amicro71259scr

การผลติ เคร่ืองดื่มชาหมกั คอมบูชาโดยเชื้อบริสุทธ์ิ สนธิรัตน์ เจริญรักษ์ วทิ ยาศาสตรมหาบณั ฑติ สาขาวชิ าจุลชีววทิ ยาประยุกต์ บณั ฑติ วทิ ยาลยั มหาวทิ ยาลยั เชียงใหม่ ธันวาคม 2559

การผลติ เคร่ืองดื่มชาหมักคอมบูชาโดยเชื้อบริสุทธ์ิ สนธิรัตน์ เจริญรักษ์ วทิ ยานิพนธ์นีเ้ สนอต่อมหาวทิ ยาลยั เชียงใหม่เพื่อเป็ นส่วนหนึ่งของการศึกษา ตามหลกั สูตรปริญญาวทิ ยาศาสตรมหาบณั ฑิต สาขาวชิ าจุลชีววทิ ยาประยกุ ต์ บณั ฑติ วทิ ยาลยั มหาวิทยาลยั เชียงใหม่ ธันวาคม 2559 ก

rrvd A44vS4^A fi I : P{ a fl tFt 5 0 {l o lJ T I H il n n 0 il uqruq.I [ fl u try o u : dYl fi A@ d a u d du55gru t0T6u:flu AimuriAlv{uf 1u3.'n[F9)l-iunr:v\\a01:€utoU]Joancllil9u,/lqjliludlcf?tu14ui{1oifll:flflL4l.-19lltJ14nnqn: rJ3 ty q r ?m a'r fl r der : :J 14'r uiar fi sr drrreryroqaq 6':im urrl:vuns{ fi€uvR::ilnl:frou fi6r{v fl : 5 tJ fl d.< nu I 1:lril : il:vrrun::runr: .f,3ld..Ll9thJ eAa o101:uvtil:flu]Han (:o{flrda:ror:ud uu duarh I5u) {{rirunran:ror:cl n :. dQrufi u?:d:JdG) ?usu d'.1 ....W:. ....... n::lr.r: . . .....t-f$v..........o'r0r'dfir6nurd'::r (.e{t rirueran:r01/ :tiq:.8rilfin:uQavl-?) (:ossran:r0ritdlq:.aarB^Aduur:aruffi) ....dt'(n/' -J.....?.nr# .... n:::Jnr: {flriraoran:r0r: ti o :. drlilfi u?:d:.ruG) ,l;slx fl:::Jfl']: (: o{flrdfl :'rrr: ri er:.fr ilfi fi u u'::a:LlG) 15 d'u?rnil 2559 o ^0^1Xdamu4ro10 {:Jlil?vlu'lou[TU'i [14u

กติ ตกิ รรมประกาศ วิทยานิพนธ์น้ีสาเร็จสมบูรณ์ได้ด้วยความกรุณาของผูช้ ่วยศาสตราจารย์ ดร.สกุณณี บวร สมบตั ิ และขอบพระคุณ รองศาสตราจารย์ ดร. สิทธิสิน บวรสมบตั ิ อาจารยท์ ่ีปรึกษาวทิ ยานิพนธ์ท่ีให้ ความรู้คาแนะนา ช้ีแนะแนวทาง และความช่วยเหลือในการทาวิทยานิพนธ์คร้ังน้ี ทาให้งานวจิ ยั สาเร็จ ลุล่วงไปไดด้ ว้ ยดี ขอกราบขอบพระคุณ รองศาสตราจารย์ วนั ชยั สนธิไชย ที่กรุณาเป็ นประธานสอบ วทิ ยานิพนธ์ รวมท้งั ผูช้ ่วยศาสตราจารย์ ดร. ยง่ิ มณี ตระกูลพวั ที่กรุณาเป็ นกรรมการสอบวิทยานิพนธ์ และแกไ้ ขขอ้ บกพร่อง พร้อมท้งั ใหค้ าแนะนาอนั เป็นประโยชน์ทาใหว้ ทิ ยานิพนธ์ฉบบั น้ีสมบูรณ์ยงิ่ ข้ึน และอาจารยท์ ุกท่านที่ไดใ้ หค้ วามรู้อนั เป็นประโยชน์แก่ขา้ พเจา้ ขอขอบพระคุณ สานักงานกองทุนสนบั สนุนการวิจยั ภายใตโ้ ครงการพฒั นางานวิจยั และ พฒั นานกั วิจยั เพื่ออุตสาหกรรม (พวอ.) เลขที่โครงการ MSD57I0017 และบริษทั อเมซ่ิง ที จากดั ที่ได้ ให้งบประมาณสนบั สนุนการทาวิทยานิพนธ์ รวมถึงเจา้ หน้าที่ ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวทิ ยาลยั เชียงใหม่ ท่ีกรุณาอานวยความสะดวกตา่ งๆ ตลอดระยะเวลาของการทาวจิ ยั คร้ังน้ี ขอขอบพระคุณเพ่ือน พ่ี และน้องๆ ในห้องปฏิบตั ิการจุลชีววิทยา 2806 ท่ีได้ช่วยเหลือให้ คาแนะนา รวมถึงใหก้ าลงั ใจในการทางานดว้ ยดีตลอดมา และขอกราบขอบพระคุณคุณพ่อและคุณแม่ ท่ีไดใ้ ห้การสนับสนุนและโอกาสในการศึกษาต่อ ตลอดจนผูม้ ีพระคุณทุกท่าน ท่ีให้การสนับสนุน ช่วยเหลือ และคอยเป็นกาลงั ใจใหข้ า้ พเจา้ เสมอมา สนธิรัตน์ เจริญรักษ์ ค

หัวข้อวิทยานิพนธ์ การผลิตเคร่ืองด่ืมชาหมกั คอมบูชาโดยเช้ือบริสุทธ์ิ ผ้เู ขียน นางสาวสนธิรัตน์ เจริญรักษ์ ปริญญา วทิ ยาศาสตรมหาบณั ฑิต )จุลชยววทิ ยาิรวยกุ ต(์ คณะกรรมการทปี่ รึกษา ผชู้ ่วยศาสตราจารย์ ดร. สกณุ ณย บวรสมบตั ิ อาจารยท์ ่ยิรึกษาหลกั รองศาสตราจารย์ ดร. สิทธิสิน บวรสมบตั ิ อาจารยท์ ่ยิรึกษาร่วม บทคดั ย่อ คอมบูชาเิ็ นเคร่ืองด่ืมชาหมกั ผลิตจากชาแลวน้าตาลโดยเช้ือผสมรวหวา่ งแบคทยเรยยกรดอว ซิติกแลวยยสต์ งานวิจยั น้ยมุ่งเน้นใชเ้ ช้ือบริสุทธ์ิเพ่ือผลิตคอมบูชา โดยไดค้ ดั แยกเช้ือบริสุทธ์ิจากหวั เช้ือคอมบูชาแลวน้ าผลไม้ สมุนไพรหมกั จานวน 35 ตัวอย่าง บนอาหาร Histrin Schramm ได้ แบคทยเรยย 425 ไอโซเลท เมื่อนามาทดสอบทางชยวเคมยแลวิรวสิ ทธิภาพการหมัก โดยใช้ Gluconacetobacter hansenii BCC 33378 เิ็ นเช้ือเิรยยบเทยยบ คดั กรองแบคทยเรยยทย่มยการผลิตกรดท่ย สูงกวา่ เช้ือ G. hansenii ได้ 8 ไอโซเลท ไดแ้ ก่ ไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10 แลว K6 โดยให้กรดเท่ากบั 8.41-9.31 g/l สาหรับวธิ ยการเตรยยมหัวเช้ือคอมบูชาจากเช้ือบริสุทธ์ิ พบวา่ ไอโซ เลท N3, S16, G42, G45, L10 แลว K6 เจริญไดด้ ยในชาเขยยวผสม 0.2% เอทานอล ในขณวท่ยไอโซ เลท N4 แลว B19 เจริญไดด้ ยในชาเขยยวทย่มย 0.2% เอทานอล แลว 0.05% แอมโมเนยยมซลั เฟต โดยใช้ รวยวเวลาการหมกั 6 วนั เมื่อนาเช้ือบริสุทธ์ิมาหมกั คอมบูชาพบวา่ มยการเจริญของเช้ือรา ส่งผลให้ รวบบการหมกั หยุดชวงกั เมื่อิรับกรวบวนการหมกั โดยการการเติมเอทานอลความเขม้ ขน้ 1,3 แลว 5% พบวา่ การหมกั ของไอโซเลท N3 ทย่มยการเติมเอทานอล 5% ใหิ้ ริมาณกรดเท่ากบั 23.98 g/l ได้ พฒั นาการใชเ้ ช้ือบริสุทธ์ิหมกั ร่วมกบั หวั เช้ือด้งั เดิม พบวา่ การหมกั โดยใชไ้ อโซเลทบริสุทธ์ิร่วมกบั หัวเช้ือด้งั เดิม ให้ิริมาณกรดสูงสุดทย่ 28.34 g/l เม่ือนาคอมบูชาหมกั แบบผสมของไอโซเลท N4 วิเคราวห์สาริรวกอบอินทรยย์ด้วยเทคนิค HPLC พบว่าิรวกอบด้วย acetic acid 17.18 mg/ml, gluconic acid 18.85 mg/ml, สาร DSL 2.27 mg/ml, succinic acid 0.30mg/ml แลววิตามินซย 0.09 mg/ml ผลจากการตรวจสอบชนิดของ 16S rRNA พบว่า เช้ือจุลินทรยยไ์ อโซเลท N3 แลว N4 เิ็ น แบคทยเรยย Gluconacetobacter xylinus แลว Gluconacetobacter intermedius ง

Thesis Title Production of Kombucha Fermented Tea Using Pure Culture Author Ms. Sonthirat Charoenrak Degree Master of Science (Applied Microbiology) Advisory Committee Asst. Prof. Dr. Sakunnee Bovonsombut Advisor Assoc. Prof. Dr. Sittisin Bovonsombut Co-advisor ABSTRACT Kombucha tea is a fermented tea beverage obtained by the fermentation of sugared tea with symbiotic cultures of acetic acid bacteria and yeasts. In this study, production of Kombucha using pure cultures and mixed culture were studied. Pure cultures were isolated from 35 samples of commercially-produced Kombucha culture and different kinds of fermented fruit juices, using Histrin Schramm as a screening medium. Four hundred and twenty-five bacterial isolates were obtained. The isolates were tested for their biochemical characteristics and fermentation efficiency in comparison with Gluconacetobacter hansenii BCC 33378, a reference strain. Eight isolates: N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10 and K6 were found to produce high levels of acids (approximately 8.41-9.31 g/l) from sugared green tea fermentation. The individual isolates were then used to prepare pure starter cultures for Kombucha. Isolates N3, S16, G42, G45, L10 and K6 had the highest growth rates in sugared green tea supplemented with 0.2% ethanol, while isolates N4 and B19 had the highest growth rates in sugared green tea supplemented with 0.2% ethanol and 0.05% (NH4)2SO4 within six days of fermentation. However, the ethanol concentration in the fermentation media was insufficient to suppress mould growth in up-scale fermentations. The fermentation conditions were therefore adjusted and it was found that in pure culture fermentation, supplementation of sugared green tea with 5% ethanol resulted in highest acid production, with isolate N3 producing the maximum total acid concentration of 23.98 g/l. When adding each of these pure cultures to the commercially-produced Kombucha culture in the mixed culture fermentation, the isolate N4 was found to produce the highest amount of acids, which reached 28.34 g/l. HPLC organic acid profiles revealed that the acids produced by the mixed จ

cultures of N4 and Kombucha starters consisted of 17.18 mg/ml acetic acid, 18.85 mg/ml gluconic acid, 2.27 mg/ml DSL, 0.30 mg/ml succinic acid, and 0.09 mg/ml ascorbic acid. Isolates N3 and N4 were identified as Gluconacetobacter xylinus and N4 was Gluconacetobacter intermedius, respectively, by 16s rRNA sequence analysis. ฉ

สารบญั หน้า กิตติกรรมประกาศ ค บทคดั ยอ่ ภาษาไทย ง ABSTRACT จ สารบญั ช สารบญั ตาราง ญ สารบญั ภาพ ฏ รายการสัญลกั ษณ์และอกั ษรยอ่ ฑ บทที่ 1 บทนา 1 1.1 ประวตั ิความเป็นมา 1.2 วตั ถุประสงค์ 1 2 บทที่ 2 ทบทวนเอกสาร 2.1 คอมบูชา (Kombucha tea) 3 2.2 วตั ถุดิบที่ใชใ้ นการหมกั คอมบูชา 2.3 จุลินทรียท์ ่ีเก่ียวขอ้ งกบั กระบวนการหมกั คอมบูชา 3 2.4 กระบวนการหมกั คอมบูชา 4 2.5 องคป์ ระกอบที่สามารถตรวจวิเคราะห์ไดจ้ ากชาหมกั คอมบูชา 7 2.6 ประโยชน์ของเคร่ืองดื่มคอมบูชาต่อสุขภาพ 9 2.7 ความเป็นพิษของคอมบูชาตอ่ ร่างกาย 11 12 บทที่ 3 อุปกรณ์และวธิ ีการวิจยั 13 3.1 วสั ดุและอุปกรณ์ 3.2 เครื่องมือ 14 3.3 สารเคมี 3.4 อาหารเล้ียงเช้ือ 14 3.5 วตั ถุดิบสาหรับการเตรียมชา 15 16 ช 17 17

สารบญั (ต่อ) หน้า 3.6 เช้ือจุลินทรีย์ 17 3.7 ตวั อยา่ งท่ีใชใ้ นการคดั แยกแบคทีเรียกรดอะซิติก 18 3.8 วธิ ีวจิ ยั 20 บทที่ 4 ผลการวจิ ยั 27 4.1 การตรวจนบั ปริมาณเช้ือจุลินทรียท์ ้งั หมดจากตวั อยา่ ง 27 4.2 การคดั แยกแบคทีเรียกรดอะซิติก 28 4.3 การทดสอบคุณสมบตั ิทางชีวเคมี 28 4.4 การทดสอบประสิทธิภาพการหมกั คอมบูชาเบ้ืองตน้ ของแบคทีเรียแตล่ ะไอโซเลท 30 4.5 การเตรียมหวั เช้ือคอมบูชาโดยเช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิสาหรับการหมกั 31 4.6 การศึกษาการหมกั คอมบูชาโดยเช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิ 35 35 4.6.1 การศึกษาระดบั ความเขม้ ขน้ ของเอทานอลท่ี 0 1 3 และ 5% ตอ่ การหมกั คอม บูชาของเช้ือแต่ละไอโซเลท 57 4.6.2 ศึกษาการหมกั โดยใชห้ วั เช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิและหวั เช้ือจุลินทรียค์ อมบูชา 60 แบบผสม ในอตั ราส่วน 1:1 62 4.7 การวเิ คราะห์ชนิดของสารประกอบอินทรียใ์ นคอมบูชาเม่ือสิ้นสุดกระบวนการ หมกั ดว้ ยเทคนิค High Performance Liquid Chromatography 64 4.8 การบง่ ช้ีชนิดของเช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิท่ีคดั แยกไดด้ ว้ ยวธิ ีการทางดา้ นดีเอน็ เอ บทที่ 5 อภิปรายผลการวจิ ยั บทที่ 6 สรุปผลการวจิ ยั 67 เอกสารอา้ งอิง 69 ภาคผนวก 74 75 ภาคผนวก ก วธิ ีเตรียมอาหารเล้ียงเช้ือ ภาคผนวก ข วธิ ีเตรียมน้ายาทดสอบ ซ

สารบญั (ต่อ) หน้า ภาคผนวก ค วธิ ีหาความเขม้ ขน้ ที่แน่นอนของสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 76 ภาคผนวก ง การคานวณหาปริมาณกรด 78 ภาคผนวก จ การทดสอบฤทธ์ิตา้ นอนุมูลอิสระดว้ ยวธิ ี DPPH และกราฟมาตรฐาน 79 ภาคผนวก ฉ การวิเคราะห์ชนิดของสารประกอบอินทรียใ์ นคอมบูชาดว้ ยเทคนิค 81 HPLC และการเตรียมสารละลายมาตรฐาน 88 ประวตั ิผเู้ ขียน ฌ

สารบัญตาราง หน้า ตาราง 2.1 ความสามารถออกซิไดซ์ของแบคทีเรียกรดอะซิติก 8 ตาราง 3.1 ค่าความเป็ นกรดด่าง ระยะเวลาการหมกั การสร้างเซลลูโลส และแหล่งที่มา 18 29 ของตวั อยา่ งน้าผลไมห้ มกั และหวั เช้ือคอมบูชา 31 ตาราง 4.1 การตรวจนบั ปริมาณเช้ือจุลินทรียท์ ้งั หมด และจานวนแบคทีเรียที่คดั แยกได้ 33 34 จากตวั อยา่ งน้าหมกั ผลไมแ้ ละหวั เช้ือคอมบูชา 38 ตาราง 4.2 ปริมาณแบคทีเรียของแต่ละไอโซเลทท่ีทาการเพาะเล้ียงในน้าชาเขียว 39 ตาราง 4.3 ปริมาณแบคทีเรียของแต่ละไอโซเลทที่ทาการเพาะเล้ียงที่ทาการเพาะเล้ียงใน 41 43 น้าชาเขียวผสม 0.2% เอทานอล 44 ตาราง 4.4 ปริมาณแบคทีเรียของแต่ละไอโซเลทท่ีทาการเพาะเล้ียงที่ทาการเพาะเล้ียงใน 45 น้าชาเขียวผสม 0.2% เอทานอล และ 0.05% แอมโมเนียมซลั เฟต ตาราง 4.5 ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระ (mg gallic/L tea broth) แบบไม่เติมเอทานอล ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.6 ปริมาณแอลกอฮอลร์ ะหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 1% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.7 ค่าความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 1% ดว้ ยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.8 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 1% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.9 ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระ (mg gallic/L tea broth) แบบเติม 1% เอทานอล ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.10 ปริมาณแอลกอฮอล์ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 3%โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ญ

สารบัญตาราง (ต่อ) หน้า ตาราง 4.11 คา่ ความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 3% ดว้ ยแบคทีเรีย 47 G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 48 51 ตาราง 4.12 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 3% ดว้ ยแบคทีเรีย 52 G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 53 55 ตาราง 4.13 ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระ (mg gallic/L tea broth) แบบเติม 3% เอทานอล 57 ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 61 ตาราง 4.14 ปริมาณแอลกอฮอล์ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 5% ดว้ ยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.15 คา่ ความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 5% ดว้ ยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.16 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 5% ดว้ ยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.17 ปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระ (mg gallic/L tea broth) แบบเติม 5% เอทานอล ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ตาราง 4.18 ปริมาณกรดอินทรียท์ ี่ตรวจวเิ คราะห์ดว้ ยวธิ ี HPLC ฎ

สารบัญภาพ หน้า ภาพ 2.1 โครงสร้างของน้าตาลซูโครส 6 ภาพ 4.1 ตวั อยา่ งน้าผลไมแ้ ละสมุนไพรหมกั ที่พบการเจริญของเช้ือจุลินทรีย์ 27 ภาพ 4.2 ตวั อยา่ งที่มีการสร้างเซลลูโลสบริเวณผวิ หนา้ อาหารเหลว HS ของบางไอโซเลท 28 ภาพ 4.3 การทดสอบ Overoxidation บนอาหาร carr medium ของไอโซเลท B44 29 ภาพ 4.4 ไอโซเลทท่ีสามารถสร้างเซลลูโลสบริเวณผวิ หนา้ อาหารเหลว HS 30 ภาพ 4.5 ปริมาณแบคทีเรียของแต่ละไอโซเลทที่ทาการเพาะเล้ียงที่ทาการเพาะเล้ียงในน้า 33 ชาเขียวผสม 0.2% เอทานอล 34 ภาพ 4.6 ปริมาณแบคทีเรียของแตล่ ะไอโซเลทที่ทาการเพาะเล้ียงที่ทาการเพาะเล้ียงในน้า 36 ชาเขียวผสม 0.2% เอทานอลและ 0.05% แอมโมเนียมซลั เฟต ภาพ 4.7 ค่าความเป็ นกรดด่างระหว่างการหมกั แบบไม่เติมเอทานอลด้วย G. hansenii, 37 แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 37 ภาพ 4.8 ปริมาณกรดอะซิติกระหว่างการหมกั แบบไม่เติมเอทานอลด้วย G. hansenii, 40 แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ภาพ 4.9 ปริมาณแบคทีเรียระหว่างการหมักแบบไม่เติมเอทานอลด้วย G. hansenii, 42 แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 44 ภาพ 4.10 ค่าความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 1% ดว้ ยแบคทีเรีย 46 G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ภาพ 4.11 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 1% โดยแบคทีเรีย 48 G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ภาพ 4.12 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 1% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ภาพ 4.13 ค่าความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 3% โดยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ภาพ 4.14 ปริมาณกรดอะซิติกระหว่างการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 3% ดว้ ยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ฏ

สารบัญภาพ (ต่อ) หน้า ภาพ 4.15 ปริมาณแบคทีเรียระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 3% ดว้ ย G. hansenii, 50 แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 53 54 ภาพ 4.16 ค่าความเป็ นกรดด่างระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 5% ดว้ ยแบคทีเรีย 56 G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลทN3, N4, S16, B19, L10 และ K6 58 59 ภาพ 4.17 ปริมาณกรดอะซิติกระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลท่ี 5% ดว้ ย G. hansenii 60 แบคทีเรียไอโซเลท, N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 62 63 ภาพ 4.18 ปริมาณแบคทีเรียที่ระหวา่ งการหมกั แบบเติมเอทานอลที่ 5% ดว้ ย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ภาพ 4.19 ค่าความเป็ นกรดด่างระหว่างการหมกั แบบผสม ด้วยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม ภาพ 4.20 ปริมาณกรดอะซิติกระหว่างการหมกั แบบผสม ด้วยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม ภาพ 4.21 ปริมาณแบคทีเรียระหว่างการหมักแบบผสม ด้วยแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10, K6 และแบบด้งั เดิม ภาพ 4.22 PCR product ของไอโซเลท N3 และ N4 ดว้ ยวธิ ี Agarose Gel Electrophoresis ภาพ 4.23 โครงสร้างววิ ฒั นาการีของแบคทีเรียกรดอะซิติกไอโซเลท N3 และ N4 ฐ

รายการสัญลกั ษณ์และอกั ษรย่อ G. hansenii Gluconacetobacter hansenii BCC 33378 CFU/ml colony forming units per millitre L ลิตร ml มิลลิลิตร mg มิลลิกรัม µl ไมโครลิตร µm ไมโครเมตร g กรัม g/l กรัมตอ่ ลิตร min นาที M หน่วยความเขม้ ขน้ สารเป็ น Molarity N หน่วยความเขม้ ขน้ สารเป็ น Normal ºC องศาเซลเซียส v/v ปริมาณต่อปริมาณ % เปอร์เซ็นต์ ฑ

บทที่ 1 บทนำ คอมบูชา (Kombucha tea) เป็ นเครื่องด่ืมชาหมัก มีต้นกาเนิดมาต้งั แต่ปี ค.ศ. 220 ในสมัย ราชวงศฉ์ ิน ใชใ้ นการบริโภคเป็ นเคร่ืองดื่มชูกาลงั ให้แก่กองทพั ทหารและสามารถลา้ งสารพษิ ได้ ในปี ค.ศ. 414 หมอคอมบูถวายการรักษาโรคกระเพาะอาหารแก่จกั รพรรด์ิดว้ ยชาหมกั ให้ผลการรักษาที่ดี ดงั น้นั ชาหมกั จึงถูกรู้จกั ในนาม “คอมบูชา” ไดแ้ พร่หลายไปในทุกทวปี ทวั่ โลก การผลิตคอมบูชานิยม ใช้ชาเขียวและชาดาเป็ นวตั ถุดิบ โดยอาศยั กระบวนการหมกั ของแบคทีเรียกรดอะซิติกและยีสต์ (Dufresne and Farnmorth, 2000) เริ่มตน้ กระบวนการภายใตส้ ภาวะใช้ออกซิเจน จุลินทรียส์ ามารถ เปลี่ยนน้าตาลและสารประกอบของชา ภายในระยะเวลา 7-10 วนั ใหเ้ ป็ นสารประกอบที่ช่วยส่งเสริม การทางานของร่างกาย เสริมสร้างประสิทธิภาพการทางานของระบบย่อยอาหาร (Roche, 1998) บรรเทาอาการของโรคไขขอ้ อกั เสบ ช่วยส่งเสริมระบบขบั ถ่าย ส่งเสริมการทางานของตบั ป้องกนั การ ติดเช้ือจุลินทรียท์ ่ีก่อโรค ช่วยคลายเครียด ป้องกนั และรักษาการเกิดเน้ืองอกและมะเร็ง ช่วยเพิ่มภูมิ- ตา้ นทานให้แก่ร่างกาย ช่วยลดคอลเรสเตอรอลและไขมนั ในเลือด และป้องกนั โรคหัวใจ (Dufresne and Farnmorth, 2000; Yang et al., 2009; Wang et al., 2010) กระบวนการหมกั คอมบูชาอาศยั จุลินทรียใ์ นกลุ่มแบคทีเรียกรดอะซิติกและกลุ่มยีสต์ ซ่ึงยีสต์ สามารถเปลี่ยนน้าตาลซูโครสให้เป็ นน้าตาลฟรุกโตสและกลูโคส แลว้ ใชใ้ นการผลิตเอทานอล ใน สภาวะที่มีแอลกอฮอลจ์ ะกระตุน้ การเจริญของแบคทีเรียกรดอะซิติก ซ่ึงสามารถเปลี่ยนกลูโคสใหเ้ ป็ น กรดกลูโคนิคและเปล่ียนฟรุกโตสใหเ้ ป็ นกรดอะซิติก เม่ือสิ้นสุดกระบวนการหมกั จะมีผลิตภณั ฑ์สอง ส่วนประกอบดว้ ย ส่วนเซลลูโลสซ่ึงเป็ นผลพลอยไดจ้ ากแบคทีเรียกรดอะซิติกและส่วนน้าชาหมกั คอมบูชา ในการบริโภค ในช่วง 15 ปี ไดม้ ีการศึกษาเก่ียวกบั สารประกอบท่ีสาคญั ในชาหมกั คอมบูชา เป็ นสารอาหารท่ีมีประโยชน์ต่อร่างกาย อาทิเช่น กรดกลูโคนิค กรดกลูคูโรนิค กรดอะซิติก กรดแล คติก กรดซิติก กรดโฟลิค กรดอะมิโน วติ ามินซี วติ ามินบี12 และเอทานอล (Dufresne and Farnmorth, 2000; Malbasa et al., 2011; Yang et al., 2009) ใน ปี 2010 Wang แล ะคณ ะ ศึ กษ าแล ะคัดแยก เช้ือจุลินทรียจ์ ากหวั เช้ือคอมบูชา เพื่อใช้เป็ นหัวเช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิเพียงชนิดเดียวให้กระบวนการ หมกั คอมบูชา ซ่ึงสามารถตรวจสอบยืนยนั ได้ว่าเป็ นแบคทีเรียกลุ่ม Gluconacetobacter โดยพบว่า 1

Gluconacetobacter sp. A4 สามารถที่จะใช้กลูโคสและฟรุกโตสในกระบวนการหมกั และสามารถ สร้างสารสาคญั คือ สาร D-saccharic acid-1,4-lactone (DSL) เป็ นสารท่ีสามารถป้องกนั การเกิดมะเร็ง และลดไขมนั ในเลือด (Wang et al., 2013) และสามารถใช้ Gluconacetobacter sp. เพียงชนิดเดียวใน กระบวนการหมกั คอมบูชาและไดผ้ ลิตภณั ฑ์ท่ีไม่มีเอทานอลเป็ นส่วนประกอบ สามารถนาไปใช้ใน อุตสาหกรรมการหมกั คอมบูชา ดังน้ันในการศึกษาน้ีจึงมุ่งเน้นไปที่การคดั แยกจุลินทรียใ์ นกลุ่ม Gluconacetobacter sp. จากหวั เช้ือจุลินทรียค์ อมบูชา และน้าผลไมห้ มกั เพื่อใชใ้ นการผลิตหมกั คอม บูชาที่มีปริมาณแอลกอฮอล์ต่าและปริมาณกรดที่เหมาะสม เพื่อปรับปรุงคุณภาพการหมกั ควบคุม ผลผลิตและรสชาติของคอมบูชาใหม้ ีความสม่าเสมอ 1.2 วตั ถุประสงค์ของกำรวจิ ัย 1.2.1 เพ่ือคัดแยกเช้ือจุลินทรีย์บริสุทธ์ิจากหัวเช้ือคอมบูชาของโรงงานที่ใช้ในการผลิต เคร่ืองด่ืมคอมบูชาและจากน้าหมกั ชีวภาพ 1.2.2 เพอ่ื หาอตั ราส่วนที่เหมาะสมของเช้ือต้งั ตน้ เพ่ือเพ่มิ ประสิทธิภาพของการหมกั คอมบูชา 2

บทที่ 2 ทบทวนเอกสาร 2.1 คอมบูชา (Kombucha) คอมบูชา คือเครื่องด่ืมชาหมกั เพ่ือสุขภาพที่มีความหวานและความเปร้ียว ดื่มแลว้ ใหค้ วามสด ช่ืนแก่ร่างกาย โดยใชช้ าและน้าตาลเป็ นวตั ถุดิบในการหมกั ซ่ึงกระบวนการหมกั จะเกิดข้ึนในสภาวะที่ มีการใชอ้ อกซิเจน โดยอาศยั เช้ือจุลินทรียท์ ่ีทางานร่วมกนั ในสองชนิดประกอบดว้ ย แบคทีเรียกรดอะ- ซิติกและยสี ต์ (Dufresne and Farnmorth, 2000) อุณหภูมิท่ีเหมาะสมในกระบวนการหมกั ที่ 18-30 ºC เมื่อสิ้นสุดกระบวนการหมกั จะไดผ้ ลิตภณั ฑ์ 2 ส่วน ประกอบดว้ ย แผ่นวุน้ หรือเซลลูโลส (cellulosic pellicle layer) ในส่วนน้ีไมน่ ิยมบริโภค เพราะมีความเปร้ียวและความเหนียวแขง็ ของแผน่ วุน้ ในส่วน ที่สองคือ น้าชาหมัก (fermented tea broth) ในส่วนน้ีจะใช้ในการดื่มบริโภค มีรสชาติที่เปร้ียว มี รสชาติของน้าชาหมกั ท่ีหวาน พบวา่ ในน้าชาหมกั มีสารประกอบตา่ งๆ หลากหลายชนิดที่มีประโยชน์ ต่อร่างกาย อาทิเช่น acetic acid, glucuronic acid, gluconic acid, succinic acid, citric acid, amino acid, vitamin C, B1, B12, glucose และ D-saccharic acid-1,4-lactone หรือสาร DSL คอมบูชาจะมีชื่อเรียกท่ีแตกต่างกนั ซ่ึงข้ึนอยกู่ บั แต่ละทอ้ งถ่ินภูมิประเทศ เช่น ประเทศไตห้ วนั เรียก Haipo หรือ Tea Fungus ประเทศญ่ีป่ ุนเรียกว่า Kocha Kinoko ประเทศรัสเซีย เรียกว่า Mo-Gu ประเทศในแถบยุโรป เรียกวา่ Heldenpilz หรือ Kombuchaschwamm นอกจากน้ีในบางประเทศรู้จกั กนั ในช่ือของ Kombucha Kargaksok Tea และ Manchurin Mushroom เป็นตน้ การบริโภคเครื่องดื่มชา หมกั พบวา่ เร่ิมมีการบริโภคต้งั แต่ปี ค.ศ.220 ในสมยั ราชวงศฉ์ ินของประเทศจีน ใชใ้ นการบริโภคเป็ น เคร่ืองดื่มชูกาลงั ให้แก่กองทพั ทหารและลา้ งสารพิษ ในปี ค.ศ.414 แพทยช์ าวเกาหลี มีชื่อวา่ “คอมบู” ไดน้ าชาหมกั จากประเทศจีนไปยงั ประเทศบา้ นเกิดของเขา และถวายการรักษาโรคกระเพาะอาหาร ให้แก่จกั รพรรด์ิดว้ ยคอมบูชา ซ่ึงใหผ้ ลการรักษาที่ดี ดงั น้นั ชาหมกั จึงถูกรู้จกั ในนาม “คอมบูชา” ตาม ชื่อของแพทยช์ าวเกาหลี จากน้นั การด่ืมชาหมกั คอมบูชาจึงไดแ้ พร่หลายขยายเขา้ ไปในเกือบทุกทวีป ของโลกท้งั ยุโรป รัสเซียและสหรัฐอเมริกา โดยผูบ้ ริโภคท่ีไดด้ ื่มคอมบูชาต่างให้การยอมรับว่า มี รสชาติหวาน มีความเปร้ียวและมีความซ่า คลา้ ยคลึงกบั แอปเปิ้ ลไซเดอร์ จดั เป็ นเครื่องดื่มท่ีสามารถ หมกั และด่ืมบริโภคข้ึนไดภ้ ายในครัวเรือน โดยผบู้ ริโภคคอมบูชามีความเช่ือวา่ การดื่มชาหมกั ชนิดน้ี จะมีผลดีต่อสุขภาพและช่วยรักษาโรคต่างๆ ได้ เช่น มีสารตา้ นอนุมูลอิสระที่สูง เพิ่มภูมิตา้ นทานและ 3

