Емцев В.Т. - Микробиология

вызывает превращение цианамида в мочевину. Далее гидролиз мо­ чевины происходит под влиянием уробактерий: CaCN2 + 2 Н ,0 ----- > H2CN2 + Са(ОН)2 H2CN2 + Н20 ----- > CO(NH2)2 C O (N H 2)2 + Н20 ----- > 2NH3 + С 0 2 Разложение хитина. Разложение хитина осуществляют мно­ гие почвенные микроорганизмы, он постоянно присутствует в поч­ ве. Это азотсодержащий полисахарид, полимер ацетилглюкозамина. Хитин содержится в наружном скелете беспозвоночных животных, в панцирных покровах насекомых, в клеточной стенке многих гри­ бов, в частности базидиомицетов и аскомицетов. Способностью разлагать хитин обладают около 50 видов бак­ терий родов Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Cytophaga, Strepto­ myces, Nocardia и Micromonospora. Из грибов активно воздействуют на это вещество мукоровые грибы и аспергиллы (Aspergillus fumiga- tus), а также Mortierella. Особенно легко разлагается хитин актино- мицетами. Известны и миксобактерии, усваивающие хитин, напри­ мер скользящая бактерия Chitinophaga pinensis. Под действием синтезируемого микроорганизмами фермента хитиназы хитин вначале разлагается на хитобиозу и хитотриозу, по­ путно образуется небольшое количество N -ацетилглюкозамина. Затем хитобиоза и хитотриоза расщепляются в присутствии хитоби- азы до уксусной кислоты, глюкозы и аммиака. 10.2. Нитрификация Аммиак, образующийся в почве, навозе и воде при разложении ор­ ганических веществ, довольно быстро окисляется до азотистой, а за­ тем азотной кислоты. Такой процесс называют нитрификацией. До середины XIX в., точнее, до работ J1. Пастера яш1ение об­ разования нитратов объясняли как химическую реакцию окисления аммиака атмосферным кислородом, причем предполагалось, что поч­ ва в этом процессе играет роль катализатора. J1. Пастер предположил, что образование нитратов — микробиологический процесс. Первые экспериментальные доказательства его гипотезы были получены Т. Ш лезингом и А. Мюнцем в 1879 г. Исследователи пропускали сточные воды через длинную колонку с песком и С а С 0 3. При фильт­ рации аммиак постепенно исчезал и появлялись нитраты. Нагревание колонки или внесение антисептиков прекращало окисление аммиака. Однако выделить культуры возбудителей нитрификации не удалось ни упомянутым исследователям, ни микробиологам, продол­ жавшим изучение нитрификации. Лишь в 1890—1892 гг. С. Н. Вино­ градский, применив особую методику, изолировал чистые культуры нитрификаторов. Ученый предположил, что нитрифицирующие бак­ 200

терии не растут на обычных питательных средах, содержащих орга­ нические вещества, это объяснило неудачи его предшественников. Действительно, нитрификаторы оказались хемолитоавтотро­ фами, т. е. бактериями, использующими энергию окисления а мми ­ ака или азотистой кислоты для синтеза органических веществ из СО, (хемосинтез). Поэтому их клетки очень чувствительны к при­ сутствию в среде органических соединений. Нитрифицирующие бактерии удалось выделить на минеральных питательных средах. С. Н. Виноградский установил, что существуют две группы ни- трификаторов: одна осуществляет окисление аммиака до азотистой кислоты (N H ^ ----->N O j) — п е р в а я ф а з а н и т р и ф и к а и и и, дру­ гая — окисление азотистой кислоты до азотной (N O j -----> N O j) — вторая фаза нитрификации. Представителей обеих групп относят к семейству Nitrobacte- riaceae. Это одноклеточные грамотрицательные бактерии. Среди ни­ трифицирующих бактерий есть палочковидные клетки, эллиптиче­ ские, сферические, извитые и дольчатые, плеоморфные. Размеры клеток колеблются от 0,3 до 1 мкм в ширину и от 1 до 3 мкм в дли­ ну. Существуют подвижные и неподвижные формы с полярным, субполярным и перитрихальным жгутикованием. Размножаются бактерии-нитрификаторы в основном делением, за исключением Nitrobacter, для которого характерно почкование. По­ чти у всех нитрификаторов хорошо развита система внутрицигоплаз- матических мембран, значительно различающихся по форме и распо­ ложению в клетках отдельных видов. Мембраны цитоплазмы подоб­ ны мембранам фотосинтезирующих пурпурных бактерий. Бактерии п е р в о й ф а з ы нитрификации представлены ро­ дами: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus и Nitroso- vibrio. Наиболее детально к настоящему времени изучен Nitrosomonas еигораеа (рис. 42, А). Он представляет собой короткие овальные па­ лочки размером 0,8—1 х 1—2 мкм. В жидкой культуре клетки Ni­ trosomonas проходят ряд стадий развития. Две основные из них пред­ ставлены подвижной формой и неподвижными зооглеями. Подвиж­ ная форма обладает субполярным жгутиком или пучком жгутиков. Описаны представители и других родов бактерий, вызываю­ щих первую фазу нитрификации. В т о р у ю ф а з у нитрификации осуществляют представители родов Nitrobacter, Nitrospira и Nitrococcus. Наибольшее число ис­ следований проведено с Nitrobacter winogradskyi (рис. 42, Б), однако описаны и другие виды (например, Nitrobacter agilis). Клетки нитро- бактера имеют удлиненную, клиновидную или грушевидную фор­ му, более узкий конец часто загнут в клювик, размеры клеток — 0,6—0,8 х 1—2 мкм. При почковании дочерняя клетка обычно под­ вижна, так как имеет один полярный жгутик. Известно чередование в цикле развития подвижной и неподвижной стадий.

Рис. 42. Нитрифицирующие бактерии: А — Nitrosomonas еигораеа\\ Б — Nitrobacter winogradskyi Описаны и другие виды бактерий, вызывающие вторую фазу нитрификации. Нитрифицирующие бактерии культивируют на простых мине­ ральных средах, содержащих аммиак или нитриты (окисляемые суб­ страты) и диоксид углерода (основной источник углерода). Источником азота для этих организмов служат аммиак, гидроксиламин и нитриты. Нитрифицирующие бактерии развиваются при pH 6,0— 8,6, оптимум реакции среды составляет pH 7,5—8,0. При значениях ниже pH 6 и выше pH 9,2 бактерии не развиваются. Оптимальная температура для развития нитрификаторов 25—30 °С. Изучение от­ нош ения различных штаммов Nitrosomonas еигораеа к температуре показало, что некоторые из них имеют оптимум развития при 26 °С или около 40 °С, другие способны довольно быстро расти при 4 °С. Нитрификаторы — облигатные аэробы 1. Используя кислород воздуха, они окисляют аммиак до азотистой кислоты (первая фаза нитрификации): N H+ + 1' / 20 2 ------ ►N 0 2 + Н20 + 2Н+ 1 В последние годы обнаружена способность бактерий к анаэробному окислению аммиака. Этот процесс, получивший название «анаммокс» (Ап- аттох), играет важную роль при очистке сточных вод. Осуществляющие его бактерии относятся к группе планктомицетов. (Прим. ред.) 202

а затем азотистую кислоту до азотной (вторая фаза нитрификации): N 0 2 + ' / 20 2 ----- > NOJ Следовательно, аммиак — продукт жизнедеятельности ам­ монифицирующих бактерий — использует для получения энергии Nitrosomonas, а нитриты, образующиеся в процессе жизнедеятель­ ности последних, служат источником энергии для Nitrobacter. Согласно современным представлениям, процесс нитрифи­ кации осуществляется на цитоплазматической и внутрицитоплазма- тических мембранах и проходит в несколько этапов. Первым про­ дуктом окисления аммиака становится гидроксиламин, затем пре­ вращающийся в нитроксил (NOH) или пероксонитрит (ONOOH), последний, в свою очередь, преобразуется в дальнейшем в нитрит, а нитрит в нитрат. Весь процесс нитрификации иллюстрирует сле­ дующая схема: N H 3 ----- » N H 2O H ----- > N O H ----- » O N O O H ----- > N O j ----- > NO j д м_ Хим. Гидроксил- Нитро- Пероксо- Нитрит Нитрат дисму- ксил нитрит миак тация N-,0 <— -------------------- Закись азота Нитритредукция Нитроксил, как и гидроксиламин, по-видимому, может диме- ризоваться в гипонитрит или превращаться в закись азота N ,0 — побочный продукт нитрификации. Кроме первой реакции (образо­ вания гидроксиламина из аммония), все последующие превращения сопровождаются синтезом макроэргических связей в виде АТФ. Нитрификаторы осуществляют фиксацию С 0 2 через восста­ новительный пентозофосфатный цикл (цикл Кальвина). В результа­ те последующих реакций образуются не только углеводы, но и дру­ гие важные для бактерий соединения — белки, нуклеиновые кисло­ ты, жиры и т. д. Долгое время нитрифицирующих бактерий относили к облигат­ ным хемолитоавтотрофам. Позднее были получены данные о спо­ собности этих бактерий использовать некоторые органические ве­ щества. Так, отмечено стимулирующее действие на рост Nitrobacter нитрита, дрожжевого автолизата, пиридоксина, глутаминовой кис­ лоты и серина. Предполагают, что некоторые нитрифицирующие бактерии обладают способностью переключаться с автотрофного на гетеротрофное питание. Однако нитрификаторы не растут на обыч­ ных питательных средах, так как большое количество легкоусвояе­ мых органических веществ, содержащихся в таких средах, задержи­ вает их развитие. Однако в природе такие бактерии хорошо развива­ ются в черноземах, навозе, компостах, т. е. в местах, где содержится много органического вещества. 203

Указанное противоречие оказывается несущественным, ecju сравнивать количество легкоокисляемого углерода в почве с те mi концентрациями органического вещества, которые нитрификаторь должны выдерживать в культурах. Так, органическое вещество поч[ представлено главным образом гуминовыми веществами, на кото­ рые приходится в черноземе 71 —91 % общего углерода, а легко усво­ яемые водорастворимые органические вещества составляют не бо­ лее 0,1% общего углерода. Следовательно, нитрификаторы не встре­ чают в почве больших количеств легкоусвояемого органического вещества. Накопление нитратов происходит с неодинаковой интенсив­ ностью на разных почвах. Чем богаче почва, тем больше соедине­ ний азотной кислоты она может накапливать. Существует метод оп­ ределения доступного растениям азота в почве по показаниям ее нитрификационной способности. Следовательно, интенсивность нитрификации можно использовать для характеристики агрономи­ ческих свойств почвы. Вместе с тем при нитрификации происходит лишь перевод одного питательного для растений вещества — аммиака в другую форму — азотную кислоту. Нитраты, однако, обладают некоторыми нежелательными свойствами. В то время как ион аммония поглоща­ ется почвой, соли азотной кислоты легко вымываются из нее. Кро­ ме того, нитраты восстанавливаются в результате денитрификации до N 2, ч т о также обедняет азотный запас почвы. Все перечисленное существенно снижает коэффициент использования нитратов расте­ ниями. В растительном организме соли азотной кислоты перед вклю­ чением в синтез должны быть восстановлены, на что тратится энер­ гия. Аммоний же используется непосредственно. В связи с этим ученые поставили вопрос о возможности искусственного снижения интенсивности нитрификации при помощи специфических ингиби­ торов, подавляющих активность бактерий-нитрификаторов и без­ вредных для других организмов. Уже предложены многочисленные промышленные препараты ингибиторов нитрификации (2-хлор-6- (трихлорметил)-пиридин, нитропирин и др.), синтезированные на пиридиновой основе. Ингибиторы нитрификации подавляют только первую фазу нитрификации и не действуют на вторую, а также на гетеротрофную нитрификацию. При применении ингибиторов ни­ трификации (нитропирин) эффективность азотных удобрений по­ вышается с 50 до 80%. Гетеротрофная нитрификация. Способны осуществлять ни­ трификацию и некоторые гетеротрофные микроорганизмы. К ним относятся бактерии из родов Pseudomonas, Arthrobacter, Corynebacteri- ит, Nocardia и отдельные виды грибов из родов Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium. Установлено, что Arthrobacter sp. в присут- 204

ствии органических субстратов вызывает окисление аммиака с обра­ зованием гидроксиламина, а затем нитрита и нитрата. Некоторые бактерии вызывают нитрификацию таких азотсодержащих органи­ ческих веществ, как амиды, амины, гидроксамовые кислоты, нитро­ соединения (алифатические и ароматические), оксимы и др. Однако считают, что гетеротрофная нитрификация не служит источником энергии для перечисленных организмов. Гетеротрофная нитрификация встречается в естественных ус­ ловиях (почвах, водоемах и других субстратах). Она может приобре­ тать главенствующее значение, особенно в атипичных условиях (на­ пример, при высоком содержании органических С- и N -соединений в щелочной почве и т. п.). Гетеротрофные микроорганизмы не толь­ ко способствуют окислению азота в таких условиях, но и вызывают образование и накопление токсичных веществ, соединений канце­ рогенного и мутагенного, а также химиотерапевтического действия. В связи с тем что некоторые из перечисленных соединений вредны для человека и животных даже в относительно низких концентраци­ ях, тщательно изучают возможность их образования в природе. 10.3. Иммобилизация азота При определенных условиях имеющиеся в почве минеральные фор­ мы азота переходят в недоступные для растений соединения. Один из таких процессов возникает вследствие бурного развития микро­ организмов, которые потребляют азот и переводят его в белок цито­ плазмы. Подобный процесс называют иммобилизацией азота. Биологически закрепленный азот не теряется из почвы. После отмирания микроорганизмов белковые вещества минерализуются и превращаются в аммиак. Иммобилизация азота наблюдается, например, при внесении в почву значительной массы соломы или соломистых удобрений. В ре­ зультате иммобилизации использование азота растениями заметно снижается, что приводит к уменьшению урожая. Таким образом, им­ мобилизация представляет собой процесс, обратный минерализации. Установлено, что превращение азотсодержащих соединений по пути минерализации или, наоборот, иммобилизации полностью определяется соотношением азота и углерода в органическом вещест­ ве, вносимом в почву. Если субстрат имеет узкое соотношение С : N, то при его разложении накапливается аммиак, поскольку микроор­ ганизмам не хватает углеродсодержащих соединений для ассимиля­ ции азота. Так, соотношение С : N сушеной крови жизотных равно 4,2 : 1, поэтому при ее распаде в почве образуется много аммиака. При внесении в почву массы, богатой углеводами и бедной азотом, происходит потребление минерального азота. Например, в соломе зерновых культур соотношение С : N приближается к 100 : 1. П о­ 205

