คู่มือปฏิบัติการ

ปฏิบตั ิการ 1

Enzyme treated cells การตรวจสอบแอนตเิ จนของหมู่เลอื ดและแอนตบิ อดตี ่อแอนตเิ จนของหมู่เลอื ดระบบต่างๆ ส่วนใหญ่ อาศยั ปฏกิ ริ ยิ าการเกาะกลุ่มของเมด็ เลอื ดแดง (hemagglutination) แต่บางครงัR เมSอื แอนตเิ จนบนผวิ ของเมด็ เลอื ดแดงมปี รมิ าณน้อยเกนิ ไป หรอื มแี อนตบิ อดใี นซรี มั ทSนี ํามาทดสอบในปรมิ าณค่อนขา้ งตSํา อาจทําให้ไม่ สามารถตรวจสอบแอนติเจนหรือแอนติบอดีเหล่านันR โดยวิธีปกติได้ นอกจากนRี ตวั อย่างเลือดทSีต้องการ ตรวจสอบบางครงัR อาจมี direct antiglobulin test ใหผ้ ลบวก หรอื ในตวั อย่างเลอื ดมี warm reactive หรอื cold reactive antibody ซงSึ รบกวนปฏกิ ริ ยิ าระหว่างแอนตเิ จนและแอนตบิ อดที ตSี อ้ งการตรวจหา จงึ ตอ้ งอาศยั วธิ กี าร พิเศษสําหรบั เพิSมระดบั ปฏิกิริยา เพSือให้ง่ายต่อการสงั เกตและการแปลผล หรือแยกแอนติบอดีทSีรบกวน ปฏกิ ริ ยิ าออกก่อน รวมถงึ การตรวจแยกชนิดของแอนตบิ อดใี นซรี มั (antibody identification) ซงSึ อาจจาํ เป็นตอ้ ง อาศยั เทคนิคพิเศษเหล่านRีมาใช้ในการเพิSมหรือลดระดบั ปฏิกิริยา เพSือช่วยยืนยนั ผลการตรวจโดยอาศยั คณุ สมบตั ทิ แSี ตกต่างกนั ไปของแอนตเิ จนและแอนตบิ อดแี ต่ละชนิด การใช้ Proteolytic enzyme Proteolytic enzyme บางชนิด เช่น papain, ficin, trypsin และ bromelin สามารถกําจดั Glycophorin A ทมSี ี N-acetylneuraminic acid (sialic acid) เกาะตดิ อยู่ บนผวิ ของเมด็ เลอื ดแดงออก จงึ ช่วยเร่งปฏกิ ริ ยิ าของ แอนตเิ จนหมู่เลอื ดและแอนตบิ อดี ทําใหเ้ หน็ ปฏกิ ริ ยิ าจบั กลุ่มของเมด็ เลอื ดแดงอย่างชดั เจน ใชต้ รวจสอบหมู่ เลอื ดระบบ Rh, P, Kidd, I และ Sd ไดง้ า่ ยขนRึ แต่มแี อนตเิ จนหม่เู ลอื ดบางระบบทไSี ม่สามารถตรวจสอบไดโ้ ดย วิธีนRีเนSืองจากแอนติเจนถูกทําลายไป ได้แก่ แอนติเจน M, N, S และ Fya เป็นต้น คุณสมบตั ิดงั กล่าวของ เอนไซม์สามารถใช้ช่วยในการตรวจกรอง (antibody screening) และการตรวจแยกชนิด (antibody identification) ของแอนตบิ อดไี ด้ เนSืองจากเอนไซมม์ คี วามคงตวั ตSําและมกี ารเปลยSี นแปลงในการเตรยี มแต่ละครงัR ดงั นนัR การเตรยี ม stock enzyme solution แต่ละครงัR จงึ ตอ้ งมกี ารทดสอบประสทิ ธภิ าพของเอนไซม์ และเวลาทใSี ชใ้ นการทําปฏกิ ริ ยิ าทSี เหมาะสม โดยการอุ่นเมด็ เลอื ดแดงกบั เอนไซมใ์ นเวลาต่างๆ กนั จากนันR