ป้องกนั โรค ช่วยให้ระบบยอ่ ยอาหารทางานไดด้ ีข้ึน ช่วยลดการเกิดโรคมะเร็ง ป้องกนั การเกิดโรคไข- ขอ้ อกั เสบ ช่วยในการลา้ งสารพิษในเลือดและระบบยอ่ ยอาหาร ส่งเสริมการทางานของตบั (Roche, 1998) รวมท้งั ช่วยลดระดบั คลอเรสเตอรอลในเลือดไดอ้ ีกดว้ ย (Yang et al., 2009) 2.2 วตั ถุดบิ ทใี่ ช้ในการหมักคอมบูชา ประกอบดว้ ย ชาและน้าตาลซูโครส 2.2.1 ชา (tea) ชาเป็ นพืชยืนต้นหรือไมพ้ ุ่มในวงศ์ Theaceae จดั อยู่ในจีนัส Camellia มีมากกว่า 300 ชนิด สาหรับชาท่ีนิยมใช้ในการบริโภคสามารถจดั แบ่งเป็ น 2 สายพนั ธุ์ คือ ชาจีน (Camellia sinensis var. sinensis) เป็นสายพนั ธุ์ท่ีนาเขา้ จากประเทศไตห้ วนั และจีน มีลกั ษณะของใบที่เล็กและแคบ ทนทานต่อ สภาพอากาศหนาวเยน็ ไดแ้ ก่ ชาอู่หลงเบอร์ 17 อู่หลงกา้ นอ่อน นิยมปลูกตามแถบจงั หวดั เชียงใหม่ เชียงราย แม่ฮ่องสอน สาหรับอีกสายพนั ธุ์คือ ชาอสั สัมหรือชาอินเดีย เป็ นสายพนั ธุ์ท่ีมีตน้ กาเนิดใน ประเทศอินเดีย และจดั เป็ นสายพนั ธุ์ด้งั เดิมของไทย (Camellia sinensis var. assamica) มีลกั ษณะใบท่ี ใหญ่ เจริญไดด้ ีในป่ าเขตร้อนช้ืน ชอบร่มเงา นิยมปลูกตามแถบจงั หวดั เชียงใหม่ เชียงราย แพร่ น่าน และลาปาง (ธีรพงษ,์ 2555 ) สาหรับวธิ ีการเก็บเก่ียวชาน้นั จะทาการเก็บยอดอ่อนของใบชา และนาเขา้ กระบวนการต่างๆ ที่ให้เกิดการหมกั ซ่ึงหากแบ่งตามกระบวนการแปรรูปชาดว้ ยกระบวนการหมกั สามารถจดั แบ่งได้ 3 ประเภทคือ ชาเขียว (green tea) ชาอู่หลง (oolong tea) และชาดา (black tea) เน่ืองจากในการผลิตชาท้งั สามน้ีมีระดบั การหมกั ท่ีแตกต่างกนั จึงทาใหช้ ามีความแตกตา่ งของ กล่ิน สี รสชาติ และองคป์ ระกอบทางเคมี (ธีรพงษ,์ 2556) 2.2.1.1 ประเภทของชาแบ่งตามกระบวนการผลิตท่ีมีระดบั การหมกั ใบชาที่แตกต่าง กนั ซ่ึงจดั แบง่ ไดด้ งั น้ีคือ ชาเขียว (green tea) เป็ นชาที่กระบวนการผลิตไม่ผา่ นการหมกั (non-fermented tea) สาหรับประเทศไทยนิยมผลิตชาเขียวจากชาสายพนั ธุ์อสั สัมและอู่หลงเบอร์ 12 (ธีรพงษ์, 2556) โดย การเก็บยอดอ่อนของตน้ ชา แตถ่ า้ หากพบวา่ ที่ใบชามีความช้ืนจะตอ้ งทาการผ่งึ เพอ่ื เป็นการไล่ความช้ืน จากน้นั นาไปอบดว้ ยไอน้า เพื่อหยุดการทางานของเอนไซม์ polyphenoloxidase ซ่ึงทาให้ไม่เกิดการ กระบวนการหมกั จากน้นั นาใบชาไปนวด (rolling) ให้เป็ นเส้น และนาไปอบแห้ง (drying) ตามดว้ ย การคดั เกรดและบรรจุ สาหรับองคป์ ระกอบที่สาคญั ที่พบในชาเขียวคือ polyphenol มีอยูป่ ระมาณ 38- 42% โดยน้าหนักแห้ง สารประกอบ polyphenol ส่วนใหญ่เป็ นสารประกอบในกลุ่ม flavonoids ซ่ึง 4

กลุ่ม flavonoids ที่พบมากจะเป็ นประเภท flavonols ท่ีประกอบด้วยสาร 3 ชนิดคือ quercetin, kaempferol และ rutin ซ่ึงสารคาเฟอีนและtheanine เป็ นสารประกอบที่ให้กลิ่นและรส และสาร leucoanthocyanins เม่ือนาชาเขียวไปตม้ เป็ นเครื่องด่ืมพบวา่ สารประกอบจาพวกโพลิฟี นอลท่ีเรียกว่า catechins ไ ด้ แ ก่ ( -) -epigallocatechin-3 -gallate (EGCG) (-)-epigallocateahin gallate (EGC) (-)- Epicatechin-3-gallate (ECG) และ (-)-Epicatechin (EC) เป็ นสารประกอบที่สามารถละลายน้าไดม้ าก ท่ีสุด สาหรับกลุ่ม catechins ท่ีพบในปริมาณน้อยได้แก่ (+)-Gal-locatechin (GC) (+)-Catechin (C) และคาเทชินอ่ืนๆ เช่น (-)-Gallocatechin gallate (GCG) และ (-)-Catechin gallate (CG) โดยพบว่าชา เขียวต่อ 1 กิโลกรัม พบ catechins 191 g, คาเฟอีน 36 g, และ flavonols 5.2 g งานวิจยั ต่างๆ พบวา่ ชา เขียวสามารถตา้ นการเกิดมะเร็งในมนุษยไ์ ด้ (Sajilata et al., 2008) ชาอู่หลง (oolong tea) เป็ นชาที่ผา่ นกระบวนการหมกั เพียงบางส่วน หรือเป็ นชาก่ึง หมกั (semi-fermented tea) นิยมใชช้ าสายพนั ธุ์จีนในการผลิต เริ่มจากการเก็บยอดออ่ นของตน้ จากน้นั นาใบชาผ่ึงกลางแจง้ (outdoor withering) ประมาณ 20-40 นาที เพ่ือให้ใบชาเกิดการคายน้าออกมา ข้นั ตอนต่อไปนาใบชาผ่งึ ในที่ร่ม (indoor withering) ที่ควบคุมอุณหภูมิและความช้ืน และใบชาจะถูก เขย่ากระตุ้นให้เกิดการช้า สาหรับการผ่ึงในท่ีร่มทาให้เกิดการหมักบางส่วนส่งผลให้เอนไซม์ polyphenoloxidase เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชนั ของ catechins ทาให้เกิดการรวมตวั กนั ของสาร catechins เป็นสารประกอบสารใหม่ที่ทาใหช้ าอูห่ ลงมีสี กล่ิน และรสชาติท่ีต่างไปจากชนิดอื่นๆ ภายหลงั การผ่งึ ในท่ีร่มใบชาจะถูกนาไปคว่ั และนวด (rolling) ใหเ้ ป็ นเส้นและนาไปอบแหง้ ตามดว้ ยการคดั เกรดและ บรรจุ (ธีรพงษ์, 2556) องคป์ ระกอบทางเคมีของชาอู่หลงจะประกอบไปดว้ ย (mg/100 ml) gallic acid 2.19 mg, คาเฟอีน 23.51 mg, gallocatechin 6.68 mg, epigallocatechin16.14 mg, catechins 1.65 mg, epicatechins 5.08 mg, epigallocatechin gallate 25.73 mg, gallocatechin gallate 1.85 mg, epicatechin gallate 5.73 mg, catechin gallate 0.6 mg, polymerization 33.65 mg แ ล ะ total phenol 99.32 mg (Sajilata et al., 2008) ชาดา (black tea) เป็ นชาท่ีผ่านกระบวนการหมักอย่างสมบูรณ์ (completely fermented tea) ใบชาสดจะถูกผ่งึ เพื่อลดความช้ืน ตามดว้ ยนวดและตี จากน้นั เป็ นกระบวนการหมกั ท่ี ปล่อยเอนไซมเ์ ร่งปฏิกิริยาออกซิเดชนั คาเทซินอยา่ งสมบูรณ์ คาเทชินจะเกิดออกซิเดชนั และรวมตวั กนั เป็ นสารประกอบใหม่ จากน้ันอบแห้ง ตามดว้ ยคดั เกรดและบรรจุ สาหรับองค์ประกอบทางเคมี ของชาดาน้นั ประกอบดว้ ย catechin ประมาณ 3-10% theaflavins ประมาณ 2-6% และ thearubigins มี ประมาณ 10-20% (Sajilata et al., 2008) 5

2.2.2 นา้ ตาลทรายหรือนา้ ตาลซูโครส (เรืองลกั ขณา, 2541) น้าตาลมีความสาคญั ต่อการดารงชีวิตของส่ิงมีชีวิต ท้งั มนุษย์ พืช สัตว์ รวมท้งั จุลินทรีย์ โดย จดั เป็ นคาร์โบไฮเดรตชนิดหน่ึงที่ให้ความหวาน หรือที่รู้จกั กันทว่ั ไปว่า น้าตาลทรายหรือน้าตาล ซูโครส (sucrose) น้าตาลซูโครสสามารถพบไดใ้ นพืชหลากหลายชนิด สาหรับพืชที่นิยมนามาผลิต เป็ นน้าตาลซูโครสหรือผลิตเพื่อการค้า ได้แก่ อ้อยและหัวบีท น้าตาลซูโครสประกอบด้วยธาตุ คาร์บอน ไฮโดรเจน และออกซิเจน จดั เป็ นสารให้ความหวานประเภทไดแซ็กคาร์ไรด์หรือน้าตาล โมเลกุลคู่ (disaccharide) ที่สามารถละลายน้าได้ ซ่ึงมีสูตรโมเลกุลเป็ น C12H22O11 โดยสูตรโครงสร้าง โมเลกุลจะประกอบด้วย โมโนแซ็กคาไรด์ 2 โมเลกุล จะประกอบข้ึนจาก α-glucose และ β-D- fructose หรือกลูโคสและฟรุกโตส (ภาพ 2.1) โดยพนั ธะระหวา่ งกลูโคสและฟรุกโตสอยใู่ นรูปไกลโค ไซด์ ถา้ ทาการไฮโดรไลซ์ซูโครสดว้ ยกรดหรือเอนไซมจ์ ะทาให้ไดน้ ้าตาลอินเวิร์ต (invert sugar) ซ่ึง เป็ นสารผสมของกลูโคสและฟรุกโตสท่ีมีจานวนโมลาร์ท่ีเท่ากนั น้าตาลอินเวิร์ตในธรรมชาติจะพบ มากในน้าผ้งึ โดยน้าตาลอินเวริ ์ตจะให้ความหวานใกลเ้ คียงกบั น้าตาลซูโครส เน่ืองจากน้าตาลกลูโคส จะไม่ค่อยหวานแต่น้าตาลฟรุกโตสจะหวานกวา่ น้าตาลซูโครส ในกระบวนการหมกั คอมบูชาน้าตาลซูโครสจดั เป็ นแหล่งคาร์บอนช้ันดีให้แก่จุลินทรีย์ โดยเฉพาะแบคทีเรียกรดอะซิติก ซ่ึงการใช้น้าตาลชนิดอ่ืนเป็ นวตั ถุดิบสาหรับหมกั จะมีผลทาให้ แบคทีเรียกรดอะซิติกมีการเจริญเติบโตไดน้ อ้ ย Malbasa et al (2008) ศึกษากระบวนการหมกั คอมบูชา โดยใช้น้าตาลโมลาสเป็ นแหล่งคาร์บอน พบแบคทีเรียกรดอะซิติกมีอตั ราการเจริญที่น้อยมากเมื่อ เปรียบเทียบกบั การใชน้ ้าตาลซูโครส ภาพ 2.1 โครงสร้างของน้าตาลซูโครส (เรืองลกั ขณา, 2541) 6

2.3 จุลนิ ทรีย์ทเ่ี กย่ี วข้องกบั กระบวนการหมักคอมบูชา เช้ือจุลินทรียท์ ่ีเก่ียวขอ้ งกบั กระบวนการหมกั คอมบูชาอาศยั กิจกรรมการหมกั ร่วมกนั หรือ แบบพ่ึงพาอาศยั ซ่ึงกนั และกนั (symbiotic) จึงทาใหไ้ ม่มีการปนเป้ื อนหรือเจริญของจุลินทรียช์ นิดอื่นที่ ก่อโรค โดยสามารถตรวจพบจุลินทรียใ์ นชาหมกั คอมบูชาได้เป็ น 2 กลุ่มหลกั ประกอบด้วย กลุ่ม แบคทีเรียกรดอะซิติก (acetic acid bacteria) และกลุ่มยีสต์ (yeast) สาหรับกิจกรรมในกระบวนการ หมกั ของจุลินทรียท์ ้งั สองกลุ่ม คือ ในระยะเร่ิมตน้ ของการะหมกั ยสี ตท์ าหนา้ ท่ีเปล่ียนน้าตาลโมเลกุลคู่ ใหเ้ ป็ นน้าตาลโมเลกุลเดี่ยว จากน้นั ยสี ตก์ ็จะเขา้ ไปเปลี่ยนน้าตาลโมเลกุลเดี่ยวใหเ้ ป็ นแอลกอฮอล์และ กรดอินทรียบ์ างชนิด เม่ือในสภาวะท่ีมีแอลกอฮอลแ์ ละน้าตาลโมเลกลุ เด่ียวจึงมีความเหมาะสมต่อการ เจริญเติบโตของแบคทีเรียกรดอะซิติก โดยแบคทีเรียกรดอะซิติกสามารถที่จะเปล่ียนแอลกอฮอลใ์ ห้ เป็ นกรดอะซิติกและกรดอินทรียห์ รือสารประกอบต่างๆ ได้ ยสี ตแ์ ละแบคทีเรียกรดอะซิติกมีกิจกรรม การหมกั ร่วมกันหรือท่ีเรียกว่า tea fungus สาหรับคาว่า “tea fungus” น้ันไม่ได้หมายถึงเห็ดรา แต่ หมายถึงกลุ่มของแบคทีเรียที่สามารถสังเคราะห์แผน่ เซลลูโลสหรือแผน่ วนุ้ บริเวณผวิ หนา้ ของชาหมกั คอมบูชา ซ่ึงมีลกั ษณะที่คลา้ ยคลึงกบั รา (Dufresne and Farnmorth, 2000; Teoh, et al 2004; Jayabalan et al., 2014) 2.3.1 แบคทเี รียกรดอะซิติก (Acetic Acid Bacteria) แบคทีเรียกรดอะซิติกเป็ นโปรคาริโอติกเซลล์ จัดอยู่ในตระกูล Acetobacteraceae เป็ น แบคทีเรียแกรมลบ เซลล์มีรูปร่างไข่จนถึงแท่งส้ัน ขนาดประมาณ 0.4-1 x 0.8-4.5 µm สามารถเจริญ ไดด้ ีที่อุณหภูมิ 30 ºC ค่าความเป็ นกรดด่างท่ีเหมาะสม 5.0–6.5 และสามารถเจริญไดเ้ ม่ือมีค่าความเป็ น กรดด่างอยู่ระหว่าง 3–4 สามารถเจริญไดใ้ นท่ีมีปริมาณกรดอะซิติกที่ 0.35% ตอ้ งการอากาศในการ เจริญเติบโต (นงลกั ษณ์ และปรีชา, 2548) แบคทีเรียท่ีอยูใ่ นตระกูลน้ีสามารถจดั แบ่งได้ 6 จีนสั ไดแ้ ก่ Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter และ Kozakia ในบางจีนัสมี แฟลกเจลลารอบข้างหรือมีแฟลกเจลลาท่ีปลายข้วั ของเซลล์ บางจีนัสสามารถสร้างแผ่นวุน้ หรือ เซลลูโลสซ่ึงสามารถขบั ออกภายนอกเซลล์หรือสะสมอยู่รอบเซลล์ แหล่งที่สามารถพบแบคทีเรีย กรดอะซิติก สามารถพบไดใ้ นธรรมชาติท่ีมีสภาพเป็ นความเป็ นกรดและมีปริมาณน้าตาลหรือปริมาณ แอลกอฮอล์ที่สูง อาทิเช่น ผลไม้ จาพวกองุ่น แอปเปิ้ ล สับปะรด เงาะ มะม่วง ลิ้นจี่ ลาไย มะเฟื อง มะนาว ละมุด ลูกพลบั สตรอเบอร์ร่ี เบียร์ ไวน์ น้าส้มสายชู ชาหมกั คอมบูชา น้าผลไมร้ สเปร้ียว และ น้าผ้งึ (Dufresne and Farnmorth, 2000; Goh et al., 2012) 7

