บทที่ 3

บทที่ 3 วิธกี ารดำเนินงานวจิ ัย งานวจิ ัยนี้ไดเ้ ลอื กศึกษาพืชสมุนไพรพ้ืนบ้านซึ่งมีกล่ินเป็นเอกลักษณ์ท่ีพบในเขตพ้ืนท่ีจังหวัดจันทบุรี จำนวน 4 ชนดิ ไดแ้ ก่ กระวาน เรว่ ลูกจัน และพรกิ ไทย ทำการศึกษาฤทธิต์ ้านอนุมลู อิสระจากพืชที่มีกลิ่น ซึ่งเป็นเอกลักษณ์ด้วยวิธี DPPH (2,2’-Azinobis-[3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid]), ABTS (2,2- Diphenyl-1-picrylhydrazyl) และ FRAP (Ferric Iron Reducing Antioxidant Power) จากสารสกัดหยาบ ทีไ่ ด้จากพืช 3.1 อุปกรณ์ เครอ่ื งมือ และสารเคมี 3.1.1 อปุ กรณ์และเคร่ืองมอื ท่ีใช้ในการเตรยี มตัวอยา่ งและทดสอบฤทธ์ิ 1) เครื่องชั่งระบบดิจิตอลทศนิยม 2 ตำแหน่ง (2-Decimal balance) Sartorious, CP3202S, Germany 2) เคร่อื งช่งั ระบบดจิ ิตอลทศนิยม 4 ตำแหน่ง (4-Decimal balance) Sartorius, BP210S, Germany 4) ไมโครปิเปตต์ (Micropipette) และไมโครปิเปตตท์ ปิ (Micropipette Tip) 5) เคร่ืองกรองสญุ ญากาศ (Rotary Evaporator) 6) เครื่องวัดค่าการดูดกลืนแสงของสารละลายในไมโครเพลท (Microplate Reader) Metertech, M965+, Taiwan 7) อุปกรณด์ ูดจา่ ยสารละลาย แบบหลายชอ่ ง (Multi-Channel Pipette) Biopette™ A 12 Channels, Labnet International, USA 8) เครือ่ งวดั คา่ พีเอช (pH Meter) HANNA instrument, HI 2210, Portugal 3.1.2 สารเคมีใช้สำหรบั การเตรยี มตัวอย่างและทดสอบฤทธิ์ 1) เอทานอล (Ethanol, C2H5OH) หรือ เอทิลแอลกอฮอล์ (Ethyl Alcohol Anhydrous, 99.9%, C2H5OH) AR Grade, Daejung, Korea 2) กรดแอสคอร์บิก (L-Ascorbic Acid, C6H8O6) AR Grade 3) กรดแกลลิก (Gallic Acid, C7H6O5) AR Grade, Sigma-Aldrich, USA 4) บวิ ทิเลเตด ไฮดรอกซีโทลูอนี (Butylated Hydroxytoluene : BHT, C15H24O) AR Grade, Panreac Quimica, Spain

19 5) ไดเมธลิ ซัลฟอกไซด์ (Dimethyl Sulfoxide : DMSO, C2H6OS ) AR Grade, Fisher chemical, USA 6) ดีพีพีเอช (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl : DPPH, C18H12N5O6) HPLC Grade, Tokyo Chemical- Industry 7) เอบีทีเอช ( 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid : ABTS, C18H18N4O6S4) lad Grade, TCL, Japan 8) โพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟต (Potassium Persulfate, K2S2O8) AR Grade, Merck, Germany 9) โทรลอกซ์รอ้ ยละ 97 (Trolox 97%) Lab Grade, Acros organics, Slovakia 10) ไอรอน(III) คลอไรด์ เฮกซะไฮเดรต (Iron(III) Chloride Hexahydrate, FeCl3·6H2O) AR