นําเซลล์มาทดสอบกบั แอนตบิ อดที Sี ทราบชนิด เชน่ เมอSื นําเซลลท์ มSี แี อนตเิ จน D และ Fya มา treat ดว้ ยเอนไซมแ์ ละทาํ ปฏกิ ริ ยิ ากบั anti-D ควรจะ ใหป้ ฏกิ ริ ยิ าทแSี รงขนRึ หรอื เกดิ ไดเ้ รว็ ขนRึ และ เมอSื ทาํ ปฏกิ ริ ยิ ากบั anti-Fya ควรใหร้ ะดบั ปฏกิ ริ ยิ าลดลง เมอSื เทยี บ กบั เซลลท์ ยSี งั ไมไ่ ด้ treat ดงั ตวั อยา่ งในตารางทSี 1 2

ตารางทีA 1 แสดงผลการหาสภาวะทAีเหมาะสมของเอนไซมด์ ้วยเซลล์ D+/Fy(a+) RBCs Reaction Inert serum Anti-D Anti-Fya Untreated 37oC Neg Neg Neg Enzyme treated AHG Neg 1+ 3+ 37oC Neg 1+ Neg 5 min AHG Neg 2+ 1+ Enzyme treated 37oC Neg 2+ Neg AHG Neg 2+ Neg 10 min 37oC Neg 2+ Neg Enzyme treated AHG w+ 2+ w+ 15 min จากตารางทSี 1 แสดงใหเ้ หน็ วา่ เวลาทเSี หมาะสมคอื 10 นาที เพราะทSี 5 นาที ยงั กําจดั แอนตเิ จน Fya ไม่ หมดและเกดิ ปฏกิ ริ ยิ ากบั anti-D ยงั ไมแ่ รงพอ สว่ นทSี 15 นาทที าํ ใหเ้ กดิ ผลบวกปลอมกบั inert serum ข้อควรระวงั 1. เอนไซม์ทําให้ปฏิกิรยิ าของ cold reactive autoagglution เกิดได้ดขี Rนึ ดงั นันR จงึ ควรหลีกเลSียงการทํา ปฏกิ ริ ยิ าระหวา่ งแอนตบิ อดกี บั enzyme treated cells ทอSี ุณหภมู หิ อ้ งหรอื ตSาํ กวา่ 2. เอนไซมไ์ มค่ งตวั ทSี 4°C ดงั นนัR เมอSื เตรยี มเอนไซมแ์ ต่ละครงัR ควรแยกเกบ็ ในปรมิ าณน้อยๆ และแชแ่ ขง็ ไว้ ก่อนใชง้ าน นํามาละลายและใชภ้ ายใน 12 ชวัS โมง หากเหลอื ให้ทิcงไป ไมน่ ํากลบั มาแชแ่ ขง็ อกี 3

การทดลองทีA 1 การหาเวลาทAีเหมาะสมในการ treat เมด็ เลือดแดงด้วยเอนไซม์ วิธีทาํ 1. นํา 1% papain 1 ส่วนผสมกับ phosphate buffered saline, pH 7.3 จํานวน 9 ส่วน ให้เป็ น 0.1% papain 2. ลา้ งเมด็ เลอื ดแดง 3 ครงัR ดว้ ยนRําเกลอื โดยครงัR สดุ ทา้ ยพยายามดดู นRําเกลอื ออกใหห้ มด 3. นําเมด็ เลอื ดแดงทลSี า้ งแลว้ จํานวน 1 ปรมิ าตรผสมกบั 0.1% papain 2 ปรมิ าตร จํานวน 3 ชุด ผสมให้ เขา้ กนั จากนนัR นําไปอุน่ ทSี 37 °C เป็นเวลา 5, 10 และ 15 นาที โดยเขยา่ หลอดเป็นครงัR คราวใหผ้ สมกนั ดี 4. เมอSื ครบเวลานําเซลลม์ าลา้ งดว้ ยนRําเกลอื 3 ครงัR 5. นําเซลลท์ ไSี ดม้ าเจอื จางดว้ ยนRําเกลอื เป็น 5% papainized red cells 6. นําเซลลท์ ไSี มไ่ ด้ treat ดว้ ยเอนไซมม์ าเจอื จางเป็น 5% cell suspension 7. เตรยี มหลอดทดลอง 3 ชุดๆ ละ 4 หลอด