แบคทีเรียกรดอะซิติกมีความสามารถในการออกซิไดซ์แอลกอฮอล์ใหเ้ ปล่ียนเป็ นกรดอะซิติก ได้แก่จีนัส Acetobacter Gluconacetobacter และ Acidomonas และมีความสามารถในการออกซิไดซ์ กรดอะซิติกไปเป็ นน้าและคาร์บอนไดออกไซด์ หรือท่ีเรียกว่าการเกิดปฏิกิริยา overoxidation of ethanol โดย Gluconobacter มีความสามารถในการออกซิไดซ์น้าตาลกลูโคสเป็ นกรดกลูโคนิค ซ่ึง แบคทีเรียกรดอะซิติกมีความสามารถในการออกซิไดซ์แอลกอฮอลใ์ ห้กลายเป็ นกรดอะซิติกโดยอาศยั เอนไซม์ alcohol dehydrogenase และ aldehyde dehydrogenase ดงั แสดงในตาราง 2.1 (Kersters et al., 2006 ; Jayabalan et al., 2014) ตาราง 2.1 ความสามารถออกซิไดซ์ของแบคทีเรียกรดอะซิติก สารต้งั ต้น ผลติ ภณั ฑ์ เอนไซม์ ethanol Acetic acid Alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase iso-butanol iso-Butyric acid Alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase α-Acetolactate Acetoin α-acetolactate decarboxylase D-Glycerol dihydroxyacetone Glycerol dehydrogenase D-mannitol D-fructose D-mannitol dehydrogenase D-sorbitol L-Sorbitol D-sorbitol dehydrogenase D-glucose D-Gluconic acid D-Glucose dehydrogenase D-gluconic acid 2-Keto-D-gluconic acid D-Gluconate dehydrogenase D-gluconic acid 5-Keto-D-gluconic acid D-Gluconate dehydrogenase 2-Keto-D-gluconic acid 2,5-Diketo-D-gluconic acid 2-Keto-D-gluconate dehudrogenase L-Sorbose L-Sorbosone L-Sorbose dehydrogenase L-Sorbosone 2-Keto-D-gulonic acid L-Sorbosone dehydrogenase D-Fructose 5-Keto-D-fructose D-Fructose dehydrogenase แบคทีเรียกรดอะซิติกท่ีสามารถตรวจพบในน้าหมกั คอมบูชาประกอบด้วยเช้ือจุลินทรีย์ ดงั ต่อไปน้ี คือ Acetobacter xylinum, A. xylinoides, A. aceti, A. pausterianus, Bacterium gluconicum, Gluconobacter oxydans (Liu et al.; Balentine as cited in Goh et al., 2012; Teoh et al., 2004) และ Gluconacetobacter sp. A4 สามารถผลิต D-saccharic acid-1,4-lactone (DSL) ซ่ึงสามารถลดระดับ คอเรลเตอรอลในเส้นเลือดได้ (Yang et al., 2009) และสามารถยบั ย้งั การทางานของเอนไซม์ β- glucuronidase ซ่ึงเป็นเอนไซมท์ ่ีกระตุน้ ใหเ้ กิดมะเร็งลาไส้ 8

2.3.2 ยสี ต์ (Yeast) ยีสต์เป็ นยูคาริโอติกเซลล์ เป็ นกลุ่มราที่มีลกั ษณะเป็ นเซลล์เดี่ยว สืบพนั ธุ์แบบไม่อาศยั เพศ อาศยั การแตกหน่อหรือแบ่งตวั สร้างสปอร์ รูปร่างกลมหรือรี มีความกวา้ งต้งั แต่ 1-5 µm และความ ยาว 5-30 µmโดยขนาดและรูปร่างมีความแตกต่างกนั ข้ึนอยกู่ บั อายแุ ละสภาพแวดลอ้ ม ยสี ตไ์ ม่มีแฟล กเจลลาหรืออวยั วะอื่นในการเคลื่อนที่ ยีสตส์ ามารถเจริญอยใู่ นที่ที่มีความเขม้ ขน้ ของเกลือและน้าตาล สูงได้ เจริญไดใ้ นช่วงอุณหภูมิต้งั แต่ 0-47 ºC บางชนิดจะไม่เจริญที่อุณหภูมิสูงกวา่ 15 ºC อุณหภูมิท่ี เหมาะสมต่อการเจริญอยทู่ ี่ 20-30 ºC ค่าความเป็ นกรดด่างที่เหมาะสมในช่วง 3.5-3.8 ยีสตส์ ามารถพบ ไดท้ ว่ั ไปในธรรมชาติ พืช ผกั ผลไมห้ รือสามารถตรวจพบไดใ้ นอาหารหรือเครื่องดื่มที่มีความเป็ น กรดและน้าตาลท่ีสูง (นงลกั ษณ์ และปรีชา, 2548) ยีสตม์ ีอยปู่ ระมาณ 350 สปี ชีส์ สามารถจดั แบ่งไดป้ ระมาณ 39 จีนสั ซ่ึงยสี ตม์ ีความเกี่ยวขอ้ ง กบั มนุษย์ มีบทบาทเกี่ยวขอ้ งกบั อุตสาหกรรมอาหาร อาทิเช่น การผลิตน้าหมกั ผลไม้ น้าส้มสายชู อุตสาหกรรมขนมปัง การผลิตแอลกอฮอล์ เกี่ยวขอ้ งกบั กระบวนการหมกั การสังเคราะห์วิตามิน ไขมนั และโปรตีน (นงลกั ษณ์ และปรีชา, 2548) โดยยสี ตท์ ่ีสามารถตรวจพบไดจ้ ากน้าชาหมกั คอมบูชา ประกอบไปดว้ ยยสี ต์ Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Brettanomyces/Dekkera, Candida, Torulospora, Koleckera, Pichia Mycotorula และ Mycoderma ซ่ึงได้มีการศึกษาเพ่ือระบุชนิดและ ตรวจสอบสายพันธุ์ได้แก่ Saccharomyces cervisiae, Saccharomyces bisporus, Saccharomycodes ludwigii, Schizosaccharomyces pombe, Zygosaccharomyces sp., Zygosaccharomyces rouxii แ ล ะ Zygosaccharomyces bailii (Jayabalan et al., 2014) 2.4 กระบวนการหมักคอมบูชา สาหรับกระบวนการหมกั คอมบูชาน้นั สามารถแบ่งไดเ้ ป็น 4 ข้นั ตอน 2.4.1 กระบวนการหมักน้าตาลให้เป็ นแอลกอฮอล์ ในช่วงระยะเร่ิมตน้ ของกระบวนการหมกั ยสี ตจ์ ะทาหนา้ ที่ยอ่ ยน้าตาลซูโครสดว้ ยเอนไซมไ์ ฮโดรเลสให้เป็ นกลูโคส และฟรุกโตส (Balentine et al., as cited in Dufresne and Farnworth, 2000) กลูโคสจะถูกย่อยสลายแบบไม่ใช้ออกซิเจน หรือท่ี เรียกว่ากระบวนการหมกั แอลกอฮอล์ ซ่ึงผลผลิตท่ีได้ในช่วงระยะเริ่มแรกจะเป็ นแอลกอฮอล์และ คาร์บอนไดออกไซด์ (นงลกั ษณ์ และปรีชา, 2548) ดงั สมการ 2.1 (Gunther, 1995) 9

C6H12O6 2C2H5OH + CO2 กลูโคส แอลกอฮอล์ คาร์บอนไดออกไซด์ 2.4.2 กระบวนการเกดิ กรดคาร์บอนิก ภายหลงั จากกระบวนการยอ่ ยสลายน้าตาลของยีสต์จะ เกิดคาร์บอนไดออกไซด์ โดยไอน้ าและความช้ืนภายในชาหมักคอมบูชาจะรวมตัวกันกับ คาร์บอนไดออกไซด์ ทาให้เกิดเป็ นกรดคาร์บอนิก ส่งผลทาใหน้ ้าหมกั คอมบูชามีความเปร้ียวซ่าและมี ฟองกา๊ ซเล็กนอ้ ย ดงั สมการ 2.2 (Gunther, 1995) CO2 + H2O H2CO3 คาร์บอนไดออกไซด์ น้า กรดคาร์บอนิก 2.4.3 กระบวนการออกซิไดซ์แอลกอฮอล์เป็ นกรดอนิ ทรีย์ต่างๆ ในสภาวะที่มีแอลกอฮอล์ ซ่ึง จะมีความเหมาะสมต่อการเจริญเติบโตของกลุ่มแบคทีเรียกรดอะซิติกท่ีสามารถเจริญไดด้ ีพร้อมท้งั สามารถออกซิไดซ์แอลกอฮอล์ให้เป็ นกรดอะซิติกและน้า นอกจากกรดอะซิติกแลว้ น้าหมกั คอมบูชา ยงั มีกรดอินทรียต์ ่างๆ เกิดข้ึน นอกจากน้ีแบคทีเรียกรดอะซิติกสามารถที่จะเปลี่ยนน้าตาลและคาเฟอีน ท่ีเป็ นส่วนประกอบของชาให้เป็ นส่วนในผลิตแผ่นวุน้ หรือเซลลูโลสบริเวณผิวหน้าของน้าชาหมกั คอมบูชา เมื่อเกิดกระบวนการออกซิไดซ์แอลกอฮอล์เกิดข้ึน จึงทาให้ชาหมกั คอมบูชามีปริมาณ แอลกอฮอล์ไม่มากหรือไม่มีแอลกอฮอล์ผสม เม่ือเทียบกบั เคร่ืองดื่มแอลกอฮอล์ทวั่ ไป ดังสมการ (Gunther, 1995) C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O แอลกอฮอล์ ออกซิเจน กรดอะซิติก น้า 2.4.4 กระบวนการผลิตแผ่นวุ้นหรือแผ่นเซลลูโลส (cellulosic pellicle layer) แผ่นวุน้ เป็ น ผลิตภัณฑ์ที่ผลิตจากกลุ่มแบคทีเรียกรดอะซิติก โดยสารคาเฟอีน (caffeine) และสารแซนทีน (xanthines) ที่เป็ นสารประกอบของชาจะช่วยกระตุ้นให้เกิดการสร้างแผ่นวุน้ ข้ึน อาศัย Entner- Doudoroff pathway ซ่ึงโครงสร้างของแผน่ วุน้ ประกอบดว้ ยเฮมิเซลลูโลสและลิกนิน ในระยะเร่ิมตน้ ของกระบวนการหมกั หรือประมาณในวนั ท่ี 3 ของการหมกั คอมบูชา สามารถสังเกตเห็นแผน่ วนุ้ หรือ แผน่ เย่อื ใสบางๆ (culture floats) เจริญปกคลุมบริเวณผิวหน้าชาหมกั อาจจะมีการจมด่ิงอยูบ่ ริเวณกน้ ของภาชนะหมกั ซ่ึงการเจริญของแผน่ วุน้ เป็ นสิ่งช้ีวดั ไดว้ า่ เช้ือจุลินทรียใ์ นชาหมกั น้นั มีการเจริญที่ดี และส่วนของน้าชาหมกั มีสารอาหารท่ีเหมาะสมต่อการเจริญของเช้ือจุลินทรีย์ เช่น แหล่งคาร์บอน ไนโตรเจน ออกซิเจน แร่ธาตุ เม่ือทาการหมกั คอมบูชาเป็ นระยะเวลานานข้ึนจะสังเกตเห็นแผน่ วุน้ ที่ หนา้ เพิ่มมากข้ึน ถา้ หากมีการเขยา่ เคลื่อนยา้ ยภาชนะหมกั หรืออุณหภูมิในการบ่มต่ากวา่ 30ºC แผน่ วนุ้ 10

อาจจะตกจมด่ิงอยูบ่ ริเวณกน้ ของภาชนะหมกั ท้งั น้ีแบคทีเรียกรดอะซิติกจะสามารถผลิตแผ่นวุน้ ปก คลุมบริเวณผวิ หนา้ ของน้าชาหมกั ไดใ้ หมอ่ ยเู่ สมอ (Jayabalan et al., 2014) 2.5 องค์ประกอบทสี่ ามารถตรวจวเิ คราะห์ได้จากชาหมักคอมบูชา (Jayabalan et al., 2014) การวเิ คราะห์องคป์ ระกอบทางเคมีของชาหมกั คอมบูชา โดยสารประกอบส่วนใหญ่ที่พบเป็ น กรดอินทรี ย์ (ตาราง 2.1) อาทิเช่น acetic acid, gluconic acid, glucuronic acid, citric acid เป็ นต้น vitamin C, B1,B2, B6 และ B12 amino acid, biogenic, pigments, lipids, proteins, ethanol, antibiotic, carbon dioxide, polyphenols, minerals และ D-saccharic acid-1,4-lactone ซ่ึงสารประกอบเหล่าน้ีเกิด จากกระบวนการเมทาบอลิซึมของแบคทีเรียกรดอะซิติกและยสี ตใ์ นกระบวนการหมกั คอมบูชา กรดอะซิติกจดั เป็ นสารประกอบอินทรียท์ ี่สามารถพบไดม้ ากที่ในคอมบูชา เป็ นกรดที่ผลิต จากแบคทีเรียกรดอะซิติก โดยแบคทีเรียสามารถท่ีออกซิไดซ์แอลกอฮอล์ให้เปล่ียนเป็ นกรดอะซิติก และน้า Chen et al (2000) ได้ตรวจวิเคราะห์กรดอะซิติกในน้าชาหมกั คอมบูชา ในวนั ท่ี 30 ของการ หมกั มีปริมาณกรดอะซิติกที่ 11 g/l โดยปริมาณของกรดอะซิติกจะมีปริมาณท่ีเพ่ิมสูงข้ึนตามระยะเวลา การหมกั ที่นานข้ึน กรดกลูคูโรนิคและกรดกลูโคนิค เป็ นกรดท่ีพบได้เป็ นหลักในน้าชาหมักคอมบูชา โดย แบคทีเรียกรดอะซิติกจะเปลี่ยนน้าตาลกลูโคสและผลิตเป็ นกรดกลูคูโรนิคและกรดกลูโคนิค โดย ปริ มาณ ก รดกลู โคนิ ค ส าม ารถ ตรวจพ บ ได้ในป ริ ม าณ ที่ เพิ่ มข้ ึ นใน ระยะเวล าการหมักที่ น านข้ ึ น เช่นเดียวกนั กรดแลคติกเป็ นกรดอินทรียช์ นิดหน่ึงท่ีไม่สามารถตรวจพบไดจ้ ากการหมกั คอมบูชาแบบ ด้งั เดิม แต่ในปี 2007 Jayabalan และคณะ ทาการศึกษาโดยใชช้ าเขียว ชาดาและชาผสมเป็ นวตั ถุดิบใน การหมกั พบวา่ จากการใชช้ าเขียวสามารถตรวจวเิ คราะห์กรดแลคติกไดใ้ นปริมาณท่ีมากถึง 0.54 g/l กรดซิตริก เป็ นอีกหน่ึงชนิดของกรดอินทรียท์ ี่ไมใ่ ช่กรดท่ีถูกผลิตมาจากกระบวนการเมทาบอ ลิซึมของการหมกั คอมบูชาแบบด้งั เดิม แต่ในปี 2011 Malbasa และคณะ ทาการศึกษาหมกั คอมบูชา โดยใช้ 1.5 g/l ของชาดา และผสมกบั น้าตาลซูโครส 7% ซ่ึงสามารถวเิ คราะห์กรดซิตริกไดม้ ากถึง 1.5 g/l สาร D-saccharic acid-1,4-lactone เป็นสารที่ถูกสร้างข้ึนจากกระบวนการเมตาบอลิซึมน้าตาล กลูโคสในวฏั จักร glucuronate สามารถลดคอเลสเตอรอลและย้บั ย้งั การทางานของเอนไซม์ β- glucuronidase ซ่ึงเป็ นเอนไซม์ท่ีกระตุน้ การเกิดมะเร็งลาไส้ โดยความเขม้ ขน้ ของสาร DSL ท่ีระดบั 11