этому вследствие внесения соломы в почву наблюдается «биологи­ ческое закрепление» минерального азота. Скорость и размеры ассимилируемого микробами азота связа­ ны и с типом угдеродсодержашего соединения. Так, глюкоза, легкс используемая микроорганизмами, может вызвать значительно более быстрое закрепление азота, чем целлюлоза или тем более лигнин. В общем можно считать, что органические соединения с соотноше­ нием С : N, близким к 20—25 : 1 и менее, способствуют накопле­ нию минеральных форм азота в почве, а вещества с более широким соотношением этих элементов вызывают иммобилизацию азотных запасов. Экспериментальные данные показывают, что в среднем на каждые 100 г разложенного органического вещества (50 г С) микро­ организмы потребляют 2 г азота (С : N = 25). Следовательно, если содержание азота в органическом веществе разлагающихся расти­ тельных остатков составляет менее 2%, он будет полностью иммобили­ зован клетками микробов, а при большем его количестве (С : N < 25) станет накапливаться аммоний. Зная условия иммобилизации неорганического азота, можно сделать важные агротехнические выводы. Так, удобрять почву, пред­ назначенную под зерновые культуры, растительными остатками, бедными азотом, опытный агроном не станет, так как это ухудшает азотное питание растений. Соломистые удобрения он будет вносить в почву лишь с добавлением соответствующих доз азотных удобрений. В осеннее время года иммобилизация полезна, так как нитра­ ты и аммиак связываются и не теряются в результате выщелачива­ ния зимой. Весной азот, входящий в состав микробной клетки, час­ тично минерализуется и превращается в аммиак и нитраты, которые затем используют растения. Интересно, что бобовые растения, ко­ торые существуют в симбиозе с бактериями, фиксирующими атмос­ ферный азот, не испытывают депрессии от внесения соломистых удобрений. Наоборот, последние увеличивают их урожай и способ­ ствуют лучшему азотонакоплению. 10.4. Денитрификация В почве совершается ряд процессов, в результате которых окислен­ ные формы азота (нитраты, нитриты) восстанавливаются до о кси дое азота или молекулярного азота. Это приводит к существенным поте­ рям из почвы ценных для растений соединений. Восстановление нитратов и нитритов до газообразных азотных соединений происхо­ дит в результате прямой и косвенной денитрификации. Под прямой денитрификацией подразумевают биологическое восстановление ни­ тратов, а под косвенной — химическое их восстановление. 206

Микроорганизмы обладают способностью восстанавливать нитраты в процессах как биосинтеза, так и катаболизма. Восстанов­ ление нитратов, осуществляемое при биосинтезе и приводящее к образованию азотсодержащих клеточных компонентов, носит назва­ ние ассимиляционной нитратредукции. Такой процесс способны вы- I поднять растения и многие микроорганизмы. В процессе диссими- ляционной нитратредукции, или денитрификации, нитраты использу­ ются как окислители органических веществ вместо молекулярного кислорода, что обеспечивает микроорганизмы необходимой энерги­ ей. При этом происходит восстановление нитратов до таких конеч­ ных газообразных продуктов, как NO, N 20 или N 2 (в зависимости от вида микроорганизма и условий среды). Ассимиляционная нитратредукции N H 2OH ------* N H 3 ------ > N органический Гидроксил- Аммиак (R —N H 2) N 0 3 ------> N 0 , амин Нитрат N O ------> N 20 ------> N 2 Окись Закись Молекуляр- азота азота ный азот Диссимиляционная нитратредукция (денитрификация) Денитрификация осуществляется микроорганизмами в ана­ эробных условиях и ингибируется кислородом воздуха. Нитраты в ана­ эробных условиях выполняют роль акцепторов электронов, которые поступают от окисляемых соединений — органических или неоргани­ ческих. В тех случаях, когда донорами электронов служат органиче­ ские соединения, денитрификацию осуществляют хемоорганогетерот­ рофы, а если неорганические — хемолитоавтотрофы. В процессе денит­ рификации участвуют ферменты, содержащие молибден (FeS-белки — нитратредуктаза А и нитритредуктаза), локализованные на клеточ­ ных мембранах. Начальный этап восстановления нитратов при де­ нитрификации катализируется ферментом нитратредуктазой А. С и н ­ тез данного фермента в клетках бактерий в присутствии нитрата идет только в анаэробных условиях. В аэробных условиях нитратре­ дуктаза А не образуется. ; Денитрификацию в системе энергетического метаболизма на­ зывают также анаэробным, или нитратным, дыханием. При нитрат­ ном дыхании хемоорганогетеротрофов органические вещества пол- £ ностью окисляются до С 0 2 и Н 20 , азот нитратов теряется в газооб­ разной форме: С6Н |20 6 + 4 N 0 3 ------> 6 С 0 2 + 6Н 20 + 2 N 2 В , Энергетические возможности ' процесса окисления органи­ ческих субстратов с участием нитратов вполне сопоставимы с энер­ 207

гетическими возможностями процесса аэробного дыхания, т. е. с участием свободного кислорода (см. с. 146). Большинство органи­ ческих субстратов, использующихся в аэробном окислении, может быть потреблено при отсутствии 0 2, если в среде имеются нитраты. Существование денитрификаторов в анаэробных условиях обеспе­ чивают не только нитраты, но и нитриты. Способностью к нитратному дыханию обладает большое чис­ ло родов бактерий. Первый этап процесса — восстановление нитра­ тов в нитриты — идет при участии разнообразных микроорганиз­ мов, как прокариот, так и эукариот (водоросли, грибы и дрожжи) Полное восстановление нитратов до газообразных продуктов (N 0. N 20 , N 2) могут осуществлять только прокариоты. В наибольшей степени способность к полному восстановле­ нию нитратов распространена у представителей родов Pseudomonas (P.fluorescens, P. stutzeri, P. aeruginosa) и Bacillus (В. licheniformis и др.). К хемолитоавтотрофным бактериям-денитрификаторам отно­ сят Thiobacillus denitrificans, Thiomicrospira denitrificans, Paracoccus deni- trificans. Сероокисляющие Thiobacillus denitrificans и Thiomicrospira denitrificans способны размножаться в анаэробных условиях, исполь­ зуя в качестве источника энергии и восстановителя элементарную серу или тиосульфат. Нитрат восстанавливается до газообразного азота: 5S + 6 K N 0 3 + 2Н 20 = 3 N , f + K2S 0 4 + 4 K H S 0 4 5K2S20 , + 8 KN O 3 + H20 ------> 4 N 2f + 9K2S 0 4 + H ,S 0 4 В обмене веществ Paracoccus denitrificans нитраты выступают окислителями водорода (Н 2), восстанавливаясь при этом полностью до N 2. Денитрифицирующие бактерии — факультативно анаэробные организмы, способные восстанавливать нитраты только в анаэроб­ ных условиях. В присутствии свободного кислорода эти бактерии переходят на аэробное дыхание (обладают полной дыхательной сис­ темой), а нитраты потребляют лишь как источник азота (ассимиля­ ционная нитратредукция). Некоторые денитрификаторы способны и к процессу азотфиксации (см. ниже). В результате микробиологической денитрификации в атмос­ феру ежегодно поступает из почв и водоемов 270—330 млн т азота. Особенно существенен этот процесс в переувлажненных почвах, а также в тех случаях, когда минеральные азотные удобрения вносят в форме нитратов совместно с навозом или другими органическими удобрениями. Азот почвы может теряться и в результате различных химиче­ ских реакций (косвенная денитрификация). Так, в кислых почвах при реакции среды ниже pH 5,5 не исключается следующая химиче­ ская реакция с потерей NO: 208

3 H N 0 2 <— » 2N O t + HN O, + H20 Молекулярный азот образуется химическим путем при реак- 1ии между азотистой кислотой и аминокислотами или солями ам- юния, протекающей при такой же кислотности: R— N H 2 + H N O ,------> N2t + R— ОН + H 20 Сонтрольные вопросы и задания . Каково значение свободноживуших и симбиотических азотфиксирующих 1икроорганизмов? 2. На какие этапы можно подразделить процесс минера- [изаиии азота микроорганизмами? 3. Какие микроорганизмы участвуют I разложении хитина? 4 . В чем сущность процесса нитрификации? 5. При­ ведите примеры процессов, при которых азот переходит в соединения, не- досту^ппные для растений. Фиксация молекулярного азота атмосферы микроорганизмами Основная масса азота на Земле находится в газообразном со­ стоянии и составляет свыше 3/ 4 атмосферы (78,09% по объему, или 75,6% по массе). Практически запас азота нашей планеты неисчер­ паем — 3,8* 10 15т N 2. А з о т — довольно инертный элемент, поэтому редко встречается в связанном состоянии. Это один из основных биофильных элементов, необходимый компонент главных полиме­ ров живых клеток — структурных белков, белков-ферментов, АТФ, нуклеиновых кислот. Никакой другой элемент так не лимитирует ресурсы питательных веществ в агросистемах, как азот. Он может стать доступным для живых организмов только в связанной форме, т. е. в результате азотфиксации. Азотфиксация — биологический процесс, и единственными организмами, способными его осуществлять, являются прокариоты (эубактерии и архебактерии). Эти микроорганизмы частью само­ стоятельно, а частью в симбиозе с высшими растениями превраща­ ют молекулярный азот ( N2) в органические соединения и интегри­ руют его (непосредственно или через растение) в белок, который в конце концов попадает в почву. Небиологические процессы фиксации азота (грозовые разря­ ды, воздействие УФ-лучей, работа электрического оборудования и двигателей внутреннего сгорания) в количественном отношении весьма несущественны, так как все вместе дают не более 0,5% свя­ занного азота. Даже вклад заводов азотных удобрений, производя­ щих синтетический аммиак по методу Габера—Боша, составляет 209

лиш ь 5%. Следовательно, свыше 90% всей фиксации молекулярного азота атмосферы осуществляется в результате метаболической ак­ тивности микроорганизмов. Согласно последним оценкам, микроорганизмы на земном шаре ежегодно фиксируют 175—190 млн т молекулярного азота в наземных экосистемах, из которых 99—110 млн т — на почвах сельскохозяйственных угодий. Ежегодное производство минераль­ ных удобрений в мире достигло 60—70 млн т; кроме того, в составе органических удобрений на поля вносится около 15 млн т азота. Если учесть, что коэффициент использования азота мине­ ральных удобрений не превышает 50%, а органических — 15—30%, то сельскохозяйственные растения из этих источников получают только 35—40 млн т азота в год. В то же время ежегодный вынос азота из почвы с сельскохозяйственной продукцией определяется почти в 110 млн т. Таким образом, основная часть азота в урожае сельскохозяйственных культур (от 60 до 90%) имеет микробиологи­ ческое происхождение, т. е. представлена азотом, фиксированным бактериями, и азотом минерализуемого органического вещества почвы, который в основной своей массе также микробного проис­ хождения. Азот, который поступает в растение и включается в состав белков, нуклеиновых кислот и других компонентов клеток в результа­ те связывания микроорганизмами, носит название «биологиче­ ский», а сами микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот атмосферы, — азотфиксаторами, или диазотрофами, т. е. исполь­ зующими как N 2, так и связанные формы азота. По способности вступать во взаимодействие с растениями микроорганизмы, осуществляющие фиксацию молекулярного азота, подразделяют на две группы — несимбиотические и симбиотические. В первой группе выделяют подгруппу свободноживущих азотфикса- торов, непосредственно не связанных с корнями высших растений, и подгруппу ассоциативных фиксаторов азота, обитающих в фитоп­ лане — ризосфере (ризоплане) и филлосфере (филлоплане), т. е. на поверхности подземных и надземных органов растений, и находя­ щихся с ними в синтрофных взаимоотношениях. К группе симбиоти­ ческих азотфиксаторов относят микроорганизмы, развивающиеся в образованных на корнях или листьях клубеньках (или узелках) и находящиеся в симбиотических взаимоотношениях с растениями. 11.1. Азотфиксация свободноживущими микроорганизмами шв- Род Clostridium. Первым из свободноживущих азотфиксаторов был открытый С. Н. Виноградским в 1893 г. Clostridium pasteurianum. Это анаэробная бактерия, вызывающая маслянокислое брожение, име- 210

! ет палочковидные клетки длиной 1,5—8 мкм и шириной 0,8—1,3 мкм. Молодые клетки несут перитрихально расположенные жгутики, в ста­ рых образуются споры. При спорообразовании клетки утолщаются по­ середине или на конце. В присутствии кислорода воздуха С. pasteuri- дпит может развиваться только при наличии в среде аэробных бакте­ рий, поглощающих кислород; организм малочувствителен к реакции среды и встречается как в кислых (pH 4,5—5,5), так и в щелочных (pH 8—9) почвах. Источником азотного питания для бактерий рода Clostridium могут служить соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При отсутствии указанных соедине­ ний бактерии усваивают молекулярный азот. Источником углерода для С. pasteurianum может быть широкий набор углеродсодержащих соединений — моносахариды, дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал) и органические кислоты. Развиваясь на пита­ тельных средах, содержащих углеводы, С. pasteurianum разлагает их с образованием масляной и уксусной кислот, диоксида углерода и водорода. Освобождающаяся при сбраживании углеводов энергия частично идет на усвоение молекулярного азота атмосферы. С. pasteurianum обычно считался слабоактивным фиксатором азота. Пределом его активности было связывание 1—3 мг азота на 1 г сброженного сахара. Однако, используя питательные среды, наи­ более отвечающие физиологическим потребностям С. pasteurianum, его активность удалось повысить до 10—12 мг азота на 1 г сброжен­ ного сахара, в некоторых случаях и более. Способность фиксировать азот атмосферы свойственна и дру­ гим видам рода Clostridium (С. butyricum, С. acetobutylicum, С. pectino­ vorum, С. felsineum и т. д.). ■ Род A zotobacter. Голландский микробиолог М. Бейеринк в 1901 г. открыл аэробную бактерию, также усваивающую молекуляр­ ный азот — Azotobacter chroococcum (сем. Azotobacteriaceae). Молодые клетки азотобактера представляют собой палочки размером 2—3 х 4— 6 мкм. Позже они превращаются в крупные кокки диаметром до 4 мкм. Кокковидные клетки обычно покрыты капсулой и содержат разные включения (жир, крахмал, поли-р-гидроксимасляную кисло­ ту и др.). У кокковидных клеток некоторых видов азотобактера появля­ ется толстая оболочка, и они превращаются в цисты. На одних пи­ тательных средах палочки быстро приобретают кокковидную форму, на других — лишь по истечении длительного времени. Палочковид­ ные клетки азотобактера имеют жгутики и обладают подвижностью (рис. 43). При переходе палочек в кокки жгутики обычно теряются. Из описанных видов азотобактера наиболее изучены: A. chroo- Г соссит, A. beijerinckii, A. vinelandii и A. paspali. Перечисленные виды различают по размерам и форме клетки, а также по некоторым дру- 211