โดยแต่ละหลอดเขยี นว่า untreated, 5 นาท,ี 10 นาที และ 15 นาที 8. เตมิ inert serum ลงไปในหลอดทดลองชดุ ทSี 1 หลอดละ 2 หยด - เตมิ Anti-D ลงไปในหลอดทดลองชดุ ทSี 2 หลอดละ 2 หยด - เตมิ Anti-Fya ลงไปในหลอดทดลองชดุ ทSี 2 หลอดละ 2 หยด 9. เตมิ เมด็ เลอื ดแดงทเSี จอื จางไวใ้ นขอ้ 5 และ 6 ลงในหลอดทSี label ตรงกนั หลอดละ 1 หยด 10.ผสมใหเ้ ขา้ กนั นําไปอุน่ ทSี 37 °C นาน 15 นาที จากนนัR นํามาปันS อา่ นผล 11.นําเซลลท์ งัR หมดมาลา้ ง 3 ครงัR โดยครงัR สดุ ทา้ ยกาํ จดั นRําเกลอื ออกใหห้ มด 12.เตมิ antihuman globulin ลงไปหลอดละ 1 หยด นําไปปันS อา่ นผลทนั ที 13.นําผลทไSี ดม้ าเปรยี บเทยี บกนั ระหวา่ งเวลาต่างๆ ทใSี ชใ้ นการ treat เซลลว์ า่ เวลาใดเหมาะสมทสSี ดุ ตารางบนั ทึกผลการหาสภาวะทAีเหมาะสมของเอนไซมด์ ้วยเซลล์ D+/Fy(a+) Cells Reaction Inert Anti-D Anti-Fya Untreated 37 oC serum Enzyme treated 5 min AHG Enzyme treated 10 min 37 oC Enzyme treated 15 min AHG 37 oC AHG 37 oC AHG 4

Elution techniques เป็นเทคนิคการแยกแอนตบิ อดอี อกจากผวิ ของเมด็ เลอื ดแดง (sensitized red cells) สว่ นใหญ่แอนตบิ อดี ทหSี ลุดออกมาสามารถนํากลบั ไปทาํ ปฏกิ ริ ยิ ากบั แอนตเิ จนได้ เทคนิค elution สามารถแบ่งออกเป็น 2 วธิ ใี หญ่ๆ คอื 1. หลกั การทางกายภาพ (physical elution) เป็นการทําลายพนั ธะระหว่างแอนตเิ จนและแอนตบิ อดี เป็นผลใหแ้ อนตบิ อดหี ลุดจากแอนตเิ จน บนผวิ ของเมด็ เลอื ดแดงโดยการเปลยSี นแปลงทางกายภาพ เช่น ความรอ้ น (Heat elution) ซงSึ สามารถแยกไดท้ งัR IgM และ IgG คลนSื เสยี ง (ultrasound elution) และการแชแ่ ขง็ และละลายอยา่ ง รวดเรว็ (freeze and thaw elution) ซงSึ ใชแ้ ยก IgG ออกจากผวิ เซลลโ์ ดยการทาํ ลายผนงั ของเมด็ เลอื ดแดง eluate ทแSี ยกออกมาไดจ้ ะนํามาทดสอบกบั เมด็ เลอื ดแดงททSี ราบแอนตเิ จนแลว้ เพอSื หา ชนิดและความจาํ เพาะของแอนตบิ อดี การใชห้ ลกั การทางกายภาพมกี ารนํามาใชม้ าก ในการชว่ ย วนิ ิจฉัย ABO hemolytic disease of the newborn (HDN) ในตวั อย่างทSใี ห้ผลบวกกบั วธิ ี direct antiglobulin test 2. หลกั การทางเคมี (chemical elution) เป็ นการใช้สารเคมีทําลายพันธะระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี ได้แก่ ether elution, chloroform, xylene แ ล ะ methylene chloride เ ห ม า ะ สํา ห รับ ก า ร แ ย ก warm reactive autoantibody และ alloantibody ซSงึ ส่วนใหญ่เป็น IgG ส่วน cold-acid elution และ digitonin- acid elution เป็ นการแยกแอนติบอดีออกจากแอนติเจนโดยการลด pH ซSึงใช้ในการแยก แอนตบิ อดชี นิด IgG เชน่ กนั ประโยชน์ของเทคนิค elution ไดแ้ ก่ 1. ใชส้ าํ หรบั ตรวจสอบตวั อยา่ งทใSี หผ้ ลบวกกบั วธิ ี direct antiglobulin test 2. ทาํ ใหแ้ อนตบิ อดบี รสิ ทุ ธแิ’ ละเขม้ ขน้ ขนRึ เพอSื ใชต้ รวจหาแอนตเิ จน 3. ใชย้ นื ยนั การมแี อนตเิ จนทแSี สดงออกออ่ นๆ (weak antigens) โดยการใชแ้ อนตบิ อดที ทSี ราบชนิด แลว้ ทดสอบกบั เมด็ เลอื ดแดง จากนนัR แยกแอนตบิ อดอี อกมา ทาํ การทดสอบกบั เซลลท์ ทSี ราบชนิด ของแอนตเิ จนแลว้ อกี ครงัR หนSึงเพอSื ยนื ยนั ผล 4. ใชเ้ ตรยี มเซลลท์ ไSี มม่ แี อนตบิ อดเี กาะอยเู่ พอSื นําไปทดสอบชนิดของแอนตเิ จนบนเมด็ เลอื ดแดง ต่อไป 5

การทดลองทีA 2.1 Lui Freeze-Thaw elution เมด็ เลอื ดแดงในสภาวะแช่แขง็ จะเกดิ สภาวะเหยSี วเนSืองจากนRําในตวั กลางกลายเป็นนRําแขง็ ทําใหส้ มดุล ของ osmolarity ระหว่างภายในและภายนอกเซลล์เสยี ไป นRําภายในเซลล์ซSงึ ประกอบดว้ ยโปรตนี มากมายจะ แขง็ ตวั ชา้ กวา่ ภายนอกเซลล์ ดงั นนัR จงึ เกดิ การสญู เสยี นRําจากภายในออกสภู่ ายนอกเซลล์ เซลลจ์ ะเหยSี วและผนงั เซลล์ถูกทําลาย ปรากฏการณ์เช่นนRีจะทําใหแ้ อนตบิ อดที จSี บั แอนตเิ จนบนผวิ เซลล์หลุดออกไปดว้ ย เทคนิคนRี เหมาะสาํ หรบั การตรวจพสิ จู น์ภาวะ hemolytic disease of the newborn ทเSี กดิ จากแอนตบิ อดใี นระบบ ABO วิธีการ 1. ลา้ งตวั อย่างเมด็ เลอื ดแดงทใSี หผ้ ลบวกกบั direct antiglobulin test ดว้ ยนRําเกลอื จํานวน “ ครงัR ในหลอด ทดลองขนาด ”•x100 mm จากนนัR เกบ็ supernatant จากการลา้ งครงัR สดุ ทา้ ย (เกบ็ บรเิ วณทใSี กลส้ ว่ นบน ของชนัR เมด็ เลอื ดแดง) ไวเ้ ป็นชดุ ควบคมุ 2. ผสมเมด็ เลอื ดแดง (washed packed red cells) ปรมิ าตร 0.5 ml กบั นRําเกลอื 3 หยด 3. ปิดฝาหลอดทดสอบ หมนุ หลอดทดสอบเพอSื ใหเ้ มด็ เลอื ดแดงเคลอื บบรเิ วณผนงั หลอดทดสอบ 4. วางหลอดทดสอบในตเู้ ยน็ อุณหภมู ิ -200C ในแนวนอน นาน 10 นาที 5. ครบเวลานําหลอดออกจากชอ่ งแชแ่ ขง็ และละลายทนั ทดี ว้ ยนRําอุน่ (Running tap water) 6. นําหลอดทดลองไปปันS ทSี 1,000 x g นาน 2 นาที 7. ดดู เกบ็ สว่ นใส (eluate) ลงในหลอดทดสอบใหมท่ แSี หง้ และสะอาด จากนนัR นําไปตรวจและหาความจาํ เพาะ ของแอนตบิ อดเี ปรยี บเทยี บกบั นRําเกลอื ทใSี ชล้ า้ งเมด็ เลอื ดแดงครงัR สดุ ทา้ ย 6

