ບົດນິພົນ ປະລິນຍາໂທ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––– XAYKHAM THIPPHAVONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O-METHYLTRANSFERASE (CoOMT) VÀO CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2021

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––– XAYKHAM THIPPHAVONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O-METHYLTRANSFERASE (CoOMT) VÀO CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) Ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 8420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học : TS. PHẠM THỊ THANH NHÀN THÁI NGUYÊN - 2021

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme columbamine o-methyltransferase (CoOMT) vào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Tôi đã tự tiến hành các bước thí nghiệm, thu kết quả và viết thành luận văn dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Phạm Thị Thanh Nhàn. Mọi kết quả đã thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác. Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ. Thái Nguyên, tháng 7 năm 2021 Tác giả luận văn Xaykham THIPPHAVONG Xác nhận của BCN Khoa Sinh học Xác nhận của cán bộ hướng dẫn TS. Phạm Thị Thanh Nhàn i

ii

iii

iv

LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dành cho tôi học bổng học tập, để tôi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã trang bị cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý giá về các môn học liên quan đến chuyên ngành của tôi và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học. Tôi xin cảm ơn toàn thể đồng nghiệp, gia đình, bạn bè đã động viên, giúp em vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinh sống tại Thái Nguyên, Việt Nam. Mặc dù đã cố gắng rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài luận văn nhưng năng lực và kinh nghiệm còn hạn chế, em rất mong nhận được sự ý kiến nhận xét của quý thầy cô để luận văn của em được hoàn thiện hơn. Thái Nguyên, tháng 7 năm 2021 Tác giả luận văn Xaykham THIPPHAVONG v

MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................... i Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii Mục lục............................................................................................................ iii Những chữ viết tắt ........................................................................................... iv Danh mục các bảng........................................................................................... v Danh mục các hình .......................................................................................... vi MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề..................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu..................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài .......................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................. 3 1.1. Giới thiệu về cây thuốc lá .......................................................................... 3 1.2. Hợp chất rotundin và enzyme Columbamine O - methyltransferase........... 5 1.2.1. Hợp chất rotundin ................................................................................... 5 1.2.2. Enzyme Columbamine O- methyltransferase .......................................... 7 1.3. Kỹ thuật chuyển gen thực vật và ứng dụng cải thiện hàm lượng dược chất trong cây thuốc............................................................................... 8 1.3.1. Phương pháp chuyển gen ở thực vật........................................................ 8 1.3.2. Kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium umefaciens ở thực vật ..................................................................................................... 10 1.3.3. Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen.................... 12 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 19 2.1. Vật liệu nguyên cứu ................................................................................. 19 2.1.1. Vật liệu thực vật.................................................................................... 19 2.1.2. Chủng vi khuẩn..................................................................................... 20 2.1.3. Hóa chất và thiết bị ............................................................................... 20 vi

2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 22 2.3.1. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá............................................ 22 2.3.2. Phân tích cây chuyển gen ...................................................................... 24 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 28 3.1. Kết quả chuyển gen CoOMT vào cây thuốc lá ......................................... 28 3.1.1. Kết quả nuôi cấy in vitro tạo nguyên liệu biến nạp................................ 28 3.1.2. Kết quả nuôi hoạt hóa vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 chứa vector chuyển gen CoOMT........................................................................................ 29 3.1.3. Kết quả biến nạp gen CoOMT vào cây thuốc lá..................................... 30 3.2. Kết quả phân tích sự cây thuốc lá chuyển gen ở mức độ phiên mã........... 34 3.2.1. Kết quả xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen.................................................................................................. 34 3.2.2. Kết quả phân tích biểu hiện gene CoOMT bằng phản ứng semi- quantitative PCR (semi- qPCR) ...................................................................... 36 3.2.3. Thảo luận về kết quả đánh giá hoạt động của vector chuyển gen pBI121-1113 - CoOMT................................................................................... 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41 vii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Gen mã hóa tổng hợp CoOMT: Columbamine O- L-tetrahydropalmatin Cộng sự Methyltranferase Nucletide tổng hợp dùng trong Cs/đtg: phản ứng PCR Axit hữu cơ dùng để khử hoạt DNA Deoxyribonucleic Acid tính các enzyme. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn dNTP: Deoxynucleoside Môi trường nuôi cây cơ bản Mật độ vi khuẩn Triphosphate Phán ứng chuỗi Polymerase Phán ứng chuỗi tổng hợp EDTA: Ethylene diamine tetraacetic cDNA từ mRNA Môi trường tạo rễ acid Môi trường kéo dài chồi Môi trường tạo đa chồi LB: Luria Bertani Dung dịch đệm điện di DNA MS: Murashige - Skoog OD:: Optical density PCR: Polymerase Chain Reaction RT-PCR: Polymerase Chain Reaction Reverse Transcription PCR RM: Rooting medium SEM: Shoot elongation medium SIM: Shoot induction medium TAE: Tris - Acetate - EDTA iv

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro ở thuốc lá ........... 21 Bảng 2.2. Cặp mồi đặc trưng của phản ứng RT-PCR..................................... 25 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR............................................................ 26 Bảng 2.4. Thông tin trình tự mồi trong phản ứng semi- qPCR và qRT-PCR.. 27 Bảng 3.1. Kết quả biến nạp vector mang gen CoOMT vào cây thuốc lá......... 33 Bảng 3.2. Kết quả định lượng RNA tổng số tách chiết từ cây thuốc lá WT và cây chuyển gen ......................................................................... 34 v

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây thuốc lá .................................................................................... 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin ................ 5 Hình 1.3. Con đường tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine .................. 8 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid.............................................................. 10 Hình 1.5. Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA sang tế bào thực vật (Tzfira và Citovsky 2006) ............................. 12 Hình 2.1. Cây thuốc lá giống K326 in vitro................................................... 19 Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện pBI121 ......................................... 20 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát............................................................ 22 Hình 3.1. Hình ảnh mẫu cây thuốc lá in vitro ................................................ 29 Hình 3.2. Hình ảnh nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng ....................... 30 Hình 3.3. Mảnh lá cây thuốc lá được ngâm trong dịch khuẩn AGL1............. 30 Hình 3.4. Mảnh lá cây thuốc lá sau khi lây nhiễm được đặt trên môi trường đồng nuôi cấy và chọn lọc.................................................. 31 Hình 3.5. Các mảnh lá tái sinh đa chồi, chọn lọc và tạo cây hoàn chỉnh ........ 32 Hình 3.6. Cây thuốc lá chuyển gen trong nhà lưới......................................... 33 Hình 3.7. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ cây thuốc lá WT và chuyển gen thế hệ T0 ..................................... 35 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0.............. 36 Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm semi-qPCR phân tích sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng ...... 37 vi

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, nhờ những tiến bộ về kỹ thuật di truyền mà người ta đã tạo ra rất nhiều giống cây trồng bằng cách lai giống, đột biến thực nghiệm, công nghệ tế bào, chuyển gen. Trong đó, chuyển gen là kỹ thuật cho phép đưa một hoặc một số gen nhất định nào đó vào hệ gen của cây chủ được quan tâm để tạo ra cây trồng biến đổi gen nhằm cải thiện một số đặc tính hay tính trạng theo hướng lợi ích cho con người. Chuyển gen đã và đang được quan tâm, được tiến hành thực nghiệm trên nhiều giống cây trồng và được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt là kỹ thuật chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacienes. Thực vật là một nguồn có giá trị cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp như steroid, alkaloids, flavonoid, terpenoid, anthocyanon, quinin và lignan . Các hợp chất này được sử dùng làm dược liệu, hương liệu, hóa chất, thuốc nhuộm, nước hoa và phụ gia có giá trị cao. Tổng số khoảng 30.000 sản phẩm thự nhiên được biết đến có hơn 80% có nguồn gốc từ thực vật. Những sản phẩm này được biết như là những hợp chất trao đổi thứ cấp, thường được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong cây như alkaloid loại L-tetrahydropalmatin (rotundin). Rotundin là một dược liệu được áp dụng trong điều trị một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất. Columbamine O-Methyltransferase (CoOMT) mới được phát hiện là một enzyme làm chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin ở cây thuộc bộ Mao lương (Rannunculaceae). Biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme CoOMT có thể sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng rotundin trong cây chuyển gen [31]. 1

Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là một loài cây thuộc họ Cà (Solanaceae) và đang là loại cây được sử dụng phổ biến nhất để biểu hiện gen chuyển từ nhiều loại sinh vật, bởi vì nó dễ trồng và dễ dàng biến đổi gen. Nó cũng cung cấp lượng mô sống đáng kể và có hệ thống nuôi cấy tế bào được thiết lập tốt. Enzyme vi khuẩn được tổng hợp trong thuốc lá có thể tăng cường bảo vệ, chống lại các stress phi sinh học và mầm bệnh. Thuốc lá cũng được sử dụng như một mô hình cho tính nhạy cảm với các bệnh thực vật, sinh tổng hợp pyridine alkaloid (như nicotine), stress oxy hóa… Cách tiếp cận kỹ thuật chuyển gen và phân tích sinh vật chuyển gen trong nghiên cứu chức năng của gen đang được ứng dụng ngày càng rộng rãi và nhiều gen mới trong hệ gen của cây thuốc lá đã được giải mã chức năng. Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần tạo thành công cây thuốc lá chuyển gen (chứa gen CoOMT) với mục đích nghiên cứu chức năng của gen CoOMT trong quá trình nâng cao năng suất tổng hợp chất ankaloid loại rotundin, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme CoOMT vào cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được một số dòng cây thuốc lá (Nicotiana Tabacum L.) mang gen chuyển CoOMT ở thế hệ T0. 3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme CoOMT vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen. 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài Những kết quả về tạo được một số dòng cây thuốc chuyển gen khẳng định cơ sở khoa học của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện sự tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp loại rotundin của cây mô hình và góp phần làm tiền đề cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào cây trồng (cây đích). 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây thuốc lá Theo Reed, Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) được phân loại thuộc giới thực vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có tới trên 85 chi với tổng số trên 1.800 loài. Chi Nicotiana được chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 loài trong đó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1 loài ở Châu Phi. Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ. Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại được trồng phổ biến làm thuốc lá là Nicotiana tabacum (N. tabacum) và N. rustica [22], [39]. Giới (Kingdome): Plantae Ngành (Division): Tracheophyta Lớp (Class): Anginosperm Bộ (Order): Solanales Họ (Family): Solanaceae Chi (Genus): Nicotiana Loài (Species): N. tabacum Hình 1.1. Cây thuốc lá Rễ thuốc lá: Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấp thu. Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, phần trên sát mặt đất. Rễ thuốc lá tập trung dày đặc ở lớp đất 0 - 30 cm, phát triển theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin được vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá. Thân cây: Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thân cây có thể đạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một 3

lá. Đường kính thân đạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là nách. Có 2 loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ. Lá thuốc lá: Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay đổi tuỳ theo giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác. Độ dày, màu sắc lá có thể thay đổi. Hoa: Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn, được hình thành do sự phân hoá của đỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa. Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối (97 - 98%), còn lại có thể do thụ phấn chéo do gió hoặc côn trùng,… Quả và hạt: Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa. Mỗi cây có 100 - 150 quả trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 - 500 quả trên chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra. Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là 0,07 - 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10.000 đến 150.00 hạt [39]. Thuốc lá là loại cây được sử dụng phổ biến nhất để biểu hiện gen chuyển từ nhiều loại sinh vật, bởi vì nó dễ trồng và dễ dàng biến đổi gen. Nó cũng cung cấp lượng mô sống đáng kể và có hệ thống nuôi cấy tế bào được thiết lập tốt. Nhiều protein vi khuẩn tham gia vào quá trình tổng hợp các sản phẩm thương mại hiện đang được thiết kế để sản xuất trong thuốc lá. Enzyme vi khuẩn được tổng hợp trong thuốc lá có thể tăng cường bảo vệ, chống lại các stress phi sinh học và mầm bệnh [30]. Thuốc lá được sử dụng rộng rãi như một hệ thống cây mô hình trong nghiên cứu chuyển gen vì nhiều lý do: Di truyền phân tử của nó được hiểu rõ, lập bản đồ gen của nó gần như được hoàn tất,… Cây thuốc lá có thể sinh trưởng, phát triển tốt trong ống nghiệm, trong điều kiện nhà kính và tạo ra một lượng lớn sinh khối. Thuốc lá cũng được coi là một trong những hệ thống tốt nhất để biến đổi lục lạp, giúp tăng cường hơn nữa hiệu quả đối với sự 4

biểu hiện của protein tái tổ hợp. Cây thuốc lá biến đổi gen cũng là mô hình lý tưởng cho nghiên cứu các chức năng sinh học cơ bản, chẳng hạn như tương tác mầm bệnh, phản ứng môi trường, điều hòa sinh trưởng và lão hóa [30]. Thuốc lá cũng được sử dụng như một mô hình cho tính nhạy cảm với các bệnh thực vật, sinh tổng hợp pyridine alkaloid (như nicotine), stress oxy hóa… [31]. 1.2. Hợp chất rotundin và enzyme Columbamine O-methyltransferase 1.2.1. Hợp chất rotundin Thực vật bậc cao có rất nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau, gồm hơn 25.000 terpenoid, khoảng 12.000 alkaloid và 8.000 phenolic. Trong đó nhiều chất có hoạt tính sinh học cao và được dùng làm thuốc, đặc biệt là các alkaloid. Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi trong động vật, có dược lực tính mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid. Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp chất hữu cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [26]. Theo Mantsch John R, Li Shi-Jiang. L-tetrahydropalmatin có tác dụng trong điều trị cai nghiện cocain và trong điều trị cai nghiện oxycodone 27. Rotundin có tên khoa học là L-tetrahydropalmatin, đây là một alkaloid, lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin trong quá trình nghiên cứu cấu trúc của palmatin theo phản ứng 24. Hình 1.2. Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin 5

Rotundin có công thức phân tử: C12H25NO4. Khối lượng phân tử là M=355,43. Danh pháp quốc tế của rotundin: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy-6H dibenzo [a, g] quinolizine. Đây là một hợp chất hữu cơ gồm 4 vòng kết dính, chứa nhân dị vòng isoquinolin, vì thế nó thuộc loại isoquinolin alkaloid và đó cũng là một trong các bộ khung alkaloid rất thường gặp trong một số họ thực vật. Rotundin là hợp chất ít độc và có nhiều hoạt tính vô cùng phong phú. Kết quả nghiên cứu ở Liên Xô (cũ), Rumani, Trung quốc đã chỉ ra rằng L- tetrahydropalmatin rất ít độc. Thí nghiệm cho thấy rằng một liều cao hơn 30 mg/kg cơ thể được tiêm đồng tử bị liệt nhất thời rồi hết [1]. Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần. Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [2]. Năm 2001, Nguyễn Minh Chính sử dụng thuốc tiêm rotundin sulfat có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, tương tự như diazepam [1] Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng), tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an toàn cao của chế phẩm. Rotundin ít độc. Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày. Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và 60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh [40]. Chu 6

Hongyuan, Jin Guozhang và cộng sự. nghiên cứu cơ chế giảm đau của L- tetrahydropalmatin thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2, ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện ở Trung Quốc 20. Một số sản phẩm của rotundin đã được thương mại hóa tại Việt Nam như: Rotundin của công ty Dược phẩm TW3, Rotundin của Công ty cổ phần Dược phẩm TW2 [41]. 1.2.2. Enzyme Columbamine O- methyltransferase Methyltransferase là enzyme chìa khóa trực tiếp tham gia nhiều con đường sinh tổng hợp nhiều hợp chất quan trọng. Mỗi methyltransferase trong quá trình sinh tổng hợp palmatine (gồm có S-adenosyl-L-methionine: norcoclaurine 6-O-methyltransferase (6OMT); S-adenosyl-L-methionine: coclaurine N-methyltransferase (CNMT); S-adenosyl-L-methionine: 3’ - hydroxy-N-methylcoclaurine 4’-O-methyltransferase (4’OMT); S-adenosyl-L- methionine: scoulerine 9-O-methyltransferase (SMT) và CoOMT) đòi hỏi tính đặc thù về cơ chất chặt chẽ cho dù các cơ chất có sự tương đồng về cấu trúc [33]. Hiện nay, sự hiện diện và chức năng của các protein tham gia con đường sinh tổng hợp rotundin nói riêng, palmatine nói chung vẫn đang được các nhà khoa học quan tâm, khám phá. Takashi và cs (2002) lần đầu tiên đã xác định được trình tự cDNA của gen CoOMT ở loài Coptis japonica và chứng minh được vai trò chuyển hóa cơ chất columbamine thành palmatine. Đồng thời, các tác giả đề xuất chức năng chuyển hóa cơ chất tetrahydro columbamine thành tetrahydropalmatine (rotundin) dựa trên những kết quả thí nghiệm. Từ trình tự cDNA thu được, Takashi và cs xác định được gen CoOMT có sự tương đồng với gen 6OMT, 4’OMT và các gen OMT khác ở thực vật, mức độ tương đồng cao hơn gen SMT (Hình 1.3) [33]. 7