Рис. 43. Клетки бактерий рода Azotobacter: делящ иеся клетки со жгутиками A. agilis(A ) и A. macrocytogenes (Б)~. В — кокковидные, окруженные слизистой капсулой, клетки A. vinelandii (по: Енсен) гим признакам, в частности пигментации колоний. Так, колонии A. chroococcum имеют бурый, почти черный цвет, A. vinelandii выде­ ляют желтый пигмент с зеленой флуоресценцией, A. paspali также продуцируют желтый пигмент. В почвах чаще всего встречается Azo­ tobacter chroococcum. Все виды азотобактера являются аэробами. Источником азота для них могут служить соли аммония, нитриты, нитраты и амино­ кислоты. В отсутствие связанных форм азота азотобактер фиксирует молекулярный азот. Небольшие дозы азотсодержащих соединений не приводят к депрессии фиксации азота, а иногда даже стимули­ руют ее. Увеличение количества связанного азота в среде полностью подавляет усвоение молекулярного азота. Энергия усвоения азота у отдельных культур азотобактера колеблется в широком диапазоне. Активные культуры связывают 15—20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества. Азотобактер способен использовать большой набор органиче­ ских соединений — моно- и дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал), многие спирты, органические кислоты, в том числе ароматические. Вообще азотобактер проявляет высокую по­ требность в органических веществах, поэтому в больших количест­ вах встречается в хорошо удобренных почвах. Для роста бактерии нуждаются в элементах минерального пи­ тания, особенно в фосфоре и кальции. Потребность азотобактера в данных элементах столь значительна, что его используют как био­ логический индикатор на наличие фосфора и кальция в почве. Для энергичной азотфиксации микроорганизмам требуются микроэле­ менты, из них наиболее важен молибден, который входит в состав ферментов, катализующих процесс усвоения азота. 212

. Отмеченные физиологические особенности характеризуют экологию данного организма. Азотобактер обитает в высокоплодо­ родных, достаточно влажных почвах с нейтральной или близкой к ней реакцией среды. При недостаточной влажности большинство клеток отмирает. В черноземных, каштановых и сероземных почвах, благоприятных для рассматриваемого микроорганизма, его обнару­ ж иваю т в значительных количествах только весной. При летнем ис­ сушении почвы остаются единичные клетки. В зоне подзолистых и дерново-подзолистых почв азотобактер можно найти в огородных и пойменных почвах, богатых органическими соединениями, с оп­ тимальным pH 6,8—7,2. (к Другие свободноживущие азотфиксирующие микроорга­ низмы. К семейству Azotobacteriaceae относят и азотфиксирующих бактерий рода Azomonas — A. agilis, A. insignis и A. macrocytogenes. Пер­ вые два вида обитают в водоемах, третий — в почвах. Виды Azomonas близки к азотобактеру, отличаются от него рядом морфологических и физиологических особенностей. Для A. agilis характерны относи­ тельно крупные, овальные клетки с перитрихальным жгутикованием, для A. insignis также крупные, но более округлые клетки, с полярны­ ми или лофотрихальными жгутиками, для A. macrocytogenes — клетки размером 8—10 мкм с одним полярным жгутиком. Образуют коло­ нии с розоватым пигментом, который флуоресцирует в ультрафи­ олетовых лучах. Представители рода Azomonas — аэробы. В отличие от азото­ бактера они могут расти и фиксировать азот при pH 4,6—6,9 и даже 4,3. Источник углерода для этих бактерий — углеводы, спирты, ор­ ганические кислоты. Достаточно эффективно виды Azomonas связы ­ вают азот атмосферы (до 15—18 мг N-, на 1 г использованного саха­ ра). Распространены в тропических почвах. К этому же семейству относятся и бактерии рода Beijerinckia, близкие по свойствам к азотобактеру. От азотобактера они отлича­ ются значительной кислотоустойчивостью, кальцифобностью и не­ которыми другими свойствами. Они могут расти и фиксировать азот даже в среде с pH 3,9. Аэробы. Впервые бактерии рода Beijerinckia выделены из кислых тро­ пических почв (pH 4,5—5,2) Малайзии, Бангладеш и Бирмы. Опи­ сан ряд видов бактерий данного рода — В. indica, В. mobilis, В. flu- minensis, В. derxii. Клетки Beijerinckia могут быть палочковидной, овальной или круглой формы. У одних видов клетки подвижны, у других — непо­ движны. Иногда наблюдается образование капсул. Цисты и эндо­ споры отсутствуют. Большинство культур бактерий рода Beijerinckia формируют на безазотистой среде с глюкозой выпуклые, блестящие, нередко складчатые слизистые колонии вязкой консистенции. При старении 213

колонии окрашиваются в красноватый или темно-коричневый цвет В отличие от азотобактера виды Beijerinckia не усваивают ароматиче ские соединения и хуже ассимилируют органические кислоты. Пр] развитии на среде с углеводами накапливаются кислые продукть (уксусная и другие органические кислоты). Бактерии рода Beijerinckia менее требовательны по сравнении с азотобактером к концентрации фосфорных соединений в среде. Даже небольшие дозы соединений кальция тормозят рост предста­ вителей данного рода. Они значительно менее, чем азотобактер, чувствительны к повышенной концентрации солей железа и алюми­ ния, нуждаются в молибдене, но также довольствуются меньшими его дозами. Эти свободноживущие азотфиксаторы фиксируют 18— 20 мг азота на 1 г использованного сахара. Бактерии рода Beijerinckia ш ироко распространены в кислых почвах субтропической и тропической зон. Реже встречаются в поч­ вах зоны умеренного климата. В окультуренных кислых почвах со­ держится больше клеток Beijerinckia, чем в целинных. Целинные лу­ говые почвы богаче бактериями рода Beijerinckia, чем лесные. К свободноживущим фиксаторам молекулярного азота семей­ ства Azotobacteriaceae относятся также виды рода Derxia, выделенные из почв Индии с pH 6,5. Это медленно растущие на безазотистых средах палочковидные бактерии со слизистыми капсулами, обла­ дающие на определенной стадии развития жгутиками. Колонии мо­ гут быть пленочными или слизистыми, при старении приобретают желтовато-коричневый цвет. Derxia используют различные источни­ ки углерода — моно-, ди-, полисахариды, спирты, органические кислоты, в среде без азота фиксируют 12—15 мг N 2 на 1 г использо­ ванного сахара. Представитель данного рода — Derxia gummosa — развивается в почвах с pH 4,5—6,5, однако лучше растет при pH 5,1—5,5. Виды данного рода распространены в почвах тропической зоны — Индии, Индонезии, тропической Африки, Южной Америки. До половины XX в. считали, что связывать молекулярный азот могут лишь отдельные специализированные виды микроорга­ низмов, относящ иеся в основном к родам Clostridium и Azotobacter. Однако положение существенно изменилось, когда для выявления азотфиксаторов вместо метода Кьельдаля стали использовать изо­ тропный метод (i5N 2), а также ацетиленовый метод (реакция восста­ новления ацетилена в этилен), выявляющий у бактерий нитрогеназу — ферментный комплекс, обеспечивающий фиксацию молекулярного азота. Последний метод более чем в 105 раз чувствительнее метода Кьельдаля и в 103 раз — метода изотопных индикаторов ( l5N 2). В результате применения новых методов было установлено, что функция фиксации молекулярного азота присуща и многим другим микроорганизмам: фототрофным бактериям, цианобактери­ 214

ям, хемолитоавтотрофным бактериям, метилотрофным, сульфатвос- станавливающим, метаногенам и др. Известно уже более ста видов микроорганизмов, обладающих способностью к фиксации азота ат­ мосферы. В воде рисовых полей, в различных водоемах распространены азотфиксирующие анаэробные фототрофные пурпурные серобакте­ рии ( Chromatium, Thiocapsa, Thiocystis и др.), пурпурные несерные бак­ терии (Rhodospirillum, Rhodopseudomonas и др.) и зеленые серобакте­ рии ( Chlorobium, Pelodictyon и др.). Аэробные цианобактерии, обладающие гетероцистами (клетки с толстой клеточной стенкой), способны фиксировать N 2. Среди них преобладают представители родов Nostoc, Anabaena, Calothrix, Cylindrospermum, Tolypothrix, Scytonema и др. В почвах обнаружено более 130 видов гетероцистных форм цианобактерий. Наиболее ш и­ роко распространены в почвах представители рода Nostoc. Усвоение молекулярного азота у цианобактерий происходит в гетероцистах, т. е. в клетках, куда ограничен доступ кислорода. Од­ нако ферментный аппарат, связывающий N 2, обнаружен и в вегета­ тивных клетках. Это дало основание для поиска негетероцистных азотфиксирующих форм. В последнее время они найдены — это представители родов Synechocystis, Synechococcus, Chroococcidiopsis, Oscillatoria, Lyngbya, Microcoleus, которые, не обладая гетероцистами, могут связывать N 2. Цианобактерии распространены во всех почвенно-климатиче­ ских зонах, однако лучше развиваются в почвах с нейтральной реак­ цией среды. Поэтому численность и видовой состав описываемых азотфиксаторов значительно возрастают в нейтральных почвах юж­ ной зоны. Отдельные виды приурочены к определенным местам обитания. Многие цианобактерии живут в симбиозе с другими рас­ тительными организмами, например с грибами, образуя лиш айни­ ки. Адаптируясь к местным условиям, эти бактерии приобрели спо­ собность фиксировать азот при температуре, близкой к 0 °С; иногда азотфиксация происходит даже при —5 °С, оптимальная температу­ ра для процесса 15—20 °С. Некоторые цианобактерии способны фиксировать азот в сим­ биозе с высшими растениями. Так, у водного папоротника Azolla, который растет на поверхности затопленных рисовых полей, в по­ лостях листьев обитает Anabaena azollae. Накопление азота в почве в результате симбиоза Anabaena с Azolla может достигать 300 кг/га в год. Подобного рода симбиоз обнаружен между печеночниками (Blasia pusilla, Anthoceros punctatus, Peltigera sp.) и Nostoc. В нижней части ствола, в специальных железах у мест отхождени? листовых черешков тропического кустарника Gunnera tnacrophylLi обитают симбиотические азотфиксирующие цианобактерии Nostoc puncti- forme. Данный вид имеет гетероцисты и синтезирует нитрогеназу.

Наибольшее значение фототрофные анаэробные бактерии и щ анобактерии имеют главным образом в переувлажненных и затем ленных почвах (болота, рисовники и т. д.), где они могут связыва до 20—50 кг/га азота в год. В затопляемых почвах рисовых полей при разложении раст! тельных остатков образуются газообразные соединения — Н2, СН С 0 2, которые могут служить источниками энергии для некоторь азотфиксирующих бактерий. Например, Corynebacterium autotroph сит окисляет водород и ассимилирует С 0 2, т. е. способна к хемол! тоавтотрофии и одновременно к фиксации азота атмосферы. Способность к азотфиксации имеется и у метилотрофных 6ai терий родов Methylomonas, Methylobacterium и Methylococcus, которь в аэробных условиях могут жить, окисляя только метан или метши вый спирт. Известны анаэробные сульфатвосстанавливающие баки рии-азотфиксаторы, относящ иеся к родам Desulfotomaculum и Desu fovibrio. Такие бактерии широко распространены в водоемах и почва где в анаэробных условиях идет микробное разложение растительных животных остатков. Выделены, описаны и многие другие свободнс живущие азотфиксирующие бактерии. Суммарная деятельность свободноживущих бактерий в npi родных субстратах, в частности в почвах, приводит к накоплени азота. Так, в пахотные почвы зоны умеренного климата за счет свс бодноживущих азотфиксаторов ежегодно поступает от 26 до 86 кг/i азота в год, в почвы тропической зоны — до 100 и более. Считаю что в среднем в пахотных почвах России свободноживущие азот фиксаторы связывают до 20 кг/га азота в год. 11.2. Ассоциативная азотфиксация В 1974—1976 гг. бразильский ученый И. Доберейнер впервые обнару­ жила спиралевидные грамотрицательные аэробные (микроаэро- фильные) бактерии — азоспириллы, развивающиеся в ризосфере и ризоплане тропических травянистых растений, обладающие способ­ ностью к азотфиксации и вступающие в ассоциативные взаимоот­ ношения с растениями. Изучение таких бактерий позволило выде­ лить среди них несколько видов: Azospirillum lipoferum, A. brasilensc, A. amazonense, A. halopraeferans. Рост и развитие ассоциативных бактерий связаны с поступле­ нием к ним от растений легкодоступных источников углерода и энергии в виде корневых выделений (сахаров, органических кислот и других органических веществ), а также корневого отпада и опада. Последующие наблюдения выявили, что бактерии рода Azospirillum встречаются в ризоплане различных растений и в более северной зоне, хотя доминируют в зоне южных почв. В ризосфере небобовых растений достаточно широко распро­ странены и азотфиксирующие бактерии родов Enterobacter, Klebsiel­ 216

la, Escherichia, Erwinia и Citrobacter (семейства Enterobacteriaceae). Бактерии перечисленных родов представляют собой грамотрица- тельные палочки, подвижные (за исключением представителей рода Klebsiella), факультативные анаэробы. Они выносят довольно низкое значение реакции среды и в большом количестве обнаруживаются под лесными насаждениями, произрастающими на подзолистых почвах. В зоне умеренного климата такие бактерии обитают под травянистыми небобовыми растениями. Изучение микробного населения корневой системы овощных культур показало, что азотфиксация в ризоплане данных растений осуществляется главным образом факультативно анаэробными бак­ териями, среди которых доминируют энтеробактерии, главным об­ разом представители рода Klebsiella. Активным азотфиксатором ока­ зался вид Klebsiella planticola. Обнаружены азотфиксирующие виды рода Bacillus: В. polymyxa, В. macerans, В. azotofixans (последний вы­ явлен на корнях злаков в тропиках). В ризосфере на корнях кукурузы, сорго и риса обнаружен но­ вый вибриоидный организм — HerbaspiriHum seropedicae, способный к фиксации азота в условиях ассоциативного симбиоза. На корнях злаковых и других небобовых растений распространены представи­ тели рода Pseudomonas, среди которых имеется ряд азотфиксаторов. Например, ассоциативный азотфиксатор P. paucimobilis часто встре­ чается под рисом. Ассоциативная азотфиксация протекает практически во всех почвах в прикорневом пространстве или на корнях различных небо­ бовых растений. Достаточно высокий уровень азотфиксации обна­ ружен в ризосфере тропических растений — сорго, кукурузы, сахар­ ного тростника, паспалум и др. В почвах зоны умеренного климата азотфиксация выявлена в ризосфере разнообразных небобовых рас­ тений — зерновых, корне- и клубнеплодных, овощных культур, па­ стбищных и дикорастущих злаков, растений влажных и суходольных лугов, лесных трав. При таком практически повсеместном распространении ас­ социативной азотфиксации эффективность ее, определяемая де- : ятельностью диазотрофных бактерий, далеко не одинакова под раз­ ной растительностью. Так, в хорошо окультуренных почвах под ри­ сом азотфиксация достигает особенно высокого уровня и протекает в среднем со скоростью 45—80 кг/га азота в год, а иногда даже до 330 кг/га азота в месяц. В то же время под пшеницей и под кукуру­ зой, культивируемыми на красноземных почвах, фиксируется соот- * ветственно около 20 и 10 кг/га азота в год. Активность ассоциативной азотфиксации определяется коли- I, чеством органических веществ — корневых выделений и корневого спада, поступающих в прикорневую зону небобовых растений. Счи­ тают, что высокая активность азотфиксации в ризосфере тропиче­ 217