การทดลองทีA 2.2 Ether elution วิธีการ 1. ลา้ งตวั อยา่ งเมด็ เลอื ดแดงทใSี หผ้ ลบวกกบั direct antiglobulin test ดว้ ยนRําเกลอื จาํ นวน “ ครงัR ในหลอด ทดลองขนาด ”•x100 mm จากนันR เก็บ supernatant จากการล้างครงัR สุดท้าย (เก็บบริเวณทSีใกล้ สว่ นบนของชนัR เมด็ เลอื ดแดง) ไวเ้ ป็นชดุ ควบคมุ 2. ผสมเมด็ เลอื ดแดงอดั แน่นในขอ้ 1 ดว้ ยนRําเกลอื ในอตั ราสว่ น 1:1 ผสมใหเ้ ขา้ กนั 3. ผสม 50% เมด็ เลอื ดแดงทไSี ดจ้ ากขอ้ ˜ กบั diethyl ether ในอตั ราสว่ น 1:1 ใชห้ ลอดทดลอง ฝาเกลยี ว ขนาด 13x100 mm 4. ปิดหลอดทดลองดว้ ยจกุ เกลยี วหรอื จกุ คอรก์ แลว้ เขยา่ หลอดอยา่ งแรงนาน 1-2 นาที (ห้ามใชพ้ าราฟิลม์ เพราะ ether ทาํ ลายพาราฟิลม์ ) 5. ค่อยๆ คลายจุกเกลยี วหรอื เปิดจุกคอรก์ เพSอื ลดความดนั ภายในหลอด แลว้ นําหลอดไปอุ่นทSี 37oC นาน 30 นาที 6. ครบเวลา ปันS ทSี 1,000 x g 10 นาที จะไดส้ ารละลายเรยี งตวั กนั 3 ชนัR - ชนัR บนสดุ เป็น ether - ชนัR กลางเป็นเศษเซลล์ (red cell stroma) - ชนัR ลา่ งสดุ คอื eluate ซงSึ เป็น hemolysate สนี Rําตาลแดง 7. ดดู ชนัR บนสดุ ซงSึ เป็นชนัR ของ ether ทงRิ 8. เปลยSี น transfer pipet เพอSื ดดู เกบ็ eluate ใสใ่ นหลอดทดลองหลอดใหม่ ขนาด 12x75 mm 9. อุ่น eluate ทSี 37oC ประมาณ 15 นาที แล้วเขย่าเป็นครงัR คราวจนกว่ากลนิS ของ ether หายไป (หาก กาํ จดั ether ออกไมห่ มด จะทาํ ใหเ้ มด็ เลอื ดแดงทใSี ชท้ ดสอบในขนัR ตอนต่อไปแตกได)้ 10. ครบเวลาปันS ทSี 1,000 x g นาน 10 นาที 11. ทดสอบ eluate ดว้ ยวธิ ี indirect antiglobulin test กบั screening cell (O1 และ/หรอื O2) หรอื กบั เซลล์ ทมSี แี อนตเิ จนตรงกบั แอนตบิ อดใี น eluate โดยใชน้ Rําเกลอื จากการลา้ งเมด็ เลอื ดแดงครงัR สดุ ทา้ ย (last wash) เป็น eluate control ซงSึ ตอ้ งใหผ้ ลลบจงึ จะสามารถแปลผลการทดสอบนRีได้ 7