Grade, Sigma-Aldrich Laborchemikalien, Germany 11) ไฮโดรคลอรกิ (Hydrochloric acid, HCl) Com Grade, Chemikit, Thailand 12) กรดอะซติ กิ (Acetic acid, CH3COOH) Com Grade, Chemikit, Thailand 13) เฟอร์รสั ซัลเฟต (Ferrous Sulfate, FeSO4) Lab Grade, Ajax Finechem, Australia 14) โซเดียม อะซิเตรท ไตรไฮเดรต (Sodium Acetate Trihydrate, CH3COONa·3H2O) AR Grade, Ajax Finechem, Australia 15) ทพี ที ีแซด (2,4,6-Tripyridyl-1,3,5-triazine: TPTZ, C18H12N6) Lab Garde, TCI, Japan 3.2 วิธีการดำเนนิ การ 3.2.1 เกบ็ ตัวอย่าง และเตรยี มตวั อยา่ ง เก็บตัวอย่างกระวานจากส่วนของเหง้า ดอก และราก เหง้าเร่ว ผลลูกจัน และผลพริกไทย ในเขตจังหวดั จนั ทบุรี 1) เตรียมตัวอยา่ งเร่วหอม ลูกจัน พริกไทย และเหง้ากระวาน มาลา้ งทำความสะอาด และหั่น เป็นชนิดเล็ก ๆ ปั่นให้ละเอียด ชั่ง 250.00 กรัม หลังจากนั้นแช่ตัวทำละลายเอทานอล 500 มิลลิลิตร ปิดปากภาชนะให้สนิท และตั้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20-24 ชั่วโมง กรอง เก็บส่วนที่เป็นสารละลาย แยกไว้ ส่วนที่เป็นกากนำไปสกัดซ้ำอีก 2 ครั้ง นำสารสกัดไประเหยเพื่อแยกตัวทำละลายออกด้วยเครื่อง ระเหยสารความดันสุญญากาศจนได้สารสกัดหยาบเข้มข้นหนืด ทำให้ตัวอย่างสารสกัดแห้งสนิทโดยการใช้ ปั๊มสญุ ญากาศ และนำสารสกดั หยาบเรว่ หอม ลกู จนั พริกไทย และเหงา้ กระวาน ชง่ั นำ้ หนัก และคิดร้อยละ ผลผลิตท่ีได้

20 2) เตรยี มตัวอย่างรากกระวานล้างทำความสะอาด และหั่นเปน็ ชิ้นเล็ก ๆ ป่นั ให้ละเอยี ด ชง่ั 141.62 กรมั หลังจากนั้นแชต่ ัวทำละลายเอทานอล 560.00 มลิ ลลิ ิตร ปิดปากภาชนะให้สนิท และตง้ั ไว้ ทอี่ ณุ หภูมหิ ้องเป็นเวลา 20-24 ชว่ั โมง กรอง เก็บส่วนท่ีเป็นสารละลายแยกไว้ สว่ นท่เี ป็นกากนำไปสกดั ซ้ำอกี 2 ครั้ง แลว้ นำไประเหยเพื่อแยกตัวทำละลายออกด้วยเครอ่ื งระเหยสารความดนั สุญญากาศจนได้ สารสกัดหยาบเข้มข้นหนดื ทำให้ตัวอยา่ งแหง้ สนิทโดยการใช้ปั๊มสญุ ญากาศ และนำสารสกดั หยาบของ รากกระวานชัง่ น้ำหนัก และคิดรอ้ ยละผลผลิต 3) เตรียมตัวอย่างดอกกระวานล้างทำความสะอาด และหั่นเป็นชนิดเล็ก ๆ ปั่นให้ละเอียด ช่ัง 45 กรัม หลงั จากนนั้ แชต่ ัวทำละลายเอทานอล 450.00 มิลลลิ ติ ร ปิดปากภาชนะให้สนิท และตั้งไว้ท่ี อณุ หภมู ิห้องเป็นเวลา 20-24 ชั่วโมง กรอง และเก็บส่วนท่ีเปน็ สารละลายแยกไว้ ส่วนท่ีเป็นกากนำไปสกัด ซ้ำอกี 2 คร้ัง แล้วนำไประเหยเพ่ือแยกตวั ทำละลายออกด้วยเคร่ืองระเหยสารความดันสุญญากาศจนได้สาร สกัดหยาบเข้มข้นหนืด ทำให้ตัวอย่างแห้งสนิทโดยการใช้ปั๊มสุญญากาศ และนำสารสกัดหยาบของดอก กระวานช่ังนำ้ หนกั และคดิ รอ้ ยละผลผลติ 3.2.2 การทดสอบฤทธิต์ า้ นอนมุ ูลอสิ ระด้วยวิธี DPPH การทดสอบนี้ดัดแปลงจาก ประภัสสร วีระพันธ์ และวัชรี คุณกิตติ (2554) และ ปฐมพงษ์ เผอื กลี และคณะ, 2561 ซ่ึงมวี ิธีการดังนี้ 1) สารละลาย DPPH เตรียมท่ีความเข้มข้น 0.20 มิลลิโมลาร์ในเอทานอล โดยการชั่ง DPPH 0.0018 กรัม ละลายด้วยเอทานอล และปรับปริมาตรด้วยเอทานอลให้ครบปริมาตร 25.00 มลิ ลิลิตร 2) การเตรียมสารละลายของตัวควบคุมเชิงบวกกรดแอสคอร์บิกเข้มข้น 60 ไมโครกรัมต่อ มิลลิลติ ร โดยเตรียมตัวควบคุมเชิงบวกที่ความเข้มขน้ สูงสุดกรดแอสคอร์บิกเขม้ ข้น 1000 ไมโครกรัมต่อ มิลลิลิตร ปริมาตร 1.50 มิลลิลิตร โดยชั่ง 0.0015 กรัม ละลายด้วยเอทานอล และปรับปริมาตร ด้วย เอทานอล จากนั้นปิเปตสารละลายตัวควบคุมเชิงบวกกรดแอสคอร์บิกที่ความเข้มข้น 1000 ไมโครกรัม ตอ่ มลิ ลิลติ ร 300 ไมโครลติ ร และปรับปริมาตรไหไ้ ด้ 1.50 มลิ ลิลิตร ด้วยเอทานอลจะได้สารละลายของ ตวั ควบคุมเชงิ บวกกรดแอสคอร์บิกเข้มข้น 60 ไมโครกรัมต่อมิลลลิ ิตร 3) การเตรียมสารละลายของตัวควบคุมเชิงบวกกรดแกลิกเข้มข้น 8 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร โดยเตรียมตัวควบคุมเชิงบวกที่ความเข้มข้นสูงสุดของกรดแกลลิกเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร 1.50 มิลลลิ ติ ร โดยชงั่ 0.0015 กรัม ละลายด้วยเอทานอล และปรับปรมิ าตรด้วยเอทานอล จาก นั้นปิเปตสารละลายสารมาตรฐานแกลลิกเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร 40 ไมโครลิตร และปรับปริมาตรด้วยไห้ได้ 1.50 มิลลิลิตรด้วยเอทานอล จะได้ตัวควบคุมเชิงบวกกรดแกลิกเข้มข้น 8 ไมโครกรัมตอ่ มลิ ลลิ ติ ร

21 4) การเตรียมสารละลายของตัวควบคุมเชิงบวก BHT เข้มข้น 80 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร โดยเตรียมตัวควบคุมเชิงบวกที่ความเข้มข้นสูงสุด BHT เข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร 1.50 มิลลิลิตร โดยชั่ง 0.0015 กรัม ละลายด้วยเอทานอล และปรับปริมาตรด้วยเอทานอล จากนั้นปิเปต สารละลายสารมาตรฐาน BHT ความเขม้ ขน้ 1000 ไมโครกรัมต่อมลิ ลลิ ิตร ปรมิ าตร 400 ไมโครลิตร และปรับ ปริมาตรให้ได้ 1.50 มิลลิลิตร ด้วยเอทานอล จะได้ตัวควบคุมเชิงบวก BHT เข้มข้น 80 ไมโครกรัมต่อ มลิ ลิลติ ร 5) การเตรียมตัวอย่างพืชเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร นำสารสกัดหยาบของพืช ตัวอย่างชั่ง 0.0015 กรัม ละลายในเอทานอล 1.5 มิลลิลิตร ถ้าตัวอย่างสารสกัดหยาบไม่ละลายให้เติม