ских растений (сахарного тростника, паспалума, маиса и др.) обус­ ловлена их способностью использовать при фотосинтезе путь через дикарбоновые кислоты (С-4 путь). Этим растениям необходимо ин­ тенсивное освещение, максимальная скорость фотосинтеза у них существенно выше, чем у растений, использующих цикл Кальвина (С-3 путь), т. е. овса, пш еницы, ячменя и др. Полагают, что по­ скольку растения С-4 типа расходуют мало углеводов при фотоды­ хании, то большее количество последних может быть использовано для роста корней и увеличения корневой экссудации. Перечислен­ ные особенности положительно сказываются на уровне ассоциатив­ ной азотфиксации. Интересно отметить, что ассоциативные бакте­ рии Azospirillum lipoferum преимущественно развиваются в ризоплане растений с С-4 типом фотосинтеза, a Azospirillum brasilense — в ри­ зоплане растений с С-3 типом фотосинтеза. Уровень азотфиксации, которая протекает в почве без расте­ ний (поля под паром, междурядья и т. п.) и осуществляется благода­ ря деятельности свободноживущих диазотрофов, существенно ниже, чем в почве под растениями. Так, в дерново-подзолистых почвах азотфиксация под посевами злаковых растений составляет около 40 кг/га азота за вегетационный период, под картофелем — 30 кг, на участках, не занятых растениями (пар, междурядья), — только 10— 13 кг/га. Обычно свободноживущие в почве бактерии, связывающие азот, используют как источник углерода и энергии пожнивные рас­ тительные остатки, а ассоциативные диазотрофы — органические вещества, выделяемые растениями в прикорневую зону в виде кор­ невых экссудатов и корневого опада. Количество фиксированного свободноживущими и ассо­ циативными бактериями молекулярного азота в дерново-подзолис­ той почве под сельскохозяйственными культурами может достигать в среднем не менее 30—40 кг/га азота в год. Причем основная часть азота (около 70%) фиксируется в процессе ассоциативной азотфик­ сации, которая поэтому играет большую роль в азотном питании небобовых растений. Ассоциативная азотфиксация может также осуществляться в филлосфере или филлоплане, т. е. на поверхности растений (листь­ ев, стеблей). Здесь обитают так называемые эпифитные бактерии, среди которых широко распространены азотфиксаторы. Доминиру­ ют бактерии семейства Enterobactenaceae, преимущественно рода Er­ winia (Erwinia herbicola). Эти бактерии развиваются и фиксируют азот, используя выделения органических и минеральных соедине­ ний, главным образом углеводов и органических кислот при экзоос­ мосе, а также летучие органические вещества (альдегиды и пр.). Количество азота, фиксированного ассоциативными бакте­ риями в филлосфере растений, зависит как от вида растения, так и от ряда внешних факторов (температуры, влажности, солнечной ра- 218

диашш и др.). Например, в филлосфере березы продуктивность ас­ социативной фиксации составляет около 9 кг/га, а в филлосфере тимофеевки — около 13 кг/га азота за вегетационный период. Считают, что ассоциативная азотфиксация происходит в фи­ топлане всех небобовых растений, хотя ее эффективность различна и определяется главным образом генотипом растений. 11.3. Симбиотическая азотфиксация Характеристика клубеньковых бактерий. Симбиотические азот­ фиксирующие микроорганизмы выделены М. Бейеринком в 1888 г. из корневых клубеньков (бородавчатых наростов) бобовых расте­ ний (рис. 44). Микроорганизмы назвали клубеньковыми бактериями, и было установлено, что они вызывают образование клубеньков, в которых осуществляется фиксация азота атмосферы. Бактерии в клубеньках питаются органическими соединениями, синтезиро­ ван ны м и растением, а растение получает из клубеньков связанные соединения азота. Так, между бактериями и растениями устанавли­ ваются симбиотические взаимоотношения. Клубеньковые бактерии, заражающие корни различных видов бобовых растений, несколько отличаются друг от друга, однако их рассматривают как группы род­ ственных организмов. Клубеньковые бактерии представляют собой грамотрицатель­ ные, от коротких до среднего размера палочки (0,5—0,9 мкм ш и­ риной, 1—3 мкм длиной), подвижные, монотрихи с полярным или субполярным расположением жгутиков или перитрихи, аэробы (рис. 45). Молодые клетки окрашиваются анилиновыми красителя­ ми равномерно, за исключением ряда видов, для которых характер­ но наличие к клетках метахроматических (полифосфатных) гранул. Старые клетки содержат одну или несколько гранул поли-р-гидро- ксимасляной кислоты. Спор не образуют. Рис. 44. Клубеньки на корнях соевых бобов (А) и клевера лугового (Б) (по: ф . Манжино) 219

Рис. 45. Клубеньковые бактерии: клетки в сканирующем (Л) и световом (Б) микроскопе; бактероиды (В) На питательных средах клубеньковые бактерии разных видов бобовых растений растут с неодинаковой скоростью. Например, клубеньковые бактерии клевера, гороха, фасоли и люцерны растут быстро, бактерии сои, люпина, арахиса и вигны — медленно. Это дало основание быстрорастущие формы отнести к роду Rhizobium, медленнорастущие — к роду Bradyrhizobium. На твердых средах клу- 220

>еньковые бактерии обычно образуют бесцветные прозрачные сли- !истые колонии, в ряде случаев колонии имеют шероховатую по- !ерхность. Источником азота для клубеньковых бактерий служат различ­ и е соединения — соли аммония и азотной кислоты, многие ами- ю кислоты , пуриновые и пиримидиновые основания и т. д. Обычно слубеньковые бактерии фиксируют азот в симбиозе с растением. Эднако на специальных питательных средах при отсутствии кисло- )Ода чистые культуры Rhizobium также способны усваивать некото­ рое количество молекулярного азота. Клубеньковые бактерии используют разнообразные углеводы, * том числе и некоторые полисахариды (декстрин, гликоген). При усвоении углеводов в процессе жизнедеятельности некоторых видов )бразуются кислоты. Бактерии потребляют многие органические <ислоты и многоатомные спирты. Фосфор клубеньковые бактерии /сваивают из минеральных и органических соединений; калий, сальций и другие элементы получают из неорганических вешеств. Слубеньковым бактериям нужны также соединения железа, некото- эые микроэлементы (молибден и др.). Лучше развиваются эти бактерии в питательной среде с вита­ минами группы В. Ряд витаминов (тиамин В,2. рибофлавин) и рос­ товые вещества (гетероауксин, гиббереллины, цитокинины и т. д.) микроорганизмы синтезируют сами. Для большинства культур клубеньковых бактерий оптималь- -юе значение pH среды находится в пределах pH 6,5—7,5, а при pH 1,5—5 и pH 8 их рост приостанавливается. Однако встречаются культуры, относительно устойчивые к кислой среде и образующие <лубеньки в почвах с pH 5. Оптимальная температура для большин- :тва культур около 24—26 °С, при температуре ниже 5 °С и выше 37 °С рост прекращается. ■■к Видовая специфичность клубеньковых бактерий. Клубенько­ вые бактерии формируют симбиотические ассоциации с бобовыми м етениями семейства Leguminosae, в котором выделяют три подсе­ мейства — Mimosoideae, Papillonoideae и Caesalpinoideae. До 90% ви- зов первого и второго подсемейств и 23% видов третьего способны вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями. Клубеньковые эактерии характеризуются видовой специфичностью (избирательно­ стью) по отношению к растению-хозяину. Определенный вид бакте­ рий обычно образует клубеньки только на одном или нескольких видах бобовых растений. Так, Rhizobium leguminosarum инфицирует горох, вику, кормовые бобы и чечевицу; Rhizobium phaseoli — фасоль; Bradyrhizobium japonicum — сою; Bradyrhizobium lupini — лю ­ пин; Bradyrhizobium vigna — вигну, маш и арахис и т. д. В 80—90-х гг. XX столетия из клубеньков, образующихся на геблях тропических бобовых растений, выделены новые формы 221

клубеньковых бактерий. Так, из стеблевых клубеньков Sesbania ros- trata — влаголюбивого бобового растения, живущего в Центрально? Африке, изолирована клубеньковая бактерия, названная Azorhizobi- ит caulinodans, а из стеблевых клубеньков тропических бобовых рас­ тений — Aeschynomene indica и Aeschynomene scarba впервые выделе­ ны клубеньковые бактерии, содержащие в клетках бактериохлоро- филл а и обладающие способностью к фотосинтезу. Они былг, названы Photorhizobium thompsonianum. Эти бактерии образуют клу­ беньки не только на стеблях, но и на корнях; однако в стеблевых клубеньках связывание азота обычно идет более активно, чем в кор­ невых. Иногда наблюдается не только видовая, но и сортовая специ­ фичность клубеньковых бактерий. У клубеньковых бактерий клеве­ ра, люцерны, эспарцета и гороха сортовая специфичность выражена слабо, а у бактерий сои, люпина и кормовых бобов она проявляется довольно активно. Иногда видовая специфичность клубеньковых бактерий нарушается, и они дают перекрестное заражение, т. е. за­ ражают разные, не очень близкие виды бобовых растений. В таких случаях бобовое растение слабо фиксирует азот атмосферы. Пока вопрос специфичности клубеньковых бактерий выяснен недостаточно. Однако экспериментальные данные позволяют пред­ ставить процесс взаимного узнавания бактерий и растений. Извест­ но, что клубеньковые бактерии существуют в почве как сапротро- фы, развиваясь за счет органических соединений. Взаимодействие клубеньковых бактерий с корневой системой бобового растения на­ чинается с привлечения (аттракции) клеток бактерий его корневы­ ми выделениями. Подвижные бактерии, способные к хемотаксису, быстрее заражают растения, чем неподвижные. Обычно заражение растения происходит только через моло­ дые корневые волоски. При первом контакте бактерий с корневым волоском определяется, подходят ли партнеры друг к другу. Бобовые растения содержат лектины — белки или гликопротеины, лишенные ферментативной активности, но способные к специфичному связы­ ванию полисахаридов. Лектины достаточно широко распространены в природе и, как считают, выполняют функцию распознавания Синтезируемые бобовым растением лектины находятся на наруж ной поверхности корневых волосков. Наружный слизистый c/ioi клеточной стенки клубеньковых бактерий имеет видоспецифичныс полисахаридные цепи. В результате взаимодействия лектинов кор невого волоска с поверхностными полисахаридами клубеньковь» бактерий определяется, будет ли корневой волосок инфицирова! бактериями или нет. Таким образом, лектины определяют хозяйскую специфич ность, реагируя с капсульными полисахаридами на поверхности клу беньковых бактерий. В качестве примера следует привести данньв 222

о значении лектинов сои для формирования ее симбиоза с Bradyrhi­ zobium japonicum. В опытах лектины сои связывались с клетками 22 из 25 испытанных штаммов клубеньковых бактерий данного вида и не связывались ни с одним из 23 штаммов клубеньковых бактерий другого вида. Значение лектинов для взаимодействия растения с клу­ беньковыми бактериями установлено для многих штаммов — Rhizo­ bium leguminosarum, R. trifolii, Bradyrhizobium japonicum. I * . Взаимодействие бактерий с растением-хозяином. Внедрение Клубеньковых бактерий в корень бобового растения-хозяина может осуществляться д в у м я п у т я м и: через верхушку корневого воло­ ска или около его конца. У некоторых бобовых растений, например арахиса, бактерии проникают через «расщелины» в основаниях бо­ ковых ответвлений корня. При таком инфицировании растение мо­ жет быть заражено большинством видов клубеньковых бактерий, и можно говорить о низкой специфичности данного бобового расте­ ния. Бобовые растения, инфицируемые через корневые волоски, проявляют обычно высокую специфичность в отношении вида клу­ беньковой бактерии-симбионта. Известно, что стенка клетки корневого волоска имеет два слоя — первичный (альфа-слой) и вторичный (бета-слой). Первич­ ный слой состоит в основном из пектиновых веществ, гемицеллю­ лоз и небольшого количества целлюлозных волокон. Целлюлозные волокна альфа-слоя образуют на верхушке корневого волоска разре­ женную сетку. Плотность целлюлозных волокон во втором слое (бе­ та-слое) значительно выше, поэтому он прочнее первичного слоя. Обычно бета-слой не доходит до верхушки молодого корневого во­ лоска. Однако когда рост волоска бывает закончен, его верхушка также покрывается двойным слоем целлюлозы. Следовательно, клу­ беньковым бактериям значительно легче проникать в бобовое рас­ тение через зону роста только еще формирующихся корневых во­ лосков. Первый признак инфицирования растения — своеобразное изменение формы корневых волосков, которые изги­ баются в виде ручки зонтика. Степень искривления волоска зависит от вида бобового растения, активности заражающего штамма, а так­ же места проникновения бактерий. Искривление корневого воло­ ска, по-видимому, объясняется тем, что прикрепившиеся к корне­ вому волоску бактерии останавливают отложение плотного бе­ та-слоя лишь в месте своего прикрепления, а образование этого слоя на противоположной стороне волоска продолжается. В резуль­ тате корневой волосок сильно закручивается и бактерии оказывают­ ся внутри завитка. Обычно в месте проникновения бактерий наблюдается раз­ рыхление клеточной стенки корневого волоска, что, возможно, обус­ ловлено действием гидролитических ферментов бактерий. В корне­ 223