การทดลองทีA 2.3 Cold-acid elution วิธีการ 1. ลา้ งตวั อยา่ งเมด็ เลอื ดแดงทใSี หผ้ ลบวกกบั direct antiglobulin test ดว้ ยนRําเกลอื จาํ นวน “ ครงัR ในหลอด ทดลองขนาด ”•x100 mm จากนนัR เกบ็ supernatant จากการลา้ งครงัR สดุ ทา้ ย (เกบ็ บรเิ วณทใSี กลส้ ว่ นบน ของชนัR เมด็ เลอื ดแดง) ไวเ้ ป็นชดุ ควบคมุ 2. ดดู เมด็ เลอื ดแดงอดั แน่นแลว้ ปรมิ าตร 1 ml ใสห่ ลอดทดสอบขนาด 13X100 mm จากนนัR นําไปแชใ่ นอา่ ง นRําแขง็ (ice bath 00C) นาน 5 นาที 3. ครบเวลาเตมิ นRําเกลอื เยน็ (chilled saline) ปรมิ าตร 1 ml ตามดว้ ย Glycine-HCl เยน็ (chilled glycine- HCl) ปรมิ าตร 2 ml 4. ผสมใหเ้ ขา้ กนั และปลอ่ ยใหท้ าํ ปฏกิ ริ ยิ าในนRําแขง็ (ice bath 0oC) นาน 1 นาที 5. นําหลอดทดลองไปปันS ทนั ทที Sี 1,000 x g นาน นาน 3 นาที 6. เกบ็ สว่ นใสขา้ งบนซงSึ เป็น eluate ใสใ่ นหลอดทดลองใหมท่ แSี หง้ และสะอาด เตมิ PBS, pH 8.2 ปรมิ าตร 0.1 ml 7. นําหลอดทดลองไปปันS ทนั ทที Sี 1,000 x g นาน นาน 3 นาที 8. เกบ็ สว่ นใสขา้ งบนซงSึ เป็น eluate ใสใ่ นหลอดทดสอบใหมท่ แSี หง้ และสะอาดและนําไปตรวจหา แอนตบิ อดี และทดสอบความจาํ เพาะ โดยใชน้ Rําเกลอื ทลSี า้ งเมด็ เลอื ดแดงครงัR สดุ ทา้ ยเป็น negative control หมายเหตทุ Aีสาํ คญั 1. Glycine-HCl ทใSี ชต้ อ้ งเกบ็ อยใู่ นทเSี ยน็ ตลอดเวลา เพอSื รกั ษา pH ไวท้ Sี 3.0 2. Phosphate buffer ทเSี ตรยี มและเกบ็ ไวใ้ นตเู้ ยน็ 40C อาจมผี ลกึ เกดิ ขนRึ ได้ ก่อนนําไปใชง้ าน หากพบผลกึ ควรนํามาอุน่ ทอSี ุณหภมู ิ 370C ใหผ้ ลกึ ละลายหมด ขนัR ตอนการเตมิ Phosphate buffer เพอSื ชว่ ยปรบั ความเป็นกรดของ Glycine-HCl ลงใหเ้ ป็นกลาง เพราะในภาวะกรดจะทาํ ใหเ้ มด็ เลอื ดแดงแตกมาก หากพบวา่ วธิ กี ารขา้ งตน้ ทาํ ใหเ้ มด็ เลอื ดแดงแตกมาก ใหเ้ ตมิ 22% BSA ไปใน eluate ทแSี ยกได้ โดยเตมิ ในอตั ราสว่ น 1:4 โดยปรมิ าตร (22% BSA: eluate = 1:4) จะชว่ ยลด การแตกของเมด็ เลอื ดแดงได้ 8

Antibody identification ตวั อยา่ งเลอื ดของผปู้ ่วยทตSี อ้ งการใชเ้ ลอื ด และเลอื ดของผบู้ รจิ าคโลหติ ทกุ ราย จะตอ้ งผา่ นการทดสอบวา่ มี alloantibody ชนิดทเSี ป็น unexpected antibody อย่หู รอื ไม่ ตวั อย่างเลอื ดเหล่านRีตอ้ งนํามาตรวจสอบภายใน เวลา 24 ชวัS โมง และใชว้ ธิ กี ารทสSี ามารถตรวจสอบปฏกิ ริ ยิ าแบบต่างๆ ตามชนิดของแอนตบิ อดี ไดแ้ ก่ ชนิดททSี าํ ให้เม็ดเลือดแดงแตก (hemolysis) ชนิดทSีทําให้เป็นเม็ดเลือดแดงจับกลุ่ม (agglutination) และชนิดทSีเป็น coating antibody การเลอื กทําปฏกิ ริ ยิ าในตวั กลางนRําเกลอื ทSอี ุณหภูมหิ อ้ ง และทSี 37 °C แล้วต่อด้วยการทํา antiglobulin test ถอื เป็นวธิ มี าตรฐานทสSี ามารถตรวจพบแอนตบิ อดแี บบต่างๆ ไดค้ รอบคลุม หากตอ้ งการเพมิS ความไวในการทดสอบ อาจเลอื กใชว้ ธิ กี ารเตมิ albumin การใช้ enzyme treated cells ใช้ Low ionic strength solution (LISS) หรอื ใชว้ ธิ ี Gel test ตามความเหมาะสมของแอนตบิ อดที สSี งสยั ผลทไSี ดจ้ ากการตรวจกรอง จะชว่ ยบง่ ชวRี า่ ควรตรวจแยกชนิดแอนตบิ อดไี ดโ้ ดยวธิ ใี ด อยา่ งไรกต็ าม การ ตรวจกรองทใSี หผ้ ลลบไมไ่ ดห้ มายถงึ การไมม่ แี อนตบิ อดใี นซรี มั ทนี ํามาทดสอบ แต่อาจเป็นเพราะเมด็ เลอื ดแดง ทเSี ลอื กเป็น screening cells นนัR ไมม่ แี อนตเิ จนทจSี าํ เพาะต่อแอนตบิ อดใี นซรี มั นนัR แอนตบิ อดชี นิด IgM จะทาํ ปฏกิ ริ ยิ ากบั เมด็ เลอื ดแดงและเกดิ การจบั กลุ่มของเมด็ เลอื ดแดงไดใ้ นตวั กลาง ทเSี ป็นนRําเกลอื อุณหภูมทิ เSี หมาะสมสาํ หรบั แอนตบิ อดชี นิดนRี คอื อุณหภูมหิ อ้ งหรอื ตSํากว่า หากแอนตบิ อดเี ป็น ชนิดทกSี ระตุน้ คอมพลเี มนทไ์ ดจ้ ะเกดิ ปฏกิ ริ ยิ าการแตกของเมด็ เลอื ดแดงใหเ้ หน็ ได้ ส่วนแอนตบิ อดชี นิด IgG เมSอื ทําปฏกิ ริ ยิ ากบั เมด็ เลอื ดแดงทอSี ุณหภูมิ 37OC จะเกดิ sensitization คอื มี แอนตบิ อดไี ปเกาะอย่บู นเมด็ เลอื ดแดง แต่ไม่ทาํ ใหเ้ มด็ เลอื ดแดงจบั กลุ่มกนั แต่ถา้ เปลยSี นตวั กลางไปเป็น high protein เชน่ การใช้ bovine serum albumin หรอื สาร polymer หรอื macromolecule อนSื ๆ จะมผี ลใหแ้ อนตบิ อดี ของหมเู่ ลอื ดบางระบบ เชน่ หมเู่ ลอื ดระบบ Rh เกดิ การจบั กลุม่ ของเมด็ เลอื ดแดงขนRึ ได้ การใช้ proteolytic enzyme บางชนิด เชน่ papain, ficin, trypsin, bromelin ไปกาํ จดั Glycophorin A ซงSึ มี N-acetylneuraminic acid (Sialic acid) เกาะอยบู่ นผวิ ของเมด็ เลอื ดแดงจะสามารถเรง่ ปฏกิ ริ ยิ าของเมด็ เลอื ด แดงและแอนตบิ อดี ทําใหเ้ หน็ ปฏกิ ริ ยิ าจบั กลุ่มของเมด็ เลอื ดแดงอย่างชดั เจน ใชต้ รวจสอบหม่เู ลอื ดระบบ Rh, P, Kidd, I และ Sd ไดง้ ่ายขนRึ แต่มแี อนตบิ อดบี างระบบทไSี ม่สามารถตรวจสอบไดโ้ ดยวธิ เี อนไซมน์ RีเนSืองจาก แอนตเิ จนถกู ทาํ ลายไป แอนตเิ จนหมเู่ ลอื ดทถSี กู ทาํ ลายโดยเอนไซม์ ไดแ้ ก่ แอนตเิ จน M, N, S และ Fya เป็นตน้ การลด ionic strength ของ antigen-antibody reaction เป็นวธิ หี นSึงททSี าํ ใหป้ ฏกิ ริ ยิ าเรว็ และแรงขนRึ ผลดี คอื ลดเวลาในการทดสอบลง ในขณะเดยี วกนั จะเหน็ การจบั กลุม่ กนั ของเมด็ เลอื ดแดงไดช้ ดั เจนขนRึ การทดลองทAี 3 9