Hình 1.3. Con đường tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine [33] 1.3. Kỹ thuật chuyển gen thực vật và ứng dụng cải thiện hàm lượng dược chất trong cây thuốc 1.3.1. Phương pháp chuyển gen ở thực vật Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc 8

gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Gen chuyển phải được di truyền cho thế hệ sau và ở mỗi thế hệ sản phẩm biểu hiện của gen phải thể hiện được chức năng sinh học như khả năng mã hóa cho các tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền [16]. Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen gián tiếp. - Phương pháp chuyển gen trực tiếp thường được sử dụng là chuyển gen bằng súng bắn gen. Với ưu điểm là thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào và nguyên liệu để bắn đa dạng, trong những năm gần đây phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen đã được áp dụng thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông. Nhưng phương pháp này đòi hỏi chi phí thiết bị đắt tiền và có nhiều bản sao trong gen biến nạp được chuyển vào tế bào cùng lúc gây khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững. - Phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng phổ biến là chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970. Việc phát hiện ra Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu năm 1980 đã biến loài này trở thành một công cụ quan trọng nhất trong chuyển gen thực vật với những ưu điểm nổi trội: (i) Gen chuyển ít bị đào thải; (ii) Số lượng bản sao ít, do đó tránh được hiện tượng ức chế và câm lặng lẫn nhau; (iii) Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do phụ thuộc vào hệ thống protein Vir; (iv) Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm; (v) Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Mặc dù vậy, phương pháp này mới chỉ được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm, nhưng hiệu quả với cây một lá mầm còn thấp (do ở cây một lá mầm các tế bào khi bị thương có xu 9

hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm). Khi nhược điểm này được khắc phục thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium sẽ ngày càng được quan tâm và dẫn trở thành một phương pháp chuyển gen được các nhà nghiên cứu ưu tiên lựa chọn vì lúa, ngô, lúa mì, … là những cây lương thực thiết yếu [42]. 1.3.2. Kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium umefaciens ở thực vật 1.3.2.1. Vi khuẩn A.tumefaciens Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng khối u ở thực vật. Agrobacterium là vi khuẩn gram âm (-), gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Vi khuẩn A. tumefaciens không tự sản xuất được một số amino acid như octopin, nopaline. Để tồn tại nó chuyển gen của nó vào thực vật, thực vật sản xuất các chất cần thiết, vi khuẩn phân hủy các chất này để lấy năng lượng. Trong quá trình cộng sinh này, vi khuẩn cũng chuyển các gen kích thích sinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thực vật. Ti plasmid là một loại plasmid đặc hiệu được vi khuẩn chuyển nạp vào tế bào thực vật gây nên tình trạng khối u [43]. Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid (https://vi.wikiarabi.org/wiki/Ti_plasmid) [43] 10

Ti plasmid là một phân tử DNA kép, gồm 150.000 - 200.000 cặp nucleotid. Tuy nhiên chỉ có một đoạn gồm 20.000 - 30.000 cặp nucleotid có khả năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ, đó là đoạn T-DNA. T-DNA có chứa các đoạn gen gây ra sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào thực vật, đó là các gen mã hóa auxin và cytokynin. Trên Ti plasmid còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hóa opine [43], [44]. 1.3.2.2. Chuyển gen qua A.tumefaciens Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất có bản chất phenol là acetosyringone (AS) và hydroxyacetosyringone. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng vir là A, B, C, D, E, F, G và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có hai chức năng chính: (i) Cắt đứt đoạn bờ phải và bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA; (ii) Bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật để tiếp cận với genome cây chủ. Vết thương của cây được nhận diện thông qua tín hiệu hóa học acetosyringone. Tín hiệu này được nhận biết đầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất của vết thương trên thực vật. Protein vir A tự phosphoryl hóa đồng thời làm cho protein vir G được phosphoryl hóa và kích hoạt sao mã các gen vir B, C, E, F, G, H. Tiếp đó, các protein được mã hóa bởi vir D, vir E thực hiện chức năng giải phóng sợi T-DNA. Protein D2 cắt T-DNA ở vị trí 5’ của bờ phải và 3’ của bờ trái, protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây. Protein C1, C2 đồng thực hiện chức năng tăng cường giải phóng T-DNA. Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm. Protein vir B có chức năng tạo kênh xuyên màng tế bào giúp sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào. Đồng thời protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển T-DNA [35], [48]. 11

Hình 1.5. Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA sang tế bào thực vật (Tzfira và Citovsky 2006) [35] 1.3.3. Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen Các cây được chuyển trồng trên giá thể có nguồn gốc in vitro được gọi là cây T0. Ở thế hệ T0, cây chuyển gen được xác nhân sự có mặt của gen chuyển bằng các phương pháp PCR, Southern blot và điện di trên gel agarose [4]. 1.3.3.1. Phân tích bằng phương pháp PCR và Southern blot Phương pháp PCR Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính DNA và tái bản DNA. Phản ứng được thực hiện khi có sự tham gia của: (i) DNA khuôn, (ii) Các đoạn DNA oligonucleotide (là đoạn DNA ngắn), (iii) DNA polymerase bền nhiệt, như Taq polymerase (enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus), (iv) dNTP, (v) Dung dịch đệm và ion Mg2+. Mỗi chu ky gồm 3 giai đoạn ở nhiệt độ khác nhau: - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50-65°C trong 20- 40 giây để mồi gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với sợi DNA, nhưng cũng đủ cao cho quá trình bắt cặp đặc 12

hiệu, nghĩa là, mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bổ sung trên mạch khuôn. Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu quá cao, mồi có thể không gắn. Thông thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn 3-5 °C so với Tm của mồi dùng trong phản ứng. Liên kết hydro bền giữa phân tử DNA- DNA chỉ được hình thành khi mồi bổ sung hoàn toàn với khuôn. Polymerase liên kết với các phân tử lai DNA mồi - khuôn và bắt đầu tổng hợp DNA. - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các DNA polymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75-80°C, và nhiệt độ 72°C thường được sử dụng với enzyme này. Tại giai đoạn này DNA polymerase tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA khuôn bằng cách thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung theo chiều 5′ đến 3′, phản ứng trùng ngưng xảy ra giữa nhóm 5′ - phosphate của dNTP với nhóm 3′ - hydroxyl phía cuối của sợi DNA vừa mới được hình thành. Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase và độ dài của đoạn DNA cần khuếch đại. Thông thường, các DNA polymerase có khả năng khuếch đại được hàng nghìn bazo nito trên một phút. Trong điều kiện tối ưu, tức là, nếu không có hạn chế do giới hạn của cơ chất hoặc chất phản ứng thì sau mỗi giai đoạn kéo dài, số lượng DNA được khuếch đại sau mỗi chu kì tuần theo hàm mũ. - Giai đoạn kết thúc kéo dài: Giai đoạn này đôi khi được thực hiện ở nhiệt độ 70-74°C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme polymerase dùng trong phản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo rằng tất cả DNA sợi đơn còn lại đều được tổng hợp hoàn toàn. Giai đoạn bảo quản: Giai đoạn này thực hiện ở nhiệt độ 4-15°C trong một thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng [4], [37]. Phương pháp Southern blot Southern blot là kỹ thuật lai giữa DNA đích (đoạn DNA cần tìm) với đoạn DNA dò (DNA đã biết trình tự trước hoặc probe) để cho phép phát hiện 13