вом волоске клубеньковые бакте­ рии образуют так называемук инфекционную нить. Последи я; представляет собой гифообразнук слизистую массу, в которую по­ гружены размножающиеся клеткр клубеньковых бактерий. Нить пе­ редвигается к основанию волос к; и клеткам эпидермиса. Тако{, путь, равный 100—200 мкм, она проходит за одни-двое суток, т. е. со скоростью 5—8 мкм/ч. Затем нить из корневого волоска про­ никает через клетки коры в па­ ренхиму. После внедрения в расти­ Рис. 46. Схема образования клубенька тельные клетки инфекционная нить покрывается целлюлозной на корне бобового растения: I — инфи­ оболочкой, которая формируется цированный корневой волосок; 2 — ин­ из целлюлозной оболочки клетки, фекционная нить; 3 — делящиеся клетки вероятно, для изоляции клубень­ растения; 4 — эндодерма; 5 — централь­ ковых бактерий. Клубеньковые ный цилиндр корня; 6 — ксилема бактерии могут размножаться (по: Г. Торнтон) только в тетраплоидных клетках коры и частично эпидермиса кор­ ня. Когда на пути инфекционной нити встречаются тетраплоидные клетки, часть бактерий переходит из нити в цитоплазму и начинает там размножаться. После инфицирования клубеньковыми бактерия­ ми растительная клетка, а также соседние незараженные начинают активно делиться. Усиленное размножение инфицированных клеток и находящихся под их стимулирующим влиянием (при участии рос­ тового вещества) соседних незараженных клеток приводит к форми­ рованию ткани клубенька (рис. 46). Обычно инфекция распростра­ няется через тетраплоидные клетки, а кора и проводящие сосуды клубенька образуются из диплоидных клеток. Бактероиды. Клетки клубеньковых бактерий, перешедшие в цитоплазму растительных клеток, растут, делятся, а затем транс­ формируются в своеобразные образования — бактероиды. Этим за­ канчивается процесс инфицирования — приблизительно через три-четыре недели после заражения. Бактероиды в 3—5 раз больше по размерам, чем обычные клетки, причем их форма меняется в за­ висимости от вида бобового растения от шаровидной и грушевид­ ной до вильчатой и ветвистой (рис. 47). Бактероиды не делятся, они составляют до 50% массы клубенька. Клубеньковые бактерии в клетках растения располагаются в ва­ куолях, окруженных перибактероидной мембраной — производным 224

Ьлазм алем мы растительной клет- |к и . Бактероиды содержат больше ?поли-(3-гидроксимасляной кислоты, «гликогена и полифосфатов, чем 1‘обычные клетки клубеньковых бак- 1терий, но меньше ДНК. Фактиче­ с к и бактероиды становятся своего |р о д а азотфиксируюшими органел- ртами клеток бобового растения- хозяина. Поэтому их называют взогосомами. Таким образом, рас­ смотренный симбиоз является вну- риклеточным. Ткань клубенька, заполнен­ ная бактероидами, обычно приоб­ ретает красноватую окраску благо­ д а р я пигменту леггемоглобину, род- Рис. 47. Клетки клубеньковой ткани, Ественному гемоглобину. Обычно наполненные бактероидами клубень­ [такая окраска характерна для клу­ ковых бактерий (по: Ф. Бергерсен) беньков, активно фиксирующих азот. Леггемоглобин выявляют уже ■ на второй день после образования клубенька, а фиксацию азота — [ на четвертый день. Леггемоглобин — один из важнейших продуктов симбиоза; в его образовании участвуют оба партнера — растение и бактерии: просте- [тическая группа (протогем) синтезируется бактериями, а белковый I компонент (апогемоглобин) образуется при участии растения. Легге- I моглобин непосредственно не участвует в фиксации молекулярного К азота, так как бактероиды могут связывать азот и без этого пигмента. I Однако леггемоглобин обладает высоким сродством к кислороду, р ч то облегчает его диффузию через клетку растений к бактероиду. I Благодаря такой особенности леггемоглобина бактероиды получают I кислород в количестве, достаточном для их роста и получения энер- Ё гии. В то же время в клубеньке не возникает слишком высокого пар- f циального давления кислорода, которое могло бы оказывать ингиби- I рующее влияние на фиксацию азота бактероидами. Клубеньки, образованные активными и неактивными клу- I беньковыми бактериями, различают по ряду признаков. Клубеньки, : образовавшиеся при инфицировании н е а к т и в н ы м и клубенько- I выми бактериями, содержат мало леггемоглобина и имеют зеленова- ! тый цвет. Клубеньки, образованные а к т и в н ы м и штаммами, ок­ рашены в розовый цвет. Кроме того, клубеньки неодинаково рас­ пределены по корневой системе растений. Активные расы клубеньковых бактерий образуют многочисленные клубеньки на главном корне, а на боковых их бывает мало. По мере старения и дегенерации клубеньки отмирают. Опре­ деленную роль в этом процессе играет опробковение клеток сосу- 225

диетой системы, задерживающее обмен питательными веществам между растением-хозяином и клубеньком. В клетках клубеньков по­ являются вакуоли, ядро перестает окрашиваться, а бактероиды рас­ творяются (лизируются). Лизис бактероидов по окончании актив­ ной жизни клубеньков обычно совпадает с некрозом клубеньков, наступающим после цветения растения-хозяина. Бактерии, сохра­ нившиеся в неразвившихся инфекционных нитях, выходят в почву, где могут довольно долго (от одного года до 20 лет) существовать в отсутствие растения-хозяина. У однолетних растений клубеньки также однолетние, у мно­ голетних клубеньки могут функционировать в течение ряда лет. К концу сезона бактероидная ткань клубеньков многолетних расте­ ний разрушается, но клубеньки не отмирают и на следующий год вновь начинают функционировать. Количество клубеньков на корнях бобовых растений всегда более или менее ограниченно. Клубеньки содержат больше азота, чем остальные части растения. Это служит доказательством того, что именно в клубеньках протекает процесс усвоения азота. Причем фиксация азота атмосферы осуществляется только в бактероидах, и около 90% связанного азота переходит из них в виде ионов аммония в цитоплазму корня бобового растения. Передача связанного азота из тканей клубенька в наземную часть растения происходит в пери­ од, когда бактероиды жизнеспособны. Определенное количество ус­ военного растениями азота выделяется корнями в почву с продукта­ ми корневых выделений, например с аминокислотами (аспарагино­ вой кислотой). ■■■ Условия формирования азотфиксирующей ассоциации. Э ф ­ фективность азотфиксации симбиотической ассоциации бобовое растение — клубеньковые бактерии определяется наличием у клубень­ ковых бактерий целого к о м п л е к с а с и м б и о т и ч е с к и х п р и з ­ наков: • вирулентности — способности клубеньковых бактерий вхо­ дить в контакт с корневой системой бобовых растений, про­ никать в ткани корня, размножаться в них и индуцировать образование клубеньков; • азотфиксирующей активности — способности связывать м о­ лекулярный азот атмосферы при помощи специальной фер­ ментативной системы и превращать его в ионы аммония; • эффективности — способности увеличивать урожай и содер­ жание белка у бобового растения-хозяина за счет передачи растению фиксированного азота и синтезированных биоло­ гически активных веществ; • конкурентоспособности — способности внесенного в почву определенного штамма клубеньковых бактерий образовы­ вать клубеньки в присутствии других штаммов того же вида; 226

Ц • специфичности — способности вступать в эффективный сим­ биоз со строго определенным набором сортов и видов бобо­ В вых растений. В ’ Перечисленные признаки генетически обусловлены и детер­ минированы в определенных генах. Так, способность к симбиозу ^■'клубеньковых бактерий обычно детерминирована плазмидными генами: /?о?-гены обусловливают узнавание хозяина; nod-гены опре­ деляют способность образовывать клубеньки; я//-гены — способ­ ность к связыванию молекулярного азота. Плазмиды, в которых ло­ кализованы указанные гены, называют 5>то-плазмидами (от англ. symbiosis inducing). У разных видов, а в ряде случаев и штаммов клу­ беньковых бактерий, число и размеры плазмид сильно варьируют. Так, отдельные штаммы бактерий могут иметь до семи плазмид мо­ лекулярной массой от 80 до 4000 МД. ИГ Ф ормирование симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями обеспечивается согласованным взаимодействием гено­ мов растений и бактерий. Процесс возникновения и функциониро­ вания симбиотического сообщества сопровождается изменением экспрессии некоторых растительных и бактериальных генов. Ряд растительных генов, необходимых для возникновения симбиоза и осуществления азотфиксации, определены в генетических экспери­ ментах. Взаимодействие бактерий и растений базируется на существо­ вании специальных генетических структур, связанных общими регу­ лирующими механизмами. У бобового растения гены контролируют способность к формированию симбиотических взаимоотношений и место инфицирования. Например, штамм клубеньковых бактерий коровьего гороха заражает растение через корневые волоски, а штамм люпина — через «расщелины» в эпидермисе коры в местах отхожде- ния боковых корешков. Геном бобового растения оказывает влия­ ние на дифференцировку и морфологию бактероидов, количество клеток бактероидов, которые локализованы в одной вакуоли. Счита­ ют, что между бобовым растением и бактериями возможен прямой обмен генами. Проявлением экспрессии генов служит возникновение в рас­ тении специфичных белков в ответ на инфицирование его клубень­ ковыми бактериями. Идентифицировано уже около 40 растительных белков — нодуяинов, появляющихся лиш ь в клубеньках. Гены ноду- линов обеспечивают бобовым растениям уникальную возможность удовлетворять потребности в азоте за счет его фиксации из воздуха. Можно считать установленным, что эффективность симбиотическо­ го сообщества бобовые растения — клубеньковые бактерии опреде­ ляется в большей степени генотипом растения-хозяина, чем геноти­ пом бактерий-симбионтов. 22 7

Эффективность функциони­ рования симбиотического аппа­ рата также во многом зависит от способности бактерий активно фиксировать молекулярный азот в симбиозе с растением. В почве могут присутствовать штаммы клу­ беньковых бактерий активные, не­ активные и переходные между ни­ ми. Заражение бобовых растений активными штаммами клубенько­ вых бактерий способствует актив­ ной фиксации азота. Неактивный штамм дает образование клубень­ ков, но фиксации азота в них не происходит (рис. 48). Активность клубеньковых бактерий меняется и в зависимости от внешних усло­ вий. Особенно легко бактерии те­ Рис. 48. Растения клевера, зараженные ряют активность при неблагопри­ клубеньковыми бактериями: слева — ятных почвенных условиях. растения, зараженные, активным Исследования показывают, штаммом; справа — растения, заражен­ ные неактивным штаммом что неактивные штаммы клубень­ ковых бактерий в почвах если и не преобладают, то встречаются очень часто. Возможно, уменьшение активности клубеньковых бактерий вызывается комплексом небла­ гоприятных свойств почв: повышенной кислотностью, недостатком органических веществ и т. д. Обычно почвы содержат в достаточно большом количестве клубеньковые бактерии тех видов бобовых растений, которых много в составе дикой флоры данной местности или которые длительное время там культивируются. Если в данной местности не произраста­ ет определенный вид бобовых или родственные ему по инокуляци- онной способности виды, то и свойственные им клубеньковые бак­ терии в почвах отсутствуют. Поэтому для обеспечения эффективного симбиоза семена бобовых перед посевом заражают высокоактивны­ ми штаммами клубеньковых бактерий, специфичных для данного растения. На количество клубеньковых бактерий в почве влияют ее свойства и состояние. Например, в нейтральных почвах (черноземах и др.) бактерии размножаются лучше, чем в кислых, здесь чаще встречаются активные формы. Окультуривание почв, особенно с внесением органических удобрений, улучшает условия для размно­ жения клубеньковых бактерий. 228

11.4. Бактерии-симбионты небобовых растений у многих небобовых растений, как древесных и кустарниковых, так и травянистых, также существуют корневые клубеньки, способные связывать молекулярный азот. Ф иксация азота в таких случаях, как и у бобовых, основана на симбиозе с прокариотами. У древесной и кустарниковой растительности клубеньки чаще всего образуются азотфиксирующими актиномицетами, у травянистой — бактериями. В большинстве случаев симбионтами деревьев и кустарников служат актиномицеты рода Frankia (рис. 49). Это аэробные организмы с септированным мицелием, образующим спорангии. Известны 17 родов древесных и кустарниковых покрытосе­ менных растений, образующих с Frankia клубеньки. Они относятся к порядкам Casuarinales, Coriariales, Fagales, Cucurbitales, Myricales, Rhamnales и Rosales. Среди растений, которые весьма эффективно связывают азот, казуарина ( Casuarina), ольха (.Alnus), облепиха ( Hip- pophae), менее эффективны в этом отношении восковница (Myrica), куропаточья трава (Dryas), лох (Elaeagnus) и шефердия (Shepherdia). Корневые клубеньки древесных растений довольно крупные, обычно они формируются на боковых корнях. Клубеньки бывают двух типов — коралловые (густые сплетения корней, разветвленных наподобие кораллов) и с прорастающими через дольки клубенька корнями (рыхлый пучок утолщенных корней), направленными А БВ Рис. 49. Влияние заражения актиномицетами рода Frankia на рост ольхи: А, В — растения, инфицированные Frankia: Б — незараженное растение (по: С. О. Суэтин) 229

вверх. Первый тип клубеньков наблюдается у ольхи и облепихи, второй — у казуарины. Установлено, что азотфиксирующие актино- мицеты обладают определенной специфичностью к растениям. На­ пример, одна группа Frankia заражает ольху, восковник и «сладкий» папоротник (компония), другая — лох, облепиху и шефердию. Актиномицеты-симбионты способны инфицировать тольк паренхимные клетки коры корня. Как и при заражении бобовы? микроорганизм проникает в корни из почвы через корневые воло ски, которые в результате скручиваются. В месте инфицировани стенки корневого волоска утолщаются и гифы, проникшие внутр клетки, покрываются толстым чехлом. По мере продвижения гж по корневым волоскам чехол утоньшается, и вокруг гиф формирует ся капсула, которая, как считают, образуется как растением, так акгиномицетом. Из корневого волоска гифы проникают в эпидермис и кор корня, вызывая деление и гипертрофию инфицированных клеток Как правило, клубки гиф заполняют центр клеток растения, у кле точных стенок происходит расширение и деление концов гиф в последнем случае формируются специфичные структуры, так на зываемые везикулы (рис. 50). В клубеньках образуется вещество, по добное леггемоглобину бобовых растений. В конце вегетации вези кулы деградируют, но в клетках растений сохраняются гифы, зара Рис. 50. Везикулы, образованные мицелием Frankia в клубеньках ольхи (по: И. Гарднер) 230