0.03-0.15 mg/ml สามารถยบั ย้งั การทางานของเอนไซม์ glucuronidase ซ่ึงสาร DSL สามารถพบไดใ้ น พืชตระกลู ส้ม ใบชาและพืชอ่ืนๆ แตพ่ บในความเขม้ ขน้ ท่ีนอ้ ย (Wang et al., 2010) นอกจากการตรวจพบกรดอินทรีย์และสารประกอบต่างๆ ตามข้างต้น ยงั มีการตรวจพบ สารประกอบดงั ตอ่ ไปน้ี แมกนีเซียม เหลก็ ฟลูออไรด์ คอไรด์ ไอโอดีน โบมีน ฟอสเฟต คาเฟอีน คาเท ชิน (catechins) ไดแ้ ก่ (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG), (-)-epigallocateahin gallate (EGC), (-)- Epicatechin-3-gallate (ECG) และ (-)-Epicatechin (EC) (Chu and Chen, 2006) 2.6 ประโยชน์ของเครื่องดื่มคอมบูชาต่อสุขภาพ (Dufresne and Farnworth, 2000) คอมบูชาไดร้ ับการยอมรับจากทวั่ โลกว่าเป็ นเคร่ืองดื่มชาหมกั เพ่ือสุขภาพ ซ่ึงได้มีงานวิจยั ทาการศึกษาเกี่ยวกบั ประโยชน์ พบวา่ ช่วยเพ่มิ ปริมาณเช้ือจุลินทรียไ์ บโอติกในร่างกาย ส่งเสริมระบบ ขบั ถ่าย ขบั พิษในเลือด ลดระดบั คอเลสเตอรอล ป้องกนั การเกิดหลอดเลือดแดงตีบตนั ลดระดบั ความ ดนั ในเลือด ช่วยส่งเสริมการทางานของระบบภูมิคุม้ กนั ลดอาการไขขอ้ อกั เสบและโรคเกาท์ ส่งเสริม การทางานของตบั ลดการเกิดภาวะตบั แข็ง ช่วยป้องกนั โรคอว้ น ลดความอยากรับประทานอาหาร ป้องกนั การติดเช้ือในระบบทางเดินปัสสาวะ กระตุน้ การทางานของระบบต่อมไร้ท่อ ช่วยลดการเกิด โรคเบาหวาน ลดการเกิดหลอดลมอกั เสบ ป้องกนั โรคหอบหืด ช่วยบรรเทาความอยากดื่มแอลกอฮอล์ ของผูป้ ่ วย ส่งเสริมการทางานของไต ป้องกนั การเกิดมะเร็ง ป้องกนั การเกิดโรคจากแบคทีเรีย ไวรัส และยสี ต์ ส่งเสริมสุขภาพของเส้นผม ผวิ เลบ็ และสายตาให้ดีข้ึน ลดอาการเครียด ลดอาการปวดศีรษะ และช่วยระบบเมตาบอลิซึมของร่างกาย ฤทธ์ิต้านแบคทเี รียของเครื่องดื่มคอมบูชา (Jayabalan et al., 2014) เคร่ืองดื่มคอมบูชามีฤทธ์ิในการยบั ย้งั แบคทีเรียก่อโรค คอมบูชามีปริมาณกรดท้งั หมดเท่ากบั 33 g/l (กรดอะซิติกเท่ากบั 7 g/l) สามารถตา้ นทานเช้ือ Agrobacterium tumefaciens, Bacillus cereus, Salmonella choleraesuis serotype Typhimurium, Staphylococcus aureus แ ล ะ Escherichia coli ซ่ึ ง เคร่ืองด่ืมคอมบูชามีฤทธ์ิในการยบั ย้งั เช้ือจุลินทรียก์ ่อโรค ไดแ้ ก่ Entamoeba cloacae, Pseudomonas aeruginosa, B. cereus, E. coli, Aeromonas hydrophila, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermis, Leuconostoc monocytogenes, Yersinia enterocolitica, S. aureus, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori และ C. albicans สาหรับสาร ออกฤทธ์ิในการตา้ นแบคทีเรียก่อโรคของคอมบูชา ส่วนใหญ่จะเป็ นกรดอะซิติก โปรตีน และสารเค ทาชิน โดยกรดอะซิติกและคาเทชินสามารถยบั ย้งั แบคทีเรียก่อโรคท้ังแกรมบวกและลบได้ (Sreeramulu et al., 2000) 12

ฤทธ์ิต้านอนุมูลอสิ ระของเครื่องดื่มคอมบูชา สารตา้ นอนุมูลอิสระในเคร่ืองด่ืมคอมบูชาประกอบดว้ ย tea polyphenol, ascorbic acid และ สาร DSL โดยปริมาณสารตา้ นอนุมูลอิสระในคอมบูชาจะมีในปริมาณมากกวา่ ชาที่ไม่ผ่านการหมกั เนื่องจากในระหวา่ งการหมกั แบคทีเรียกรดอะซิติกและยสี ตจ์ ะมีการผลิตเอนไซมแ์ ละเขา้ ไปยอ่ ยขนาด โมเลกุลของ tea polyphenol ใหม้ ีขนาดและโครงสร้างใหม่ส่งผลให้มีปริมาณตา้ นอนุมูลอิสระเพ่ิมข้ีน และเม่ือสิ้นสุดการหมกั เคร่ืองดื่มคอมบูชามีสารประกอบอินทรียท์ ่ีจดั เป็ นสารตา้ นอนุมูลอิสระจาพวก ascorbic acid, DSL และ gallic acid จึงทาให้เครื่องดื่มคอมบูชามีสารต้านอนุมูลอิสระที่เพิ่มข้ึน (Jayabalan et al., 2008) 2.7 ความเป็ นพษิ ของคอมบูชาต่อร่างกาย (Jayabalan et al., 2014) ได้มีรายงานความเป็ นพิษของการด่ืมคอมบูชาต่อร่างกาย ภายหลงั จากดื่มบริโภคในบาง บุคคลพบอาการคล่ืนไส้ อาเจียน วงิ เวยี นศีรษะ ในปี ค.ศ. 1995 ศูนยป์ ้องกนั และควบคุมโรค หา้ มหญิง มีครรภแ์ ละให้นมบุตรดื่มบริโภคคอมบูชา การตรวจพบสารตะกว่ั เนื่องจากใช้ภาชนะเซรามิกในการ ผลิตและมีความเป็ นพิษต่อระบบทางเดินอาหาร ในปี ค.ศ. 1998 มีการพบโรคแอนแทรกซ์ จาก แบคทีเรียบาซิลสั ในเครื่องดื่มคอมบูชา สาเหตุของการเกิดโรคแอนแทรกซ์มาจากสภาพการหมกั ที่ไม่ ถูกสุขลกั ษณะ และยงั มีรายงานความเสี่ยงการด่ืมบริโภคคอมบูชาของผูป้ ่ วยท่ีมีสภาวะภูมิคุม้ กนั บกพร่อง (HIV) จะเกิดอาการขา้ งเคียงดงั น้ี อาการแพ้ วงิ เวยี นศีรษะ อาเจียน ปวดคอ แต่ท้งั น้ียงั ไมไ่ ดม้ ี การรายงานยืนยนั ท่ีแน่ชดั วา่ การเกิดโรคหรืออาการขา้ งเคียงในขา้ งตน้ มีสาเหตุหลกั ที่แทจ้ ริงมาจาก การด่ืมบริโภคเคร่ืองด่ืมคอมบูชา (Jayabalan et al., as cited in sadjadi, 1998 Gamundi and Valdivia, 1995 Srinivasan et al., 1997 Phan et al., 1998 Sabouraud et al., 2009) 13

บทท่ี 3 อปุ กรณ์และวธิ ีการวจิ ยั 3.1 วสั ดุและอุปกรณ์ 3.1.1 ขวด Duran ขนาด 250 500 1000 และ 2,000 ml 3.1.2 ขวด Duran ปากกวา้ ง ขนาด 500 และ 1,000 ml 3.1.3 Spatular 3.1.4 ผา้ ขาวบาง 3.1.5 ถุงมือยาง 3.1.6 Loop 3.1.7 Beaker ขนาด 100, 500 และ 1,000 ml 3.1.8 Cylinder ขนาด 100, 500 และ 1,000 ml 3.1.9 Erlenmeyer Flask ขนาด 250 และ 125 ml 3.1.10 Slide และ cover slip 3.1.11 Silicone tube ขนาด 3 x 5 และ 8 x 12 mm 3.1.12 Test tube ขนาด 16 x 150 และ 18 x 150 mm 3.1.13 Micropipette ขนาด 50-200, 200-1,000 และ 1,000-10,000 µl 3.1.14 Pipette tip ขนาด 200, 1,000 และ 10,000 µl 3.1.15 Peti dish 3.1.16 หมอ้ ตม้ ชา 3.1.17 ผา้ ปิ ดจมูก 3.1.18 Microwell Plate 3.1.19 Syring ขนาด 1 และ 10 ml 3.1.20 Nylon membrane 0.45 µm ขนาด 47 mm. 14

3.1.21 Nylon Syring Filter 0.45 µm 3.1.22 Eppendorf 3.1.23 หลอด PCR 3.1.24 ขวดสีชา 3.1.25 กระดาษกรอง Whatman เบอร์ 1 3.1.26 Forceps 3.1.27 Funnel ขนาด 100 mm 3.1.28 Volumetric Flask ขนาด 50, 100 และ 500 ml 3.1.29 Stainless-Steel Beaker ขนาด 1,000 และ 2,000 ml 3.2 เครื่องมือ 3.2.1 กลอ้ งจุลทรรศนแ์ บบเลนส์ประกอบ (Olympus, CX-31, USA) 3.2.2 เครื่องชงั่ ทศนิยม 2 ตำแหน่ง (Mettler Toledo, PL602-L, Switzerland) 3.2.3 เครื่องชงั่ ทศนิยม 4 ตาแหน่ง (Mettler Toledo, AB304-5, Switzerland) 3.2.4 Biosafety cabinet (ESCO, SC2-4A1, Singapore) 3.2.5 Autoclave (Tomy, SX-700, Japan) 3.2.6 Ebulliometer (Dujardin-salleron, Paris) 3.2.7 Hot air oven (Heraeus, USA) 3.2.8 Incubator (Memmert, Germany) 3.2.9 pH meter (Ohaus, starter3100, USA) 3.2.10 Spectrophotometer (Thermo Spectronic, GENESYS 20, USA) 3.2.11 Vortex mixer (Gemmy, VM-300, Taiwan) 3.2.12 Water bath (Julabo, TW20, Germany) 3.2.13 Microplate reader 3.2.14 HPLC (Agitent Technologies 1200 series) 3.2.15 Column C18 (150 × 4.6 mm.) 3.2.16 Agarose gel Electrophoresis 15

3.2.17 Gel drog 3.2.18 Mini MJ PCR 3.2.19 Centrifuge 3.2.20 ตูแ้ ช่แขง็ -20 ◦C (Sanyo) 3.3 สารเคมี 3.3.1 Acetic acid (AR grad, Sigma) 3.3.2 Activated charcoal decolorizing (Sigma-aldrich) 3.3.3 Bromocresol purple (Sigma-aldrich) 3.3.4 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) (Sigma-aldrich) 3.3.5 Ethanol 99.9% (Labsacn) 3.3.6 Fehling’s solution 3.3.7 3 % Hydrogen peroxide solution 3.3.8 Kovac' s oxidase reagent 3.3.9 Phenopthalene solution 3.3.10 ชุดยอ้ มสีแกรม 3.3.11 สารละลาย 1.0 N NaOH 3.3.12 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (Merck) 3.3.13 2,2-diphenyl-1 picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma) 3.3.14 Sodium carbonate anhydrous (Na2CO3) (Labal chemie) 3.3.15 Gallic acid monohydrate (Sigma) 3.3.16 Calcium carbonate (Labscan) 3.3.17 Methanol 99.9 % (Labscan) 3.3.18 Deionized water (Labscan) 3.3.19 D-saccharic acid-1,4-lactone (Sigma) 3.3.20 Potassium dihydrogen phosphate KH2PO4 3.3.21 Gluconic acid (AR, Labscan) 16

3.3.22 Glucuronic acid (AR, Labscan) 3.3.23 L-ascorbic acid (AR ,Lobal chemie) 3.3.24 Succinic acid (AR, Labscan) 3.3.25 สารละลาย 1.0 N HCl 3.3.26 TE beffer pH 8 3.3.27 10% SDS 3.3.28 Proteinase K 3.3.29 5M NaCl 3.3.30 สารละลาย CTAB 3.3.31 Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol 25:24:1 3.3.32 Isopropanol 3.3.33 Ethanol (Labscan) 3.3.34 RNase A 3.3.35 Phenol chloroform 3.3.36 Cycloheximide (Sigma) 3.4 อาหารเลยี้ งเชื้อ (ภาคผนวก ข) 3.4.1 Glucose yeast calcium carbonate agar (GYCA) 3.4.2 Histrin and Schramm (HS medium) 3.5 วตั ถุดิบสาหรับการเตรียมชา 3.5.1 ชาเขียว (อเมซ่ิง ที) 3.5.2 น้าตาลทราย (มิตรผล) 3.6 เชื้อจุลนิ ทรีย์ 3.6.1 Gluconacetobacter hansenii BCC 33378 17

3.7 ตวั อย่างทใี่ ช้ในการคัดแยกเชื้อแบคทเี รียกรดอะซิตกิ ตวั อยา่ งท่ีใชใ้ นการคดั แยกเช้ือจุลินทรีย์ ประกอบดว้ ย 2 แหล่ง คือ หวั เช้ือจุลินทรียค์ อมบูชา จากโรงงานและน้าผลไม้ สมุนไพรหมกั (fermented fruit juices) จากจงั หวดั ระนอง จงั หวดั ชุมพรและ จงั หวดั เชียงใหม่ จานวน 35 ตวั อยา่ ง ประกอบดว้ ยน้าผลไมห้ มกั ลูกจนั ทน์ เสาวรส ระกา ตะลิงปลิง เปลือกกลว้ ยหอม ขนุน มะกรูด มะขามป้อม น้าข้ีเถา้ ผสมเปลือกทุเรียน มงั คุด สับปะรด ละมุด สมอ ลูกจาก ตะไคร้ มะม่วงหิมพานต์ ลูกยอ มะขามป้อม บอระเพ็ด กล้วยผสมมะเขือเทศ ผลไม้รวม มะเฟื อง มะม่วงหาวมะนาวโห่ วา่ นชกั มดลูก ลิ้นจี่ ลาไย ขมิ้น ข่า กระชาย กลว้ ยน้าวา้ มะนาว อญั ชนั และรางจืด ตัวอย่างน้าหมกั มีค่าความเป็ นกรดด่างระหว่าง 2.18-4.19 ยกเวน้ ตวั อย่างน้าข้ีเถ้าผสม เปลือกทุเรียนท่ีมีค่าความเป็นกรดด่างเท่ากบั 12.91 ดงั แสดงในตาราง 3.1 ตาราง 3.1 ค่าความเป็นกรดด่าง ระยะเวลาการหมกั การสร้างเซลลูโลส และแหล่งที่มาของตวั อยา่ งน้า ผลไม้ สมุนไพรหมกั และหวั เช้ือคอมบูชา รหสั /ตัวอย่าง ค่าความเป็ นกรด-ด่าง ระยะเวลาการหมัก การเกดิ (เดือน) เซลลูโลส จังหวดั เชียงใหม่ นา้ ผลไม้หมกั 3.46 9 - 2.77 13 + NC 1 : เสาวรส 2.47 13 + NC 3 : มะขามป้อม 3.42 12 + NC 4 : มะเฟื อง 2.83 14 + NC 5 : ลิ้นจ่ี NC 7: กลว้ ยน้าวา้ 2.69 1 + นา้ สมุนไพรหมัก 3.08 9 + NC 2: มะเขือเทศ 2.97 9 + NC 6 : ขิง 3.94 12 - NC 8 : มะนาว 2.28 1 + NC 9: บอระเพด็ K 1 : หวั เช้ือคอมบูชา 2.81 13 + จังหวดั ชุมพร นา้ ผลไม้หมัก SC 3 : สมอไทย 18