trình tự DNA đích [8] và được ứng dụng thông thương trong nghiên cứu DNA của bộ gene, kiểm tra kết quả chuyển gene hoặc kiểm tra sự có mặt của một gene nào đó trong bộ gene của tế bào [45]. Nguyên lý của kỹ thuật Southern blot dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA (phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hoá chất gây biến tính DNA như NaOH hoặc Formandehyt) và nguyên tắc bổ sung giữa các cặp nucleotide: A-T, G-C (các đoạn polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung). Áp dùng màng lai nitrocellulose hay nylon có khả năng tiếp nhận DNA. Lai Southern đòi hỏi một đoạn DNA (RNA) đã biết trình tự để làm mồi “Probe”. Probe được đánh dấu trước, các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR [45]. Kỹ thuật Southern blot gồm các thao tác (1) Tách chiết, làm biến tính các DNA kếp thành sợi đơn, DNA tinh sạch được xử lý với kiềm, cắt bởi các enzyme giới hạn (RE) thành các đoạn kích thước khác nhau, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose; (2) Chuyển DNA đã biến tính từ gel agarose lên màng lai (nylon hoặc nitrocellulose); (3) Lai với mẫu dò (chuyển màng lai đã chứa DNA vào bể chứa dung dịch đệm và bổ sung DNA dò) và (4) Kiểm tra kết quả lai bằng kỹ thuật phóng xạ tự gh, kết quả lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi (đối với đầu dò đánh dấu phóng xạ), phương pháp so màu (với đầu dò đánh dấu bằng biotin) hay dựa vào sự phát quang (với các đầu dò phát quang sinh học) để định vị DNA-probe [8], [45]. 1.3.3.2. Kỹ thuật điện di trên gel agarose Điện di ngang trên gel agarose (Agarose gel electrophoresis) là kỹ thuật được sử dụng chủ yếu để phân tách DNA trong mẫu dựa trên kích thước, kỹ thuật này cũng được sử dụng để phân tách RNA hoặc protein [38]. Phân tử DNA được cấu tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi khung sườn (backbone) từ đường dideoxybose và một nhóm phosphate. Theo cấu trúc này, mỗi một nucleotide sẽ đều mang điện tích âm, điều này khiến 14

DNA có điện tích âm tỷ lệ thuận với khối lượng (mass-to-charge). Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điện trường có thể khiến DNA di chuyển về phía điện cực dương. Quy trình thực hiện 1) Chuẩn bị gel agarose: - Agarose là một loại polysaccharide tự nhiên được chiết từ tảo biển. Gel agarose sử dụng trong điện di thường ở nồng độ 0.5 ~ 2%, tùy vào kích thước DNA cần phân tách. - Khi đổ gel agarose, một chiếc lược sẽ được cắm lên trên miếng gel và gỡ ra khi gel đã đông đặc để tạo thành các giếng cho phép nạp mẫu vào. 2) Chạy điện di trên gel agarose: - Miếng gel agarose được đặt trong bồn điện di, chứa dung dịch đệm (buffer) dẫn điện và ổn định pH, thường là Tris-acetate-EDTA (TAE) hoặc Tris-Borate-EDTA (TBE). - Mẫu DNA được pha với dung dịch nạp mẫu (loading dye) nhằm giữ mẫu chìm trong giếng và cung cấp chỉ thị màu để nhận biết sự điện di. 3) Quan sát DNA sau khi điện di: - Nhuộm gel để quan sát do DNA “vô hình” với mắt thường, phổ biến nhất là nhuộm bằng hóa chất huỳnh quang, chẳng hạn như Ethidium Bromide (EtBr)… Tùy vào loại hóa chất nhuộm huỳnh quang được sử dụng, có thể bổ sung chúng vào agarose trước khi đổ gel hoặc sau khi chạy điện di để nhuộm - Sau khi điện di và nhuộm gel xong, có thể thực hiện ghi nhận hình ảnh DNA thông qua hệ thống đọc gel (gel document system) hay còn gọi là hệ thống chụp ảnh gel. Hệ thống đọc gel gồm nguồn chiếu sáng (illumination source), bộ lọc (filter) để loại bỏ ánh sáng nền và camera để ghi nhận hình ảnh, đôi khi còn tích hợp PC và trang bị màn hình cảm ứng [4], [5], [38]. 1.4. Một số thành tựu trong nghiên cứu chuyển gen ở cây thuốc lá Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trở thành một công cụ quan trọng nhất trong chuyển gen thực vật 15

với các mục đích nhữ tăng khả năng chống chịu, nâng cao năng suất và chất lượng, cải thiện khả năng tích lũy dĩnh dưỡng và tăng cường các họp chất có hoạt tính sinh học [26]. Trong vài năm trở lại đây các nhà nghiên cứu đã thực hiện xây dựng và hoàn thiện quy trình chuyển gen ở nhiều loại cây thiết yếu trong lĩnh vực lương thực-dược phẩm và nông lâm nghiệp, trong đó có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen vào thuốc lá. Kết quả nghiên cứu chuyển gen Glycine max Chalcone Isomerase 1A (GmCHI1A) để tăng hàm lượng isoflavone dạng aglucone vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens là tiền đề cho mô hình tăng cường biểu hiện gen GmCHI1A ở cây đậu tương của Lê Thị Hồng Trang, Chu Hoàng Mậu và Nguyễn Hữu Quân (2019). Trong nghiên cứu đã dùng chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A có nguồn gốc từ cây đậu tương vào cây thuốc lá giống K326 và tạo cây thuốc lá chuyển gen. Từ 90 mẫu biến nạp đã tạo được 30 cây thuốc lá chuyển gen sinh trưởng phát triển bình thường trong điều kiện nhà lưới, hiệu suất chuyển gen là 33,33%. Kết quả phân tích PCR thu được 22 cây thuốc lá chuyển gen có gen chuyển GmCHI1A và hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn phân tích này là 24,44%. Gen chuyển GmCHI1A được xác nhận đã biểu hiện ở cây thuốc lá bằng phân tích RT-PCR. Kết quả chuyển gen GmCHI1A vào cây thuốc lá là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI1A trên cây đậu tương chuyển gen [11]. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen của Lò Thanh Sơn (2015) trong định hướng cải thiện kích thước bộ rễ nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương đã nhận xét rằng, gen chuyển GmEXP1 (Expansin) liên quan đến sự kéo dài rễ được xác định tồn tại trong hệ gen của các dòng cây thuốc lá, hiệu suất chuyển gen đạt 5%. Kết quả nghiên cứu xác định được gen chuyển di truyền ổn định và biểu hiện protein expansin tái tổ hợp qua thế hệ T0 và T1. Trong điều kiện hạn và không gây hạn, các dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả 16

năng kéo dài rễ chính cao hơn so với đối chứng từ 34,56% - 41,23% [15]. Đặc biệt, Lò Thanh Sơn đã thành công chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84 nhờ A. tumefaciens và tạo được cây đậu tương chuyển gen T0 cho sản phẩm dương tính với PCR. Protein expansin tái tổ hợp được biểu hiện ở một dòng cây đậu tương chuyển gen và hiệu suất chuyển gen đạt 0,27% [32]. Nghiên cứu chuyển gen kháng chống mọt (ZmDEF1) nhờ Agrobacterium tumefaciens vào giống thuốc lá C9-1 của Vì Thị Xuân Thủy và cộng sự (2017). Kết quả cho thấy, biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào 60 mảnh lá của giống thuốc lá C9-1 trong 3 lần thí nghiệm thu được 56 mảnh sống sót, tạo được 69 chồi, chuyển được 12 cây chuyển gen ra trồng trong bầu đất và có 6 cây trồng tại nhà lưới sinh trưởng, phát triển bình thường, biểu hiện xanh tốt, mập mạp. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phản ứng PCR thu được 5/6 dòng cây chuyển gen chứa gen chuyển ZmDEF1, hiệu suất chuyển gen đạt 8,33% [17]. Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen ssiv tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thông qua A. tumefaciens của Nguyễn Thị Minh Hồng và cộng sự (2018). Trong nghiên cứu đã phân lập được gen ssiv từ giống sắn KM140. Cấu trúc này được chèn vào vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S và biến nạp vào cây thuốc lá bằng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens. Sau đó, cây chuyển gen được kiểm tra bằng phương pháp PCR và đánh giá sự biểu hiện của gen qua phương pháp phân tích hàm lượng tinh bột. Kết quả cho thấy hàm lượng tinh bột tích lũy trong cây chuyển gen vượt trội hơn các cây không chuyển gen (26,9 - 67,9%; rễ 6,8 - 17,6%) ở cùng điều kiện sinh trưởng. Nghiên cứu này đã tạo ra một hướng mới trong việc tạo cây trồng biến đổi gen có khả năng tăng sự tích lũy tinh bột [14]. Trong nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen GmDREB7 phân lập từ cây đậu tương, Đỗ Thanh Kim Hường (2019) đã tiến hành thí 17