жаюшие весной новые ткани. Обычно при симбиозе с небобовыми растениями энергия азотфиксации актиномицетами рода Frankia больше, чем у клубеньковых бактерий бобовых растений. Клубеньки обнаружены у большой группы травянистых расте­ ний — злаковых, осоковых, лютиковых и др. В клубеньках этих рас­ тений выявлены микробные ассоциации, состоящие из двух-трех видов микроорганизмов, которые представлены грамположительны- ми и грамотрицательными бактериями. Установлено, что в клубень­ ках осуществляется азотфиксация, однако роль отдельных бактерий в нем пока не определена. В последнее время из клубеньков на растениях, не относя­ щихся к бобовым, — тропическом кустарнике Trema orientalis (семейство крапивных) и близком к нему Parasponia parviflora — вы­ делены бактерии, близкие к клубеньковым бактериям бобовых. Ука­ занные бактерии способны заражать бобовые растения и образовы­ вать клубеньки. Их относят к роду Rhizobium. Из клубеньков на листьях тропических кустарников Pavetta и Psychotria выделены азотфиксирующие бактерии, отнесенные к роду Klebsiella ( Klebsiella rubacearum). Листовые клубеньки также обогащают растение азотом. Поэтому в Индии, Ш ри-Ланке и других странах листья Pavetta ис­ пользуют как зеленое удобрение. Азотфиксирующие симбионты обогащают почву азотом в сле­ дующей степени: однолетние бобовые (фасоль, соя, вика, бобы, го­ рох, чечевица) накапливают 40—110 кг/га азота в год), многолетние (клевер, лю церна) — 150—220, тропическое бобовое — Sesbania ros- frata — от 324 (сухой сезон) до 458 (влажный сезон), небобовые рас­ тения — 150—300 кг/га азота в год. 11.5. Биохимия азотфиксации Молекула азота характеризуется очень прочной тройной связью, кото­ рая обусловливает инертные свойства газа. Так, азот с трудом вступает в химическую связь с другими элементами и веществами. Используе­ мый в производстве азотных минеральных удобрений метод Г аб ера- Боша, заключающийся в синтезе аммиака из молекулярного азота и водорода на катализаторах, требует высоких температуры и давления. В то же время микробиологическое связывание молекулярного азота осуществляется при обычных температуре и давлении. Фиксация азота атмосферы представляет собой восстанови- ельный процесс, и первым его продуктом, который можно вы­ вить, служит аммиак. Процесс восстановления азота представляет обой ряд ферментативных реакций, осуществляемых ферментным комплексом нитрогеназой. Активный центр нитрогеназы содержит !ва компонента: первый состоит из белка, в состав которого входят юлибден, железо и сера, или M o-Fe-белка, второй — из белка, со­ держащего железо и серу, или Fe-S-белка. Выявлена также ванадий­ 231

содержащая нитрогеназа, однако уровень активности ее на 30% ни­ же, чем у молибденсодержащей нитрогеназы. В природных субстра­ тах при нехватке молибдена последний может замещаться ванадием. Впервые нитрогеназа была обнаружена в клетках анаэробного азотфиксатора Clostridium pasteurianum, затем у аэробных свободножи- вущих бактерий, клубеньковых бактерий и других связывающих азот микроорганизмов. Нитрогеназа и катализуемый ею процесс фиксации азота характеризуются чрезвычайно высокой чувствительностью к мо­ лекулярному кислороду. Последний служит энергичным акцептором водорода и подавляет образование восстановленных продуктов азота. У свободноживущих азотфиксаторов существуют особые меха­ низмы, защищающие нитрогеназу от кислорода. Как уже отмечалось, у клубеньковых бактерий функцию защиты нитрогеназы от высокого парциального давления кислорода выполняет леггемоглобин, обла­ дающий высоким сродством к кислороду. Леггемоглобин цитоплазмы клеток клубенька, в которых локализованы бактероиды, препятствует свободному доступу кислорода, обеспечивая дозированное его пос­ тупление, что необходимо бактероидам для роста и получения энер­ гии, и в то же время не сказывается отрицательно на фиксации азота. Считают, что процесс связывания молекулярного азота начина­ ется с поступления азота, растворенного в воде, в азотфиксирующий центр, где в активации молекулы азота участвуют два атома молиб­ дена (рис. 51). В результате взаимодействия с азотом молибден вос­ станавливается, принимая электроны, которые поступают в активный центр через Fe-S-белок и M o-Fe-бслок. Такой перенос электронов связан с гидролизом АТФ, т. е. идет с затратой энергии. В транспорте электронов к нитрогеназе принимает участие железосодержащий водорастворимый белок-фермент ферредоксин, а в активации водо­ рода воды и переносе протонов — фермент гидрогеназа. \\: Нитрогеназа Брожение Феррелоксин Ф о т о с и н т е з------\" АТФ _ Mg2+ Дыхание Глугамат 4 ------------ У глеводы Глутамин П оли-р-гидрооксибутират Аспарагин Цитруллин Рис. 51. Схема взаимосвязи процессов, лежащих в основе фиксации молекулярного азота (по: В. J1. Кретович) 232

Восстановленный ферредоксин, служащий донором электро­ нов, образуется у свободноживущих азотфиксаторов рода Clostridium при так называемом фосфорокластическом расщеплении пирувата с образованием ацетилфосфата, а у пурпурных зеленых серобактерий и цианобактерий — в процессе фотосинтеза. Главный источник АТФ у аэробных азотфиксаторов — окис­ лительное фосфорилирование, у анаэробных — фосфорокластиче- ская реакция, у фототрофных фиксаторов азота — фотофосфорили- рование. Для клубеньковых бактерий источником энергии для про­ цесса фиксации азота служат продукты фотосинтеза, поступающие из листьев растений. Они трансформируются и запасаются в бакте­ роидах главным образом в виде поли-р-гидроксимасляной кислоты, при использовании которой происходит образование АТФ. Восстановление одной молекулы азота до двух молекул N H 3 требует затраты энергии в виде 12 молекул АТФ: N 2 + 6 Н + + 6е“ + 12А ТФ ----- > 2NH3 + 12АДФ + 12Ф„ Как видно, процесс фиксации молекулярного азота связан с затратами большого количества энергии. Например, Clostridium pasteurianum для связы­ ван ия I мг N , в процессе брожения перерабатывает 500 мг сахара. Источни­ кам и протонов, электронов и АТФ служат процессы брожения (у анаэроб­ ных азотфиксаторов), дыхания (у аэробных азотфиксаторов) и фотосинтеза (у цианобактерий, пурпурных и зеленых серных бактерий). Восстановление молекулярного азота до аммиака осуществ­ ляется в т р и последовательные стадии. Вначале N3 превращается вдиимид ( H N = N H ) , затем в гидразин (H2N — МН2)и, наконец, в N H 3: + 2Н + + 2е~ + 2 Н + + 2е~ + 2 Н + + 2е~ N= N ■»HN = NH ->H2N - N H 2 *2NH Диимид Гидразин 4 АТФ 4 АТФ 4 АТФ 4АДФ + 4ФН 4АДФ + 4ФН 4АДФ + 4ФН Установлено, что нитрогеназа может восстанавливать не толь­ ко молекулярный азот (N = N ), но и ацетилен (Н С = С Н ), азид, за­ кись азота, цианид, нитриты, изонитрилы и протоны. На восстанов­ лении ацетилена основан метод, который используют для выявле­ ния нитрогеназы. Ацетилен восстанавливается только до этилена, который достаточно легко определить методом газовой хроматогра­ фии. Все до настоящего времени изученные азотфиксирующие бак­ терии и симбиотические ассоциации обладают способностью восста­ навливать ацетилен в этилен. Нитрогеназная система при участии АТФ катализует также восстановление протонов, сопряженно обра­ зующихся в процессе азотфиксации, до молекулярного водорода. Аммиак, образовавшийся в процессе фиксации N 2, связыва­ ется кетокислотами, что приводит к синтезу аминокислот. Так, из 233

2-оксоглутарата и аммиака получается глутаминовая кислота. Глу­ таминовая кислота с затратой энергии в виде АТФ превращается в глутамин, а из него синтезируется важнейший метаболит — аспара­ гин. Из щавелевоуксусной кислоты и аммиака образуется аспараги­ новая кислота, из пирувата и N H 3 — а-алан ин и т. д. В дальнейшем аминокислоты идут на синтез белков и других азотсодержащих ор­ ганических соединений. Процесс связывания молекулярного N2 бактериями подвер­ жен регуляции. Так, у многих микроорганизмов синтез нитрогеназы происходит только тогда, когда она нужна, т. е. когда в среде отсут­ ствует источник связанного азота. В присутствии ионов аммония синтез фермента подавляется. В регуляции образования нитрогена­ зы важная роль принадлежит ферменту глутаминсинтетазе. Глута- минсинтетаза и глутаматсинтаза необходимы микроорганизмам, чтобы включать ионы аммония в органические соединения в тех случаях, когда их концентрация N H 4b низка. Благодаря высокому сродству к ионам аммония эти ферменты поддерживают концентра­ цию NH^ в бактериальной клетке на низком уровне. Увеличение концентрации ионов аммония в среде, а следовательно, и внутри клетки бактерии, ингибирует глутаминсинтетазу, а в конечном итоге и синтез нитрогеназы. Бактериальные гены, вовлеченные в процесс азотфиксации, обозначаются индексами nif и fix. Синтез нитрогеназного комплекса у микроорганизмов непосредственно кодируется 17 «//-генами, ко­ торые либо входят в состав хромосомы (Klebsiella, Bradyrhizobium), либо существуют в форме огромной мегаплазмиды (Rhizobium). Ос­ тальные гены, участвующие в азотфиксации (кроме ////-генов), отно­ сят к //х-генам. Гены nif высококонсервативны, поэтому при пе­ реносе в другие виды бактерий продукты указанных генов легко «вписываются» в метаболизм нового хозяина. Следовательно, спо­ собность к связыванию азота может передаваться от одной бактерии к другой при прямом межклеточном контакте. Благодаря существо­ ванию эффективных систем обмена генетической информацией nif- гены достаточно широко распространены в мире микроорганизмов. В 80-х гг. XX столетия разрабатывался генно-инженерный про­ ект, направленный на перенос «//-генов в высшие растения с тем, чтобы обеспечивать фиксацию азота непосредственно в растительных тканях независимо от наличия симбиотических микроорганизмов. В рамках этого проекта была предпринята попытка передать группу ////-генов Klebsiella pneumoniae в клетки низших эукариот — дрожжей. В одном случае все 17 nif-генов были интегрированы в хромосому дрожжей, а в другом — была осуществлена трансформация дрожже­ вых клеток автономной плазмидой со встроенной «//-областью. Однако в обоих типах трансформированных клеток дрожжей — и с хромосомой, и с плазмидной локализацией nif-области — отсут­ 234

ствовала как фиксация азота, так и заметная экспрессия каких бы то ни было трансформированных генов. Осуществление азотфикса­ ции вне клеток азотфиксирующих бактерий сопряжено с большими трудностями, в частности, поскольку для связывания N 2, помимо нитрогеназы необходимы еще специфичные железо- и серосодержа­ щие белки, требуется также защита этого фермента от кислорода. Однако удалось передать «//-гены от Klebsiella pneumoniae к Escheri­ chia coli при конъюгации, при этом наблюдались нормальная экс­ прессия nif- генов и успешная азотфиксация. Успешно проведены и другие эксперименты по переносу плазмидных «//-генов в клетки неазотфиксируюших прокариот. Контрольные вопросы и задания 1. Каково значение фиксации молекулярного азота для растений? 2. Приведите примеры свободноживущих микроорганизмов, усваивающих азот. 3. В чем суть ассоциативной азотфиксации и какие микроорганизмы ее выполняют? 4. Ка­ кие растения вступают в симбиотические отношения с азотфиксирующими бактериями? 5. Перечислите симбиотические признаки клубеньковых бак­ терий. 6. На какие стадии можно разделить процесс восстановления моле­ кулярного азота до аммиака? Г л а в а 12 Микробиологические превращения соединений серы, фосфора, железа В биосфере постоянно происходит круговорот элементов, в ко­ тором основная роль принадлежит микроорганизмам. В предыдущих главах мы познакомились с разнообразными микробиологическими процессами, которые связаны с превращениями углерода, кислоро­ да и азота. Ниже рассматриваются циклические превращения таких важных элементов, как сера, фосфор и железо. 12.1. Биологический цикл соединений серы Сера — необходимый питательный элемент для организмов. В почве она встречается в форме сульфатов — C aS 0 4 *2H20 , N a2S 0 4, K2S 0 4, (N H 4)2S 0 4, сульфидов — FeS2, N a2S, ZnS и органических соедине­ ний. Сера содержится в аминокислотах белков — растений, живот­ ных и микроорганизмов, валовые ее запасы в почвах сравнительно невелики, и растения часто испытывают недостаток в ней. Органические и неорганические формы серы под влиянием де­ ятельности микроорганизмов подвергаются в почве различным пре- 235

Рис. 52. Биологический цикл превращения серы вращениям. Направление трансформаций соединений серы регулиру­ ется в основном факторами внешней среды. Органические соедине ния серы могут быть разрушены и минерализованы. В определенны условиях восстановленные неорганические соединения серы подвер гаются окислению микроорганизмами, а окисленные (сульфаты сульфиты и др.), наоборот, могут быть восстановлены в H2S (рис. 52 Окисление соединений серы. Среди активных окислителе] восстановленных неорганических соединений серы можно выделит следующие группы микроорганизмов: • тионовые бактерии, представленные родами Thiobacillus Thiosphaera, Thiomicrospira, Thiodendron, а также ахребакте рии рода Sulfolobus; • одноклеточные и многоклеточные (нитчатые, образующи трихомы) формы, относящиеся к родам Achromatium, Thio bacterium, Thiospira, Beggiatoa, Thiothrix, Thioploca и др.; • фотосинтезирующие пурпурные и зеленые серные бакте­ рии, а также некоторые цианобактерии; • хемоорганогетеротрофные организмы родов Bacillus, Pseudo­ monas, актиномицеты и грибы ( Penicillium, Aspergillus). Микроорганизмы первой группы обитают в почве. Нитчатые формы встречаются главным образом в грязевых водоемах, воз­ можно их развитие в затопленных почвах, содержащих восстанов- 236

