Standard_method_in_urine(full)

วิธมี าตรฐานสำหรบั การตรวจพสิ ูจนส ารเสพตดิ ในปัสสาวะ เลมท่ี 1 Standard Methods for Analysis of Narcotics in Urine (Volume I) สำนกั ยาและวัตถุเสพติด กรมวิทยาศาสตรการแพทย Department of Medical Sciences



ทีป่ รึกษา อธบิ ดีกรมวทิ ยาศาสตร์การแพทย์ นายอภชิ ัย มงคล รองอธิบดีกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ นางวารุณี จินารตั น ์ รองอธิบดีกรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ นางจรุ ภี รณ์ บุญยวงศ์วโิ รจน ์ รองอธบิ ดีกรมวิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ นายธงชยั เลิศวิไลรตั นพงศ ์ ผ้ชู ว่ ยอธิบดีกรมวิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ นายสมชาย แสงกจิ พร ผู้อำ� นวยการสำ� นักยาและวัตถเุ สพติด นางสาวสุรชั น ี เศวตศลิ า ผูจ้ ัดทำ� สำ� นกั ยาและวตั ถุเสพติด นางอรพิณ ทนันขตั ิ สำ� นกั ยาและวัตถเุ สพติด นางสาวรุ่งทพิ ย์ เจือตี๋ ส�ำนกั ยาและวตั ถเุ สพตดิ นางสาวอังคณา กริชพิทักษเ์ งนิ ส�ำนกั ยาและวตั ถเุ สพตดิ นายสุเมธ เที่ยงธรรม ส�ำนกั ยาและวตั ถเุ สพตดิ นางสาวสรัลนนั ท์ เผา่ พชื พนั ธ ์ุ ส�ำนกั ยาและวัตถเุ สพติด นายกษิวิชญ์ ด�ำเกล้ยี ง เจ้าของ ส�ำนักยาและวตั ถุเสพตดิ กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ กระทรวงสาธารณสขุ จ.นนทบรุ ี โทร 0 2951 0000 ตอ่ 99162, 99015 โทรสาร 0 2580 5733 รหสั หนังสอื : DMScBDN – 20150803 พมิ พท์ ่ี โรงพมิ พ์คงเกียรติการพิมพ์ เลม่ ท่ี 1 จำ� นวน 1000 เลม่ ปีทีพ่ ิมพ์ พ.ศ.2558 ISBN : 978-616-11-2721-3

ค�ำน�ำ บทบาทหน้าท่ีและภารกิจหนึ่งของกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์คือ การสนับสนุนการแก้ไข ปญั หายาเสพตดิ ของประเทศ ในดา้ นการตรวจพสิ จู นข์ องกลางวตั ถเุ สพตดิ การตรวจพสิ จู นส์ ารเสพ ตดิ ในปสั สาวะและการตรวจวเิ คราะหค์ ณุ ภาพวตั ถเุ สพตดิ ทใี่ ชใ้ นทางการแพทย ์ ตามพระราชบญั ญตั ิ วัตถทุ ่อี อกฤทธ์ติ อ่ จติ และประสาท พ.ศ. 2518 พระราชบญั ญัติป้องกนั และปราบปรามยาเสพติด พ.ศ.2519 พระราชบัญญัติยาเสพติดให้โทษ พ.ศ. 2522 พระราชก�ำหนดการป้องกนั การใช้สาร ระเหย พ.ศ. 2533 และพระราชบัญญัติฟืน้ ฟูสมรรถภาพผู้ตดิ ยาเสพตดิ พ.ศ. 2545 ผลการตรวจ พสิ จู นจ์ ากหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารเปน็ ขอ้ มลู ประกอบการบำ� บดั ฟน้ื ฟแู ละเปน็ หลกั ฐานสำ� คญั ในทางอรรถคดี กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ มีห้องปฏิบัติการด้านการตรวจพิสูจน์สารเสพติดในส่วนกลางคือส�ำนัก ยาและวัตถุเสพติดและศนู ยว์ ทิ ยาศาสตร์การแพทย์ 14 แห่ง กระจายอยูท่ กุ ภมู ภิ าคของประเทศ จงึ จำ� เป็นตอ้ งมีวิธกี ารตรวจพสิ ูจนท์ ่มี ีประสิทธิภาพและเปน็ มาตรฐานเดยี วกนั ทัง้ กรมวทิ ยาศาสตร์การ แพทย์ สำ� นกั ยาและวตั ถเุ สพตดิ รว่ มกบั ศนู ยว์ ทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ 14 แหง่ ดำ� เนนิ การจดั ทำ� เอกสาร วิธีมาตรฐานส�ำหรับการตรวจพิสูจน์สารเสพติดในปัสสาวะขึ้น เพื่อใช้เป็นวิธีมาตรฐานส�ำหรับการ ตรวจพสิ ูจน์สารเสพตดิ ในปสั สาวะของกรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ หวังว่าเอกสารวิธีมาตรฐานส�ำหรับการตรวจพิสูจน์สารเสพติดในปัสสาวะ เล่มท่ี 1 จะมี ประโยชนอ์ ยา่ งยงิ่ ตอ่ งานตรวจพสิ จู นส์ ารเสพตดิ ในปสั สาวะ ของกรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทยแ์ ละตอ่ หนว่ ยงานอน่ื ท่ีเก่ยี วข้อง ทจี่ ะนำ� ไปใชใ้ นทางปฏบิ ตั แิ ละอ้างอิงต่อไป (นายแพทยอ์ ภิชยั มงคล) อธบิ ดกี รมวทิ ยาศาสตร์การแพทย์

กติ ติกรรมประกาศ คณะผู้จดั ท�ำขอขอบคณุ ทา่ นทใี่ หข้ อ้ คิดเหน็ และทบทวนเอกสารฉบับรา่ งดังตอ่ ไปนี้ 1. นางสดุ ใจ นนั ตารัตน ์ ศนู ยว์ ทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ ท่ี 1 เชียงใหม่ 2. นางสาวจิราภรณ ์ อ่ำ� พันธ์ ศนู ยว์ ทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ ท่ี 2 พิษณโุ ลก 3. นายราเมศ กรณีย์ ศูนย์วทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย์ท่ี 3 นครสวรรค์ 4. นายณัฐพล ไชยศรหี า ศนู ย์วิทยาศาสตรก์ ารแพทยท์ ี่ 6 ชลบรุ ี 5. นางสาวประทุมวรรณ์ กติ ตอิ ภิบลู ย ์ ศูนย์วิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ท่ี 7 ขอนแกน่ 6. นางสาวอจั จมิ า ทองบ่อ ศนู ยว์ ิทยาศาสตร์การแพทย์ ที่ 8 อดุ รธานี 7. นายวรศักดิ์ อินทร์ชยั ศนู ย์วทิ ยาศาสตร์การแพทย์ ท่ี 9 นครราชสีมา 8. นางโชติกา องอาจณรงค ์ ศูนย์วทิ ยาศาสตร์การแพทย์ ท่ี 10 อบุ ลราชธานี 9. นางแฉล้ม ชนะเดช ศนู ยว์ ิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ 11 สุราษฎรธ์ านี 10. นางสาวจตรุ พร เชือ้ ชว่ ยชู ศูนย์วิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ ที่ 12 สงขลา 11. นายอุดมศักด ์ิ สุดมาตร ศูนย์วิทยาศาสตรก์ ารแพทย์ ท่ี 12/1 ตรัง

สารบัญ บทที่ หน้า 1. ความรทู้ ว่ั ไป 1.1 ประเภทของยาเสพตดิ ใหโ้ ทษ.......................................................................................................................................1 1.2 การตรวจหาสารเสพติดในปสั สาวะ...........................................................................................................................3 1.3 เกณฑต์ ัดสินผลบวกวา่ เปน็ ผ้มู ีสารเสพตดิ ในรา่ งกาย.......................................................................................6 1.4 เมตาบอไลตข์ องสารเสพตดิ สตู รโครงสรา้ งและมวลโมเลกลุ .....................................................................7 1.5 หลกั การทางโครมาโทกราฟ.ี ........................................................................................................................................10 1.6 การปรับสภาวะการทำ� งานทางเทคนิคโครมาโทกราฟ.ี ................................................................................18 1.7 เกณฑก์ ารคัดเลอื กวธิ มี าตรฐานการตรวจพสิ ูจนส์ ารเสพตดิ ......................................................................20 2. วธิ กี ารตรวจพิสูจน์สารเสพติดในปัสสาวะ 2.1 การตรวจเบอ้ื งต้นสารเสพตดิ ในปัสสาวะดว้ ยหลักการภมู คิ ุ้มกันวิทยา...............................................21 โดยใช้ Rapid Test Kit 2.2 การตรวจยืนยนั เมทแอมเฟตามนี ในปสั สาวะดว้ ยเทคนิค...........................................................................24 Thin Layer Chromatography (TLC) 2.3 การตรวจปรมิ าณแอมเฟตามีนและเมทแอมเฟตามีนในปัสสาวะ..........................................................35 ดว้ ยเทคนิค Gas Chromatography – Massspectrometry (GC-MS) 2.4 การตรวจปริมาณยาบา้ และยาอีในปสั สาวะ.......................................................................................................49 ด้วยเทคนคิ Gas Chromatography – Massspectrometry (GC-MS) 2.5 การตรวจปรมิ าณสารกลุม่ แอมเฟตามีนส์และเอค๊ ซ์ตาซใี นปัสสาวะ.....................................................62 ด้วยเทคนิค Liquid Chromatography – Massspectrometry (LC-MS) 2.6 การตรวจปริมาณกญั ชาในปสั สาวะ.........................................................................................................................79 ดว้ ยเทคนิค Gas Chromatography – Massspectrometry (GC-MS) 2.7 การตรวจปริมาณมอร์ฟนี ในปสั สาวะ......................................................................................................................92 ด้วยเทคนิค Gas Chromatography – Massspectrometry (GC-MS) บรรณานุกรม..................................................................................................................................................................................... 105



วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปส สาวะ เลม ท่ี 1 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย บทที่ 1 ความรทู้ วั่ ไป 1.1 ประเภทของยาเสพตดิ ให้โทษ (1) ยาเสพติดให้โทษในความหมายตามพระราชบัญญัติยาเสพติดให้โทษ พ.ศ.2522 หมายถึง สารเคมหี รอื วัตถชุ นิดใดๆ ซ่ึงเมือ่ เสพเขา้ สู่รา่ งกายไม่วา่ จะโดยรับประทาน ดม สูบ ฉีด หรือด้วยประ การใดๆ แลว้ ท�าใหเ้ กิดผลตอ่ ร่างกายและจติ ใจในลกั ษณะสา� คัญ เชน่ ตอ้ งเพ่มิ ขนาดการเสพเร่ือยๆ มอี าการถอนยาเม่ือขาดยา มคี วามต้องการเสพทงั้ รา่ งกายและจติ ใจอย่างรุนแรงอยู่ตลอดเวลา และ สขุ ภาพโดยทวั่ ไปจะทรดุ โทรมลง ใหร้ วมตลอดถงึ พชื หรอื สว่ นของพชื ทเี่ ปน็ หรอื ใหผ้ ลผลติ เปน็ ยาเสพ ตดิ ใหโ้ ทษหรอื อาจใชผ้ ลติ เปน็ ยาเสพตดิ ใหโ้ ทษและสารเคมที ใ่ี ชใ้ นการผลติ ยาเสพตดิ ใหโ้ ทษดงั กลา่ ว ดว้ ย ทง้ั นตี้ ามทร่ี ฐั มนตรปี ระกาศในราชกจิ จานเุ บกษา แตไ่ มห่ มายความถงึ ยาสามญั ประจา� บา้ น บาง ตา� รบั ตามกฎหมายวา่ ดว้ ยยาทม่ี ยี าเสพตดิ ใหโ้ ทษผสมอย ู่ ซง่ึ สามารถแบง่ ไดด้ งั นตี้ ามพระราชบญั ญตั ิ ยาเสพติดใหโ้ ทษ พ.ศ.2522 แบง่ ออกเปน็ 5 ประเภท คือ 1 ยาเสพตดิ ใหโ้ ทษ ประเภทท่ี 1 ได้แก่ เฮโรอนี แอลเอสด ี แอมเฟตามีน หรือยาบา้ ยาอี หรือยาเลิฟ 2 ยาเสพติดให้โทษ ประเภทที ่ 2 ยาเสพติดประเภทนี้ สามารถนา� มาใชเ้ พอ่ื ประโยชน ์ ทางการแพทยไ์ ด้ แตต่ อ้ งใชภ้ ายใต้การควบคมุ ของแพทย ์ และใชเ้ ฉพาะกรณที จ่ี า� เป็น เทา่ นน้ั ไดแ้ ก ่ ฝน มอรฟ์ นี โคเคน หรือ โคคาอนี โคเคอีน และเมทาโดน 3 ยาเสพติดใหโ้ ทษ ประเภทท ี่ 3 ยาเสพติดประเภทน้ีเปน็ ยาเสพตดิ ใหโ้ ทษที่มียาเสพตดิ ประเภทท่ี 2 ผสมอยูด่ ว้ ย มีประโยชนท์ างการแพทย์ การน�าไปใชเ้ พื่อจดุ ประสงคอ์ ืน่ หรือเพือ่ เสพตดิ จะมีบทลงโทษก�ากบั ไว ้ ยาเสพติดประเภทน้ี ไดแ้ ก ่ ยาแกไ้ อ ทีม่ ีตวั ยา โคเคอีน ยาแกท้ ้องเสยี ท่ีมฝี นผสมอย่ดู ว้ ย ยาฉดี ระงบั ปวดต่าง ๆ เช่น มอร์ฟีน เพทดิ นี ซ่งึ สกัดมาจากฝน 4 ยาเสพตดิ ให้โทษ ประเภทท่ ี 4 คอื สารเคมที ใี่ ช้ในการผลติ ยาเสพติดใหโ้ ทษประเภทที่ 1 หรือประเภทที่ 2 ยาเสพติดประเภทนี ้ ไม่มกี ารน�ามาใช้ประโยชน์ในการบ�าบัดโรคแต่ อย่างใด และมบี ทลงโทษก�ากับไว้ด้วย ไดแ้ ก่ น้�ายาอะเซตคิ แอนไฮไดรย์ และ อะเซตลิ คลอไรด์ ซ่งึ ใช้ในการเปล่ยี น มอร์ฟนี เป็นเฮโรอีน สารคลอซูโดอีเฟดรีน สามารถใชใ้ น การผลิตยาบ้าได้ และวตั ถอุ อกฤทธิต์ ่อจิตประสาทอีก 12 ชนดิ ทีส่ ามารถน�ามาผลติ ยาอีและยาบา้ ได้ 5 ยาเสพตดิ ใหโ้ ทษ ประเภทท ี่ 5 เปน็ ยาเสพตดิ ใหโ้ ทษทม่ี ไิ ดเ้ ขา้ ขา่ ยอยใู่ นยาเสพตดิ ประเภท ท ี่ 1 ถึง 4 ได้แก่ ทุกส่วนของพืช กญั ชา ทุกส่วนของพชื กระท่อม เหด็ ขี้ควาย เปน็ ตน้

2 วธิ มี าตรฐานสําหรับการตรวจพิสูจนส ารเสพติดในปส สาวะ เลม ท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย นอกจากนนั้ ยาเสพติดสามารถจา� แนกประเภทตามเกณฑ์อ่ืนๆไดด้ งั น้ี  จา� แนกตามการออกฤทธ์ติ อ่ ระบบประสาท แบ่งเปน็ 4 ประเภท (2) 1. ประเภทกดประสาท ไดแ้ ก ่ ฝน มอร์ฟีน เฮโรอนี ยานอนหลบั ยาระงบั ประสาท ยากลอ่ มประสาท เครอื่ งด่ืมมึนเมา ทกุ ชนดิ รวมทั้งสารระเหย เช่น ทินเนอร์ แล็กเกอร์ น�้ามันเบนซิน กาว เป็นตน้ มักพบวา่ ผู้เสพตดิ มีร่างกายซูบซีด ผอม เหลือง ออ่ นเพลยี ฟุ้งซ่าน อารมณเ์ ปลี่ยนแปลงง่าย 2. ประเภทกระตุ้นประสาท ไดแ้ ก ่ ยาบา้ ยาอ ี กระทอ่ ม โคเคน มกั พบวา่ ผู้เสพตดิ จะ มอี าการหงุดหงดิ กระวนกระวาย จติ สบั สนหวาดระแวง บางคร้งั มอี าการคลุ้มคลั่ง หรอื ท�าในสง่ิ ทคี่ นปกตไิ มก่ ล้าท�า เชน่ ท�าร้ายตนเอง หรอื ฆ่าผู้อ่นื เป็นต้น 3. ประเภทหลอนประสาท ไดแ้ ก่ แอลเอสดี และ เห็ดขี้ควาย เป็นต้น ผู้เสพตดิ จะมี อาการประสาทหลอน ฝนั เฟือ งเห็นแสงสีวจิ ิตรพสิ ดาร หูแว่ว ไดย้ ินเสยี งประหลาด หรอื เหน็ ภาพหลอนทนี่ า่ เกลยี ดนา่ กลวั ควบคมุ ตนเองไมไ่ ด ้ ในทส่ี ดุ มกั ปว ยเปน็ โรคจติ 4. ประเภทออกฤทธิ์ผสมผสาน คือท้งั กระตุ้นกดและหลอนประสาทร่วมกนั ผู้เสพตดิ มักมอี าการหวาดระแวง ความคดิ สับสนเห็นภาพลวงตา หแู วว่ ควบคุมตนเองไม่ได้ และปวยเป็นโรคจติ ได้  จ�าแนกตามแหล่งท่ีมาโดยแบ่งตามแหล่งทเี่ กดิ ซ่งึ จะแบ่งออกเป็น 2 ประเภท (2) คอื 1 ยาเสพติดธรรมชาต ิ ( natural drugs ) คอื ยาเสพติดทผ่ี ลติ มาจากพืช เชน่ ฝน มอร์ฟนี กระท่อม กญั ชา เป็นต้น 2 ยาเสพตดิ สังเคราะห ์ ( synthetic drugs ) คือ ยาเสพตดิ ทีผ่ ลติ ขึ้นดว้ ยกรรมวธิ ที าง เคม ี เช่น เฮโรอีน แอมเฟตามนี ยาอี เอก็ ซ์ตาซ ี เป็นต้น

วิธีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพิสูจนส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ที่ 1 3 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 1.2 การตรวจหาสารเสพติดในปสสาวะ (3) การตรวจหาสารเสพติดในร่างกายของผู้เสพ สามารถใช้ตัวอย่างชีววัตถุหลายชนิด เช่น ปัสสาวะ ซีร่ัม เส้นผมเป็นต้น ปัสสาวะเป็นตัวอย่างชีววัตถุที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลายและเป็นท่ี ยอมรบั ในกระบวนการยตุ ิธรรมในระดบั สากล ขอ้ ดขี องการใชต้ วั อยา่ งปสั สาวะคอื เปน็ ตวั อยา่ งทสี่ ามารถเกบ็ ไดง้ า่ ยเมอ่ื เทยี บกบั สารชวี วตั ถุ อื่นๆและสามารถเก็บตัวอย่างในปริมาณมากได้ ท�าให้มีตัวอย่างเพียงพอท่ีจะใช้ในการตรวจ และ ระยะเวลาท่ีสามารถตรวจพบสารเสพติดในปัสสาวะ ค่อนข้างนานหลายวนั แตอ่ ยา่ งไรกต็ าม การใช้ ตัวอย่างปัสสาวะกม็ ีขอ้ เสยี หลายประการ เชน่ อาจมีการสบั เปลีย่ น หรอื ปลอมปนตัวอย่าง และรปู แบบของการขบั สารเสพตดิ หรอื เมตาบอไลตข์ องสารเสพตดิ ทางปสั สาวะ ขน้ึ กบั คา่ ความเปน็ กรด หรอื ด่างของปสั สาวะ การตรวจสารเสพตดิ ในปสั สาวะ 2 ขั้นตอน คอื 1. การตรวจสารเสพติดเบอ้ื งตน้ 2. การตรวจสารเสพติดข้นั ยนื ยันผล 1. การตรวจสารเสพติดเบ้ืองต้น มีวัตถุประสงค์ เพื่อคัดแยกตัวอย่างท่ีคาดว่าจะมีสารเสพ ติด ออกจากตัวอยา่ งทไี่ มม่ สี ารเสพตดิ โดยท่ัวไปมวี ธิ กี ารตรวจ 2 วิธ ี คือ 1.1 การใชช้ ุดทดสอบสารเสพติดเบอ้ื งตน้ ท่ใี ช้หลักการภมู คิ ุ้มกนั วทิ ยา 1.2 การใชเ้ ครอ่ื งมอื ทีใ่ ช้หลกั การภมู ิคุม้ กนั วทิ ยาต่างๆ เช่น เครอ่ื ง AxSYM เคร่ือง cobas integra และเครื่อง evidence เปน็ ตน้ ตวั อยา่ งทใี่ ห้ผลบวกในขน้ั ตอนน้ถี อื ว่า อาจมีสารเสพติดผสมอยู่ และหากต้องการตรวจ ยนื ยนั ผล ใหส้ ง่ ตวั อยา่ งปสั สาวะทเี่ หลอื ไปยงั หอ้ งปฏบิ ตั กิ ารตรวจยนื ยนั ผล ปจั จบุ นั การใชช้ ดุ ทดสอบ ส�าเรจ็ รปู ทใ่ี ช้หลกั การภมู คิ ุ้มกนั วิทยา เป็นวธิ กี ารตรวจสารเสพตดิ เบอื้ งต้นทน่ี ยิ มใชท้ ่ัวไป ซ่ึงมขี ้อดี คอื ขน้ั ตอนการตรวจไม่ยุง่ ยาก อ่านผลได้รวดเรว็ ราคาไมส่ ูงเกินไป สามารถใชต้ รวจคดั แยกตัวอยา่ ง จ�านวนมาก ได้ในระยะเวลาอนั สัน้ และสามารถน�าไปใชใ้ นสถานทต่ี ่างๆ นอกห้องปฏิบตั ิการ (on-site) ได้อย่างสะดวก โดยไม่จ�าเป็นต้องใช้เครื่องมือพิเศษ หรือใช้บุคลากรท่ีมีความรู้ หรือมี ทกั ษะสงู 2. การตรวจยืนยันผล มีจดุ ประสงคเ์ พ่ือเปน็ การนา� ตัวอยา่ งปัสสาวะท่ีใหผ้ ลบวกในข้นั ตอน การตรวจเบ้ืองต้นมาตรวจยืนยนั อีกคร้งั ในห้องปฏบิ ตั กิ าร วา่ มีสารเสพติดหรอื ไม่ โดยการตรวจดว้ ย เทคนิคโครมาโตกราฟ ี (chromatography) เชน่ โครมาโทกราฟแี บบแผน่ บาง (TLC) ไฮเพอร์ฟอร์ แมนซล์ คิ วดิ โครมาโทกราฟ ี (HPLC) แกส๊ โครมาโทกราฟ ี (GC) แก๊สโครมาโทกราฟ-ี แมสสเปคโทเมท รี (GC-MS) ลิควิดโครมาโตกราฟ-ี แมสสเปคโทเมทร ี (LC-MS) เป็นตน้

4 วธิ มี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ ูจนส ารเสพติดในปสสาวะ เลมที่ 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย วิธกี ารตรวจหาสารเสพติดด้วย TLC เปน็ วธิ กี ารท่มี ีความถูกต้อง สะดวก คา่ ใชจ้ า่ ยน้อย หอ้ ง ปฏิบัตกิ ารทั่วไปสามารถท�าได้ ส่วนวิธ ี GC GC-MS HPLC และ LC-MS เป็นวิธกี ารทีม่ คี วามถกู ต้อง สงู และมคี า่ ใชจ้ ่ายสูงเนื่องจากเคร่อื งมอื มรี าคาแพง และผู้ปฏบิ ตั ิงานต้องมคี วามรู้ความช�านาญสงู ในการใช้เครื่องมอื และการแปลผล โอกาสทจี่ ะตรวจพบสารเสพตดิ ในปสั สาวะมคี วามสมั พนั ธก์ บั ชว่ งเวลาทเ่ี กบ็ ตวั อยา่ งและชว่ ง เวลาทเ่ี สพดงั แสดงในตารางท1ี่ ถา้ ชว่ งเวลาทเี่ กบ็ ตวั อยา่ งใกลเ้ คยี งกบั ชว่ งเวลาทเ่ี สพครงั้ หลงั สดุ มาก เกินไป มีโอกาสสูงที่จะตรวจไม่พบสารเสพติดในปัสสาวะเนื่องจากสารเสพติดยังไม่ถูกขับออกจาก ร่างกาย นอกจากนนั้ จะตอ้ งทราบชนดิ ของสารเสพติดและสารเมตาบอไลตข์ องสารเสพติดน้ันๆ ซง่ึ เกิดขึ้นในกระบวนการเผาผลาญสารเสพติดของร่างกายท�าให้สารเสพติดเปลี่ยนแปลงโครงสร้างไป และถกู ขับออกจากรา่ งกายทางปสั สาวะ ดงั แสดงในตารางท ่ี 2 ตารางท่ี 1 ชว งเวลาทีม่ ีโอกาสตรวจพบสารเสพติดในปสสาวะ แบง ตามชนดิ ของสารเสพตดิ และลกั ษณะการเสพ (4) ชนดิ สารเสพตดิ ผู้เสพไมป ระจ�า ผ้เู สพประจา� ผ้เู สพเรอื้ รงั แอมเฟตามนี 1-3 วัน 2-6 วัน 2-3 สัปดาห์ เมทแอมเฟตามีน 1-3 วนั 2-6 วนั 2-3 สัปดาห์ 1-3 วัน 2-6 วนั 2-3 สปั ดาห์ ยาอี 2-5 วนั 4-14 วนั อาจนานถึง 2-3 เดือน กัญชา 12-48 ชม. 1-4 วนั อาจนานถึง 2-3 สัปดาห์ โคคาอีน 12-48 ชม. 2-6 วัน อาจนานถึง 2-3 สัปดาห์ มอร์ฟนี 1-3 วนั 2-5 วนั อาจนานถงึ 2-3 สัปดาห์ โคเดอนี 2-5 วนั 4-14 วนั อาจนานถงึ 1 เดือน เบนโซไดอาซิปนส์