nghiệm biến nạp cấu trúc vector mang gen chuyển pBI121_GmDREB7 vào cây thuốc lá mô hình giống K326 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Sau 3 lần biến nạp và chọn lọc bằng kháng sinh đã thu được 45 cây sinh trưởng tốt. Khi phân tích DNA tổng số bằng điện di trên gel 0,8% và xác định sự có mặt của gen chuyển GmDREB7 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi XbaI-DREB7F/ DREB7-SacI-R, kết quả cho thấy trong 9 cây thuốc lá chuyển gen được phân tích thì có 7 cây cho kết quả dương tính với PCR, có nghĩa là gen chuyển GmDREB7 đã có mặt trong hệ gen của các cây thuốc lá chuyển gen. Như vậy, bước đầu đã xác định được gen chuyển GmDREB7 đã được biểu hiện ở mức phiên mã tổng hợp mRNA trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 [7]. Theo cách tiếp cận này, chúng tôi đã sử dụng cấu trúc vector chuyển gen mang gen CoOMT biến nạp vào cây thuốc lá mô hình K326 nhằm đánh giá hiệu quả hoạt động của cấu trúc được thiết kế và chức năng của gen trong cây mô hình, làm cơ sở cho sự chuyển gen mục tiêu vào cây Bình vôi để nâng cao hàm lượng dược chất rotundin và alkaloid. 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nguyên cứu 2.1.1. Vật liệu thực vật Giống thuốc lá sử dụng để làm vật liệu trong nghiên cứu là giống K326 được nuôi cấy in vitro trong phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên. Giống K326 là giống thuốc lá được Công ty Novatis lai tạo tờ tổ hợp lai Mc Nair 225 (coker 139 x coker 319) x (NC nair 30 x NC 95), sản xuất và đưa ra từ năm 1982, ở trên thế giới giống này đang được trồng rất phổ biến. Tại Việt Nam, giống này đã được chọn lọc bởi tập đoàn giống nhập khẩu từ Mỹ và nó đã chính thức được công nhận là giống quốc gia vào năm 1996 [18]. Chiều cao cây là 1,4m, thân to, lá dài, màu xanh đậm, thời gian sinh trưởng 110 - 120 ngày, số lá thu hoạch 18 - 19 lá. Hình 2.1. Cây thuốc lá giống K326 in vitro Giống cây thuốc lá K326 hiện là giống trồng phổ biến nhất ở Việt Nam với năng suất từ 18 đến 20 tạ/ha, nó dễ sấy và có tỉ lệ lá cấp 1 và cấp 2 rất cao. Hàm lượng nicotine của cây là từ 1,6 đến 3,0%, và hàm lượng đường khử là từ 15 đến 30%. Hương vị của nó được đánh giá ở mức rất cao và có tính chất hút đạt tốt. Tuy nhiên, nó có nhược điểm lớn nhất là ra hoa sớm [18]. 19

2.1.2. Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn A. tumefaciens (AGL1) tái tổ hợp mang vector pBI121- 1113 chứa gen chuyển CoOMT do Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên cung cấp. Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện pBI121 (Chen PY, Wang CK và cs 2003) [20] 2.1.3. Hóa chất và thiết bị Hóa chất: Bột MS, agar, sucrose, vitamin B5, nước cất, cồn, các phytohoocmon như BAP, IBA; môi trường nuôi khuẩn LB; các chất kháng sinh như kanamycin, cefotaxime, rifampicin, acetosyringone, carbenicillin; và một số chất khác cho thí nghiệm phân tích di truyền như: thuốc nhuộm ethidium bromide (EtBr), mồi, Taq polymerase, dNTP, dung dịch đệm, ion Mg2+, agarose, CTAB, TAE, EDA, NaOH, NaCl, … Dụng cụ: Nồi hấp khử trùng (auto clave), buồng cấy vô trùng (biological safety cabinets), tủ lắc, máy đo pH, máy đo OD, máy li tâm, máy PCR, máy soi gel, tủ lạnh, tủ sấy, bể ổn nhiệt, cuối chày sứ, cân điện tử, bộ đồ cấy gồm: dao 20

cấy, que cấy, đĩa cấy, đèn cồn, bông, giấy làm nút, giấy thấm, bình tam giác, pipet, đĩa petri, ống falcon, cốc thủy tinh định mức cùng các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật. 2.2. Địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro và chuyển gen ở cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens được tiến hành trên trang thiết bị của Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, phân tích cây thuốc lá chuyển gen tại phòng Công nghệ gen của khoa sinh học trường Đai học sư phạm Thái Nguyên. Các thí nghiệm ra cây được bố trí tại vườn ươm của trường. Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro ở thuốc lá Môi trường Ký Thành phần hiệu Nuôi cây in vitro (chuẩn MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 14g/l bị vật liệu) Đồng nuôi cấy (Co- MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 14g/l cultivation medium) CCM + AS 0,2mM + BAP 1,5mg/l; pH = 5,4 Cảm ứng tạo đa chồi MS cơ bản + sucrose 30g/l +agar 14g/l SIM (Shoot induction medium) + BAP 1,5mg/l+ kanamycine 50 mg/ml Kéo dài chồi (Shoot MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 14g/l + elongation medium) SEM IAA 0,1mg/l+ kanamycine 50 mg/ml . Ra rễ (Rooting medium) MS cơ bản + sucrose 30g/l + agar 14g/l + RM IBA 0,1mg/l + kanamycine 50 mg/ml. Thời gian nghiên cứu: Từ 8/2020 đến 6/2021. Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 21

2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá Biến nạp cấu trúc mang gen chuyển CoOMT thông qua lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens vào mảnh lá và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen được thực hiện như mô tả của Topping (1998) [34]. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen được mô tả tổng quát trong hình 2.3. Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Tạo nguyên liệu biến nạp gen: Môi trường tái sinh: Sau khi chuẩn bị môi trường, mẫu sạch (phần đỉnh sinh trưởng và đoạn thân) được chuyển sang môi trường tái sinh cây là MS cơ bản có bổ sung sucrose 30 g/l, agar 14 g/l và BAP 0,5 mg/l. Môi trường đều được chuẩn pH=5,8 và khử trùng. Thí nghiệm 22

được tiến hành ở nhiệt độ 25±20°C, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Những mẫu cây thuốc lá hoàn chỉnh đạt 5-7 tuần tuổi được thu làm vật liệu thí nghiệm biến nạp gen [8], [11], [14]. Tạo dịch huyền phù A. tumefaciens: A.tumefaciens chủng AGL1 chứa plasmid pBI121-1113 được cất giữ trong glycerol ở -20°C. Bước chuẩn bị vi khuẩn là nuôi khuẩn trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh rifampicin, karnamycine, caribe nuôi ở 28°C lắc ở 150 vòng/phút trong 3-5 ngày. Tiếp theo là nuôi vi khuẩn hoạt hóa (nuôi buổi sáng) trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh rifamicine, karnamycine, carbeciline và lắc ở 150 vòng/phút, 28°C, tiến hành nuôi 6 tiếng. Sau 6 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy (40ml) trên ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút, ở 4°C trong 12 phút và lấy một phần nữa (5ml) đo nồng độ vi khuẩn hoặc OD cho tới khi đạt được OD600 ≈ 0.5- 1.0. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn bằng dịch nuôi hoặc môi trường ½ MS mà có bổ sung AS trong nồng độ phù hợp. Dịch huyền phù vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm ngay với mảnh lá non [14]. Biến nạp hoặc lây nhiễm vi khuẩn với lá: Lá thuốc lá bị cắt thành mảnh nhỏ với kích thước 1 cm2. Ngay sau khi cắt mảnh lá được đưa vào dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung AS trong khoảng 20- 30 phút, lắc nhẹ trong tủ cấy điều kiện vô trùng. Sau 30 phút những mảnh lá nhiễm khuẩn được phơi khô trong thời gian nhất định (nhưng không khô quá). - Đồng nuôi cấy: Mảnh lá khô sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường nuôi cộng sinh 1,5 mg/l BAP có bổ sung AS trên đĩa petri, nuôi trong tối, ở nhiệt độ 21°C trong 2 ngày 2 đêm (48 tiếng). - Nuôi phục hồi và tạo chồi: Sau khi nuôi trong tối 48 tiếng mẫu được rửa bằng nước cất khử trùng có kháng sinh cefotaxime trong 30 phút và làm thật khô. Sau đó chuyển mẫu sang môi trường 1,5mg/l BAP có bổ sung kanamycine và cefotaxime, nuôi trong sáng, thời gian chiếu sáng 16 giờ 23