1енные формы серных соединений. Фотосинтезирующие бактерии неимущественно обитают в водной среде (пруды, морские лагуны, )зера и т. д.). Наиболее широко распространены тионовые бактерии рода Thiobacillus, впервые выделенные из морского ила в 1902 г. М. На­ тансоном, а в 1904 г. — М. Бейеринком. Представители данного ро­ да способны окислять тиосульфат, сероводород, сульфиды, тетрати- онаты и тиоцианаты. Наиболее изучены виды: Т. thiooxidans, Т. thio- parus, Т. novellus, Т. denitrificans, Т. ferrooxidans и др. Бактерии рода Thiobacillus представляют собой неспорообра­ зующие грамотрицательные палочки длиной от 1 до 4 мкм, диа­ метром около 0,5 мкм. Большинство видов рода подвижны и пере­ двигаются с помощью полярного жгутика. Источником углерода для синтеза органических соединений бактерии служат С 0 2 и бикарбо­ наты. За исключением Т. novellus и некоторых других видов, относя­ щихся к факультативным хемолитоавтотрофам и хемолитогетеро- трофам, представители рода Thiobacillus облигатные хемолитоавто- трофы, т. е. живут за счет энергии, выделяющейся при окислении неорганических соединений серы. Ход окислительных процессов, вызываемых серными бактериями, может быть представлен следую­ щими уравнениями: H2S + у 2о 2 ------> S + Н20 H2S + 2 0 2 ------> H2S 0 4 2S + 3 0 2 + 2 Н , 0 ------ > 2H 2S 0 4 5N a2S20 3 + 4 0 2 + Н 20 ------ > 5N a2S 0 4 + H2S 0 4 + 4S 2N a2S20 3 + >/20 2 + H20 ------> N a 2S40 6 + 2NaOH Тетратионаты могут подвергаться дальнейшему окислению до серной кислоты: N a2S40 6 + S 0 2 + 6Н + ------> N a2S 0 4 + 3H 2S 0 4 Гипотетическая цепь реакций окисления элементарной серы бактериями рода Thiobacillus может быть представлена в следующем виде: S®-------- > s2o32- -------- > s4o62- Тиосульфат Тетратионат SO|“ <------ s o 32- <- - s3o 62- Сульфат Сульфит Тритионат По имеющимся данным, для окисления бактериями молеку­ лярной серы необходим ее контакт с клетками, причем скорость 237

процесса зависит от площади соприкосновения элемента с бактери­ альными клетками. Последнее позволяет предположить, что на кле­ точной поверхности бактерий действуют ферменты, способствую­ щие поступлению серы внутрь клетки, и под их влиянием сера восстанавливается до сульфидного иона, окисление которого проис­ ходит в дальнейшем внутриклеточно. Sulfolobus sp. и Thiobacillus fer- rooxidans кроме окисления серы обладают также способностью окислять двухвалентное железо Fe2+. Тионовые бактерии — облигатные аэробы, за исключением Т. denitriftcans, который в присутствии нитрата развивается как ан ­ аэроб. В последнее время обнаружены сероокисляющие бактерии, способные к жизнедеятельности при pH 2—3 и температуре 70—75 °С и сохраняющие жизнеспособность при 90 °С. Это термоацидофиль­ ные архебактерии, факультативные хемолитоавтотрофы рода Sulfolo­ bus. Распространены они в термальных серных источниках. Одноклеточные бесцветные серобактерии представлены Achro- matium, Thiobacterium, Macromonas, Thiospira и др. Эти организмы имеют сферическую, овальную, палочковидную или извитую форму, есть подвижные и неподвижные, грамотрицательные. К многокле­ точным бесцветным (нитчатым) серным бактериям относят микро­ организмы родов Beggiatoa, Thioploca, Thiothrix и др. Они окисляют сероводород до элементарной серы, которая временно откладывает­ ся внутри клеток. Установлена способность бактерий указанных ро­ дов окислять серу и использовать органические вещества. Способ­ ность автотрофного усвоения СО, для снабжения клеток углеродом пока не доказана. Окисляют соединения серы также фотолитоавтотрофные пур­ пурные и зеленые серные бактерии. Они обычно обитают в среде, где имеется H 2S. Большой роли в почвах не играют. Серу могут окислять многие хемоорганогетеротрофные мик­ роорганизмы, например некоторые виды родов Bacillus, Pseudomo­ nas, актиномицетов и грибов. Хемоорганогетеротрофные организмы окисляют серу в присутствии органических веществ. Такое пре­ вращение представляется для них побочным процессом в главном направлении метаболизма. Окисление серы хемоорганогетеротроф- ными микроорганизмами идет довольно медленно и слабо. Бактерии, окисляющие неорганические соединения серы, применяют при разработке месторождений полезных ископаемых. Так, проведены исследования, которые позволили начать примене­ ние окисляющих серу бактерий из рода Thiobacillus (Т. ferrooxidans) для выщелачивания бедных сульфидных руд. Наиболее практически освоены методы микробиологического выщелачивания меди из ми­ нералов, в которых медь соединена с серой. Обработке подвергают отвалы бедных руд на поверхности или под землей. Аналогично бак- 238

I терии рода Thiobacillus можно использовать для получения различ­ ных металлов и редких элементов из минералов, содержащих серу. Использование микробов в качестве «металлургов» экономиче­ ски выгодно. Стоимость меди, полученной микробиологическим вы­ щелачиванием, обходится в два с половиной раза дешевле, чем гидрометаллургическим способом. Микробиологический способ раз­ работки полезных ископаемых применяют во многих странах мира. ■ ■ Н Восстановление неорганических соединений серы. Оно осу­ ществляется при разнообразных обменных процессах. Сульфаты мо­ гут быть источником серы как для микро-, так и для макроорганиз­ мов. Усвоение данных соединений сопровождается восстановлением серы в биосинтетических процессах, при так называемой ассимиля­ ционной сульфатредукции. Если растворимые сульфаты закрепляют­ ся в клетках микроорганизмов, процесс обозначают как иммобилиза­ цию серы. В плохо аэрированных, затопляемых почвах, с дефицитом кислорода, а также в водах лиманов, некоторых морей и других во­ доемов в зоне анаэробиоза происходит микробиологическое восста­ новление сульфатов в результате диссимиляционной сульфатредук­ ции, или сульфатного дыхания. Среди бактерий, вызывающих восстановление сульфатов, наи­ более подробно изучены неспорообразующие — род Desulfovibrio и спорообразующие — род Desulfotomaculum. К роду Desulfovibrio относят неспороносные грамотрицательные изогнутые палочки, иногда S-образные или спиральные, имеющие полярные жгутики и отличающиеся большой подвижностью. Это об­ лигатные анаэробы, мезофилы (оптимальная температура 30 °С). Об­ наружены в морской воде или иле, пресной воде и почве. Типичный вид — Desulfovibrio desulfuricans. Известны также D. vulgaris и D. gigas. Среди представителей рода встречаются галофилы. Бактерии рода Desulfotomaculum представлены грамотрица- тельными, прямыми или изогнутыми спорообразующими подвиж­ ными палочками с перитрихальным расположением жгутиков. Это облигатные анаэробы, восстанавливающие сульфаты до сульфидов. Они обнаружены в пресных водах, почвах, геотермальных областях, некоторых испорченных продуктах, в кишечнике насекомых и руб­ це животных. Desulfotomaculum nigrificans может превращать сульфа­ ты в сульфиды при высоких температурах (оптимум 55 °С). К роду Desulfotomaculum относят также D. orientis, представленный изогну­ тыми палочками, D. ruminis и D. acetooxidans, имеющие прямые па­ лочки. Обнаружен ряд новых сульфатредуцирующих бактерий, — в частности, рода Desulfobacter с неспорообразующими палочками, родов Desulfococcus и Desulfosarcina, представленных кокковыми 239

формами, и рода Desulfonema, — имеющих нитевидную форму и пе­ редвигающихся скольжением. Сульфатредуцирующие бактерии — специализированная груп­ па анаэробных микроорганизмов, использующих сульфат как ак­ цептор электронов (водорода) для окисления органических соедине­ ний или водрода. Большинство сульфатредуцирующих бактерий относится к гетеротрофам, но известны и автотрофные виды. Донором электронов (водорода) для сульфатредукторов служат орга­ нические соединения (кислоты, спирты), а также молекулярный во­ дород; продуктом восстановления соединений серы является H,S. Анаэробное окисление органических веществ некоторыми сульфатредуцирующими бактериями ( Desulfotomaculum nigrificans, D. orientis, D. ruminis, D. vulgaris, D. desulfuricans и др.) является не­ полным и ведет к аккумуляции уксусной кислоты и ее солей как ко­ нечного продукта: 2CH3CHOHCOONa + M gS04 ----- > H2S + 2C H 3COONa + СО, + M gC 03 + H:< Лактат натрия Ацетат натрия Другие виды осуществляют полное окисление органически веществ, в том числе и ацетата, до С 0 2. Восстановлению могут подвергаться и другие соединения се ры, например тиосульфаты и молекулярная сера. Восстановлени SO^~ и S2Ojj“ до S®. осуществляют облигатно анаэробные бактерж Clostridium thermosulfurogenes, выделенные из термального источника Это хемоорганогетеротрофы, термофилы, они могут вызывать бро жение с образованием этанола, молочной и уксусной кислот, Н2 осуществляют гидролиз пектина и крахмала. Восстановление ти осульфата С. thermosulfurogenes выполняют с образованием молеку лярной серы, которая откладывается на их клеточных стенках и вы­ деляется в среду. Молекулярную серу могут восстанавливать до H,S многие термоацидофильные облигатно анаэробные архебактерии — Desulfu- rococcus mucosus, Pyrococcus furiosus, Thermoproteus tenax и др. Пере­ численные виды обитают в кислых гидротермальных источниках. Так, для Pyrococcus furiosus оптимальная кислотность среды состав­ ляет 1, температурный оптимум — 100 °С. В анаэробных условиях серу могут восстанавливать архебактерии рода Sulfolobus, которые, как указывалось выше, в аэробных условиях серу окисляют. Значительное количество сероводорода образуется при мине­ рализации белковых соединений. Возбудителями данного процесса служат бактерии родов Pseudomonas, Bacillus, Proteus, Clostridium и др. Считают, что биогенная сера, которая поступает в атмосферу в виде органических летучих соединений, представляет главным образом продукт жизнедеятельности бактерий, минерализующих белковые вещества. 240

Сульфатредуцируюшие бактерии наносят определенный ^ушерб, разрушая материалы, неустойчивые к сероводороду. Указан­ ные организмы разлагают нефтяные продукты, загрязняют серово­ дородом промышленный газ и т. д. Деятельность сульфатредуци- f руюших бактерий — одна из причин коррозии металлического обо­ рудования в анаэробной зоне. Считают, что ущерб от коррозии трубопроводов под землей наполовину может быть отнесен на счет этих микроорганизмов. Сероводород токсичен, поэтому при накоплении его в почве растительность быстро погибает. Если сероводород образуется в во­ доеме, то растения и животные в нем также гибнут. В некоторых озерах, лиманах и даже в открытом море на определенной глубине (в Черном море на глубине 200 м) сероводород накапливается в та­ ком количестве, что полностью подавляет развитие большинства живых существ. В то же время бактерии, восстанавливающие сульфаты, игра­ ют большую роль в геологических процессах. Они образуют H2S, участвующий в образовании серных руд. При окислении серово­ дорода серными бактериями появляются залежи серы промышлен­ ного значения. Сульфатредуцируюшие бактерии участвуют и в обра­ зовании сульфидных руд. 12.2. Превращение соединений фосфора П И В Превращение органических соединений фосфора. По зна­ чению в питании растений фосфор занимает второе место после азота. Он входит в состав почвы, растений и микроорганизмов в ви­ де органических и неорганических соединений. В почву соединения фосфора поступают с растительными и животными остатками, а также с минеральными удобрениями. Фосфор в почве может быть в следующих ф о р м а х : • в составе первичных минералов — в форме фосфатов каль­ ция (апатиты, оксиапатиты, фторапатиты, фосфориты), фосфатов или оксифосфатов железа (вивианит); • в органической форме — от 25 до 85% общего фосфора в разных почвах; органический фосфор составляет от 0,5 до 2% органического вещества почвы; фосфор входит в со­ став фитина и других инозитфосфатов, нуклеиновых кислот |[' и нуклеотидов, лецитина и гумусовых соединений. Сельскохозяйственные растения содержат от 0,05 до 0,5% 1\" фосфора. У растений, как и у животных, данный элемент находится в форме органических соединений (фитин, фосфолипиды, нукле­ иновые кислоты и т. д.). Ф осфор (неорганический ортофосфат) мо­ !, жет также присутствовать в клеточных вакуолях в качестве внутрен­ него буфера. 241

В противоположность азоту и сере, которые в растительны тканях находятся в восстановленной форме ( = N H 2, = S H ) , фосфо входит в органические соединения в окисленной форме — в вид фосфата. В обмен микроорганизмов вовлекаются такие фосфорорганичесю соединения, как фитин, фосфолипиды, нуклеопротеиды. Фитин — кальциймагниевая соль инозитфосфорной кислоты: 0 — РО (О Н ), 1 СН /N (О Н )2О Р — о — С Н С Н — о — Р О (О Н )2 (О Н )2ОР —о —С Н с н —о —РО (О Н )2 сн I о — РО(ОН)2 Инозитфосфорная кислота Фосфолипиды, или фосфатиды, или сложные жиры, представляют собой эфиры глицерина и высокомолекулярных жирных кислот. Напри­ мер, один из спиртовых гидроксилов глицерина образует эфир с фосфор­ ной кислотой, которая, в свою очередь, связана с каким-либо другим со­ единением. Таким соединением может быть холин (тогда фосфолипид но­ сит название лецитин), или коламин (тогда фосфолипид именуют кефали- ном)'. Н2С — О — С — R, О // НС — о — с — R, он' I/ н,с—о —р = о \\ О — С Н 2— С Н 2— N+ = (C H 3)3 ОН- Лецитиноподобное соединение (R ,, К2-жирные кислоты) Нуклеопротеиды состоят из белков и нуклеиновых кислот. В молеку­ лу последних входит ряд пуриновых и пиримидиновых оснований, пентозг (сахар) и фосфат. Большой резерв органического фосфора в почве не может быть ис­ пользован растениями без предварительного превращения его микроорга­ низмами в доступную неорганическую форму. Органические источники фосфора усваиваются микроорганизмами с различной скоростью. Легче всего дефосфорилируются нуклеиновые кисло­ ты, фитин разлагается медленно, лецитин по скорости разложения занимает среднее положение. В качестве примера показано разложение фитина мик­ роорганизмами. Под влиянием фермента фитазы фосфат отщепляется от 242

инозитфосфорной кислоты или ее кальциймагниевой соли — фитина с об­ разованием инозита и фосфорной кислоты: 0 — РО(ОН), >он I 1 СН /\\ ? ' (О Н )2О Р — О — С Н С Н — о — Р О (О Н )2 I I + 6Н ,0 — | (О Н ),О Р— о — СН С Н — о — РО(ОН)2 Ч VС Нй / снч но— сн с н — ОН о — РО(ОН)2 Инозитфосфорная кислота |I + 6 Н 3Р 0 4 НО — СН С Н — ОН фосфорная Ч/ кислота СН I ОН Инозит Органические соединения фосфора разлагаются бактериями родов Pseudomonas, Bacillus (В. megaterium, В. mesentericus), грибами родов Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Trichothecium, некоторыми ак ­ тиномицетами и другими микроорганизмами. Разложение указан­ ных соединений осуществляют также дрожжи ( Rhodotorula, Saccharo­ myces, Candida, Hansenula и др.). Разложение органических веществ при участии микроорга­ низмов сопровождается фиксацией в клетках определенного коли­ чества фосфора в виде тех же органических веществ. Поэтому вне­ сение в почву органических соединений, слишком бедных фосфо­ ром, например соломы, может вызывать биологическое закрепление ■фосфатов и связанное с ним фосфорное голодание растений. 'Щ П ревращ ение неорганических соединений ф о сф о р а. Ряд не­ органических форм фосфора в почве представлен нерастворимыми фосфатами кальция (апатиты, оксиапатиты, фосфориты), которые со­ держатся в основном в нейтральных и щелочных почвах (в кислых преобладают соли железа и алюминия). Такие соединения фосфора входят в состав минералов и недоступны или слабо доступны растени­ ям. Многие микроорганизмы могут переводить нерастворимые соеди­ нения фосфорной кислоты в растворимое состояние, среди них пред­ ставители бактерий, актиномицетов, грибов и других групп микроор­ ганизмов родов Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Penicillium, Aspergillus и т. д. Растворение фосфатов в почве происходит в результате образования диоксида углерода или различных кислот. Появляющийся в результате дыхания или других процессов разрушения органического вещества диоксид углерода в присутст­ вии воды переходит в угольную кислоту, которая более или менее быстро растворяет нерастворимый фосфат: Са3( Р 0 4)2 + 2СО , + 2Н 20 ------> 2 С аН Р 0 4 + С а (Н С 0 3)2 243