ตาราง 3.1 (ต่อ) ค่าความเป็ นกรด-ด่าง ระยะเวลาการหมกั การเกิด (เดือน) เซลลูโลส รหสั /ตวั อยา่ ง 3.10 12 4.00 12 + SC 4 : สับปะรด 4.13 11 + SC 5 : ลาไย 4.11 29 - SC 6 : มะม่วงหาวมะนาวโห่ 3.04 24 - SC 10 : ผสม + SC 11 : ผลไมร้ วม 12.91 10 นา้ สมุนไพรหมกั - SC 1 : น้าข้ีเถา้ ผสมเปลือก 4.19 13 3.35 9 + ทุเรียน 3.11 9 + SC 2 : ขมิน้ 2.98 13 + SC 7 : ข่า 2.80 36 + SC 8 : กระชายดา - SC 9 : ดอกอญั ชนั 3.26 28 SC 12 : สมุนไพรรวม 2.76 9 + จังหวดั ระนอง 2.57 7 + นา้ ผลไม้หมกั 3.25 11 + SR 1 : ลูกจาก 2.45 32 + SR 3 : มงั คุด 3.04 13 + SR 4 : มะขามป้อม 2.81 13 + SR 7 : ระกา + SR 9 : ทบั ทิม 2.18 2 SR 11 ละมุด 2.65 12 - SR 12 สมอไทย 3.00 12 - นา้ สมุนไพรหมัก 2.20 29 + SR 2 : มะขามแขก + SR 5 : มะกรูด SR 6 : ลูกจนั ทนเ์ ทศ SR 8 : เปลือกกลว้ ยหอม 19

ตาราง 3.1 (ต่อ) คา่ ความเป็นกรด-ด่าง ระยะเวลาการหมกั การเกิด (เดือน) เซลลูโลส รหสั /ตวั อยา่ ง 2.43 29 3.82 12 + SR 10 ตะลิงปลิง 2.77 13 - SR 13 รางจืด + SR 14 ลูกยอ 3.8 วธิ ีการวจิ ัย 3.8.1 การตรวจนับปริมาณเชื้อจุลนิ ทรีย์ท้งั หมดจากตวั อย่าง 1) นาตัวอย่างหัวเช้ือจุลินทรีย์คอมบูชาและน้ าผลไม้ สมุนไพรหมัก (ตาราง 3.1) ตวั อย่างละ 10 ml ทาการเจือจางและเกล่ียลงบนอาหารแข็ง Histrin Schramm (HS) และอาหารแข็ง Glucose yeast calcium carbonate (GYC) นาไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั 2) นบั จานวนโคโลนีท่ีสามารถเจริญบนอาหารแขง็ ท้งั สองชนิดน้ี 3.8.2 การคัดแยกเชื้อแบคทเี รียกรดอะซิติก (Kersters et al., 2006) 1) นาตวั อย่างหัวเช้ือคอมบูชาและน้าผลไม้ สมุนไพรหมกั ตวั อยา่ งละ 10 ml เล้ียงใน อาหารเหลว HS ท่ีมีการเติมความเขม้ ขน้ 50 ppm ของ cycloheximide 90 ml นาไปบ่มที่อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั 2) ทาการคดั เลือกตวั อยา่ งที่มีการสร้างแผน่ วนุ้ บนผิวหนา้ อาหารเหลว HS นาตวั อยา่ งที่ มีการสร้างแผ่นวุน้ ทาการเจือจางและเกลี่ยลงบนอาหารแข็ง GYC และอาหารแข็ง HS จากน้นั นาไป บม่ ท่ีอุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั 3) นับจานวนโคโลนีท่ีสามารถเจริญบนอาหารแข็งท้ังสองชนิดน้ีได้ โดยทาการ ตรวจสอบภายใตก้ ลอ้ งสเตอริโอ ทาการคดั เลือกโคโลนีท่ีมีสีขาวขุ่น ผวิ หนา้ และขอบมีลกั ษณะขรุขะ และทาการแยกเช้ือบริสุทธ์ิแตล่ ะไอโซเลทบนอาหารแขง็ GYC และอาหารแขง็ HS จากน้นั นาไปบม่ ท่ี อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั และนาไปทาการเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4°C 20

3.8.3 การทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี (Kersters et al., 2006) คดั เลือกเช้ือ Gluconacetobacter sp. โดยการทดสอบคุณสมบตั ิทางชีวเคมีดงั ต่อไปน้ี 1) การทดสอบการเกิดปฏิกิริยา overoxidation โดยเพาะเล้ียงแบคทีเรียลงบนอาหารแข็ง bromocresol green ethanol ทาการขีดเช้ือจุลินทรีย์ให้เป็ นวงกลมมีขนาดเส้นผ่านศูนยก์ ลาง 1 cm บริเวณตรงกลางของจานอาหารเล้ียงเช้ือ นาไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 30°C เป็ นเวลา 14 วนั วดั ขนาดเส้นผา่ น ศูนยก์ ลางบริเวณท่ีอาหารเปลี่ยนสีจากเขียวเป็ นเหลืองภาย ในระยะเวลา 24 ชว่ั โมง และสังเกตการ เปลี่ยนสี ของอาหารภายในระยะเวลา 14 วนั โดยแบคทีเรียจีนัส Gluconacetobacter ให้ผลบวก สามารถเปลี่ยนสีอาหารจากสีเขียวเป็นเหลืองและเปล่ียนสีกลบั เป็นสีเขียวไดอ้ ีกคร้ัง 2) การทดสอบการสร้างเอนไซม์ catalase โดยป้ายเช้ือลงบนสไลด์ จากน้ันหยด ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ความเขม้ ขน้ 3% ลงบนสไลด์ เข่ียเช้ือจุลินทรียใ์ ห้ผสมกนั สังเกตการเกิด ฟองก๊าซ ถา้ หากเกิดฟองก๊าซแสดงวา่ ใหผ้ ลเป็ นบวก และไม่เกิดฟองก๊าซใหผ้ ลเป็นลบ โดยแบคทีเรีย จีนสั Gluconacetobacter จะใหผ้ ลบวก 3) การทดสอบการสร้างเอนไซม์ oxidase โดยหยด Kovac' s oxidase reagent ลงบน กระดาษกรอง และทาการป้ายเช้ือจุลินทรียล์ งบนกระดาษกรองท่ีหยดสาร Kovac' s oxidase บนั ทึกผล โดยการตรวจดูถา้ หากมีการเกิดสีน้าเงินข้ึนให้ผลเป็ นบวก ถา้ หากไม่เกิดสีน้าเงินให้ผลเป็ นลบ โดย แบคทีเรียจีนสั Gluconacetobacter จะใหผ้ ลลบ 4) การทดสอบการสร้างแผน่ วุน้ โดยทดสอบในหลอดทดลองที่มีอาหารเหลว HS บ่มท่ี อุณหภูมิ 30°C เป็ นเวลา 3-7 วนั บนั ทึกผลโดยการสังเกตการสร้างแผน่ วนุ้ บนผวิ หนา้ อาหารเหลว HS ซ่ึงแบคทีเรียจีนสั Gluconacetobacter ใหผ้ ลบวก สามารถสร้างแผน่ วนุ้ บริเวณผวิ อาหารเหลว HS 3.8.4 การเตรียมนา้ ชาเขยี วสาหรับการหมกั คอมบูชา 1) ตม้ น้าให้เดือดเติมชาเขียว 1% และทาการตม้ เป็ นเวลา 15 นาที จากน้นั นาไปกรองดว้ ย ผา้ ขาวบางท่ีปราศจากเช้ือ 2) ตม้ น้าเช่ือมที่มีน้าตาลซูโครส ความเขม้ ขน้ 10% ทาการตม้ 10 เปอร์เซ็นต์ และเทน้า ชาตม้ ผสมใหเ้ ขา้ กนั กบั น้าเช่ือม และต้งั ใหค้ วามร้อนอีกคร้ังหน่ึง 3) ทาการเทน้าชาที่ผสมน้าเชื่อม ใส่ลงในขวดปากกวา้ งท่ีปราศจากเช้ือจุลินทรีย์ และทา การต้งั ทิง้ พกั ไวใ้ หเ้ ยน็ ที่อุณหภูมิหอ้ ง เพื่อใชใ้ นการหมกั ตอ่ ไป 21

3.8.5 การทดสอบประสิทธิภาพการหมักคอมบูชาเบื้องต้นของแบคทีเรียแต่ละไอโซเลท (Malbasa et al., 2011) 1) นาเช้ือจุลินทรียท์ ่ีผา่ นการทดสอบคุณสมบตั ิทางชีวเคมีในข้นั ตน้ เล้ียงในอาหารเหลว HS 5 มิลลิลิตร นาไปบม่ ท่ีอุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั 2) ทาการปรับปริมาณเช้ือจุลินทรียใ์ ห้ได้ความขุ่นเทียบกับสารละลายมาตรฐาน 0.5 McFarland จากน้ันทาการถ่ายเช้ือจุลินทรียป์ ริมาณ 0.5 ml ในน้าชาเขียว จานวน 5 ml จากน้นั นาไป บ่มท่ีอุณหภูมิ เป็ นเวลา 7 วนั โดยใช้ G. hansenii เป็ นเช้ือมาตรฐาน และทาการวิเคราะห์ปริมาณกรด ท้งั หมดดว้ ยการไทเตรทกบั สารละลาย 0.1 M โซเดียมไฮดรอกไซด์ โดยใชฟ้ ี นอล์ฟทาลีนเป็ นอินดิเค เตอร์ 3.8.6 การเตรียมหวั เชื้อคอมบูชา (ดดั แปลงจาก Yang et al., 2009) 1) นาไอโซเลทที่ระบุวา่ เป็ น Gluconacetobacter sp. เล้ียงในอาหารเหลว HS 50 ml บ่มท่ี อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั 2) ทาการป่ันเหวี่ยงท่ีความเร็ว 6000 รอบต่อนาที ท่ีอุณหภูมิ 4°C เป็ นเวลา 20 นาที ถ่าย ตะกอนเซลลล์ งในน้าชาเขียวที่ปราศจากเช้ือ นาไปบม่ ที่อุณหภูมิหอ้ งเป็นเวลา 7 วนั 5) ทาการเก็บตวั อย่าง เจือจางและเกลี่ยเช้ือจุลินทรียล์ งบนอาหารแข็ง HS โดยทาการ ตรวจนบั ปริมาณเช้ือจุลินทรียใ์ ห้ได้เท่ากบั 7 logCFU/ml เน่ืองจากผลการทดลองเพาะเล้ียงในน้าชา เขียวเพียงชนิดเดียว พบว่าแบคทีเรียท้งั 8 ไอโซเลท มีอตั ราการเจริญในน้าชาเขียวได้น้อยกว่า 7 logCFU/ml ดงั น้นั จึงมีการศึกษาและเติมสารท่ีเหมาะสมแก่การเจริญของเช้ือลงไปในน้าชาเขียว โดย ทาการเปรียบเทียบการเจริญในน้าชาเขียว 3 สูตร ดังน้ี 1) น้าชาเขียว 2) น้าชาเขียวที่เติม 0.2% เอ ทานอล และ 3) น้ าชาเขียวท่ีเติม 0.2% เอทานอลและ 0.05% แอมโมเนียมซัลเฟต นาไปบ่มท่ี อุณหภูมิหอ้ ง เป็นเวลา 7 วนั ทาการเกบ็ ตวั อยา่ ง จากน้นั เจือจางและเกลี่ยเช้ือจุลินทรียล์ งบนอาหารแข็ง HS นาไปบม่ ท่ีอุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั ทาการตรวจนบั จานวนโคโลนีใหไ้ ดป้ ริมาณเช้ือจุลินทรีย์ เทา่ กบั 7 logCFU/ml เพอ่ื หาระยะเวลาที่เหมาะสมในการเตรียมหวั เช้ือคอมบูชาสาหรับการหมกั 22

3.8.7 การศึกษาการหมกั คอมบูชาโดยเชื้อจุลนิ ทรีย์บริสุทธ์ิ 3.8.7.1 การศึกษาระดบั ความเข้มข้นของเอทานอลต่อการหมกั คอมบูชา 1) เล้ียงเช้ือจุลินทรียใ์ นอาหารเหลว HS นาไปบ่มที่อุณหภูมิ 30°C เป็ นเวลา 3 วนั และ นาไปเตรียมหวั เช้ือคอมบูชาใหไ้ ดป้ ริมาณเช้ือจุลินทรียเ์ ทา่ กบั 7 logCFU/ml 2) ทาการเตรียมน้าชาเขียวและถ่ายหวั เช้ือจุลินทรียค์ อมบูชาปริมาณ 15% ลงไปในน้าชา เขียว ท่ีมีเอทานอล 0,1, 3 และ 5% (v/v) นาไปบ่มที่อุณหภูมิหอ้ ง เป็นเวลา 15 วนั 3) เก็บตวั อยา่ งเพื่อตรวจวดั ค่าความเป็ นกรดด่าง ตรวจวดั ปริมาณแอลกอฮอลด์ ว้ ยเคร่ือง ebulliometer ตรวจหาปริมาณจุลินทรียท์ ้งั หมด โดยวิธีเจือจำงและเกล่ียลงบนอำหำรแข็ง HS และ ตรวจวเิ คราะห์สารตา้ นอนุมูลอิสระดว้ ยสาร DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate) ในทุก 2 วนั ของการหมกั คอมบูชา (Jayabalan et al., 2008) 3.8.7.2 ศึกษาการหมัก โดยใช้หัวเชื้อจุลินทรีย์บริสุทธ์ิและหัวเชื้อจุลนิ ทรีย์คอมบูชาแบบ ผสม ในอตั ราส่วน 1:1 1) เล้ียงเช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิในอาหารเหลว HS นาไปบ่มที่อุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั นาไปเตรียมหวั เช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิและทาการเตรียมหวั เช้ือจุลินทรียแ์ บบผสม 2) ทาการเตรียมน้าชาเขียวและถ่ายหวั เช้ือจุลินทรียบ์ ริสุทธ์ิ 5% และหวั เช้ือจุลินทรียแ์ บบ ผสม 5% ลงไปในน้าชาเขียว นาไปบม่ ท่ีอุณหภูมิหอ้ ง เป็นเวลา 15 วนั 3) เก็บตวั อยา่ งเพื่อตรวจวดั ค่าความเป็ นกรดด่าง ตรวจวดั ปริมาณแอลกอฮอลด์ ว้ ยเครื่อง ebuliometer และตรวจหาปริมาณจุลินทรียท์ ้งั หมด โดยวธิ ีเจือจำงและเกล่ียลงบนอำหำรแข็ง HS และ ตรวจวเิ คราะห์สารตา้ นอนุมูลอิสระดว้ ยสาร DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate) ในทุก 2 วนั ของการหมกั (Jayabalan et al., 2008) 3.8.8 การวเิ คราะห์ชนิดของสารประกอบอนิ ทรีย์ในคอมบูชาเมื่อสิ้นสุดกระบวนการหมักด้วย เท คนิ ค High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Jayabalan et al., 2007 ; Chu and Chen, 2006) การวเิ คราะห์สารประกอบอินทรียใ์ นคอมบูชา ซ่ึงประกอบดว้ ย กรดกลูโคนิค กรดกลูคูโรนิค กรดแอสคอร์บิค กรดออะซิติก กรดซกั ซินิคและน้าตาล D-saccharic acid-1,4-lactone (DSL) 23