sáng/ngày, ở nhiệt độ 25± 20°C trong 6 tuần. Trong thời gian nuôi phục hồi mẫu được chuyển sang môi trường mới trong mỗi 14 ngày. - Tái sinh cây biến nạp gen hoàn chỉnh: Chồi tái sinh trong môi trường chọn lọc 1,5 mg/l BAP được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh MS0 có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật, nuôi sáng ở 25°C, thời gian 20- 30 ngày. Sau đó chuyển sang môi trường tạo rễ 0,2 mg/ml IBA trong 20 ngày để chuẩn bị phân tích và chuẩn bị mang ra vườn ươm [6], [15]. - Chuyển cây ra đất: Cây tái sinh trên môi trường chọn lọc MS0+IBA có 2-5 lá và có 3-4 rễ đã trở thành cây hoàn chỉnh được chuyển ra đất trồng và để tiến hành đánh giá cây chuyển gen [4], [8]. 2.3.2. Phân tích cây chuyển gen 2.3.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số RNA được tách từ lá cây chuyển gene bằng Trizol™ Reagent [46],[47]. Các bước thực hiện: (1) Nghiền mịn mẫu thân mầm và bẹ lá ngô bị xử lý hạn qua các ngưỡng trong nitơ lỏng, lấy 300mg bột mẫu vào eppendorf 2 ml đã khử DEPC. (2) Bổ sung 1ml Trizol, trộn đều mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. (3) Bổ sung 1ml hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24:1), lắc mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. (4) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, hút 600������l dịch phía trên chuyển sang eppendorf 1,5ml đã khử DEPC. (5) Bổ sung 500������l isopropanol, lắc nhẹ, đặt mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút để tủa RNA. Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn. (6) Bổ sung 500������l cồn 70o để rửa. Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn (bước này thực hiện 2 lần). (7) Làm khô mẫu trong box bật quạt 5 phút, hòa tan cặn bằng 50������l nước khử ion có DEPC và DNase, bảo quản mẫu ở -86oC. 24

2.3.2.2. Phương pháp RT- PCR xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá chuyển gen - Thiết kế và tổng hợp mồi: Dựa trên trình tự gen đăng kí trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI mã số AB073908 và cấu trúc vector pBI121-1113 mang gen CoOMT. Gen đích có kích thước đầy đủ được gắn thêm trình tự mã hóa đoạn peptid tín hiệu cmyc và trình tự cắt của enzyme giới hạn ở hai đầu, tổng kích thước là 113bp. Chúng tôi sử dụng phẩn mềm DNAstar thiết kế cặp mồi đặc trưng cho phản ứng RT- PCR, semi-qPCR, qRT- PCR phân tích cây thuốc lá chuyển gen. Thông tin về các cặp mồi được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.2. Cặp mồi đặc trưng của phản ứng RT-PCR TT Tên mồi Trình tự (5' - 3') Nhiệt Kích độ bắt thước gen cặp dự kiến 1 RT-Fw TCTAGAATGGATACTCCGAACAC 1113bp 58oC 2 RT-Rv GAGCTCTCAGAGTTCGTCTT - 1.5 ug RNA được sử dụng để tổng hợp cDNA theo hướng dẫn của bộ kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit [46]. Phản ứng RT- PCR được thực hiện qua hai giai đoạn. (1) Giai đoạn RT: Đây là giai đoạn tổng hợp cDNA từ mRNA. Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của hãng sản xuất Fermentas. Bước 1: Trộn hỗn hợp gồm 3������l RNA, 1������l mồi Oligo(dT)18, 8������l nước khử ion khử DEPC, li tâm nhanh mẫu, ủ ở 65oC trong 5 phút. Bước 2: Bổ sung 2������l dung dịch đệm cho enzyme phiên mã ngược, 1������l dNTPs, 1µl Inhibitor, li tâm nhanh mẫu, đặt mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Bước 3: Bổ sung 1������l reverse transcriptase. Sau đó đặt mẫu vào máy PCR với chu trình nhiệt 42oC trong 1 giờ và 70oC trong 10 phút. (2) Giai đoạn PCR: cDNA được sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen CoOMT. Thành phần của phản ứng được trình bày trong Bảng 2.2. 25

Chu trình nhiệt cho phản ứng RT- PCR gen CoOMT là 94˚C: 3 phút 30 giây; (94˚C: 30 giây; 58˚C: 50 giây; 72˚C: 1 phút 20 giây) lặp lại 30 chu kỳ; 72˚C: 10 phút; 4˚C: ∞. Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Nước deion - 7,5 Master mix 2X 12,5 Primer ( F+ R) 10 pmol/������l 2,0 cDNA/DNA 100 ng/������l 2 Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau đó, nhuộm gel trong dung dịch EtBr, soi gel và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Mỗi mẫu biến nạp là mảnh lá được tái sinh chồi từ mảnh lá đó và 3 lần chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa trồng trên giá thể. Số cây hoàn chính của mỗi mẫu biến nạp gen dương tính với PCR được tạo thành một dòng cây thuốc lá chuyển gen. Hiệu suất chuyển gen được tính theo công thức: Hiệu suất chuyển gen (%) = Số dòng cây chuyển gen sống sót trên môi trường chọn lọc/dương tính với PCR Tổng số mẫu biến nạp 2.3.2.3. Phương pháp phân tích sự biểu hiện gen CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen bằng phản ứng PCR bán định lượng (semi- qPCR) Các cặp mồi của gen tham chiếu Actin và gen đích CoOMT được thiết kế dựa trên trình tự gen trên Genbank và tổng hợp theo đơn đặt hàng với Công ty Phù Sa (Việt Nam) để sử dụng cho phản ứng PCR bán định lượng (semi- qPCR) và realtime RT-PCR (qRT- PCR) nhằm phân tích mức độ phiên mã và hoạt động của cấu trúc vector chuyển gen trong cây mô hình (thuốc lá). Thành phần phản ứng semi- qPCR tương tự bảng 2.3. 26

Bảng 2.4. Thông tin trình tự mồi trong phản ứng semi- qPCR và qRT-PCR Tên mồi Trình tự mồi 5’- 3’ Nhiệt độ bắt cặp ActNF GATCTTGCTGGTCGTGATCTT 58oC ActNR GTCTCCAACTCTTGCTCATAGTC COMT-qF CGCTCCACAATTACGAGGAT 60oC COMT-qR CAGTGGTAAATTCTCGGTGTCC Chu trình nhiệt cho phản ứng semi-qPCR đoạn gen tham chiếu (house- keeping gene) Actin là 94˚C: 5 phút; (94˚C: 20 giây; 58˚C: 20 giây; 72˚C: 30 giây) lặp lại 26, 28, 30 chu kỳ; 72˚C: 10 phút; 4˚C: ∞. Chu trình nhiệt cho phản ứng semi-qPCR đoạn gen CoOMT là 94˚C: 5 phút; (94˚C: 20 giây; 60˚C: 20 giây; 72˚C: 30 giây) lặp lại 26, 28, 30 chu kỳ; 72˚C: 10 phút; 4˚C: ∞. Sản phẩm semi-qPCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau đó, nhuộm gel trong dung dịch EtBr, soi gel và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và các số liệu thống kê thu được được xử lý bằng phần mềm SPSS (với α= 0,05). 27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chuyển gen CoOMT vào cây thuốc lá Giống cây thuốc lá K326 được chọn làm đối tượng nhận gen chuyển CoOMT. Trong thí nghiệm này, cấu trúc mang gen chuyển CoOMT (pBI121- 1113 - CoOMT) được chuyển vào cây thuốc lá qua mảnh lá bị tổn thương bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens. 3.1.1. Kết quả nuôi cấy in vitro tạo nguyên liệu biến nạp Để có nguyên liệu phục vụ biến nạp cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT vào cây mô hình, chúng tôi sử dụng một bình mẫu cây thuốc lá in vitro tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên để nhân giống. Phần thân cây được cắt thành các đoạn ngắn có kích thước khoảng 0,5- 1 cm và được cấy chuyển trên môi trường MS+ sucrose 30 g/l+ agar 8 g/l. Các mẫu lá non được cắt thành các mảnh lá có kích thước khoảng 1 cm2 và được cấy chuyển lên môi trường MS + sucrose 30 g/l+ agar 14 g/l có bổ sung BAP 1,5 mg/ml. Các môi trường đều được chuẩn pH= 5,8 và khử trùng. Thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ 25°C±2, với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, cường độ chiếu sáng 200 lux. Khi mẫu đoạn thân hoặc mảnh lá tạo được chồi mới, chồi được chuyển sang môi trường MS+ sucrose 30 g/l+ agar 14 g/l+ IBA 0,2 mg/ml. Khi mẫu phát triển thành hoàn chỉnh sau 5- 7 tuần tuổi với 6- 7 lá được thu làm vật liệu để biến nạp gen. Kết quả nuôi cấy in vitro cây thuốc lá tạo nguyên liệu phục vụ biến nạp cấu trúc vector mang gen chuyển, làm cơ sở để đánh giá hiệu quả hoạt động của cấu trúc trên cây mô hình được thể hiện ở hình 3.1. 28