Мобилизация нерастворимых соединений фосфора происхо­ дит также благодаря образованию микроорганизмами органически) кислот и кетокислот при неполном окислении углеводов или и> брожении. В некоторых случаях растворению фосфатов способству­ ют азотная кислота, образующаяся при жизнедеятельности нитри­ фицирующих бактерий, серная кислота, появляющаяся в результате деятельности сероокисляющих бактерий. 12.3. Превращение соединений железа Железо в небольших количествах необходимо всем живым существам. В почве оно содержится в органическом и неорганическом виде. Рас­ тительные организмы усваивают неорганические соединения железа, находящиеся в почве в растворимом виде. Существенную, если не ос­ новную, роль в трансформации железа в природе, в частности в пере­ воде нерастворимых его соединений в растворимые и обратно, играют микроорганизмы. Биологический цикл железа показан на рисунке 53. М инерализация органических соединений, содержащих же­ лезо. Органические вещества, содержащие железо, могут быть пред­ ставлены ферментами каталазой и пероксидазой, цитохромами, железопорфириновыми соединениями и др. Минерализацию желе­ зосодержащих органических соединений осуществляют многие хе­ моорганогетеротрофные организмы (бактерии, актиномицеты и гри­ бы). Органическую часть молекулы, содержащей железо, усваивает тот или иной микроорганизм, а железо освобождается и в аэробных условиях, как правило, осаждается в виде гидроксида. Таким обра­ зом, осаждение элемента часто происходит в результате непосредст­ венного воздействия микроорганизмов на органическую часть со­ единения, а не на само железо. Окисление восстановленных соединений ж елеза. Многие микроорганизмы прямо или косвенно участвуют в окислении желе­ за. Их называют железобактериями. Данные организмы окисляют комплексные органические соединения железа, а образующийся в результате гидроксид железа откладывается на Fe2+ поверхности их клеток. Ж елезобактерии пред­ ставлены нитчатыми бактериями, флекси- бактериями, одноклеточными бактериями раз­ Органическое личных родов, микоплазмами, цианобакте­ железо риями. Все железобактерии подразделяют на две большие группы: хемоорганогетеротрофы Fe3+ и хемолитоавтотрофы. К хемоорганогетеро- Рис. 53. Биологический трофным железобактериям относят нитчатые, одноклеточные формы бактерий и мико­ цикл превращения плазмы. 244

Нитчатые железобактерии разнообразны по морфологии, окис­ ляют неорганические соединения железа в болотах, ручьях, железис­ тых источниках, озерах, дренажных трубах и других влажных местах с образованием охристых осадков. Указанные микроорганизмы назы­ вают охрообразователями. К ним относятся грамотрицательные, аэробные бактерии, имеющие слизистые чехлы, в которых накапли­ вается окисное железо. У одних видов железобактерий нити непо­ движны (Leptothrix), флексибактерии обладают способностью к сколь­ жению ( Toxothrix, Spirothrix). Род Leptothrix включает железобактерии, образующие цепочки клеток. Их боковая поверхность выделяет гидроксид железа, из ко­ торого формируется цилиндрический чехол, покрывающий всю це­ почку. По мере утолщения чехла ограничивается доступ к клеткам закисного железа, кислорода и С 0 2. Вследствие этого бактериаль­ ные клетки покидают старые чехлы, выходят наружу и начинают строить новые чехлы. Из пустых чехлов образуются охристые осадки в водоемах. Окисление Fe2+ Leptothrix осуществляет в результате действия перекиси водорода, которая образуется при окислении органиче­ ских соединений и концентрируется в чехлах, поступающее туда же­ лезо при участии фермента каталазы окисляется и откладывается в виде гидроксида. Подобной функцией обладают и некоторые сли­ зистые цианобактерии. Нитчатые бактерии обитают в воде. Их можно культивировать на средах с органическим веществом. По-видимому, они хемоорга­ ногетеротрофы. Одни нитчатые бактерии (Leptothrix ochraceae) сво­ бодно плавают в воде, не прикрепляясь к субстрату, другие при­ крепляются к какому-либо твердому предмету в воде. Размножаются | нитчатые формы поперечным делением с образованием специали­ зированных подвижных клеток. Одноклеточные бактерии могут окислять железо в почвах (или . других средах) с нейтральной реакцией среды при наличии закисно­ го железа и органических веществ. К таким микроорганизмам отно­ сят коринеформную бактерию Arthrobacter siderocapsulatus и стебель­ ковую бактерию со спирально закрученными стебельками, образую­ щую звездчатые комплексы клеток в виде розеток, — Seliberia stellata. К хемоорганогетеротрофным бактериям, аккумулирующим железо в почвах, относят и микоплазмы. Это мелкие бактерии без клеточной стенки, обычно они ассоциированы с прокариотными или эукариотными микроорганизмами и обладают способностью к паразитизму. Микоплазмы полиморфны, они имеют кокковидные клетки, связанные тонкими нитями, на поверхности которых откла­ дываются окислы железа. Указаннная группа микроорганизмов представлена родами Gallionella, Siderococcus, Metallogenium. 245

Типичный представитель рода Gallionella — G. ferrugineae имеет вибриоидные клетки со жгутиками. Клетки расположены г длинном плоском, спирально перекрученном стебельке. Одна стс рона клетки вогнутая, другая — выпуклая. Из последней выделяете наружу коллоидный гидроксид железа, из которого постепенн формируется стебелек. При делении клетки стебелек дихотомически ветвится. Изуче ние стебельков под электронным микроскопом показало, что он способны к самостоятельному росту и на них возникаю т новые кги точные образования. В стебельках обнаружен белок. По-видимом стебельки — живые образования, а не мертвые части железобак терий. До последнего времени было не выяснено: эти бактерии — хемоорганогетеротрофы или хемолитоавтотрофы. У представителей рода Gallionella, однако, выявлена рибулозобифосфаткарбоксилаза, что свидетельствует о способности бактерий использовать энергию, освобождающуюся при окислении Fe2+----- > Fe3+, т. е. их можно от­ нести к хемолитоавтотрофам. К типичным хемолитоавтотрофным железобактериям относят облигатно ацидофильные организмы, способные получать энергию в результате окисления закисного железа и использовать углерод ди­ оксида углерода. Группу таких микроорганизмов представляют: тионовая бак­ терия — Thiobacillus ferrooxidans, грамотрицательная бактерия с доволь­ но сложным циклом развития (псевдококки — вибрионы-спирил­ лы) — Leptospirillum ferrooxidans и архебактерия Sulfolobus acidocal- darius. Все перечисленные микроорганизмы развиваются в кислых средах (оптимум pH 2—3 и ниже). Они обитают в кислых руднич­ ных водах, содержащих сульфиды разных металлов, в том числе пи­ рит (FeS2), а также в пиритизированных торфяниках, железистых источниках. Реакцию окисления двухвалентного железа в трехвалентное при участии Thiobacillus ferrooxidans можно записать так: 4F e2+ + 4 Н + + 0 2 ------> 4F e3+ + 2 Н ,0 Выявлены термофильные штаммы Sulfolobus acidocaldarius, ко торые наряду с соединениями серы окисляют двухвалентное железо Установлена способность к накоплению оксидов железа у не­ которых фототрофов, в частности цианобактерий. Подобную же способность проявляют нитчатые зеленые бактерии и отдельные во­ доросли. Хемолитоавтотрофные и ряд хемоорганогетеротрофных мик­ роорганизмов, под влиянием которых происходит трансформащи железа в природе, принимают участие в образовании железистых от- 246

пожений. Последние обусловливают формирование осадочных ж е­ лезистых руд в болотах, озерах и других водоемах. Многие железобактерии окисляют не только железо, но и м а р г а н е ц . Например, нитчатая бактерия Leptothrix discophorus об­ ладает способностью окислять Мп2+ до Мп4+. Выделен Metallogenium symbioticum, отнесенный к железоокисляющим микоплазмам, осу­ ществляющий окисление марганца в строго аэробных условиях. В присутствии марганца указанный организм приобретает форму «паучка» с нитями, покрытыми окислами марганца и расходящими­ ся из одного центра. П в г Восстановление окисленных соединений железа. В хорошо дренированных почвах и водоемах большая часть железа и марганца встречается в окисленном состоянии. При анаэробиозе наблюдают­ ся восстановительные процессы в основном как результат активнос­ ти хемоорганогетеротрофных бактерий родов Bacillus, Clostridium и др. Окисные соединения железа и марганца восстанавливают мно­ гие гетеротрофные аэробные организмы, резко смещающ ие окисли­ тельно-восстановительный потенциал среды. Контрольные вопросы и задания 1. Какие группы микроорганизмов существуют за счет энергии, выделяю­ щейся при окислении неорганических соединений серы? 2. Кратко охарак­ теризуйте основные направления трансформации соединений серы в почве. 3. В каких формах фосфор может находиться в почве? 4. Какие виды бакте­ рий участвуют в трансформации соединений железа в почве? 5. Приведите примеры химических реакций, осуществляемых микроорганизмами рас­ сматриваемых групп.

Ра здел 2 Сел ьскохозя йстве нь микробиология Глава 13 Микроорганизмы почвы и их сообщества Мир почвенных микроорганизмов весьма разнообразен, одна ко в курсе микробиологии в основном рассматривают бактерии в том числе актиномицеты, микроскопические грибы и близкие к ним организмы. Прочие группы обычно изучают в других курсах. 13.1. Методы определения численности, состава и активности почвенных микроорганизмов яш и Прямые методы определения численности микроорганиз­ мов. При определении состава и активности почвенных микроорга­ низмов прежде всего встает вопрос об общем количественном анали­ зе микроорганизмов почвы. Наиболее объективный метод такого анализа — п р я м о е м и к р о с к о п и р о в а н и е п о ч в ы по С. Н. Ви ­ н о г р а д с к о му. В соответствии с предложенной ученым методикой готовят почвенную суспензию и под микроскопом в определенном ее объеме подсчитывают общее число микроорганизмов. При подго­ товке почвенной суспензии целесообразно использовать один из ре­ комендуемых способов диспергирования почвы и десорбции мик­ роорганизмов из почвенных частиц: растирание почвы, обработка поверхностно-активными веществами, ультразвуком и т. д. Далее пересчетом устанавливают, сколько микроорганизмов приходится на 1 г исследуемой почвы. По Виноградскому, препараты готовят на предметном стекле и просматривают под оптическим микроскопом. В поле зрения можно видеть палочковидные бактерии, мелкие и крупные кокки, обрывки мицелия грибов и актиномицетов и другие микроорганиз­ мы. Определение числа бактериальных клеток прямым микроскопи- рованием облегчается при использовании люминесцентного микро­ скопа и красителей. При этом микроорганизмы лучше видны среди мелких частиц почвы. Красителями могут служить акридиновый оранжевый, изотиоционат и др. 248

При окрашивании акридиновым оранжевым красный тон при­ обретают мертвые клетки, зеленый — живые. Для окраски мицелия и установления его длины при прямом микроскопировании пользуют­ ся диацетатом флуоресцеина. Иногда прямую микроскопию приме­ няют для микробиологического анализа срезов почвы, помещенных в метил метакрилат, фильтратов почвенных суспензий (на фильтрах Зейца), окрашенных метиленовым синим или другими красителями. Б. В. Перфильев и Д. Р. Габе для подсчета микроорганизмов в почве рекомендовали пользоваться сконструированной ими к а ­ п и л л я р н о й к а м е р о й , глубина которой не превышает 30—40 мкм, а ширина — не более диаметра поля зрения микроскопа. Подсчитав число микроорганизмов в капилляре, можно также сделать пересчет на 1 г почвы. Для прямого подсчета микроорганизмов почвы используют э л е к т р о н н ы й м и к р о с к о п , при помощи которого наряду с обыч­ ными видами можно обнаружить множество мельчайших форм микроскопических существ. Для прямого анализа микрофлоры поч­ вы применяют и сканирующ ий электронный микроскоп, дающий объемное изображение анализируемых объектов (рис. 54). Прямые методы дают представление об общей численности микроорганизмов в почве. Однако внешний облик микроорганиз­ мов, как правило, не позволяет судить об их видовой принадлежнос­ ти и функциях. Определить принадлежность микроскопических су­ ществ, обнаруженных в почве, к разным систематическим и физио­ логическим группам можно при помощи разнообразных приемов. ■■■■ Косвенные методы определения численности микроорганиз­ мов. Так, состав отдельных групп1 микроорганизмов (бактерии, ак- тиномицеты, грибы и т. д.) может быть уточнен п о с е в о м п о ч в е н - 1 Здесь и далее понятие «группы микроорганизмов» имеет, как пра­ вило, не таксономический, а скорее, морфо-физиологический и функци­ ональный — экологический смысл. Анализ подобных групп традиционно использовался в почвенной микробиологии, и именно в таком виде резуль­ таты исследований были представлены в большинстве цитированных работ. Поэтому несколько условное понятие «групп» в учебнике сохранено, содер­ жание же термина ясно из текста. Студентам же, наверное, полезно задуматься, сколько раз за послед­ ние десятилетия менялись объем и содержание ключевых терминов в мик­ робиологии. Например, «бактерии» — палочковидные микроорганизмы, па­ лочковидные неспорообразующие микроорганизмы (в отличие от бацилл); преимущественно одноклеточные формы (в отличие от мицеальных — акти­ номицетов); прокариоты (за исключением прокариотических синезеленых водорослей, впоследствии цианобактерий); все прокариоты (включая ци­ анобактерии); наконец, снова лишь группа прокариот (поскольку к другой группе, или домену, теперь относят археи, или архебактерии). (Прим. ред.) 249