วธิ ีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสจู นสารเสพติดในปส สาวะ เลมท่ี 1 5 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย ตารางท่ี 2 ชนิดสารเสพตดิ สารสา� คัญ สารเมตาบอไลต์ และสารที่ตรวจพบไดใ้ นปสสาวะ (3) ชนิดสารเสพตดิ สารส�าคัญ สารเมตาบอไลต์ สารท่ีตรวจพบได้ใน ปสสาวะ ยาบ้า/ยาไอซ์ เมทแอมเฟตามนี แอมเฟตามีน เมทแอมเฟตามนี แอมเฟตามนี ยาอี 3,4 เมทิลลีนไดออกซีเมท- 3,4 เมทิลลนี ไดออกซี MDMA แอมเฟตาม(ี MDMA) แอม-เฟตามนี (MDA) MDA ยาเลฟิ 3,4 เมทิลลนี ไดออกซี 3,4 เมทิลลนี ไดออกซี MDA แอม-เฟตามนี (MDA) แอม-เฟตามนี (MDA) กัญชา 11-นอร์-เดลต้า-9- เฮโรอีน เตตรา-ไฮโดรแคนนา 11-นอร์-เดลตา้ -9-เตตรา- มอรฟ์ นี สารกลมุ่ แคนนาบนิ อยด์ บินอล คาร์บอกซิลคิ ไฮโดรแคนนาบินอล โคเดอนี เตตราไฮโดรแคนนาบินอล คารบ์ อกซิลิคแอซดิ แอซดิ (THC) (11-Nor-∆9 -THC- (11-Nor-∆9 -THC-COOH) COOH) เฮโรอนี มอรฟ์ นี มอร์ฟนี 6-โมโนอะเซตลิ 6-โมโนอะเซตลิ มอรฟ์ ีน มอร์ฟนี (6MAM) (6MAM) มอรฟ์ นี มอรฟ์ นี -3-กลูคิวโรไนด ์ มอร์ฟนี (M3G) มอรฟ์ ีน-3-กลูคิวโรไนด์ (M3G) โคเดอนี มอรฟ์ นี โคเดอีน มอร์ฟนี โคเดอนี โคเดอีน-6-กลคู ิวโร โคเดอนี -6-กลูควิ โรไนด ์ ไนด์ (C6G) (C6G) โคคาอนี โคคาอนี เบนโซอลิ เอคโกนีน เบนโซอลิ เอคโกนีน สารกลมุ่ เบนโซ สารกลมุ่ เบนโซไดอาซปิ น ส์ สารกลุ่มเบนโซไดอา สารกลุ่มเบนโซไดอาซิปน ส์ ไดอาซิปน ส์ ซปิ นส์

6 วิธมี าตรฐานสําหรบั การตรวจพิสจู นสารเสพติดในปส สาวะ เลม ที่ 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 1.3 เกณฑ์ตดั สินผลบวกวาเปน ผมู้ ีสารเสพตดิ ในรางกาย (1) ค่าเกณฑ์ตัดสินผลบวก (cut-off) ซึ่งหมายถึงปริมาณต�่าสุดของสารเสพติดในปัสสาวะท ี่ กฏหมายก�าหนดและใช้เป็นเกณฑ์ตัดสินว่ามีสารเสพติดอยู่ในปัสสาวะหรือไม่ เกณฑ์ตัดสินว่ามีสาร เสพติดอยู่ในปัสสาวะตามประกาศคณะกรรมการป้องกันและปราบปรามยาเสพติด เร่ืองก�าหนด หลกั เกณฑ์ วิธีการ และเง่อื นไขการตรวจหรือทดสอบวา่ บคุ คล หรอื กลุม่ บุคคลใดมีสารเสพติดอยใู่ น รา่ งกายหรือไม ่ พ.ศ. 2543 ดงั แสดงในตารางท ี่ 3 ตารางที่ 3 ชนดิ สารเสพติด ประเภทยาเสพตดิ ใหโ้ ทษ และเกณฑต์ ัดสิน สารเสพตดิ /วตั ถุออกฤทธ์ิ ประเภทยาเสพติดใหโ้ ทษ เกณฑต์ ดั สนิ (นาโนกรมั /มลิ ลิลิตร) กลุ่มแอมเฟตามีน (Amphetamines) ยาเสพติดใหโ้ ทษประเภท 1 1000 กล่มุ ยาอี(MDA, MDMA และ MDE) ยาเสพติดใหโ้ ทษประเภท 1 1000 กลุม่ โคเคน (Cocaine) ยาเสพติดใหโ้ ทษประเภท 2 300 กลุ่มโอปเ อตส์ (Opiates) ยาเสพติดใหโ้ ทษประเภท 2 300 กลุ่มกัญชา (Canabinoid) ยาเสพติดให้โทษประเภท 5 50

วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ ูจนสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ท่ี 1 7 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 1.4 เมตาบอไลต์ของสารเสพติด สตู รโครงสรา้ งและมวลโมเลกลุ กระบวนการเมตาบอลิซึม คือกระบวนเปล่ียนแปลงสารทางเคมี ที่เกิดขึ้นในเซลล์สิ่งมีชีวิต สารทีเ่ กิดขนึ้ เรียกเมตาบอไลต ์ เมตาบอไลต์ของสารแบง่ ตามกล่มุ ของสารเสพตดิ แสดงดงั รูปท่ี 1 ถึง รปู ท ่ี 5 Hydrocodone, MW 299.36 Hydromorphone, MW 285.34 Heroin, MW 369.41 Codeine, MW 299.36 6-Monoacetylmorphine, MW 327.37 Norcodeine, MW 285.34 Morphine, MW 285.34 Codeine-6-glucuronide, Normorphine, MW 271.31 MW 475.49 Norcodeine-6-glucuronide, Morphine-3-glucuronide, MW 461.46 MW 461.46 Normorphine-6-glucuronide, MW 447.44 รปู ที่ 1 เมตาบอไลตข์ องกลุม ฝน (5)

8 วิธีมาตรฐานสําหรับการตรวจพสิ ูจนส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 3,4-methylenedioxy Methamphetamine (MDMA), 3,4-dihydroxyMethamphetamine (DHMA), MW 193.2 MW 181.2 3,4-methylenedioxy Amphetamine (MDA), 4-hydroxy-3-methoxy Methamphetamine (dHMMA), MW 179.2 MW 195.3 3,4-dihydroxyAmphetamine (DHA), MW 167.2 4-hydroxy-3-methoxyAamphetamine (dHMA), MW 181.2 รูปที่ 2 เมตาบอไลตข์ อง MDMA (6) Methamphetamine 4-Hydroxymethamphetamine, MW 165.23 MW 149.23 Amphetamine, MW 135.2 4-Hydroxyamphetamine 4-Hydroxynorephedrine MW 151.2 MW 167.2 Norephedrine, MW 151.2 4-Hydroxyphenylacetone Phenylacetone Benzoic acid Hippuric acid, MW 179.17 MW 150.17 MW 134.18 MW 122.12 รูปท่ี 3 เมตาบอไลต์ของเมทแอมเฟตามีน (7)

วิธมี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ จู นส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 9 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย Delta-9 tetrahydrocannabinol, MW 314.46 8-hydroxy-delta-9 tetrahydrocannabinol, MW 331.47 11-hydroxy-delta-9 tetrahydrocannabinol, 8,11-hydroxy-delta-9 tetrahydrocannabinol, MW 348.48 MW 331.47 11-nor-9-carboxy-delta-9 tetrahydrocannabinol, MW 344.45 รปู ที่ 4 เมตาบอไลตข์ อง Delta-9 tetrahydrocannabinol (8) Norcocaine, MW 289 Cocaethylene, MW 317 Cocaine, MW 303 Benzoxylecgonine, MW 289 Ecgonine methylester, MW 199 Ecgonine, MW 185 รูปท่ี 5 เมตาบอไลต์ของกลมุ โคเคน (9)

10 วธิ มี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ ูจนส ารเสพติดในปส สาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 1.5 หลกั การทางโครมาโทกราฟ (10) โครมาโทกราฟเี ปน็ วธิ กี ารหนง่ึ ทใ่ี ชแ้ ยกสารผสม โดยอาศยั ความแตกตา่ งในการกระจายตวั ของ สารแต่ละชนดิ ในวฏั ภาคนิง่ (stationary phase) หรือตัวดดู ซบั (adsorbent) และวัฏภาคเคล่ือนที่ (mobile phase) หรือตวั ท�าละลาย หรือตัวชะ (eluent) สารต่างชนดิ กนั มีความสามารถในการ แยกทแ่ี ตกต่างกัน ทงั นข้ี นึ้ อยกู่ ับความสามารถในการดูดซับ (adsorbtion) ที่แตกตา่ งกัน โดย พบ ว่าประสิทธภิ าพของการแยกสารขึ้นอยูก่ ับชนดิ ของตวั ดดู ซับ และตวั ชะ ตัวดูดซบั แตล่ ะชนดิ มีความ สามารถในการดูดซับสารไว้บนพ้ืนผิวได้ต่างกัน ตัวดูดซับมีขั้วสามารถดูดซับสารมีขั้วได้ดีกว่าสาร ไม่มขี ั้ว ดังน้ันสารไมม่ ีขว้ั จงึ ถูกชะออกมาก่อนสารมีขว้ั ตัวดูดซับท่นี ยิ มใชค้ อื alumina ใช้แยกสาร ท่เี ปน็ เบส silica gel ใชแ้ ยกสารได้เกอื บทุกชนดิ โดยเฉพาะสารท่เี ป็นกรด เปน็ กลาง หรือเปน็ เบส ออ่ น และยงั มตี ัวดูดซบั อน่ื ๆ เช่น Calcium carbonate, Activated carbon, Tlorisil, Sucrose, Starch, และ Icing sugar ตัวชะท�าหน้าที่ละลายสารออกจากวัฏภาคนิ่ง ตัวชะมีความสามารถในการชะสารด้วย ความเร็วท่ีแตกต่างกัน ตัวชะที่มีข้ัวสูงจะพาสารเกือบทุกชนิดเคลื่อนที่ไปได้เร็ว ในขณะที่ตัว ชะที่มีขั้วต�่าจะพาสารที่ถูกดูดซับน้อยออกมาก่อน ดังนั้นในการเลือกตัวชะท่ีเหมาะสมกับ ชนิดของตัวดูดซับและประเภทของสารที่ต้องการแยก จะท�าให้ความสามารถในการแยกสาร บริสุทธ์ิมีประสิทธิภาพสูงสุด โดยพบว่าในการเพ่ิมข้ัวของตัวชะน้ัน จะต้องค่อยๆเพ่ิมหรือมีการ เปลี่ยนแปลงขั้วอย่างระมัดระวังเพื่อป้องกันไม่ให้เกิดการแยกของวัฏภาคน่ิง ในคอลัมน์เกิดข้ึน 1.5.1 โครมาโทกราฟแบบแผนบาง ( Thin-layer chromatography; TLC ) เป็นเทคนิคแยกสาร แบบของแข็ง - ของเหลว โดยใช้ alumina หรอื silica gel เป็นวฏั ภาคนิง่ เคลือบเป็นแผ่นบางๆ หนาประมาณ 0.25 - 1.00 mm บนกระจกหรือบนแผ่น Aluminum และใช้ตัวทา� ละลายเป็นวฏั ภาคเคลื่อนทใี่ นโครมาโตกราฟ ี แบบแผ่นบางน ี้ ของเหลวเคล่ือนตวั ผา่ น วฏั ภาคนง่ิ ขน้ึ ในแนวตง้ั โครมาโตกราฟแี บบแผน่ บางนมี้ ปี ระโยนอ์ ยา่ งมากในการวเิ คราะหเ์ ชงิ คณุ ภาพ แบบงา่ ยและใชส้ ารในการวเิ คราะหป์ รมิ าณนอ้ ย แตก่ ม็ ขี อ้ เสยี คอื ใชใ้ นการแยกสารปรมิ าณ มากๆ ไม่ ดนี กั การตรวจวัด แสงอัลตราไวโอเลต (UV) เหมาะสมต่อการสังเกตต�าแหน่งสารโดยใช้ ความยาวคลนื่ สนั้ ท ี่ 254 nm และความยาวคลืน่ ยาวที่ 365 nm ( อนั ตราย แสง UV เปน็ อนั ตราย ต่อดวงตาและผิวหนัง จงึ ควรใช้เวลาสัมผัสกบั แสง UV ใหส้ ้นั ทีส่ ดุ ) และพน่ ดว้ ยนา�้ ยาเพอ่ื ใหจ้ ุดสาร มองเห็นได้

วิธีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพิสูจนสารเสพติดในปส สาวะ เลม ท่ี 1 11 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 1.5.2 แกส โครมาโทกราฟ ( Gas chromatography; GC )(11,12) เป็นเทคนิคการแยกสาร ที่ม ีขั้วต�่า สารตัวอย่างต้องระเหยเป็นแก๊สหรือไอ ณ จุดฉีดสาร carrier gas เปน็ วัฏภาคเคลอื่ นทีพ่ าสารเข้าสคู่ อลมั น์ซง่ี มีวัฏภาคนิง่ ชนดิ ของเหลว หรือของแข็ง ท�า หนา้ ทแ ี่ ยกสารและถกู ตรวจวดั ในส่วนของตัวตรวจวัด แบ่งออกเป็น 2 ชนิดคือ Gas liquid chromatography (GLC) ใช้หลกั การ การแบง่ สว่ น (partition) คอื สารผสมที่ ตอ้ งการแยกอยู่ในสภาพทเ ่ี ป็น แกส๊ หรอื ไอ เมอื่ สารผสมผ่านเข้าสคู่ อลัมน์ สารผสมจะแยกออกจาก กันด้วยความแตกต่างในการกระจายตัวในวฏั ภาคเคลือ่ นที ่ และวัฏภาคน่งิ วฏั ภาคนง่ิ เปน็ ของเหลว ท่ีเคลือบอยู่บนผิวของ inert solid support Gas solid chromatography (GSC) ใช้หลักการ การดูดซับ โดยวัฏภาคนิ่งเป็นของแข็ง สามารถดดู ซบั สารโมเลกลุ เลก็ ๆ ทสี่ ามารถเปล ยี่ นเปน็ แกส๊ หรอื ไอ โดยม ี active solids (adsorptive particles) บรรจุอยู่ในคอลัมน์เป็น molecular sieves หรือ porous polymers, silica gel, alumina และ activated carbon การตรวจวัด ชนดิ ของตัวตรวจวัดขน้ึ กบั ชนิดของสารประกอบท่จี ะวเิ คราะห ์ บนั ทกึ ผลการ ตรวจวัดในรูปแบบความสัมพันธ์ของเวลาและการตอบสนองของเครื่องมือ การหาค่าพ้ืนท่ีของพีค หรอื ความสูงของพคี สามารถบง่ บอกปรมิ าณของสารได้ ตารางที่ 4 คุณสมบัตขิ องตวั ตรวจวัดโดยเทคนคิ แกสโครมาโทกราฟ (10) ตวั ตรวจวัด ความจา� เพาะ ความไว Flame ionization (FID) สารประกอบอินทรยี ท์ ่ีสามารถถูกออกซไิ ดส.์ 10-12 Thermal conductivity (TCD) สารประกอบอินทรยี ์. 10-10 Electron capture (ECD) Halides, Nitrates, Nitriles, Peroxides, Anhy- 10-14 drides, Organometallics Nitrogen-phosphorus Nitrogen, Phosphorus 10-8 Flame photometric (FPD) Sulphur, Phosphorus, Tin, Boron, Arsenic, 10-9 Photo-ionization (PID) Germanium, Selenium, Chromium Aliphatics, Aromatics, Ketones, Esters, Aldehydes, Amines, Heterocyclics, Organo- 10-11-10-12 sulphurs, Some organometallics Hall electrolytic conductivity Halide, Nitrogen, Nitrosamine, Sulphur 10-8

12 วธิ มี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ ูจนส ารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 1.5.3 ไฮเพอรฟ์ อรแ์ มนซ์ลคิ วิดโครมาโทกราฟ ( Hyperformance liquid chromatography, HPLC ) เป็นเทคนิคแยกสารประกอบ ที่ผสมอยู่ในตัวอย่าง โดยกระบวนการแยกเกิดข้ึน ระหว่าง 2 วัฎภาค คือ วัฎภาคนิ่ง หรือคอลัมน์ ( column ) กับวัฎภาคเคลื่อนท่ี ซ่ึงจะถูก แยกออกมาในเวลาที่ต่างกัน สารผสมที่อยู่ในตัวอย่าง สามารถถูกแยกออกจากกันได้น้ัน จะ ขึ้นอยู่กับความสามารถในการเข้ากันได้ดีของสารน้ัน กับวัฎภาคเคลื่อนท่ี โดยสารประกอบ ท่ีสามารถเข้ากันได้ดีกับวัฎภาคเคลื่อนที่จะถูกแยกออกมาก่อน ส่วนสารท่ีเข้ากันได้ไม่ดีกับ วัฎภาคเคล่ือนท่ีหรือเข้ากันได้ดีกับวัฎภาคนิ่งก็จะถูกแยกออกมาทีหลัง การตรวจวดั ชนิดของตวั ตรวจวัดท่ีใชข้ ึ้นกับชนดิ ของสารประกอบทีจ่ ะวิเคราะห ์ และตามท่ี ระบไุ ว้ในเอกสาร ตารางท่ี 5 คณุ สมบัตขิ องตัวตรวจวดั โดยเทคนคิ ลคิ วิดโครมาโทกราฟ( 13) ชนิด ความจา� เพาะ ความไว ผลตอ ผลตอ (ก/มล) อณุ หภูมิ อตั รา การไหล UV-VIS ส�าหรบั สารทมี่ ีหมู่ chromophore 5 5x10-10 น้อย ไม่มีผล Fluorescence สา� หรับสารท่ีสามารถเปรง่ แสงฟลูออเรเซนซ์ 10-10 นอ้ ย ไม่มผี ล Mass วัดมวลโมเลกลุ ของสารตอ่ ประจ ุ โดยเปลยี่ น 10-10 ไม่มผี ล ไม่มผี ล Spectrometry สารตัวอย่างให้เป็นไอออน Refractive วัดค่าความแตกตา่ งดัชนีหักเหของสารตัว 5x10-7 ± 10-4 OC ไม่มผี ล Index อย่างและวัฏภาคเคลือ่ นท่ี Electro วัดปฏิกริ ยิ าออกซเิ ดชนั รดี กั ชน่ั ทางเคมี 10-8 ± 1 OC มีผล chemical ไฟฟ้า ความไวสงู และเฉพาะ

วธิ มี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นสารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ท่ี 1 13 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 1.5.4 การเลอื กเทคนิคโครมาโทกราฟใหเ้ หมาะกับงาน ตารางที่ 6 เปรยี บเทียบคุณสมบัตแิ ละประสิทธิภาพของเทคนิคTLC HPLC และ GC (10,11) หวั ขอ้ TLC HPLC GC ชนิดของวัฏภาคน่ิง silica, alumina, silica, alumina, a film of a polymer ชนดิ ของวัฏภาคเลือ่ นท่ี polymer polymer or a wax ของเหลว ของเหลว แก๊ส ความจา� เพาะเจาะจง ต่�า สูง สงู ความไว ต่�า สูง สงู กว่า HPLC ประสทิ ธิภาพการแยก ตา่� สงู สูงกวา่ HPLC ประสทิ ธภิ าพในการ นอ้ ย มาก มาก วิเคราะห์ น้อย มาก มากกว่าHPLC จ�านวนตวั อยา่ งต่อ ของเหลว ของเหลว ของแข็ง,ของเหลวท่ี หน่วยเวลา สารมีขัว้ สารมีขั้วและไมม่ ีข้วั ระเหยได้ และแก๊ส แคบกว่า GC สารมขี ้ัวและไมม่ ขี ้วั จ�านวนสารทีต่ รวจ ได้ทกุ ชนดิ กว้างกวา่ GC วิเคราะหต์ ่อการ ไม่ยุง่ ยาก ได้ทุกชนิด 2 - 800 g/mL ถงึ µg/mL ไม่สลายตวั ทค่ี วามร้อนสงู วิเคราะห์ เชิงคณุ ภาพและกึ่ง คณุ สมบัติของตัวอย่าง ปรมิ าณ มีวิธีเตรียมหลากหลาย ยงุ่ ยากกวา่ HPLC สถานะ mg/mL ถงึ pg/mL ต�่ากว่า µg/mL ความเปน็ ขั้ว เชงิ คุณภาพและปริมาณ เชิงคุณภาพและปรมิ าณ มวลโมเลกลุ ความคงสภาพ การเตรียมตัวอย่างกอ่ น ตรวจวเิ คราะห์ ความเข้มข้นในการ ตรวจวเิ คราะห์ ประเภทของงานตรวจ วเิ คราะห์ Waste Solvent นอ้ ยกวา่ HPLC มาก ไม่มี

14 วธิ มี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ ูจนสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมที่ 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย ตารางท่ี 6 เปรยี บเทียบคณุ สมบัติและประสิทธภิ าพของเทคนิคTLC HPLC และ GC (10,11) (ตอ) หัวข้อ TLC HPLC GC น้อยกวา่ TLC น้อย ความอันตรายจากสาร มาก มคี วามซับซอ้ นกว่า GC มคี วามซับซอ้ น เคมี ไม่ซบั ซอ้ น สงู เข้าใจง่าย สูง ความซับซอ้ นของ เครื่องมอื สูง ราคาเครอ่ื งมอื และการ บ�ารงุ รักษา 1.5.5 นยิ ามศัพท์ ตารางที่ 7 นยิ ามศัพทท์ างโครมาโทกราฟ (14) คา� ศพั ท์ สัญญ ความหมาย และสตู รค�านวณ ลกั ษณ์ Number of theoretical N ความสามารถในการแยกสาร แสดงถึงประสทิ ธิภาพของ plates หรอื คอลมั น์ ควรมีค่ามากกวา่ 2,000 ตอ่ คอลัมน์ Column efficiency N(ร า=ย ล1ะ6เ อ(tยี R/ดWแส)2ด งดงั รปู ท่ี 6) Capacity factor k’ ค่าท่ีบอกความสามารถในการจับสารที่จะวเิ คราะหไ์ ว้ใน คอลมั น์ Hold-up time หรือ tM เวลาทีว่ ฏั ภาคเคล่ือนทใ่ี ชใ้ นการเคล่ือนที่ผ่านคอลัมน ์ Dead time หรอื หมายถึง เวลาของ unretain solvent peak Hold-up volume Vm ปริมาตรของวฏั ภาคเคลือ่ นทีผ่ า่ นคอลมั นข์ อง unretain component Dwell volume หรอื D ปรมิ าตรของวัฏภาคเคลอ่ื นท่ภี ายในทอ่ ระหว่างปัม้ ถึง gradient delay volume คอลัมน์ Retention factor Rf อัตราส่วนของระยะทางทีส่ ารเคล่อื นทไ่ี ป ตอ่ ระยะทาง ที่ตัวท�าละลายเคล่ือนท่ีไป เวลาที่สารใชใ้ นการเคลอื่ นทีต่ ้งั แต่ ฉดี สาร (inject) ถงึ จุดสงู สุดของพคี Retention time tR ส�าหรับการตรวจเอกลกั ษณ ์ : สารที่สนใจในตวั อยา่ ง และ ในสารอา้ งอิง ไม่มากกวา่ 2 เปอร์เซน็ หรือ ±0.1 นาท ี (15)

วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพิสูจนสารเสพติดในปสสาวะ เลม ท่ี 1 15 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย ตารางท่ี 7 นิยามศัพทท์ างโครมาโทกราฟ (14) (ตอ) คา� ศพั ท์ สญั ญ ความหมาย และสตู รค�านวณ Retention volume ลักษณ์ Relative retention time VR ปริมาตรของวัฏภาคเคลอ่ื นท่ี ทใ่ี ชส้ า� หรับการชะสาร Resolution ออกจากวฏั ภาคนงิ่ เวลาท่ีสารใช้ในการเคลื่อนที่ ต้งั แต่ฉดี สารถงึ จุดสงู สุด ของพคี RRT ส�าหรับการตรวจเอกลักษณ์ : สารท่ีสนใจเทยี บกับ สารประกอบอา้ งอิงวสั ดุอา้ งอิง ควรอยใู่ นชว่ ง ±0.1 เปอร์เซ็นต์ เป็นค่าพารามเิ ตอร์ท่ีใชบ้ อกความสามารถในการแยก พคี ออกจากกัน RS ควรมคี า่ เท่ากบั หรอื มากกว่า 1.5 (รRาS ย=ล ะ2เ อ×ยี (ดtRแ2ส- ดtRง1ด) งั/ร (ปู Wท1 ่ี 6+) W2) Separation factor หรอื ความสามารถของวัฏภาคน่ิงในการดูดซับหรอื ละลาย selectivity a ตวั อย่างสองชนดิ ปกติมีค่ามากกว่า 1 อตั ราส่วนสญั ญาณระหวา่ งสัญญาณท่ีตอ้ งการกบั สัญญาณรบกวน Signal-to-noise ratio S/N S/N = 2H/h (รายละเอยี ดแสดงดังรูปท ่ี 7) System suitability พิจารณาจาก Symmetry factor  เปอร์เซน็ ต์คา่ เบี่ยงเบนมาตรฐานสมั พัทธ ์ (%RSD) ของ ความสงู ของพคี หรือ พ้นื ท่ีของพคี หรือ เวลา ทส่ี ารใชเ้ คล่อื นทผ่ี ่านคอลมั น ์  Resolution  Tailing factor  Number of theoretical plates คา่ ที่แสดงความสมมาตรฐานของพีค หรอื Tailing factor (T) AS (รAายS ล=ะ Wเอ0ีย.0ด5/แ2สfดงดงั รูปที่ 8)

16 วธิ ีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปส สาวะ เลมท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย รูปที่ 6 โครมาโทแกรมของการแยกสาร 2 ชนิด tR1 และ tR2 คอื retention time ของพคี ท่ ี 1 และ 2 ตามล�าดบั h คือ ความสงู ของพีค h/2 คอื ความสงู ครง่ึ หนงึ่ ของความสูงทง้ั หมด Wh/2 คือ ความกวา้ งทค่ี วามสูงครง่ึ หนงึ่ ของความสงู ทง้ั หมด W1 และ W2 คือ ความกว้างของพคี ท ี่ 1 และ 2 ที่เสน้ ฐาน รปู ที่ 7 โครมาโทแกรมของ noise และ พคี H คือความสูงของพคี

วธิ มี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นสารเสพติดในปส สาวะ เลม ที่ 1 17 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย h คอื ความสูงของ noise รูปท่ี 8 Asymmetrical chromatography peak f คอื ความกวา้ งของพีคสว่ นหนา้ ที่ความสูง 0.05h Wh0.05 คอื ความกว้างของพีคส่วนหลังที่ความสูง 0.05h คอื ความสูงของพีค 0.05h คือ 0.05 ของความสงู ของพคี

18 วิธมี าตรฐานสําหรับการตรวจพิสจู นส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ที่ 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 1.6 การปรับสภาวะการท�างานทางเทคนคิ โครมาโทกราฟ (14) 1.6.1 การปรับสภาวะการท�างานทางเทคนิค HPLC ตามข้อกา� หนดของ USP37-NF-32 ในการวิเคราะหโ์ ดยเทคนคิ HPLC สามารถปรับระบบการท�างานจากวธิ ีมาตรฐาน โดยไม่ต้อง ทา� การตรวจสอบควมถกู ตอ้ ง (method validation) รายละเอียดดงั ตารางที่ 8 ตารางท่ี 8 การปรับสภาวะการทา� งานทางเทคนิค HPLC ตามข้อกา� หนดของ USP 37-NF-32(14) หวั ข้อ Isocratic เกณฑ์ก�าหนด Gradient ขนาดอนภุ าค L / dp Ratio Constant ไม่สามารถปรับเปล่ยี นได้ ของวฏั ภาคน่งิ ไมส่ ามารถปรับเปล่ียนได้ ความยาวคอลมั น์ or N: -25 to + 50% อตั ราการไหล F 2 − F1×แ(dลcะ22 × ±d5p01%)/ (dc12×dp2) ไมส่ ามารถปรบั เปล่ียนได้ ชนดิ ของคอลมั น ์ สามารถปรบั เปล่ยี นไดแ้ ต่ตอ้ งใหค้ า่ ที่ ไมส่ ามารถปรับเปล่ียนได้ column ID เป็นเส้นตรงทค่ี งที่ สามารถปรบั เปลีย่ นไดแ้ ต่ตอ้ งใหค้ ่าที่ สามารถปรับเปล่ียนไดแ้ ต่ต้องใหค้ า่ ทเ่ี ปน็ ปรมิ าณการฉดี เปน็ เสน้ ตรงและอย่ใู นขอบเขตของ เสน้ ตรงและอยู่ในขอบเขตของ limit of limit of detection detection อณุ หภมู คิ อลมั น์ ± 10% ± 10% คา่ pH ของวัฏ ± 0.2 หน่วย ± 0.2 หน่วย ภาคเคลื่อนท่ี ความเข้มขน้ ของ สามารถปรบั ได้ ± 10% ของคา่ ที่ สามารถปรบั ได้ ± 10% ของคา่ ที่ก�าหนด เกลอื ใน Buffer ก�าหนด อัตราสว่ นของวัฏ A : B โดยท ี่ A > B ไมส่ ามารถปรับเปลย่ี นได้ ภาคเคลอ่ื นท่ี ปรบั ได้สูงสดุ 30% relative แต่ไม่ เกิน 10% absolute ความยาวคลื่น ไม่สามารถปรบั เปลย่ี นได้ ไมส่ ามารถปรับเปลีย่ นได้ UV-Visible ( ผลจากการตรวจสอบเครื่องยอมให้ ( ผลจากการตรวจสอบเครื่องยอมให้ตา่ ง Detector ต่างได ้ ± 3 nm ) ได้ ± 3 nm ) หมายเหตุ Fdd1pc 1ค1 คือคอื อื อ เัตคสรว้นาาผกมา่ายนราไศวหูนคลอยทก์ลรี่ ลมั ะานบง์ทุ ค ี่รอ(mะลบัมl ุ/นmท์ in่ีระ) บ ุ ddF2pc 2ค2 คือคือ อื อ เตัคสรว้นาาผกมา่ายนราไศวหนูคลอยท์กลเ่ี ลมัปานลง์ท่ียคนจ่ี อะ ล(ใmัมชน้l/์ทmจ่ี iะnใ)ช้

วธิ มี าตรฐานสําหรับการตรวจพิสจู นส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ท่ี 1 19 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 1.6.2 การปรบั สภาวะการทา� งานทางเทคนิค GC ตามขอ้ ก�าหนดของ USP 37-NF-32 (14) ในการวเิ คราะหโ์ ดยเทคนิค GC สามารถปรบั ระบบการทา� งานจากวิธมี าตรฐาน โดยไม่ต้อง ท�าการตรวจสอบควมถูกต้อง ( method validation ) รายละเอยี ดดังตารางที ่ 9 ตารางที่ 9 การปรับสภาวะการทา� งานทางเทคนิค GC ตามขอ้ กา� หนดของ USP 37-NF-32 หวั ขอ้ เกณฑก์ า� หนด ความยาวคอลัมน์ ปรบั ได้ในชว่ ง ± 70 % ของคา่ ทก่ี า� หนด เสนผานศูนยก ลางในคอลัมน ปรบั ไดใ้ นช่วง ± 50 %. ของค่าที่ก�าหนด ความหนาของฟล ม (capillary GC) ปรับไดใ้ นชว่ ง -50 % to 100 %. ของค่าทก่ี �าหนด ขนาดอนภุ าคของวัฏภาคนิง่ เปลีย่ นจากขนาด ใหญ่ไปเลก็ หรอื ขนาดเล็กไปใหญ ่ หากอยใู่ น เกณฑย์ อมรับของ system suitability อตั ราการไหล ปรับได้ในชว่ ง ± 50 %.ของคา่ ทีก่ �าหนด ปรมิ าณการฉีด/การทิ้ง สามารถปรบั ไดห้ ากคา่ ฉีดซา�้ ยงั อยูใ่ นเกณฑท์ กี่ �าหนด อณุ หภูมิของ oven ปรบั ไดใ้ นช่วง ± 10 %.ของค่าที่ก�าหนด โปรแกรมอุณหภมู ิของ oven สามารถปรบั ได้ ตา่ งจากจดุ ที่ก�าหนด ± 20 %

20 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ จู นสารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 1.7 เกณฑก์ ารคัดเลือกวธิ ีมาตรฐานการตรวจพสิ จู น์สารเสพตดิ หนังสือเล่มน้ีได้รวบรวมวิธีตรวจพิสูจน์สารเสพติดปัสสาวะโดยพิจารณาจากหลักเกณฑ์ที่น่า เช่อื ถอื แบง่ เป็น 2 แบบ ดงั น้ี 1. วธิ ที ีผ่ า่ นการตรวจสอบความถูกต้องของวธิ ตี ามเกณฑม์ าตรฐานสากล กระบวนการตรวจสอบความถกู ตอ้ งของวธิ วี เิ คราะห ์ ( method validation ) ถกู นา� มาใชเ้ พอื่ ใหเ้ กดิ ความม่นั ใจว่าวธิ วี ิเคราะห์มีความถกู ต้อง แม่นย�า โดยทัว่ ไป guideline ในการใชท้ า� method validation ตามมาตรฐานสากลทไี่ ดร้ บั การยอมรบั จากทวั่ โลก ไดแ้ ก ่ “ guideline on bioanalytical method validation ” ของ european medicines agency ( EMA ) (16) และ “ guidance for industry: bioanalytical method validation ” ขององคก์ ารอาหารและยา ประเทศสหรฐั อเมรกิ า ( US FDA ) (17) 2. วิธที ผ่ี า่ นการรับรองตามระบบสากล ISO / IEC 17025 : 2005

วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสูจนสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 21 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 2.1 การตรวจเบ้อื งต้นสารเสพตดิ ในปสสาวะด้วยหลกั การภูมิคุ้มกันวทิ ยาโดยใช้ Rapid Test Kit 1. ขอบขา ย ( Scope ) เป็นวิธีมาตรฐานในการปฏิบัติงานตรวจหาสารเสพติดในปัสสาวะ ใช้เป็นมาตรฐานในการ ตรวจพิสูจน์เบื้องต้นเพ่ือเป็นวิธีท่ีใช้ตรวจเบื้องต้นเพ่ือหาสารเสพติดชนิดต่างๆ ในปัสสาวะ เช่น Methamphetamine MDMA Morphine Opiates THC Cocaine Benzodiazepines หรอื สารเสพติดอน่ื ๆ ด้วยหลกั การภูมคิ ุ้มกนั วิทยา 2. เอกสารอา้ งอิง ( Reference ) 2.1 รวมกฎหมายยาเสพติด พร้อมดว้ ยกฎกระทรวง ระเบียบ ข้อบงั คบั ทเ่ี กยี่ วข้อง, ส�านกั งาน ป.ป.ส. กระทรวงยุติธรรม พ.ศ.2552 หมายเลขเอกสารเผยแพร ่ 1-09-2552. 2.2 United Nation. Recommended Method for the Detection and Assay of Heroin Cannabinoids Cocaine Amphetamine and Ring substituted Amphetamine Derivatives in Biological Specimens, Manual for Use by Nation Laboratories, ST/NAR/27. New York : United Nation, 1995. 3. หลกั การ ( Principle ) ชดุ ทดสอบสารเสพตดิ ในปสั สาวะทม่ี จี า� หนา่ ยในทอ้ งตลาดใชห้ ลกั การ leteral flow testหรอื Immunochromatographic strip test ซง่ึ อาศัยการเกิดปฏิกิรยิ าระหวา่ งสารแอนติเจนและสาร แอนติบอดบี นแผ่นทดสอบทท่ี า� ดว้ ยไนโตรเซลลูโลส 4. เคร่อื งมือ และอปุ กรณ์ ( Apparatus ) 4.1 ชดุ ทดสอบหลักการภมู คิ ุ้มกันวทิ ยา ชนิดบรรจุตลบั เชน่ Methamphetamine MDMA Morphine Opiates THC Cocaine และ Benzodiazepines เปน็ ตน้ 4.2 ถงุ มือยาง 4.3 ปากกาชนดิ กนั น้�า