Hình 3.1. Hình ảnh mẫu cây thuốc lá in vitro A : Nuôi cấy đoạn thân trên môi trường MS0 sau 1 tuần; B đoạn thân xuất hiện đa chồi trên MS0 sau 3 tuần; C: chồi đang sinh trưởng trên MS0 sau 2 tuần; D: nuôi cấy mảnh lá trên MS0 +BAP 1,5 mg/l trong 1 tuần; E: cụm chồi sinh trưởng trên MS0; F: cây in vitro hoàn chỉnh 3.1.2. Kết quả nuôi hoạt hóa vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 chứa vector chuyển gen CoOMT Vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB lỏng 20 ml được bổ sung thêm kháng sinh chọn lọc như: rifamycin 50 mg/ml, kanamycin 50 mg/ml, carbenicillin 50 mg/ml, ở 28°C, lắc ở 150 vòng/phút trong 3-5 ngày. Sau đó sử dụng 1ml dịch khuẩn nuôi hoạt hóa với 50ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc rifamycin 50 mg/ml, kanamycin 50 mg/ml, carbenicillin 50 mg/ml ở 28°C, lắc ở 150 vòng/phút trong 4-6 tiếng. Kết quả đo OD600nm= 0.63. Ly tâm dịch khuẩn với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 4°C trong thời gian 12 phút. Hòa tan tế bào vi khuẩn lắng tạo huyền phù vi khuẩn bằng cách đổ 40ml dung dịch ½ MS và 40l AS 100 vào ống falcon 50 ml và lắc. 29

Hình 3.2. Hình ảnh nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng A: Môi trường nuôi khuẩn lỏng gồm 20 ml LB + kháng sinh chọn lọc; B : Dịch khuẩn sau nuôi phục hồi 4 ngày 3.1.3. Kết quả biến nạp gen CoOMT vào cây thuốc lá Thí nghiệm chuyển cấu trúc vector mang gen CoOMT được thực hiện trên cây thuốc lá N. tabacum giống K326 thông qua chủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1, nhằm mục đích đánh giá hiệu quả hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chức năng của gen chuyển trong việc làm tăng khả năng tổng hợp chất akalloid trên cây mô hình. Vật liệu nhận gen là các mảnh lá có kích thước khoảng 1cm2 đã được gây tổn thương quanh mép lá. Sau đó ngâm mảnh lá trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 25-30 phút. Trong dịch khuẩn gồm cặn vi khuẩn, 100 ml môi trường ½ MS có bổ sung AS50 trong nồng độ 100l/100ml (Hình 3.3). Hình 3.3. Mảnh lá cây thuốc lá được ngâm trong dịch khuẩn AGL1 30

Đồng nuôi cấy: Mảnh lá khô sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường nuôi cấy có bổ sung BAP 1,5 mg/ml, AS 50l/ml trên đĩa petri, nuôi trong tối, ở nhiệt độ 21°C trong 2 ngày 2 đêm (Hình 3.4). Hình 3.4. Mảnh lá cây thuốc lá sau khi lây nhiễm được đặt trên môi trường đồng nuôi cấy và chọn lọc Sau khi nuôi trong tối 48 tiếng, mẫu được rửa bằng nước cất khử trùng có kháng sinh cefotaxime 500mg/ml, rửa trong 30 phút bằng chia thành 2 giai đoạn. Sau khi rửa xong mẫu được làm thật khô bằng giấy thấm khử trùng và chuyển mẫu lên bình tam giác có chứa môi trường có bổ sung BAP 1,5 mg/l, kanamycine 50 mg/ml và cefotaxime 500 mg/ml. Nuôi ngoài sáng, thời gian chiếu sáng 16 giờ sáng/ngày, ở nhiệt độ 25°C ± 2 trong 6 tuần. Trong thời gian nuôi phục hồi mẫu được chuyển sang môi trường mới 2 lần (mỗi 14 ngày). Chồi tái sinh trong môi trường chọn lọc có bổ sung BAP 1,5 mg/l và kháng sinh đã trưởng thành được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh MS cơ bản có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật và kháng sinh chọn lọc vector tái tổ hợp, nuôi sáng ở 25°C, thời gian 20- 30 ngày. Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 1-2 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ (RM) MS0+ IBA 0.2 ml/l bổ sung kháng sinh chọn lọc trong 14 ngày. Cây tái sinh trên môi trường chọn lọc có 2-5 lá, có 3- 4 rễ đã trở thành cây hoàn chỉnh được chuyển ra đất trồng và để tiến hành đánh giá hiệu suất chuyển gen và phân tích cây chuyển gen (hình 3.5). 31

Về nguyên lý khoa học, cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT (pBI121-1113 - CoOMT) được thiết kế mang thêm gen chỉ thị kháng kháng sinh. Do vậy, những mẫu nhận được cấu trúc này đều có khả năng sống sót, sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine. Những mẫu không nhận được cấu trúc chuyển gen và cây đối chứng đều không có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine hoặc tạo những kiểu hình kém phát triển (màu lá ngày càng ngà vàng, kích thước mẫu nhỏ, xoăn và dị dạng...), nếu nuôi cấy trong thời gian dài mẫu chết. Hình 3.5. Các mảnh lá tái sinh đa chồi, chọn lọc và tạo cây hoàn chỉnh A: Các mảnh lá sau đồng nuôi cấy cảm ứng tạo đa chồi trên SIM trong 2 tuần bổ sung BAP 1,5mg/l với cefotaxime và kanamycine; B: cảm ứng tạo cụm chồi trên SIM trong 2 tuần bổ sung BAP 1,5mg/l với cefotaxime và kanamycine; C: Các chồi đang tái sinh trên môi trường kéo dài chồi SEM trong 1 tuần (BAP 1,5mg/l với cefotaxime và kanamycine); D: Kéo dài chồi SEM trong 2 tuần; E: cây được tạo ra rễ trong môi trường RM trong 2 tuần có bổ sung IBA 0.2ml/l và kháng sinh chọn lọc; F: cây hoàn chỉnh. 32

Khi cây chuyển gen ra rễ và phát triển tốt thành cây hoàn chỉnh và có 3-4 lá thì chuyển sang đất trồng. Kết quả chuyển cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT vào giống thuốc lá K326 trong 3 lần biến nạp là 150 mẫu được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả biến nạp vector mang gen CoOMT vào cây thuốc lá Đối chứng và Số mẫu Số mẫu tạo Số chồi Số cây Số cây trồng thí nghiệm biến nạp cụm chồi tái sinh ra rễ trên giá thể ĐC1 30 19 52 31 17 ĐC0 30 0 00 0 Thí 1 50 14 25 14 9 nghiệm 2 50 33 72 40 17 3 50 22 55 30 15 Tổng 150 69 152 84 41 Ghi chú: ĐC1* là lá mầm cây thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh; ĐC0* là lá mầm cây thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh Hình 3.6. Cây thuốc lá chuyển gen trong nhà lưới Trên bảng trên cho thấy với 150 mẫu cây sau ba lần biến nạp thu được 69 mẫu tạo cụm chồi và có 152 mẫu chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc MS chứa cefotaxime, kanamycin và trong đó có 84 mẫu ra rễ, còn 41 cây trên giá 33

thế. Trong khi đó ĐC0 là 30 mẫu không chuyển gen được nuôi trên môi trường chọn lọc kháng sinh thì không xuất hiện mẫu tạo chồi, ở ĐC1 thì có 19 mẫu ra chồi, 52 chồi kéo dài, 31 chồi ra rễ, đem 17 cây trồng trên giá thể. Hiệu suất chuyển gen gia đoạn này là 27,3%. Kết quả này phù hợp với các công trình đã công bố trước đây [3], [25], [32], [36]. 3.2. Kết quả phân tích sự cây thuốc lá chuyển gen ở mức độ phiên mã 3.2.1. Kết quả xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen Mẫu lá từ 01 cây WT và 06 cây trong số 41 cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20) có đặc điểm sinh trưởng, phát triển tốt nhất trong nhà lưới được sử dụng để tách chiết RNA tổng số bằng Trizol™ Reagent. Các mẫu dịch chiết RNA tổng số được định lượng bằng máy Nanodrop (Bảng 3.2). Kết quả bảng 3.2 cho thấy dịch chiết RNA tổng số của 01 mẫu cây thuốc lá WT và 06 cây thuốc lá chuyển gen đều có tỉ số A260/A280 dao động từ 1,92- 1,96, đảm bảo độ tính sạch và hàm lượng tốt cho các phản ứng phân tích phân tử tiếp theo (nồng độ dao động từ 425- 793 ng/������������). Bảng 3.2. Kết quả định lượng RNA tổng số tách chiết từ cây thuốc lá WT và cây chuyển gen STT Mẫu/Dòng Tỉ số A260/A280 Nồng độ (ng/������������) 1 WT 1,93 505,3 26 1,96 793,9 37 1,93 500,0 48 1,92 435,0 59 1,99 1038,0 6 10 1,93 425,0 7 20 1,95 639,6 34