DMSO ปริมาตร 200 ไมโครลิตร และนำตั้งบนเครื่องผสมสารละลายจนละลาย และปรับปริมาตรด้วย เอทานอลใหค้ รบปรมิ าตร 1.5 มิลลลิ ติ ร 6) นำสารละลายที่เตรียมไว้ผสมให้เข้ากันลงในถาดหลุมชนิด 96 หลุม ปริมาตรให้การเตรียม ตัวควบคุมเชิงบวกกรดแอสคอร์บิกให้ได้ความเข้มข้น 60 30 15 7.5 และ 3.75 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร กรดแกลลิกที่ความเข้มข้น 8 4 2 1 และ 0.5 ไมโครลิตรต่อมิลลิลิตร BHT ที่ความเข้มข้น 80 40 20 10 และ 5 ไมโครลิตรต่อมิลลลิ ิตร และตวั อย่างเข้มขน้ 1000 500 250 125 และ 62.5 ไมโครลิตรต่อมิลลิลิตร โดยใช้เทคนิค Serial two fold dilution และตั้งทิ้งไว้ในที่มืด เป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงท่ี ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตรด้วยไมโครเพลทรีดเดอร์ทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง และคำนวณร้อยละการ ตา้ นอนุมลู อสิ ระ (% DPPH Radical Scavenging Activity) ตามสมการ รอ้ ยละการต้านอนุมูลอสิ ระ DPPH = Acontrol –Asample-blank x 100 Acontrol เมอื่ A control เปน็ ค่าการดดู กลืนแสงของสารกลุ่มควบคมุ A sample-blank เป็นค่าการดูดกลืนแสงของสารตวั อย่าง จากนั้นคำนวณหาค่าความเข้มข้นของสารที่สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระท่ีร้อยละ 50 (IC50) โดยการสรา้ งกราฟหาความสมั พนั ธ์ระหวา่ งร้อยละการต้านอนมุ ูลอสิ ระ และความเขม้ ข้นของสาร สกดั หยาบสมุนไพรที่ความเข้มขน้ ตา่ ง ๆ และคำนวณหาความเข้มขน้ ของสารสกัดหยาบสมุนไพรที่ทำให้ ความเข้มข้น DPPH ลดลงร้อยละ 50 จากสมการเส้นตรง y = mx + c ซึ่งสารสกัดที่ให้ค่า IC50 น้อย หมายถึงมีการยับยั้งอนุมูลอิสระของ DPPH ได้ดี แสดงว่ามีฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระดี โดยแทนค่าจาก สมการ y = mx + c เมื่อ แทนคา่ y เทา่ กบั 50 จะได้ x เท่ากบั ค่า IC50

22 3.2.3 การทดสอบฤทธิ์ตา้ นอนุมูลอสิ ระวธิ ี ABTS การทดสอบนี้ดัดแปลงจาก สุชาดา มานอก และปวีณา ลิ้มเจริญ (2558) และ สุธิรา มณีฉาย และ ประสบอร รนิ ทอง (2559) ซง่ึ มีวิธกี ารดังน้ี 1) การเตรยี มสารละลาย ABTS - สารละลาย ก : เตรียมสารละลาย ABTS ท่ีความเข้มข้น 7 มิลลิโมลาร์ โดยชั่งสาร ABTS มา 0.0192 กรมั ละลายในนำกลนั่ และปรบั ปรมิ าตรเปน็ 5 มิลลิลติ ร - สารละลาย ข : เตรียมสารละลายโพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟตที่ความเข้มข้น 2.45 มิลลิโมลาร์ โดยช่ังสารโพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟต 0.0033 กรัม ละลายในน้ำกล่ันและปรับปริมาตรเป็น 5 มิลลิลติ ร - รเี อเจนท์ของ ABTS : ผสมสารละลาย ABTS ความเขม้ ขน้ 7 มิลลิโมลาร์สารละลาย โพแทสเซียมเปอร์ซัลเฟตท่ีความเข้มขน้ 2.45 มิลลิโมลาร์ ผสมกันในอัตราส่วน 1 : 0.5 แล้วตั้งทิ้งไวใ้ น ท่มี ืดทอี่ ณุ ภมู หิ ้อง เป็นเวลา 12-16 ชม. เพอื่ ให้ปฏิกิรยิ าเกิดได้อย่างสมบรู ณ์จะไดร้ เี อเจนท์ของ ABTS - เตรียมรีเอเจนท์ ABTS เพ่ือการวเิ คราะห์ : โดยการเจือจางรเี อเจนทข์ อง ABTS ดว้ ย เอทานอลจนวัดคา่ การดูดกล่ืนแสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโนเมตรให้ไดค้ ่าในชว่ ง 0.7-0.9 2) การเตรียมตวั ควบคุมเชิงบวกกรดแอสคอร์บกิ เข้มข้น 40 ไมโครกรมั ตอ่ มลิ ลิลิตรเตรียม ตัวควบคุมเชิงบวกที่ความเข้มข้นสงู สุดของกรดแอสคอร์บิกเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ให้ได้ ปริมาตร 1.5 มลิ ลิลิตร โดยช่งั 0.0015 กรมั ละลายดว้ ยเอทานอล และปรับปรมิ าตรด้วยเอทานอล โดย การปิเปตตัวควบคุมเชิงบวกกรดแอสคอร์บิกเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร 60 ไมโครลิตร และปรับดว้ ยเอทานอล ให้ได้ปริมาตร 1.5 มิลลลิ ิตร 3) การเตรียมตัวอย่างพืชเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร นำสารสกัดหยาบของพืช ตวั อยา่ งหนัก 0.0015 กรัม ละลายในเอทานอล 1.5 มลิ ลิลิตร ถ้าตัวอย่างสารสกดั หยาบไม่ละลายให้เติม DMSO ปริมาตร 200 ไมโครลิตร และนำตั้งบนเครื่องผสมสารละลายจนละลาย และปรับปริมาตรด้วย เอทานอลใหค้ รบปริมาตร 1.5 มิลลิลติ ร 4) นำสารละลายที่เตรียมไว้ผสมให้เข้ากันลงในถาดหลุมชนิด 96 หลุม โดยทำการปิเปต ตัวควบคุมเชิงบวกกรดแอสคอร์บิกให้ได้ความเข้มข้น 40 20 10 5 และ 2.5 และตัวอย่างเข้มข้น 1000 500 250 125 และ 62.5 ไมโครลิตรต่อมิลลิลิตร โดยใช้เทคนิค Serial Two Fold Dilution และผสมกับ รีเอเจนท์ ABTS ตั้งทิ้งไว้ในที่มืด เป็นเวลา 8 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโนเมตร ด้วยเครื่องไมโครเพลทรีดเดอร์ ทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง และคำนวณร้อยละการต้านอนุมูลอิสระตาม สมการ

23 รอ้ ยละการต้านอนุมูลอสิ ระ ABTS = Acontrol –Asample-blank x 100 Acontrol เมอื่ A control เป็นคา่ การดูดกลืนแสงของสารกลุ่มควบคมุ A sample เป็นค่าการดดู กลืนแสงของสารตวั อย่าง จากนั้นคำนวณหาค่า ความเข้ มข้ นของสาร ที่สามารถยับยั้งอนุ มูล อิสระ ท่ีร้ อย ล ะ 50 (IC50) โดยการสรา้ งกราฟหาความสัมพนั ธร์ ะหว่างร้อยละการต้านอนุมูลอิสระ และความเข้มข้นของ สารสกัดหยาบสมุนไพรที่ความเข้มข้นต่าง