การตรวจแยกชนิดแอนติบอดี (Antibody identification) วิธีทาํ 1. เตรยี มหลอดทดลองจาํ นวน 2 ชดุ ๆ ละ 13 หลอด เขยี นวา่ 1 ถงึ 11 และหลอดทSี 12 และ 13 เขยี นวา่ O1 และ O2 ตามลาํ ดบั 1. หยดตวั อยา่ งซรี มั ลงไปในหลอดทเSี ตรยี มไวท้ กุ หลอดๆ ละ 2 หยดในชดุ ทSี 1 2. หยด panel cells เบอร์ 1 ลงในหลอดทSี 1 จาํ นวน 1 หยด 3. หยด panel cells เบอร์ 2 ลงในหลอดทSี 2 จาํ นวน 1 หยด และเรอSื ยไปจนถงึ หลอดทSี 11 4. หยด screening cell O1 และ O2 ลงในหลอด O1 และ O2 จาํ นวน 1 หยด ตามลาํ ดบั ในชดุ ทSี 2 5. หยด papainized panel cells เบอร์ 1 ลงในหลอดทSี 1 จาํ นวน 1 หยด 6. หยด papainized panel cells เบอร์ 2 ลงในหลอดทSี 2 จาํ นวน 1 หยด และเรอSื ยไปจนถงึ หลอดทSี 11 7. หยด papainized screening cell O1 และ O2 ลงในหลอด O1 และ O2 จาํ นวน 1 หยด ตามลาํ ดบั ผสมใหเ้ ขา้ กนั ดี ทงRิ ไวท้ อSี ุณหภมู หิ อ้ งนาน 5 นาที 8. ปันS อา่ นผล hemolysis และ agglutination บนั ทกึ ผลลงในชอ่ ง RT (room temperature) 9. นําหลอดทงัR 26 หลอด ไปอ่นุ ทAี 37 °C นาน 30 นาที สาํ หรบั ชดุ ทAี 1 และ นาน 15 นาที สาํ หรบั ชดุ ทAี 2 เมอSื ครบเวลานํามาปันS อา่ นผล บนั ทกึ ผลลงในชอ่ ง 37 °C นําหลอดในชดุ ทSี 1 ทงัR 13 หลอด และ หลอดในชดุ ทAี 2 ทีAให้ผลลบมาลา้ งดว้ ยนRําเกลอื 3-4 ครงัR ครงัR สดุ ทา้ ย พยายามกาํ จดั เอานRําเกลอื ออก ใหม้ ากทสSี ดุ แลว้ เตมิ anti-human globulin ลงไป หลอดละ 1 หยด เขยา่ ใหเ้ ขา้ กนั 10. ปันS อา่ นผล และบนั ทกึ ผลลงในชอ่ ง AHG 11. ในหลอดชดุ ทSี 1 หากไมม่ กี ารจบั กลมุ่ กนั ใหต้ รวจซRาํ โดยดจู ากกลอ้ งจลุ ทรรศน์ จากนนัR ใหห้ ยด CCC ลงไป 1 หยด ปันS และอา่ นผลอกี ครงัR หนSึง 12. ในหลอดชดุ ทSี 2 ทอSี า่ นผลเป็นลบใหห้ ยด CCC ลงไป 1 หยด ปันS และอา่ นผลอกี ครงัR หนSึงแปลผลชนิด ของแอนตบิ อดตี ามหลกั การ ruling out หรอื cross out หมายเหต:ุ โดยปกตจิ ะทาํ antibody identification ดว้ ย panel cells ปกตกิ ่อน เมอSื เกดิ ปัญหา หรอื ปฏกิ ริ ยิ าไม่ ชดั เจน หรอื ตอ้ งการตรวจยนื ยนั จงึ จะนําซรี มั นนัR ๆ มาทาํ ปฏกิ ริ ยิ ากบั enzyme treated panels อกี ครงัR โดยไม่ ควรใชเ้ วลาในการทาํ ปฏกิ ริ ยิ านานเกนิ 15 นาที และไมต่ อ้ งอา่ นผลดว้ ยกลอ้ งจลุ ทรรศน์ 10