22 วธิ มี าตรฐานสําหรับการตรวจพสิ จู นสารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 5. วธิ ีด�าเนนิ การ ( Procedure ) 5.1 น�าตัวอยา่ งปัสสาวะ ออกจากต้เู ยน็ วางให้ตวั อยา่ งมีอุณหภมู ิใกลเ้ คียงอุณหภูมหิ อ้ ง 5.2 บันทึกรายละเอียดชดุ ทดสอบท่ใี ช้ เชน่ ยีห่ ้อ / ชื่อผลติ ภัณฑ์ วันหมดอายุ รุ่นทผ่ี ลติ เป็นตน้ 5.3 เตรียมชดุ ทดสอบ โดยฉกี ซองหรอื ใชก้ รรไกรตดั ออกจากซองบรรจ ุ เขียนรหสั ตัวอย่าง ปสั สาวะไวบ้ นตลับทดสอบ 5.4 หยดตวั อย่างปสั สาวะลงบนหลมุ ทดสอบ ใหต้ รงกับเลขรหสั ตัวอย่างปัสสาวะ โดยใช้ ปริมาณปัสสาวะตามทก่ี �าหนดในคมู่ อื ของชดุ ทดสอบของแตบ่ ริษทั ผผู้ ลิต 5.5 รอใหป้ สั สาวะเคลื่อนที่ผ่าน membrane แลว้ อ่านผลในเวลาท่กี �าหนดในคู่มือของ ชดุ ทดสอบของแตบ่ ริษัทผูผ้ ลิต 5.6 การอา่ นผล การอ่านผลบวก หรือผลลบ ของชุดทดสอบทใี่ ชห้ ลักการภมู คิ ุ้มกนั วิทยา โดยดูแถบสที ่ี เกิดขึ้น ณ ตา� แหนง่ ทดสอบ ( T ) และต�าแหนง่ ควบคมุ ( C ) ดังน้ี การอานผลบวก มีแถบสีมว่ งแดงเกิดขึน้ เพียงเส้นเดียว ณ ตา� แหน่งควบคุมคณุ ภาพ ( C ) และไมม่ ีแถบสีเกิด ขึน้ ณ ต�าแหน่งทดสอบ ( T ) การอานผลลบ มแี ถบสมี ่วงแดงเกดิ ข้ึน 2 เส้น ณ ต�าแหนง่ ทดสอบ ( T ) และ ต�าแหน่งควบคมุ คณุ ภาพ ( C ) แปลผลไมไ ด้ มี 2 กรณ ี คือ - ไมม่ ีแถบสีม่วงแดง ท้ังต�าแหน่งทดสอบ ( T ) และตา� แหนง่ ควบคมุ คุณภาพ ( C ) - เกิดแถบสมี ว่ งแดงเฉพาะตา� แหน่งทดสอบ ( T ) แตไ่ ม่มีแถบสี ณ ต�าแหนง่ ควบคุม ( C ) แสดงว่าชุดทดสอบนั้นเสื่อมคุณภาพ หรอื ผลติ ไม่ไดม้ าตรฐาน

วธิ ีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 23 กรมวิทยาศาสตรการแพทย Positive Negative Invalid Result ผลบวก ผลลบ ชุดทดสอบเส่ือมสภาพ 5.7 บันทกึ ผลลงในตารางแบบบันทึกผลการตรวจสารเสพตดิ ในปสั สาวะ ดังน้ี P หมายถึง ผลบวก N หมายถงึ ผลลบ PN หรอื NP หมายถงึ ผลบวก / ลบไมช่ ดั เจน 5.8 การแปลผล - กรณีให้ผลลบ รายงานผลตรวจไมพ่ บสารเสพตดิ นัน้ ๆ หรือท�าการตรวจยืนยนั - กรณีให้ผลบวกหรอื ใหผ้ ลบวกไม่ชัดเจน ต้องทา� การตรวจยืนยันผลทุกตัวอย่าง 6. การควบคมุ คณุ ภาพและผลการทดสอบ ( Assuring the quality of test results ) 6.1 ต้องศึกษาค่มู ือของชดุ ทดสอบก่อนการใชง้ านเสมอ และปฏบิ ัติตามขอ้ แนะนา� อยา่ ง เคร่งครัด เช่น การใชง้ าน ปรมิ าณปัสสาวะท่ใี ช้ เวลาการอา่ นผล การเก็บรกั ษา ชุดทดสอบ 6.2 ไมใ่ ช้ชดุ ทดสอบท�ีหมดอายุ ไมเ่ ปิ ดชดุ ทดสอบออกจากซองเป็นเวลานานก่อน การใช้ 6.3 ใช้หลอดดดู ดดู ปัสสาวะ 1 อนั ตอ่ ตวั อยา่ งปัสสาวะ 1 ตวั อยา่ ง เทา่ นนั� 6.4 ชดุ ทดสอบตอ้ งประเมินคุณภาพทุก 3 เดือน หรือกอ่ นการใชง้ าน กบั QC sample ทม่ี คี วามเขม้ ขน้ -50 % และ +50 % ของคา่ cut off

24 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปส สาวะ เลม ท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 2.2 การตรวจยนื ยนั เมทแอมเฟตามนี ในปส สาวะด้วยเทคนิค Thin Layer Chromatography ( TLC ) 1. ขอบขาย ( Scope ) เป็นวิธีมาตรฐานในการปฏิบัติงานตรวจยืนยัน Methamphetamine ในปัสสาวะ ที่ระดับ ความเขม้ ขน้ 500 ng/ml ข้นึ ไปโดยใชต้ วั อยา่ งปสั สาวะ 3 ml 2. เอกสารอ้างองิ ( Reference ) 1.1 นภาภรณ์ ปญั จะ การตรวจยืนยนั หายาม้าในปัสสาวะ ( Confirmatory Test of “ YA Ma ” in Urine ). นนทบรุ ,ี กรมวทิ ยาศาสตรก์ ารแพทย,์ ตลุ าคม 2538. 1.2 ดวงพร อภกิ ันตภันต ์ การตรวจหายาบา้ ในปัสสาวะ กองวิเคราะหว์ ตั ถุเสพตดิ กรมวทิ ยาศาสตร์การแพทย์, พฤษภาคม 2540. 1.3 พรชัย ตรีโลเกศวฒั นา เอกสารวิชาการ การตรวจพสิ จู น์ยาเสพติดและวตั ถุออก ฤทธต์ิ ่อจติ และประสาท ในกลุม่ PHENETHYLAMINES. ส�านกั ยาและวตั ถเุ สพติด กรมวิทยาศาสตรก์ ารแพทย,์ สงิ หาคม 2548. 1.4 Anthony C Moffat, M David Osselton and Brian Widdop, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons.Third edition, Volume 1, Pharmaceuticals Press London, 2004. 1.5 United Nation. Recommended Methods for the Detection and Assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine, Amphetamine, Methamphetamine and Ring-Substituted Amphetamine Derivatives in Biological Specimens, Manual for Use by Nation Laboratories, ST/NAR/27. New York: United Nation, 1995.

วธิ ีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสูจนส ารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 25 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 3. หลักการ ( Principle ) Methamphetamine จดั เป็นสารเสพติดให้โทษประเภท 1 ตามพระราชบญั ญัตยิ าเสพตดิ ให้โทษ พ.ศ. 2522 เป็นสารออกฤทธ์ิส�าคญั ในยาบา้ ไอซ์ สาร Methamphetamine เมอื่ เข้าสู่ ร่างกายจะผ่านกระบวนการเมตาบอไลต ์ 70 % จะถูกขบั ออกทางปัสสาวะภายใน 24 ช่วั โมง ในรปู Methamphetamine 43 %, 4-hydroxy-methamphetamine 15 % และ Amphetamine 5 % การตรวจแยกสารดว้ ยเทคนคิ TLC ซง่ึ อาศยั หลกั การละลายและการดดู ซบั ทแ่ี ตกตา่ งกนั ของ สารแต่ละชนิด สารทล่ี ะลายไดด้ ใี นสารละลายตัวพา ( mobile phase ) จะถกู พาเคลื่อนทีอ่ อกมา กอ่ น และเคลอื่ นทีผ่ ่านตวั ดดู ซบั ( stationary phase ) ได้เรว็ กว่าสารทเ่ี คล่อื นทีผ่ ่านตัวดูดซับได้ช้า กวา่ ท�าให้สารแยกสารผสมออกจากกันได้ 4. เครอ่ื งมือ และอปุ กรณ์ ( Apparatus ) 4.1 เคร่ืองมอื (Instruments) 4.1.1 เครอ่ื งชัง่ ละเอียด (analytical balance) ชนดิ ทศนิยมไม่น้อยกว่า 3 ตา� แหนง่ 4.1.2 เครือ่ งผสมน้า� ยาแบบหมนุ วน (vortex mixer) หรอื เครอื่ งเขย่า (shaker) 4.1.3 เครื่องสูบสญุ ญากาศ (vacuum pump) สา� หรับฉีดพ่น (spray) สารเคมี 4.1.4 เครอื่ งปนั หมนุ เหว่ียงความเร็วไม่น้อยกว่า 2,000 รอบต่อนาที 4.1.5 ตู้อบ (hot air oven) 4.1.6 หัวฉีด spray 5. สารเคมี ( Reagent ) 5.1 สารเคม ี (Chemicals) ชนดิ AR Grade 5.1.1 Acetone 5.1.2 conc. Ammonia 5.1.3 Dichloromethane 5.1.4 Ethanol 5.1.5 Ethyl acetate

26 วธิ มี าตรฐานสาํ หรบั การตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปส สาวะ เลมท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 5.1.6 Fast black K salt 5.1.7 n-Hexane 5.1.8 Isopropanol 5.1.9 Methanol 5.1.10 Ninhydrin 5.1.11 Sodium tetraborate decahydrate 5.1.12 3′, 3′′, 5′, 5′′ -Tetrabromophenolpthaleine ethyl ester (TBPE) 5.2 สารมาตรฐาน ( Standard ) ความเข้มข้นในรปู base ดังต่อไปน้ี มใี บรับรองผลการตรวจวเิ คราะห ์ ( certificatate of analysis : COA ) มีความบริสุทธ์มิ ากกวา่ 98 % as is หรอื เทยี บเท่า 5.2.1 Amphetamine sulfate 10 mg/ml in ethanol 5.2.2 Ephedrine hydrochloride 5 mg/ml in methanol 5.2.3 Methamphetamine hydrochloride 3 mg/ml in methanol 5.2.4 Methamphetamine hydrochloride 1 mg/ml in methanol 5.2.5 Pseudoephedrine hydrochloride 5 mg/ml in methanol แบง่ สารมาตรฐานบรรจุ vial ฝาเกลียว ขนาด 2 ml เพื่อความสะดวกในการใช้งานและ เกบ็ ในตเู้ ย็นอณุ หภมู ิ 2-8 °C อายุการใช้งาน 1 ปี หากใชห้ ลงั จาก 1 ปี ตอ้ งมีการตรวจ สอบคณุ ภาพก่อนน�ามาใช้ หมายเหตุ Amphetamine sulfate ละลายน้า� กลนั่ 1 ใน 4 ของปริมาตร แลว้ ปรบั ปรมิ าตรดว้ ย Ethanol