3.7.8.1 การเตรียมสภาวะเคร่ือง HPLC กาหนดสภาวะของเคร่ือง HPLC ที่ใชใ้ นการวเิ คราะห์ ดงั น้ี type columm : C18 (150 × 4.6 mm.) mobile phase : 20 mM KH2PO4 detector UV : 210 nm flow rate : 0.8 ml/min injection volumn : 20 µl run time standard : 10 min run time sample : 60 min เปิ ดเครื่อง ลา้ งทาความสะอาดเครื่องดว้ ยน้าปราศจากไอออน (Deionized Water) เป็ นเวลา 1 ชว่ั โมง ตามดว้ ยสารละลาย mobile phase เป็ นเวลา 30 นาที หรือรอจน base line เรียบเป็ นเส้นตรง จึง ทาการฉีดสารละลายมาตรฐานและตวั อยา่ งเพือ่ ทาการวเิ คราะห์เขา้ เคร่ือง HPLC (ภาคผนวก ฉ) 3.8.8.2 การเตรียมตัวอย่างคอมบูชา เพ่ือวเิ คราะห์ด้วยเครื่อง HPLC 1) นาตวั อยา่ งคอมบูชาท่ีมีการหมกั 2 แบบ คือ การหมกั แบบเติม 3% เอทานอลและ การหมกั แบบผสม ทาการปั่นเหว่ียงที่ความเร็ว 6,000 รอบต่อนาที ท่ีอุณหภูมิห้องเป็ นเวลา 10 นาที ถ่ายของเหลวส่วนใสบริเวณดา้ นบนและกรองผา่ นดว้ ย 0.45 µ 2) นาตวั อยา่ งคอมบูชาความเขม้ ขน้ 0.01 ที่เจือจางดว้ ยน้าปราศจากไอออน 3) ฉีดตวั อย่างคอมบูชาปริมาตร 20 µl เขา้ เครื่อง HPLC เป็ นเวลานานประมาณ 60 นาที และนาพ้ืนที่ใต้กราฟ คานวณปริมาณสารประกอบของคอมบูชาโดยเทียบกับสารละลาย มาตรฐาน 3.8.9 การบ่งชี้ชนิดของเชื้อจุลนิ ทรีย์แบคทเี รียกรดอะซิติกบริสุทธ์ิทค่ี ดั แยกได้ด้วยวธิ ีการทาง ชีวโมเลกลุ (Identification of Microbial by DNA analysis) (Sambrook and Russell, 2001) 3.8.9.1 วธิ ีการสกดั โครโมโซมดีเอน็ เอจากแบคทเี รียกรดอะซิติก 1) เล้ียงเช้ือแบคทีเรียกรดอะซิติกบริสุทธ์ิในอาหารเหลว HS นาไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 3 วนั ทำกำรถ่ำยแบคทีเรียกรดอะซิติกใส่ลงหลอดไมโครเซนติฟิ วทิวขนำด 1,500 µl 2) นาไปปั่นเหวี่ยงท่ีความเร็ว 5,000-7,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 4°C เป็ นเวลา 5 นาที และเทส่วนใสบริเวณดา้ นบน (supernatant) ทิ้งและเก็บส่วนตะกอนเซลล์ 24

3) ละลายตะกอนเซลล์ดว้ ย 567 TE beffer pH 8 ผสมให้เขา้ กนั จากน้นั เติม 30 µl ของ 10% SDS และ 3 µl ของ 20 mg/ml proteinase K และเขยา่ ผสมใหเ้ ขา้ กนั (gently mix) 4) นาไปบ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็ นเวลา 1 ชัว่ โมง จากน้นั เติม 5M NaCl ปริมาตร 100 µl และผสมใหเ้ ขา้ กนั (inverting the tube) 5) เติม 80 µl ของสารละลาย CTAB ผสมให้เขา้ กนั และนาไปบ่มที่อุณหภูมิ 65°C เป็ น เวลา 10 นาที 6) เติม equal volume ของสาร Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol 25:24:1 ผสมให้ เขา้ กนั 7) นาไปปั่นเหว่ียงท่ีความเร็ว 12,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิหอ้ ง เป็ นเวลา 10 นาที ถ่าย ส่วนใสบริเวณบนสุดใส่หลอดใหม่ 8) เติม isopropanol 0.6 เท่า และผสมให้เขา้ กนั (gently mix) นาไปบ่มที่อุณหภูมิ -20°C เป็ นเวลา 1 ชวั่ โมง และนาไปปั่นเหว่ียงท่ีความเร็ว 12,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 4°C เป็ นเวลา 10 นาที 9) ถ่ายของเหลวส่วนใสดา้ นบนทิ้ง เติม 1 ml ของ 70% เอทานอล และนาไปปั่นเหวี่ยงท่ี ความเร็ว 12,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 4°C เป็ นเวลา 10 นาที ดูดส่วนใสดา้ นบนทิ้งและเก็บส่วน ตะกอนดีเอน็ เอไว้ 10) นาตะกอนดีเอน็ เอผ่งึ ให้แหง้ (dry) ที่อุณหภูมิหอ้ ง เพ่อื นาส่วนเอทานอลออกใหห้ มด จากตะกอนดีเอน็ เอ และเติม 20 µl ของ 1X TE buffer pH 8 เพือ่ ละลายตะกอนดีเอ็นเอ 11) เติม RNase A 2 µl เพ่ือยอ่ ยสลาย RNA บ่มท่ีอุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 ชวั่ โมง 12) เติม equal volume phenol chloroform Isoamyl อตั ราส่วน 25:24:1 นาไปป่ันเหว่ยี งที่ ความเร็ว 12,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิหอ้ งเป็นเวลา 10 นาที และดูดส่วนใสบริเวณดา้ นบนทิง้ 13) เติม isopropanol 0.6 เท่า ผสมให้เขา้ กนั (gently mix) นาไปบ่มที่อุณหภูมิ -20°C เป็ น เวลา 1 ชวั่ โมง และนาไปป่ันเหวย่ี งที่ความเร็ว 12,000 รอบตอ่ นาที ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 10 นาที 14) เติม 1 ml ของ 70% เอทานอล นาไปปั่นเหวี่ยงท่ีความเร็ว 12,000 รอบต่อนาที ท่ี อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 10 นาที 15) ผ่ึงตะกอนดีเอ็นเอให้แห้ง (dry) ท่ีอุณหภูมิห้อง เพ่ือกาจดั ส่วนเอทานอลออกจาก ส่วนตะกอนดีเอน็ เอ 16) เติม 20 µl ของ 1X TE buffer pH 8 เพ่ือละลายตะกอนดีเอน็ เอ และนาดีเอ็นเอไปเก็บ ที่ 4°C เพือ่ เกบ็ ไวใ้ ชศ้ ึกษำตอ่ ไป 25

3.8.9.2 การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยเทคนิค Polymerase chain reaction (PCR) (Jayabalan et al., 2007 ; Chu and Chen, 2006) โดยใชไ้ พรเมอร์ที่จาเพาะกบั แบคทีเรียกรดอะซิติกในส่วนของ 16S rDNA Ac1 : GCTGGCGGCATGCTTAACACAT Ac2 : AACCACATGCTCCACCGCTTG PCR Reaction Deionized H2O ความเขม้ ขน้ 1x (µl) 25mM MgCl 16.85 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 1.5 mM 1.5 10mM dNTP 3.0% 0.75 10X Taq Buffer 0.2 mM 0.5 10µM Ac1 (forward primer) 1x 2.5 10µM Ac2 (reverse primer) 0.3 µM 0.75 Taq Polymerase (5U/µl) 0.3 µM 0.75 DNA template 0.08 U 0.4 1 PCR condition Initial Denaturation 94°C 2 นาที 30 รอบ Denaturation 98°C 10 วนิ าที Annealing 62°C 30 วนิ าที Extension 68°C 30 วนิ าที Final Extension 68°C 30 วนิ าที หยดุ ปฏิกิริยาท่ีอุณหภูมิ 4ºC ตรวจวเิ คราะห์ผล PCR product โดยวธิ ี Agarose Gel Electrophoresis 26

บทที่ 4 ผลการวจิ ยั 4.1 การตรวจนับปริมาณเชื้อจุลนิ ทรีย์ท้งั หมดจากตัวอย่าง การตรวจนบั ปริมาณเช้ือจุลินทรียท์ ้งั หมดจากน้าหมกั ผลไมแ้ ละหวั เช้ือคอมบูชาท้งั หมด 36 ตวั อยา่ ง โดยทาการเจือจางและเกลี่ยลงบนอาหารแขง็ GYC และ HS บ่มที่อุณหภูมิ 30°C เป็ นเวลา 3 วนั จากตวั อยา่ งท้งั หมด 36 ตวั อยา่ ง พบตวั อยา่ งเพียง 21 ตวั อยา่ ง ไดแ้ ก่น้าหมกั ผลไม้ ลูกจาก มงั คุด มะขามป้อม ลูกจนั ทน์เทศ ระกา เปลือกกลว้ ยหอม ตะลิงปลิง ละมุด ลูกยอ มะเฟื อง สมอ สับปะรด ขมิ้น กลว้ ยน้าวา้ กระชาย มะนาว อญั ชนั ผลไมร้ วม สมุนไพรรวม และหวั เช้ือคอมบูชา (ภาพ 4.1) ท่ี พบการเจริญเติบโตของเช้ือจุลินทรีย์บนอาหารแข็ง GYC อยู่ระหว่าง 6.08-8.67 logCFU/ml บน อาหาร HS อยู่ระหวา่ ง 6.85-9.00 logCFU/ml ซ่ึงจากการนับจานวนโคโลนีบนอาหารท้งั สองชนิด ดงั แสดงในตาราง 4.1 พบว่าการเจริญเติบโตของเช้ือจุลินทรียใ์ นตวั อยา่ งน้าหมกั สับปะรดเท่ากบั 6.08 logCFU/ml บนอาหารแข็ง GYC และในตวั อย่างน้าหมกั กล้วยน้าวา้ เท่ากบั 9.00 logCFU/ml บนอาหารแขง็ HS โดยทุกตวั อยา่ งพบการเจริญบนอาหารแขง็ HS มากกวา่ บนอาหารแขง็ GYC (ก) (ข) (ค) (ง) (จ) (ฉ) ภาพ 4.1 ตวั อย่างน้าผลไม้และสมุนไพรหมักท่ีพบการเจริญของเช้ือจุลินทรีย์ (ก): ลูกยอ, (ข): ตะลิงปลิง, (ค): ลูกจนั ทน์เทศ, (ง): ลูกจาก, (จ): มงั คุด และ (ฉ): มะนาว 27

4.2 การคัดแยกแบคทเี รียกรดอะซิตกิ การคดั แยกแบคทีเรียกรดอะซิติกจากน้าผลไม้ สมุนไพรหมกั และหัวเช้ือคอมบูชา โดยนา ตวั อยา่ งน้าหมกั ผลไมต้ วั อยา่ งละ 10 ml เล้ียงในอาหารเหลว HS บ่มท่ีอุณหภูมิ 30°C เป็ นเวลา 3 วนั ทาการคดั เลือกตวั อยา่ งที่มีการสร้างเซลลูโลสบริเวณผวิ หนา้ อาหาร (ภาพ 4.2) และนาตวั อยา่ งทาการ เจือจางและเกล่ียลงบนอาหารแข็ง HS และ GYC บ่มที่อุณหภูมิ 30°C เป็ นเวลา 3 วนั เม่ือนาไป ตรวจสอบภายใตก้ ล้องสเตอริโอ เพื่อคดั เลือกโคโลนีที่มีความใกล้เคียงกบั เช้ือจุลินทรียใ์ นกลุ่ม Gluconacetobacter sp. ซ่ึงมีลักษณะสีขาวขุ่น ผิวหน้าและขอบขรุขระ และมีการสร้างลักษณะ เหมือนเซลลูโลสบนผิวหน้าอาหารแข็ง HS และมีการสร้างวงใสและมีลกั ษณะสีขาวข่นุ บนอาหาร แขง็ GYC สามารถคดั เลือกไดท้ ้งั หมด 425 ไอโซเลท โดยคดั แยกไดส้ ูงสุดจากตวั อยา่ งมะขามป้อม ระกา ผกั และผลไมร้ วม และละมุด จานวน 40, 30, 30 และ 29 ไอโซเลท ตามลาดบั 4.3 การทดสอบคุณสมบัตทิ างชีวเคมี ในการทดสอบคุณสมบตั ิชีวเคมีของแบคทีเรียท้งั หมด 425 ไอโซเลท พบวา่ 114 ไอโซเลท มีการสร้างเอนไซม์ catalase ไม่มีการสร้างเอนไซม์ oxidase เม่ือนามายอ้ มสีแกรมพบว่า เป็ น แบคทีเรียแกรมลบ รูปแท่ง (ก) (ข) (ค) (ง) ภาพ 4.2 เซลลูโลสบริเวณผิวหน้าอาหารเหลว HS ของบางไอโซเลท (ก): ไอโซเลท N3, (ข): ไอโซ เลท M37, (ค): ไอโซเลท T100 และ (ง): ไอโซเลท D21 จากน้นั จึงนามาทดสอบการเกิด overoxidation โดยถา้ หากเกิดปฏิกิริยา overoxidation แสดง ว่าเป็ นแบคทีเรียในจีนัส Gluconacetobacter คือ ปฏิกิริยาท่ีกรดอะซิติกถูกออกซิไดซ์ไปเป็ น คาร์บอนไดออกไซด์และน้ า จากการทดสอบพบ แบคทีเรียจานวน 114 ไอโซเลท สามารถ เกิดปฏิ กิริ ยา overoxidation บนอาหาร Carr medium โดยแบคทีเรี ยจีนัส Gluconacetobacter 28

สามารถเปลี่ยนอาหารจากสีเขียวไปเป็นสีเหลือง แลว้ กลบั มาเป็ นสีเขียวอีกคร้ัง ภายในระยะเวลา 14 วนั แต่แบคทีเรียท้งั 114 ไอโซเลท สามารถเปล่ียนกลบั ไปเป็นสีเขียวไดอ้ ีกดงั แสดงในภาพ 4.3 เมื่อนาแบคทีเรียท้งั 114 ไอโซเลท ทดสอบการสร้างเซลลูโลสบนอาหารเหลว HS เน่ืองจาก แบคทีเรียในจีนัส Gluconacetobacter มีความสามารถสร้างเซลลูโลสหรือแผ่นวุน้ บนหน้าของ อาหารเหลวได้ ซ่ึงพบแบคทีเรียจานวน 93 ไอโซเลท โดยตวั อย่างน้าหมกั มะขามป้อม, ละมุด, ลูก จาก และตะลิงปิ ง พบแบคทีเรียสามารถสร้างเซลลูโลสบนผิวหนา้ อาหารเหลว HS เท่ากบั 13, 9, 7 และ 6 ไอโซเลท ตามลาดบั ดงั แสดงตวั อยา่ งในตาราง 4.1 และภาพ 4.4 ดงั แสดงในตาราง 4.1 (ก) (ข) (ค) (ง) ภาพ 4.3 การทดสอบคุณสมบตั ิ Overoxidation บนอาหาร carr medium ของไอโซเลท B44 (ก): 0 วนั , (ข): 1 วนั , (ค): 4 วนั และ (ง): 14 วนั ตาราง 4.1 การตรวจนบั ปริมาณเช้ือจุลินทรียท์ ้งั หมด และจานวนแบคทีเรียที่คดั แยกไดจ้ ากตวั อย่าง ผลไม้ สมุนไพรหมกั และหวั เช้ือคอมบูชา ตัวอย่าง: รหสั ปริมาณแบคทเี รีย (logCFU/ml) จานวนไอโซเลท จานวนไอโซเลท GYCA HSA ทส่ี ร้างวุ้น นา้ หมกั จาก กลว้ ยน้าวา้ : A 8.48±0.02 9.00±0.01 26 3 ตะลิงปลิง: B 6.84±0.06 7.48±0.03 16 6 มะขามป้อม: D 6.65±0.09 7.08±0.04 40 13 กระชาย : E 6.93±0.02 7.82±0.05 26 5 ผลไมร้ วม : F 6.83±0.03 7.04±0.01 11 6 เปลือกกลว้ ยหอม: G 6.60±0.01 7.18±0.07 26 5 มะเฟื อง : I 7.49±0.03 7.85±0.03 15 4 ระกา: J 8.29±0.03 8.47±0.03 30 2 หวั เช้ือคอมบูชา : K 7.29±0.01 7.85±0.03 23 3 29

