sentido gen interno 10 µM Iniciador antisentido gen interno 10 µM Sonda gen interno 5 µM Total -

n interno. ncentración final Volumen para una Volumen para 100 reacción (µL) reacciones (µL) - 2.08 208 1X 5.00 500 300 nM 0.30 30 300 nM 0.30 30 180 nM 0.36 36 300 nM 0.30 30 300 nM 0.30 30 180 nM 0.36 36 9.00 900 - 38

Cuadro 8. Condiciones de amplificación de p35S y gen interno. Etapa Temperatura (°C) Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 95 10 min 1 Desnaturalización 95 15 s 45 Alineamiento y extensión 60 60 s Análisis de resultados Los resultados se realizan mediante el análisis de la gráfica de amplificación y los valores Ct de p35S y gen interno obtenidos. Se considera la presencia de amplificación cuando se observa la curva típica. Procedimiento 1. En la gráfica, se comprueba la amplificación por la presencia de tres fases de la curva típica: a) inicial, b) exponencial y c) meseta, además, las líneas de amplificación deben estar por encima de la línea del umbral (Figura 28). 2. También, se verifica que los valores Ct se encuentren en el rango de 20 a 36. 3. Se confirma: a) amplificación de p35S y gen interno en el control positivo, b) amplificación del gen interno, pero no de p35S en el control negativo, y c) sin amplificación en el control sin templado. 39

Figura 28. Gráfica de amplificación de p35S y gen interno. 40