ๆ และคำนวณหาความเข้มข้นของสารสกัดหยาบสมุนไพรที่ ทำให้ความเข้มข้น ABTS ลดลงร้อยละ 50 จากสมการเส้นตรง y = mx + c ซึ่งสารสกัดที่ให้ค่า IC50 น้อย หมายถึงมีการยบั ยัง้ อนมุ ูลอิสระของ ABTS ได้ดี แสดงว่ามีฤทธิก์ ารต้านอนุมูลอสิ ระดี โดยแทนคา่ จากสมการ y = mx + c เมื่อ แทนค่า y เท่ากบั 50 จะได้ x เทา่ กับค่า IC50 3.2.4 การทดสอบฤทธิต์ ้านอนุมลู อิสระวิธี FRAP (Ferric reducing antioxidant power) การทดสอบน้ีดดั แปลงจาก Sayompek et al. (2012) ซ่ึงมวี ธิ ีการดงั นี้ เป็นวิธีทดสอบความสามารถในการรีดิวซ์เฟอร์ริกของสารต้านออกซิเดชันจากสารประกอบ เชิงซ้อนของเฟอร์ริก [Fe (III) (TPTZ)2]3+ ทำให้เกิดการเปลี่ยนรูปเป็นสารประกอบเชิงซ้อนของเฟอร์รัส [Fe(II)(TPTZ)2]2+ จากสารละลายสีเหลืองจะถูกเปลี่ยนเป็นสารละลายสีน้ำเงินม่วง ปริมาณของ [Fe (II) (TPTZ)2]2+ ที่เกิดขึ้นคือความสามารถในการเป็นสารต้านออกซิเดชันที่แสดงผลในรูป FRAP เทียบกับกราฟ มาตรฐานของโทรลอกซ์ (Trolox Equivalent) 1) การเตรียมตัวอย่างพืชเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร นำตัวอย่างของสารสกัด พริกไทย เหงา้ กระวาน ดอกกระวาน รากกระวาน ลูกจัน และเหงา้ เรว่ หอมชง่ั 0.0015 กรมั ละลายดว้ ย เอทานอล 1.50 มิลลิลิตร ถ้าตัวอย่างสารสกัดหยาบไม่ละลายให้เติม DMSO ครั้งละ 200 ไมโครลิตร และนำตั้งบนเครื่องผสมสารละลายจนละลาย และปรับปริมาตรด้วยเอทานอลให้ครบปริมาตร 1.50 มิลลลิ ิตร 2) การเตรียมสารละลาย FRAP reagent - เตรียมอะซิเตท บฟั เฟอร์ (Acetate buffer) pH 3.6 ความเข้มขน้ 300 มิลลิโมลาร์ โดยทำการชั่งโซเดียมอะซิเตทไตรไฮเดรต 1.50 กรัม ละลายด้วยกรดอะซิติก 8 มิลลิลิตร ปรับด้วยน้ำ ปราศจากไอออน จนไดป้ ริมาตร 500 มลิ ลิลิตร

24 - เตรียมเฟอร์ริกคลอไรด์ (FeCl3•6H2O) ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์ โดยชั่งสารของ เฟอรร์ กิ คลอไรด์ 0.054 กรมั นำมาละลายดว้ ยน้ำปราศจากไอออนปรับปริมาตรให้เปน็ 10 มิลลลิ ิตร - เตรียม TPTZ ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ โดยชั่ง TPTZ 0.0312 กรัม นำไป ละลายด้วยกรดไฮโดรคลอรกิ ความเขม้ ข้น 40 มิลลโิ มลาร์ ปรบั ปรมิ าตรเป็น 10 มลิ ลิลติ ร ทีอ่ ณุ หภมู ิ 50 องศาเซลเซียส เขย่าจนสารละลายใสไมม่ ตี ะกอน - เตรียม FRAP Reagent โดยปิเปตอะซิเตท บัฟเฟอร์ pH 3.6 ปริมาตร 20 มิลลิลิตร ปิเปตเฟอร์ริกคลอไรด์ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์ ปริมาตร 2 มิลลิลิตร และปิเปต TPTZ ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ปริมาตร 