ตาราง 4.1 (ต่อ) ปริมาณแบคทเี รีย (logCFU/ml) จานวนไอโซเลท จานวนไอโซเลท GYCA HSA ทสี่ ร้างว้นุ ตัวอย่าง: รหสั 7.46±0.05 7.63±0.02 12 3 นา้ หมกั จาก 7.01±0.04 7.81±0.01 21 6 มะนาว : L 6.73±0.01 7.12±0.08 26 7 มงั คุด : M 6.08±0.05 6.85±0.03 11 4 ลูกจาก : N 7.36±0.04 7.61±0.03 10 3 สบั ปะรด : P 7.78±0.05 8.12±0.03 29 9 ขมิน้ : R 6.64±0.02 7.019±0.05 13 4 ละมุด : S 6.23±0.08 7.41±0.01 15 1 ลูกจนั ทนเ์ ทศ : T 8.67±0.06 8.88±0.04 30 3 อญั ชนั : U 6.23±0.01 6.70±0.01 21 4 ผกั และผลไมร้ วม : V 7.36±0.08 8.11±0.09 17 2 สมอ :W ลูกยอ : Y (ก) (ข) (ค) (ง) (จ) ภาพ 4.4 ไอโซเลทท่ีสามารถสร้างเซลลูโลสบริเวณผวิ หนา้ อาหารเหลว HS (ก): ไอโซเลท M3, (ข): ไอโซเลท N6, (คM): aไอnโgซoเลsท M37, (ง): ไอโซเลท 100 และ (จ): ไอโซเลท I21 4.4 การทดสอบปรtะeสeิทnธิภาพการหมกั คอมบูชาเบือ้ งต้นของแบคทเี รียแต่ละไอโซเลท นาแบคทีเรียจานวน 93 ไอโซเลท ทดสอบประสิทธิภาพการหมกั เบ้ืองตน้ โดยเพาะเล้ียงใน น้าชาเขียว จานวน 5 ml จากน้นั นาไปบ่มท่ีอุณหภูมิ 30°C เป็นเวลา 7 วนั โดยใช้ G. hansenii เป็ นเช้ือ มาตรฐาน และทาการวเิ คราะห์ปริมาณกรดท้งั หมดดว้ ยการไทเตรทกบั สารละลาย 0.1 M โซเดียมไฮ- ดรอกไซด์ โดยใชฟ้ ี นอล์ฟทาลีนเป็ นอินดิเคเตอร์ พบแบคทีเรียจานวน 83 ไอโซเลท สามารถเจริญ 30

และสร้างกรดในน้าชาเขียว โดยผลิตกรดได้ 3.67-9.31 g/l เม่ือทาการคดั เลือกไอโซเลทท่ีใหป้ ริมาณ กรดใกล้เคียงกับ G. hansenii (8.13 g/l) พบแบคทีเรียจานวน 8 ไอโซเลท คือ N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10 และ K6 สามารถสร้างกรดได้เท่ากับ 8.46, 9.31, 8.42, 8.44, 8.77, 8.43, 8.46 และ 8.41 g/l ตามลาดบั 4.5 การเตรียมหัวเชื้อคอมบูชาโดยเชื้อจุลนิ ทรีย์บริสุทธ์ิสาหรับการหมัก จากการทดลองเตรียมหัวเช้ือคอมบูชาโดยตอ้ งให้ไดป้ ริมาณแบคทีเรียเท่ากบั 7 logCFU/ml โดยทาการเพาะเล้ียงในน้าชาเขียวเพียงอย่างเดียวและนาไปบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็ นเวลา 7 วนั พบวา่ ปริมาณแบคทีเรียกรดอะซิติก G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10 และ K6 ในวนั เริ่มต้นของการหมกั เท่ากับ 6.39, 4.66, 3.69, 3.51, 3.92, 3.84, 3.75, 3.41 และ 3.46 logCFU/ml ตามลาดบั โดยในวนั ที่ 1 ของการหมกั ไอโซเลท N3, N4, G42, G45, L10 และ K6 มี ปริมาณเพ่ิมข้ึนเป็ น 6.32, 6.14, 4.46, 4.35, 5.03 และ 4.61 logCFU/ml ตามลาดับ โดย G. hansenii, S16 และ B19 มีปริมาณลดลงเลก็ นอ้ ยเป็น 5.47, 3.46 และ 3.64 logCFU/ml ตามลาดบั เมื่อระยะเวลา การหมกั ในวนั ที่ 3 จะพบการปนเป้ื อนของเช้ือราในบริเวณผวิ หนา้ ของหัวเช้ือคอมบูชา ดงั แสดงใน ตาราง 4.2 ตาราง 4.2 ปริมาณแบคทีเรียของแตล่ ะไอโซเลทท่ีทาการเพาะเล้ียงในน้าชาเขียว ปริมาณแบคทเี รีย (logCFU/ml) ไอโซเลท ระยะเวลาการหมัก (วนั ) G. hansenii 0 12 3 N3 6.39±0.20 N4 4.66±0.36 5.47±0.31 5.68±0.14 ปนเป้ื อนเช้ือรา S16 3.69±0.21 ปนเป้ื อนเช้ือรา B19 3.51±0.24 6.32±0.07 5.75±0.72 ปนเป้ื อนเช้ือรา G42 3.92±0.20 ปนเป้ื อนเช้ือรา G45 3.84±0.22 6.14±0.35 5.28±0.48 ปนเป้ื อนเช้ือรา L10 3.75±0.24 ปนเป้ื อนเช้ือรา K6 3.41±0.49 3.46±0.41 3.35±0.32 ปนเป้ื อนเช้ือรา 3.46±0.40 ปนเป้ื อนเช้ือรา 3.64±0.18 3.57±0.33 ปนเป้ื อนเช้ือรา 4.46±0.15 5.43±1.58 4.35±0.31 4.31±0.27 5.03±0.92 4.84±0.15 4.61±0.15 4.38±0.43 31

ทาการเล้ียงแบคทีเรียแต่ละไอโซเลทในน้าชาเขียวท่ีมีการเติม 0.2% เอทานอล เพ่ือเตรียม เป็ นหัวเช้ือคอมบูชาสาหรับหมกั พบวา่ ปริมาณแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10 และ K6 ในวนั เริ่มต้นของการหมักหัวเช้ือคอมบูชาเท่ากับ 6.40, 4.47, 3.72, 3.56, 3.91, 3.95, 3.68, 3.49 และ 3.42 logCFU/ml ตามลาดบั โดยในวนั ท่ี 6 ของการหมกั G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10 และ K6 มีปริมาณเพ่ิมข้ึนเป็ น 8.44, 7.98, 8.05, 7.57, 8.29, 8.49 และ 8.52 logCFU/ml ตามลาดับ แต่ไอโซเลท N4 และ B19 ท่ีมี อตั ราการเจริญท่ีนอ้ ยเทา่ กบั 5.63 และ 7.54 logCFU/ml ตามลาดบั ซ่ึงไอโซเลท N4 และ B19 ยงั คงมี ปริมาณแบคทีเรียนอ้ ยกวา่ 7 logCFU/ml ดงั แสดงในภาพ 4.5 และตาราง 4.3 เม่ือทาการทดลองเพาะเล้ียงแบคทีเรียในน้ าชาเขียวผสม 0.2% เอทานอลและ 0.05% แอมโมเนียซัลเฟต พบว่าปริมาณแบคทีเรีย G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, G42, G45, L10 และ K6 ในวนั เร่ิมต้นของการหมกั หัวเช้ือคอมบูชาเท่ากบั 6.37, 4.51, 3.76, 3.60, 3.97, 3.41, 3.71, 3.41 และ 3.38 logCFU/ml ตามลาดบั โดยในวนั ที่ 6 ของการหมกั แบคทีเรียไอโซ เลททุกไอโซเลทมีปริมาณแบคทีเรียท่ีเพ่ิมข้ึนเท่ากบั 8.57, 8.14, 7.11, 7.69, 8.31, 7.75, 7.97, 8.13 และ7.84 logCFU/ml ซ่ึงไอโซเลท N4 และ B19 ที่ทาการเพาะเล้ียงในน้าชาผสม 0.2% เอทานอลมี ปริมาณแบคทีเรียเท่ากบั 5.63 และ 7.54 logCFU/ml ตามลาดบั แต่เม่ือทาการเพาะเล้ียงในน้าชาเขียว ผสม 0.2% เอทานอลและ 0.05% แอมโมเนียซัลเฟต มีปริมาณแบคทีเรียที่เพิ่มข้ึนเท่ากบั 7.11 และ 8.31 logCFU/ml ตามลาดบั ดงั แสดงในภาพ 4.6 และตาราง 4.4 จากการศึกษาการเตรียมอาหารเล้ียงเช้ือสาหรับเตรียมหัวเช้ือคอมบูชาเพื่อใช้สาหรับการ หมกั ของแบคทีเรียท้งั 8 ไอโซเลทเป็ นดงั น้ีคือ ไอโซเลท N3, S16, G42, G45, L10 และ K6 ใชน้ ้าชา เขียวท่ีเติม 0.2% เอทานอล และไอโซเลท N4 และ B19 เจริญไดด้ ีในที่มี 0.2% เอทานอลและ 0.05% แอมโมเนียมซลั เฟต โดยใชร้ ะยะเวลาการหมกั 6 วนั จึงจะสามารถนาไปใชเ้ ป็ นหัวเช้ือสาหรับหมกั คอมบูชา 32

ป ิรมาณแบคทีเ ีรย ้ัทงหมด (logCFU/ml) 9 8 G. hansenii N3 7 N4 6 S16 B19 5 G42 G45 4 L10 3 K6 ระยะเวลาการหมกั (วนั ) ภาพ 4.5 ปริมาณแบคทีเรียของแต่ละไอโซเลทท่ีทาการเพาะเล้ียงที่ทาการเพาะเล้ียงในน้าชาเขียว ผสม 0.2% เอทานอล ตาราง 4.3 ปริมาณแบคทีเรียของแต่ละไอโซเลทท่ีทาการเพาะเล้ียงท่ีทาการเพาะเล้ียงในน้าชาเขียว ผสม 0.2% เอทานอล ไอโซเลท 0 ปริมาณแบคทเี รีย (logCFU/ml) 7 6.40±0.02 8.47±0.01 G. hansenii 4.47±0.09 ระยะเวลาการหมัก (วนั ) 7.65±0.05 N3 3.72±0.37 6.57±0.08 N4 3.56±0.39 3456 8.09±0.07 S16 3.91±0.12 6.59±0.10 7.91±0.03 7.89±0.04 8.44±0.02 7.96±0.16 B19 3.95±0.10 6.53±0.18 7.58±0.03 7.40±0.02 7.98±0.05 7.58±0.16 G42 3.68±0.90 4.32±0.21 4.66±0.09 5.68±0.10 5.63±0.05 8.53±0.01 G45 3.49±0.03 4.58±0.15 6.00±0.00 7.71±0.07 8.05±0.02 8.34±0.00 L10 3.42±0.39 6.44±0.33 7.01±0.10 7.20±0.04 7.54±0.10 7.81±0.05 K6 5.15±0.21 7.04±0.00 7.14±0.05 7.57±0.04 6.04±0.61 6.05±0.06 7.80±0.03 8.29±0.01 6.56±0.01 7.84±0.06 7.23±0.04 8.49±0.08 5.30±0.43 6.18±0.00 6.48±0.00 8.52±0.04 33

ป ิรมาณเ ้ืชอแบค ีทเ ีรย ้ทังหมด (logCFU/ml) 10 G. hansenii 9 N3 8 N4 7 S16 6 B19 G42 5 G45 4 L10 3 K6 ระยะเวลาการหมกั (วนั ) ภาพ 4.6 ปริมาณแบคทีเรียของแต่ละไอโซเลทที่ทาการเพาะเล้ียงที่ทาการเพาะเล้ียงในน้าชาเขียว ผสม 0.2% เอทานอลและ 0.05% แอมโมเนียมซลั เฟต ตาราง 4.4 ปริมาณแบคทีเรียของแต่ละไอโซเลทท่ีทาการเพาะเล้ียงที่ทาการเพาะเล้ียงในน้าชาเขียว ผสม 0.2% เอทานอลและ 0.05% แอมโมเนียมซลั เฟต ไอโซเลท 0 ปริมาณแบคทเี รีย (logCFU/ml) 7 6.37±0.16 9.19±0.03 G. hansenii 4.51±0.13 ระยะเวลาการหมกั (วนั ) 7.98±0.04 N3 3.76±0.30 7.60±0.00 N4 3.60±0.42 3456 8.11±0.05 S16 3.97±0.15 6.72±0.16 8.19±0.03 7.78±0.03 8.57±0.04 8.76±0.00 B19 3.41±0.14 5.70±0.94 5.98±0.00 7.37±0.04 8.14±0.08 7.30±0.05 G42 3.71±0.13 4.44±0.05 4.74±0.03 6.48±0.03 7.11±0.02 8.37±0.15 G45 3.41±0.67 6.53±0.06 6.65±0.04 7.70±0.17 7.69±0.12 8.36±0.05 L10 3.38±0.44 6.03±0.06 6.45±0.01 7.54±0.15 8.31±0.11 7.92±0.06 K6 6.65±0.06 7.51±0.11 7.69±0.08 7.75±0.09 6.11±0.22 6.12±0.01 7.89±0.77 7.97±0.19 6.70±0.06 7.76±0.01 7.60±0.09 8.13±0.00 6.36±0.48 7.22±0.05 7.18±0.09 7.84±0.06 34

4.6 การศึกษาการหมกั คอมบูชาโดยเชื้อจุลนิ ทรีย์บริสุทธ์ิ 4.6.1 การศึกษาระดับความเข้มข้นของเอทานอลที่ 0, 1, 3 และ 5 % ต่อการหมักคอมบูชาของ เชื้อแต่ละไอโซเลท จากการทดลองของแบคทีเรียท้งั 6 G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ใหผ้ ลการทดลองดงั ต่อไปน้ี 4.6.1.1 ระดับความเข้มข้นของเอทานอลที่ 0 เปอร์เซ็นต์ หรือไม่เตมิ เอทานอล 4.6.1.1.1 ปริมาณแอลกอฮอล์ เม่ือเติมเอทานอลระดบั ความเขม้ ขน้ ที่ 0% โดยอาศยั G. hansenii, แบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในการหมัก พบว่า ในวนั เริ่มต้นของการหมักไม่ตรวจพบปริมาณ แอลกอฮอลใ์ นน้าชาหมกั สาหรับการหมกั แบบไม่เติมเอทานอล มีระยะเวลาการหมกั นานที่สุด 5 วนั ซ่ึงในวนั ท่ี 7 ของการหมกั จะพบการเจริญของเช้ือรา 4.6.1.1.2 ค่าความเป็ นกรด-ด่าง คา่ ความเป็นกรดด่างของการหมกั แบบไม่เติมเอทานอล โดยอาศยั G. hansenii, แบคทีเรียไอ โซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ในการหมกั พบวา่ เมื่อเริ่มตน้ กระบวนการหมกั ค่าความเป็ น กรดด่างของแต่ละไอโซเลทอยู่ระหว่าง 4.19-5.40 ในวนั ท่ี 5 ของการหมกั ดว้ ยแบคทีเรียไอโซเลท N3, N4, S16, B19, L10 และ K6 ให้ค่าความเป็ นกรดด่างท่ีลดลงจาก 4.19, 5.40, 4.35, 4.75, 4.64 และ 4.50 ตามลาดับ เป็ น 3.88, 2.77, 3.96, 5.36, 4.98 และ 4.48 ตามลาดับ ส่ วนการหมักด้วย แบคทีเรีย G. hansenii ในวนั ที่ 5 ของการหมกั ให้ค่าความเป็ นกรดด่างท่ีลดลงจาก 4.76 เป็ น 3.99 สาหรับการหมกั คอมบูชาแบบไม่เติมเอทานอลมีระยะเวลาการหมกั ท่ีสุดสูง 5 วนั ซ่ึงในวนั ที่ 7 ของ การหมกั จะพบการเจริญของเช้ือรา ดงั แสดงในภาพ 4.7 35