Khoảng 1,5 ug RNA được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1.2% (Hình 3.7). Kết quả điện di cho thấy RNA tổng số thu được đảm bảo chất lượng và độ tinh sạch để thực hiện các phản ứng phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng semi-qPCR và đánh giá mức độ phiên mã, hoạt động của cấu trúc vector chuyển gen thông qua phản ứng realtime RT-PCR (hay qRT-PCR). Hình 3.7. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ cây thuốc lá WT và chuyển gen thế hệ T0 (WT: RNA tách chiết từ cây Wild type- cây thuốc lá không chuyển gen; 6, 7, 8, 9,10, 20: RNA tách chiết từ các dòng cây thuốc lá chuyển gen) Xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật RT- PCR với cặp mồi RT_Fw/RT-Rv khuếch đại được toàn bộ trình tự cDNA-Cmyc- kdel và trình tự nhận biết của RE ở hai đầu, kích thước sản phẩm dự kiến khoảng 1,2kb (Hình 3.8A). Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR ở hình 3.8A cho thấy 06 cây chuyển gen đều dương tính (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20), cây WT không xuất hiện do không được chuyển cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT. Để xác định chất lượng cDNA tổng hợp được và khẳng định kết quả xác định sự có mặt của gen chuyển là chính xác, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi 18S (Hình 3.8B). Kết quả hình 3.8A và 3.8B hoàn toàn trùng khớp. Như vậy bước đầu có thể nhận xét rằng gen chuyển CoOMT đã có mặt trong hệ gen của các cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 (T0-6, T0- 7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20). 35

(A) (B) Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR xác định sự có mặt của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 (M: thang DNA 1 kb; WT: sản phẩm nhân gen CoOMT từ cây Wild type- cây thuốc lá không chuyển gen; 6, 7, 8, 9,10, 20: sản phẩm nhân gen CoOMT từ các dòng cây thuốc lá chuyển gen; (-): Đối chứng âm) 3.2.2. Kết quả phân tích biểu hiện gene CoOMT bằng phản ứng semi- quantitative PCR (semi- qPCR) Để đánh giá hiệu quả hoạt động của cấu trúc vector mang gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen làm cơ sở để chuyển cấu trúc vào cây Bình vôi, nhằm nâng cao hàm lượng dược chất có hoạt tính rotundin, RNA tổng số của cây WT và 06 dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 (T0-6, T0-7, T0- 8, T0-9, T0-10, T0-20) tiếp tục được sử dụng để phân tích mức độ biểu hiện của gen chuyển CoOMT ở mức phiên mã bằng phản ứng semi-qPCR. Kết quả phản ứng semi-qPCR vừa là cơ sở để để đánh giá định tính mức độ phiên mã, vừa khảo sát tính đặc hiệu của hai cặp mồi ActNF/ ActNR của gen Actin và COMT-qF/ COMT-qR của gen CoOMT khi thực hiện phản ứng qRT- PCR định lượng chính xác mức độ phiên mã của gen. Kết quả semi-qPCR được thể hiện ở hình 3.9. 36

Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm semi-qPCR phân tích sự biểu hiện của gen chuyển CoOMT trong cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng (WT: sản phẩm nhân gen CoOMT từ cây Wild type- cây thuốc lá không chuyển gen; 6, 7, 8, 9,10, 20: sản phẩm nhân gen CoOMT từ các dòng cây thuốc lá chuyển gen) Từ kết quả thể hiện ở hình 3.9, các band sản phẩm phản ứng semi-qPCR của gen tham chiếu Actin ở 01 mẫy cây WT và 06 mẫu cây chuyển gen thế hệ T0 (T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-20) tương đối đều nhau. Điều này cho thấy mức độ phiên mã của gen Actin ở các cây đều như nhau ở mọi điều kiện, đúng với lý thuyết về gen tham chiếu (house-keeping gene). Trong khi đó, gen chuyển CoOMT chỉ biểu hiện ở cây chuyển gen, không biểu hiện ở cây WT. Ở 26 chu kì, sự phiên mã của gen chuyển CoOMT ở 6 cây chuyển gen thấp hơn. Khi lên 28 chu kì, sự phiên mã của gen chuyển CoOMT ở 6 cây chuyển gen mạnh hơn cả gen tham chiếu Actin ở 30 chu kì. Các band sản phẩm phản ứng semi-qPCR của gen CoOMT đều có kích thước to và rõ nét hơn các band sản phẩm phản ứng semi-qPCR của gen tham chiếu Actin ở 6 mẫu cây chuyển gen thế hệ T0. Kết quả này bước đầu chứng tỏ cấu trúc vector chuyển gen mang gen chuyển CoOMT đã hoạt động tốt ở mức độ phiên mã. Gen đích đã được biểu hiện mạnh nhờ promoter có trong vector. Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn RNA tổng số của mẫu cây WT, mẫu T0-07, T0-09, T0-20 làm đại diện cho các mức độ phiên mã khác nhau (đối chứng- WT, biểu hiện thấp, biểu hiện cao) để định lượng chính xác mức độ phiên mã bằng phản ứng qRT-PCR với cặp mồi ActNF/ ActNR của gen Actin 37

và COMT-qF/ COMT-qR của gen CoOMT đã được thiết kế và kiểm tra bằng phản ứng semi-qPCR. Kết quả qRT-PCR là một minh chứng khẳng định cấu trúc chuyển gen pBI121-1113 – CoOMT hoạt động tốt trên cây mô hình, có thể chuyển vào cây đích để phân tích chức năng gen trong việc cải thiện hàm lượng dược chất rotundin và alkaloid. 3.2.3. Thảo luận về kết quả đánh giá hoạt động của vector chuyển gen pBI121-1113 - CoOMT Vector pBI121-1113 - CoOMT được thiết kế chứa cấu trúc 35S-CoOMT- cmyc-KDEL-polyA, gen nptII kháng Karnamycine và một số thành phần khác. Tập hợp các thành phần trong cấu trúc nằm giữa bờ trái (Left Border-LB) và bờ phải (Righ Border-RB) của vector thiết kế bảo đảm cho gen đích hoạt động và dễ dàng sàng lọc thể tái tổ hợp. Promoter 35S là một promoter mạnh được phân lập từ virus gây bệnh khảm lá súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus - CaMV), có thể khởi động phiên mã cho gen trong tất cả các loại mô bào thực vật ở các giai đoạn sinh trưởng và phát triển. Trong nghiên cứu này, khi thiết kế vector chuyển gen pBI121, promoter CaMV35S đã được sử dụng hướng đến việc khởi động phiên mã của gen chuyển CoOMT nhằm tăng cường sinh tổng hợp rotundin, palmatin ở cây Bình vôi. Một số nghiên cứu gần đây về chuyển gen ở thực vật đã sử dụng promoter CaMV35S trong cấu trúc vector chuyển gen đã thu được kết quả biểu hiện gen chuyển khả quan thông qua phân tích Western blot và ELISA. Promoter CaMV35S trong vector chuyển gen pCB301-GmEXP1 đã tăng cường sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá chuyển gen được xác nhận bằng kết quả phân tích Real-time RT-PCR và Western blot [32]. Sự biểu hiện mạnh của gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB2 trong vector pBI121-GmDREB2 chứa promoter CaMV35S được minh chứng bằng kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp GmDREB2 và tác động tăng cường tổng hợp proline ở cây chuyển gen trong điều kiện gây hạn nhân tạo [36]. Theo hướng tạo cây chuyển gen kháng virus theo cơ chế RNAi, Lo Thi Mai Thu và cs (2016) đã sử dụng promoter CaMV35S trong 38