2 มิลลิลิตร ให้มีอัตราส่วนเป็น 10 ต่อ 1 ต่อ 1 ก่อนใช้ต้องนำไปอุ่นที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 4 นาที (เตรยี มใหมท่ ุกครั้ง) 3) ทดสอบความสามารถในการรีดิวซ์เฟอรร์ ิกของสารต้านอนมุ ลู อิสระ (Ferric Reducing Antioxidant Power) - เตรียมกราฟมาตรฐานเฟอร์รัสซัลเฟต โดยทำการชั่ง 0.0015 กรัม จากนั้นนำไป ละลายด้วยน้ำปราศจากไอออน 1.50 มิลลิลิตร แล้วนำมาเตรียมให้ได้ทั้งหมด 6 ความเข้มข้น คือที่ความ เข้มข้น 0 50 100 250 350 และ 500 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร นำแต่ละความเข้มข้นไปเติมถาดหลุมชนิด 96 หลุมปริมาตร 20 ไมโครลิตร จากนั้นทำการเติม FRAP Reagent ปริมาตร 180 ไมโครลิตร ทิ้งไว้ใน ทีม่ ืดเป็นเวลา 8 นาที นำไปทำการวิเคราะห์ดว้ ยเคร่ืองไมโครเพลทรีดเดอรท์ ่ีความยาวคล่นื 600 นาโนเมตร นำค่าการดูดกลืนแสงท่ีได้ไปสร้างกราฟมาตรฐานความสัมพันธ์ระหวา่ งค่าการดูดกลืนแสงและความเข้มข้น ของเฟอร์รัสซลั เฟต - เตรียมกราฟมาตรฐานโทรลอกซ์ โดยทำการชั่ง 0.0015 กรัม จากนั้นนำไป ละลาย ด้วยเอทานอล 1.5 มิลลิลิตร แล้วนำมาเตรียมให้ได้ทั้งหมด 6 ความเข้มข้น คือ ที่ความเข้มข้น 0 50 100 25 350 และ 500 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร นำแต่ละความเข้มข้นไปเติมให้เข้ากันลงในถาดหลุมชนิด 96 หลุมปริมาตร 20 ไมโครลิตร จากนั้นทำการเติม FRAP Reagent ปริมาตร 180 ไมโครลิตร ทิ้งไว้ในที่มืด เป็นเวลา 8 นาที นำไปทำการวิเคราะห์ด้วยผลเครื่องไมโครเพลทรีดเดอร์ที่ความยาวคลื่น 600 นาโนเมตร นำค่าการดูดกลืนแสงท่ีได้ไปทำการสร้างกราฟมาตรฐานระหว่างค่าการดูดกลืนแสง และความเข้มข้นของ โทรลอกซ์ - การวิเคราะห์ตัวอย่าง นำตัวอย่างของสารสกัดพริกไทย เหง้ากระวาน ดอกกระวาน รากกระวาน ลูกจัน และเร่วหอม ที่สกัดด้วยเอทานอลที่มีความเข้มข้น 1000 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร เติม ใส่ในปริมาตร 20 ไมโครลิตร เตมิ FRAP Reagent ปรมิ าตร 180 ไมโครลติ ร ทง้ิ ไว้ในที่มดื เปน็ เวลา 8 นาที นำไปทำการวิเคราะห์ด้วยเครื่องไมโครเพลทรีดเดอร์ ที่ความยาวคลื่น 600 นาโนเมตร โดยทำการวิเคราะห์ 3 ซ้ำ ซ้ำละ 3 คร้ัง และการคำนวณค่า FRAP โดยแทนค่าในสมการเส้นตรงที่ได้จากกราฟมาตรฐานของ เฟอรัสซัลเฟตและโทรลอกซ์

25 - การวิเคราะห์ควบคุมเชิงบวก (Positive Control) โดยเตรียมสารละลายกรดแกลลิก และ BHT ที่ความเข้มขน้ 1 มิลลิกรัมต่อมิลลลิ ิตร โดยละลายด้วยเอทานอล หลังจากนั้นนำไปวิเคราะห์ เช่นเดียวกันกับการวิเคราะห์ตัวอยา่ ง