วิธีมาตรฐานสําหรับการตรวจพิสูจนส ารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมที่ 1 27 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 6. การเตรยี มตวั อยา ง ( Preparation of test sample ) 6.1 การเตรียมวสั ดุ/อปุ กรณ์ 6.1.1 น�าตวั อย่างปัสสาวะออกจากตู้เยน็ วางไวใ้ หเ้ ยน็ ที่อุณหภูมิห้อง 6.1.2 เขยี นรหัสตัวอย่างปสั สาวะบน test tube ขนาด 16 x 100 mm และ microcentrifuge tube ขนาด 2 ml 6.2 การเตรยี มสารละลาย 6.2.1 0.01 % TBPE in Dichloromethane: ชัง่ TBPE 0.1 g. ละลายใน Dichloromethane 1,000 ml เกบ็ ในขวดแกว้ สีชา ทีอ่ ุณหภูมิห้อง ใชไ้ ดน้ าน 6 เดือน ( สามารถแบ่งมาใช้ในขวดแก้วใสได ้ โดยใหส้ ังเกตสีกอ่ น ใช้งานคอื จะตอ้ งเป็นสีเหลอื ง ) 6.2.2 1 % Fast black K salt in distilled water : ช่ัง Fast black K salt 0.5 g. ละลายในน้า� กลัน่ 50 ml กรองก่อนใช้งานทกุ คร้งั สามารถใช้ได้ ภายใน 1 สปั ดาห์ หมายเหตุ ถา้ สารละลายเปล่ียนจากสีน้า� ตาลเขม้ เปน็ สีน�้าตาลอ่อน แสดงวา่ สารละลายเปลยี่ นสภาพ ไม่ควรใช้งาน 6.2.3 2 % Ninhydrin in Ethanol: ชัง่ Ninhydrine 1 g ละลายใน Ethanol 50 ml ควรเตรียมใหม ่ ๆ ก่อนใช้ 6.2.4 developing solvent : เตรยี มกอ่ นแช ่ TLC plate ประมาณ 60 นาที 6.3 การเตรียม QC sample 6.3.1 Negative control ( NC ) A. Certified drugs free urine B. ปสั สาวะของผู้ทีไ่ มไ่ ด้รบั ประทานยาใดๆ ตอ่ เน่ืองกนั อย่างนอ้ ย 5 วัน

28 วธิ ีมาตรฐานสําหรับการตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลม ที่ 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 6.3.2 Positive control ( PC ) 1) เตรยี ม stock standard solution : Methamphetamine 100 mg/ml - ดูดสารละลายมาตรฐาน Methamphetamine 1 mg/ml (base) 1 ml ใส่ volumetric flask ขนาด 10 ml ปรับปรมิ าตรดว้ ย Methanol จะได้สารละลาย Methamphetamine 100 mg/ml 2) เตรยี ม spiked urine : Methamphetamine 1 mg/ml (P1) - ดดู สารละลาย Methamphetamine 100 mg/ml 1 ml ใส่ volumetric flask ขนาด100ml ปรับปรมิ าตรด้วย negative urine 3) เตรียม spiked urine: Methamphetamine 0.5 mg/ml (P0.5) - ดดู สารละลาย Methamphetamine 100 µg/ml 0.5 ml ใส่ volumetric flask ขนาด100 ml ปรับปริมาตรด้วย negative urine 6.4 การเตรยี มตวั อย่าง : Extraction & concentration 6.4.1 ดูดตวั อย่างปสั สาวะ ตวั อย่างละ 2 หลอดๆ ละ 3 ml ใสใ่ น test tube ขนาด 16 x 100 mm 6.4.2 ดดู positive control และ negative control หลอดละ 3 ml ใสใ่ น test tube ใหม้ ีจ�านวนหลอดเท่ากบั จ�านวน plate ที่จะ spot ตวั อย่าง เช่น 2 system จ�านวน 2 plate ตอ้ งเตรยี ม /positive control 4 หลอด 6.4.3 วดั ค่า pH บนั ทึกผล 6.4.4 เตมิ Sodium tetraborate decahydrate ประมาณ 100 mg และ 0.01% TBPE ใน Dichloromethane ประมาณ 1 ml ลงในทุกหลอด เขย่าประมาณ 1 นาที วางไวส้ กั ครเู่ พ่อื ใหแ้ ยกช้นั บันทกึ สี 6.4.5 ดดู organic solvent ( ช้นั ลา่ ง ) ใสใ่ น microcentrifuge tube 6.4.6 นา� ไปปันดว้ ยเคร่อื ง centrifuge ที่ความเร็ว ไมต่ า�่ กว่า 2,000 รอบต่อนาที ประมาณ 10 นาท ี ( ถ้าใชค้ วามเร็วมากขึ้น สามารถใชเ้ วลานอ้ ยลงได้ ) 6.4.7 ดดู organic solvent ( ชน้ั ล่าง ) ใส่ใน microcentrifuge tube อนั ใหม ่ ระเหยแหง้

วิธมี าตรฐานสําหรบั การตรวจพิสูจนสารเสพติดในปสสาวะ เลมที่ 1 29 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 7. วิธีด�าเนินการ ( Procedure ) 7.1 spot ตวั อย่างลงบน TLC plate 7.1.1 เตรียม TLC plate โดยใช้ spotting template ปดครอบลงบน TLC plate ใชด้ นิ สอจุดเบาๆ ต�าแหน่งที่จะ spot ตวั อย่าง/standard โดย  ให้ห่างจากขอบดา้ นข้างอย่างนอ้ ย 2 cm  สูงจากขอบดา้ นลา่ งประมาณ 1.5 cm และ  แตล่ ะ spot ห่างกันอยา่ งนอ้ ย 1 cm เขยี นรหสั ตัวอยา่ งปัสสาวะ ไว้ด้านบนตรงจดุ ท่ีจะ spot ประมาณ 15 cm เขียน solvent system ที่ต้องการแชไ่ วท้ ีด่ ้านบน ดังภาพ ภาพแสดงตัวอยา่ งการเตรียม TLC plate

30 วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ ูจนสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 7.1.2 ละลาย residue จากขอ้ 6.4.7 ดว้ ย Dichloromethaneประมาณ 100 µl ( ประมาณ 2 หยด ) spot บน TLC plate จนหมด ละลายซ้า� อีกเล็กน้อย ( ประมาณ 1 หยด ) และ spot ซ้า� จนหมด 7.1.3 spot สารละลายมาตรฐาน ดงั น้ี  Methamphetamine จา� นวน1จดุ ๆ ละ 1 µl ใน plate1แผน่ ของแต่ละ ระบบ  Amphetamine จา� นวน 1 จดุ ๆ ละ 2 µl Ephedrine และ Pseudoephedrine ชนดิ ละ 1 จดุ ๆ ละ 1 µl ใน plate 1 แผน่ ของแตล่ ะระบบ  ในแผ่น plate ทุกแผ่นและทุกระบบ  Spot P1 และ P 0.5 ในแผน่ plate ทุกแผ่นและทุกระบบ  Spot negative control ใน plate แผ่นที ่ 1 ของแตล่ ะระบบ  เมือ่ spot เสรจ็ แล้วนา� แผ่น plate ไปอบท่ีอุณหภูม ิ 90 ºC เปน็ เวลา 5 นาท ี กอ่ นนา� ไปแชใ่ น developing solvent 7.2 Development: การตรวจยืนยันผลด้วยวธิ ี TLC จะตอ้ งเตรียมตวั อย่าง เพ่อื แชใ่ น developing solvent อย่างนอ้ ย 2 system โดยเลอื ก system modified TE และ T2 เป็นหลกั 7.2.1 น�า TLC plate ที่ spot เสร็จแล้วไปแชใ่ น developing solvent ท่ ี saturated ดว้ ย saturation pad ( เตรยี มก่อนแช ่ ประมาณ 60 นาท ี ) Organic solvent แอชตั 1ราpสlวaนte แอชตั 2ราpสlวaนte 43 85 System ท่ี 1 Modified TE Ethyl acetate 5 10 System ท่ี 2 T2 Methanol 2 4 System ท่ี 3 PT conc. Ammonia 50 75 Ethyl acetate 20 30 Acetone 2 4 conc. Ammonia 30 60 n-Hexane 20 40 iso-propanol 2.5 5 conc. Ammonia

วิธมี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปส สาวะ เลม ท่ี 1 31 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 7.2.2 น�า TLC plate ออกจาก tank เมือ่ solvent เคลอ่ื นทไี่ ดค้ วามสูงประมาณ 15 cm จากจุดเร่มิ spot ต้ังไวใ้ นตู้ดดู ควันให ้ solvent ระเหยออกหมด ใชเ้ วลาประมาณ 1 ช่ัวโมง หรอื อบในต้อู บ อุณหภูมิไม่เกนิ 120 ºC นาน 15 นาท ี กรณ ี spray ดว้ ย Ninhydrin ต้องอบ plate ก่อนเสมอ เพ่อื ประสทิ ธิภาพ ในการติดสที ่ชี ดั เจนขึ้น 7.3 Detection : 7.3.1 น�า TLC plate วางในแนวตัง้ ในตดู้ ดู ควนั spray ดว้ ย  1% Fast black K salt in distilled water ( ไมต่ อ้ งอบซา้� )  2% Ninhydrin in Ethanol อบซา้� ในตู้อบ อุณหภมู ิ 120 ºC นาน 15 นาที 7.3.2 ดูต�าแหนง่ การเคล่อื นที่และสีของตัวอย่างเทียบกบั positive control และ สารมาตรฐาน ดังนี้ Color Rf order T2 สาร Fast black K Ninhydrin Modi- PT Salt fied TE 4 1. Amphetamine 3 2. Methamphetamine ชมพ-ู มว่ ง มว่ ง 4 3 3. Ephedrine 1 4. Pseudoephedrine ส้มแดง มว่ ง 3 2 2 1 สม้ แดง ม่วง 1 ( เป็นแนวยาว; tail ) ส้มแดง ม่วง 2 4  คา่ Rf ของสารแต่ละชนิดใน TLC plate แต่ละแผน่ อาจมคี ่าแตกตา่ ง กนั เลก็ นอ้ ย เนอ่ื งจากการระเหยของสารละลายใน TLC tank ซ่ึงมี ปัจจยั มาจากอุณหภูมิของห้องปฏบิ ตั ิการ แต่ใหถ้ ือล�าดบั การเคลอ่ื นท่ี ของสารแตล่ ะชนิดตามตารางขา้ งตน้  Spot ของสารตวั อยา่ งในแตล่ ะ plate ควรมีคา่ Rf คลาดเคลอ่ื น ไม่เกนิ รอ้ ยละ ± 10 เม่อื เทยี บกับ positive control

32 วธิ มี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ ูจนสารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 7.4 การแปลผล (Evaluated) 7.4.1 ตวั อยา่ งท่ใี หผ้ ลบวก Methamphetamine หมายถงึ กรณใี ดๆ ดังต่อไปนี้ 1 ตวั อย่างทีใ่ ห ้ spot ทีม่ สี แี ละมีค่า Rf ตรงกบั positive control สาร มาตรฐาน และ Methamphetamine ทงั้ 2 system 2 ขนาดของ spot และความเข้มของส ี เทยี บเท่าหรอื ใหญ/่ เข้มกวา่ P1 7.4.2 ตัวอย่างท่ใี ห้ผลลบ Methamphetamine หมายถึง กรณใี ดๆ ดังต่อไปนี้ 1 ตัวอยา่ งท่ีไมใ่ ห ้ spot ที่มีสีและ/หรอื มีค่า Rf ไม่ตรงกับสารมาตรฐาน และ / หรือ positive control Methamphetamine ใน 1 หรอื ทัง้ 2 system 2 ขนาดของ spot และความเข้มของส ี เล็กหรอื จางกว่า P1 7.5 การบนั ทึกผลภาพ TLC 7.6 การเกบ็ ภาพดว้ ยอปุ กรณ์ถา่ ยภาพ เชน่ scanner 8. การค�านวณและการรายงานผล (Calculation and report) 8.1 การค�านวณคา่ Rf R f = ระยะจากจุดเร่มิ ต้นที่ spot ถึงจดุ กงึ่ spot ทีเ่ คลื่อนทไี่ ป ระทางจากจุดเรม่ิ ตน้ ที่ spot ถึงจุดท่ี developing solvent เคลอื่ นทไ่ี ป % ค ว า ม ค ล า ด เ ค ล ่อื น ข อ ง ค า่ R f = ( R f s a m p l e R f –s t aRnf dstaarnddard ) x 100 8.2 การรายงานผล 8.2.1 ตวั อยา่ งทีร่ ายงานตรวจพบ Methamphetamine ตามเงื่อนไขข้อ 7.4.1 ให้รายงานผล “ตรวจพบเมทแอมเฟตามีน” 8.2.2 ตวั อย่างทร่ี ายงานตรวจไมพ่ บ Methamphetamine ตามเง่อื นไขขอ้ 7.4.2 ให้รายงานผล “ ตรวจไม่พบเมทแอมเฟตามนี ”

วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ ูจนสารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 33 กรมวิทยาศาสตรก ารแพทย 9. การควบคุมคุณภาพและผลการทดสอบ ( Assuring the quality of test results ) 9.1 ตัวอยา่ งท่ตี รวจพิสูจนต์ ้องทา� TLC ด้วย developing solvent อยา่ งน้อย 2 system 9.2 กรณที �า TLC เพยี ง 1 system ต้องวเิ คราะหด์ ว้ ยเทคนคิ chromatography อ่นื ๆ รว่ มด้วย 9.3 กรณีผล TLC ไมช่ ดั เจน เช่น ปรากฏ spot ท่ีใกล้เคยี งหรือติดกับ Methamphetamine ตอ้ งวิเคราะหด์ ว้ ยเทคนิคอน่ื ๆ รว่ มด้วย เช่น GC-MS 9.4 ต้องมกี ารตรวจสอบสารมาตรฐานทีใ่ ชเ้ ป็นระยะๆ สม่า� เสมอ 10. รายละเอยี ดอนื่ ๆ 10.1 การตรวจยนื ยันด้วยเทคนคิ TLC และหรอื เทคนคิ อ่ืนๆ ตวั อยา่ งปัสสาวะควรทา� การ ตรวจเบ้ืองตน้ โดยใชช้ ุดทดสอบหลักการภูมคิ ุม้ กันวิทยา (rapid test kit) หรอื ใช้ เครื่องมือท่อี าศยั หลักการภูมคิ ุ้มกันวทิ ยา โดยพิจารณา ดังน้ี - กรณใี หผ้ ลบวกหรือใหผ้ ลบวก/ลบไม่ชัดเจน ตอ้ งทา� การตรวจยนื ยันผลทุก ตวั อย่าง - กรณีใหผ้ ลลบ จะท�าการตรวจยนื ยันผลหรือไม่ก็ได้ ขน้ึ อยกู่ ับดลุ พินจิ ของ หัวหน้าหอ้ งปฏิบัติการวิเคราะห ์ เชน่ กรณรี อ้ งขอพเิ ศษ หรือ ต้องการท�า เพือ่ ยืนยันผลลบ เปน็ ตน้ 10.2 ความไวของวิธ ี (คา่ LOD) โดยใช้ปัสสาวะ 3 ml 250 ng/ml (750 ng) เมอ่ื spray ด้วย 1% Fast black K salt in DI H2O 500 ng/ml (1500 ng) เมื่อ spray ด้วย 2% Ninhydrin in Ethanol 10.3 สามารถใช้สารละลายมาตรฐาน มากกวา่ ที่ระบุใน SOP ได ้ เชน่ Fenfluramine MDMA MDA MDE Phenylpropanolamine Phentermine Ranitidine เป็นต้น กรณตี รวจพบ MDMA/MDA/MDE ใน system PT ต้องทา� การตรวจยนื ยัน ดว้ ยเทคนคิ อืน่ ๆ เพมิ่ เติม เชน่ LC-MS หรือ GC-MS เป็นตน้ 10.4 การวิเคราะห์ซ้า� ด้วยวธิ เี ดมิ กรณ ี spot ใหญ่ทา� ใหค้ า่ Rf คลาดเคล่ือน ใหเ้ จือจาง ตวั อย่าง โดยใชต้ วั อยา่ งลดลง 1-3 เท่า ดว้ ย negative urine แล้วทา� การสกัด ตวั อย่างตามขอ้ 6.4 10.5 การ saturated solvent ใน TLC tank ควรใชค้ ลบิ หนีบติด saturation pad กบั แผ่นกระจกเพ่ือป้องกันการโคง้ งอ

34 วิธมี าตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ ูจนสารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 10.6 การเตรยี มสารละลายตา่ งๆ สามารถเตรียมตามปริมาตรท่ีต้องการได้ แต่ความ เข้มข้นต้องเปน็ ไปตามทีก่ า� หนด 10.7 โครมาโทแกรมการตรวจพสิ ูจนห์ าเมทแอมเฟตามีนในปัสสาวะด้วยเทคนคิ Thin Layer Chromatography ( TLC ) System : TE, T2 Spraying agent : 1% Fast Black K salt in water Plate : Silica Gel GF 254 TE T2 Pseudo Ephedrine Amphetamine Ephedrine Amphetamine P1 Ephedrine P 0.5 Methamphetamine Pseudo Ephedrine Methamphetamine P1 P 0.5

วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ จู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 35 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย 2.3 การตรวจปรมิ าณแอมเฟตามนี และเมทแอมเฟตามนี ในปสสาวะ ด้วยเทคนคิ Gas Chromatography – Massspectrometry ( GC-MS ) 1. ขอบขาย ( Scope ) เป็นวิธีมาตรฐานในการปฏิบัติงานตรวจพิสูจน์ยืนยันผลและหาปริมาณ Amphetamine และ Methamphetamine ในปัสสาวะดว้ ยเทคนคิ การสกดั ด้วยวัฏภาคของแขง็ และแก๊สโครมาโท กราฟี-แมสสเปกโทรเมทรี ทร่ี ะดบั ความเขม้ ขน้ 100 ng/mlขนึ้ ไป 2. เอกสารอา้ งอิง ( Reference ) 2.1 รวมกฎหมายยาเสพตดิ พรอ้ มดว้ ย กฎกระทรวง ระเบยี บ ข้อบงั คับ ทเ่ี กี่ยวขอ้ ง, ส�านักงานปอ้ งกนั และปราบปรามยาเสพตดิ กระทรวงยตุ ธิ รรม พ.ศ. 2552, หมายเลข เอกสารเผยแพร ่ 1-09-2552, 26-27. 2.2 ความผิดและโทษเกย่ี วกบั กฎหมายยาเสพตดิ , กองนติ กิ าร ส�านักงานปอ้ งกันและ ปราบปรามยาเสพตดิ ส�านักนายกรฐั มนตร,ี หมายเลขเอกสารเผยแพร่ 02-07-2543; 12-16. 2.3 Recommended Method for the Detection and Assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine, Amphetamine, Methamphetamine and Ring - Substituted Amphetamine Derivative in Biological Specimens, UNITED NATIONS New York, 1995; 59-70. 2.4 Varian. Toxicology Manual Confirmation of Drugs of Abuse in Urine with Ion-Trap GC-MS, Varian, Inc, 2001; 5-18. 3. หลักการ ( Principle ) Amphetamine และ Methamphetamine จัดอยู่ในกลุ่ม Phenethylamines ซง่ึ มสี ตู ร โครงสรา้ งคลา้ ยกัน การตรวจแยกดว้ ย หลกั การโครมาโทกราฟแี ผน่ บาง ไม่สามารถแยกออกจากกนั ไดอ้ ยา่ งชดั เจน การตรวจดว้ ยเครอื่ งแกส๊ โครมาโทกราฟ-ี แมสสเปกโทรเมทร ี จะมลี กั ษณะการแยกสาร ดว้ ยหลกั การแบบเดียวกัน แตม่ ีความจา� เพาะเจาะจงและความไว ( selectivity และ sensitivity ) มากขึน้ ซ่ึงจะท�าใหส้ ามารถตรวจวัดสารในปริมาณตา่� ๆ ไดด้ ี

36 วิธมี าตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ จู นส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลมท่ี 1 กรมวทิ ยาศาสตรการแพทย การแยกสารดังกล่าวด้วยเครื่องแก๊สโครมาโทกราฟี - แมสสเปกโทรเมทรี อาศัยหลักการ แยกสารผสมออกจากกัน โดยคุณสมบัติความสามารถในการกลายเป็นไอ การละลาย และการดูด ซับที่แตกต่างกันของสารแต่ละชนิดในคอลัมน์ ในอุณหภูมิและเวลาท่ีต่างกันด้วยเครื่องแก๊สโครมา โทกราฟ ี แล้วใช้ แมสสเปกโทรเมทรี เพื่อทา� ให้สารทแี่ ยกไดแ้ ตกตวั เปน็ ไอออน (ion fragment) แลว้ ศกึ ษารปู แบบการแตกตวั ของสารนนั้ ๆ เทยี บกบั สารมาตรฐานทเ่ี ตรยี มขนึ้ เอง หรอื ฐานขอ้ มลู ใน software ของเครือ่ ง MS database เชน่ Wiley07 หรอื NIST05 การหาปรมิ าณสารจะข้ึนกบั ความสงู ของพคี ( peak abundance ) และพน้ื ทใี่ ต้พคี (peak area) เปรยี บเทยี บกบั ความสงู พคี ห รอื พ้นื ทีใ่ ตพ้ คี ของสารมาตรฐาน และเพ่ือให้วธิ ีการตรวจวิเคราะห์เชงิ ปริมาณของยาบ้าในปัสสาวะ เป็นที่น่าเช่ือถือและมีความถูกต้องมากข้ึน การเตรียมตัวอย่างปัสสาวะก่อนการวิเคราะห์จึงมีความ ส�าคัญ ในวิธีวิเคราะห์น้ีได้เลือกเทคนิคการสกัดด้วยวัฏภาคของแข็งมาใช้เป็นวิธีการเตรียมตัวอย่าง ซึ่งเป็นวิธที ่ียอมรบั ในระดับสากล ตารางแสดงโครงสรา้ งและมวลโมเลกลุ ของสารท่ีวิเคราะห์ Compound Structure Compound -PFPA Formula / MW Formula / MW 1. Amphetamine C9H13N / 135 C12H12F5NO / 281 2. Methamphetamine C13H14F5NO / 295 C10H15N / 149 3. Phentermine C10H15N / 149 C13H14F5NO / 295

วธิ ีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพิสจู นสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมที่ 1 37 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 4. เครอ่ื งมอื และอุปกรณ์ ( Apparatus ) 4.1 เคร่อื งมือ 4.1.1 เครอื่ งแก๊สโครมาโทกราฟ-ี แมสสเปกโทรมิเตอร(์ GC-MS) 4.1.2 เครื่องเตรียมตวั อยา่ งอตั โนมตั ิ 4.1.3 เครอ่ื งผสมสา� หรบั หลอดทดลอง (vortex mixer) 4.1.4 เครือ่ งระเหยแห้ง (evaporator with nitrogen) 4.1.5 เคร่ือง heating block 4.1.6 solid phase extraction ( SPE ) ชนดิ OASIS HLP cartridge 3 ml/60 mg 4.2 เครอื่ งแก้วและอปุ กรณ์ 4.2.1 micropipette และ micropipette tips ขนาด 50-200 µl และ 1-5 ml 4.2.2 positive pipette และ pipette tips ขนาด 10, 50, 100, 250, 1000 µl 4.2.3 ขวดวัดปริมาตร ( volumetric flask ) ขนาด 5,10 ml 4.2.4 กระดาษกรองชนดิ nylon ขนาดรูพรนุ 0.2 µl 4.2.5 กระบอกตวงขนาด 1000 ml 4.2.6 บีกเกอรข์ นาด 1000 ml 4.5.7 micro centrifuge tube ขนาด 1.5 ml

38 วธิ ีมาตรฐานสาํ หรับการตรวจพสิ ูจนส ารเสพติดในปส สาวะ เลม ที่ 1 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 5. สารเคมี ( Reagent ) 5.1 สารเคมที ่ัวไป 5.1.1 Methanol ( AR grade และ HPLC grade ) 5.1.2 Phosphoric acid ( AR grade ) 5.1.3 Ethyl acetate ( AR grade และ HPLC grade ) 5.1.4 Ammonium hydroxide ( AR grade ) 5.1.5 Pentafluoropropionic acid anhydride ( PFPA ) ( AR grade ) 5.1.6 Purified water Type I ( Milli-Q water ) 5.1.7 Certified drugs free urine 5.2 สารมาตรฐาน มีใบรับรองผลการตรวจวิเคราะห์ ( certificate of analysis; COA ) มีความบรสิ ุทธมิ์ ากว่า 98% as is หรอื เทยี บเทา่ 5.2.1 Amphetamine sulfate 5.2.2 Methamphetamine hydrochloride 5.2.3 Phentermine hydrochloride

วธิ มี าตรฐานสําหรบั การตรวจพิสูจนสารเสพตดิ ในปสสาวะ เลม ท่ี 1 39 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 6. การเตรียมตวั อยาง (Preparation of test sample) 6.1 การเตรยี มสารเคมี 6.1.1 2 % Ammonium hydroxide ตวง 40 ml 25% Ammonium hydroxide ดว้ ยกระบอกตวงขนาด 100 ml ใสล่ งในขวดวดั ปริมาตรขนาด 500 ml ท่มี นี า้� กรองอยู่ประมาณ 2 ใน 3 ของขวด เขย่าขวดเบาๆ ปรับปริมาตรด้วยน�้ากรองเก็บไวใ้ น ขวดแกว้ ท่ีอุณหภมู ิหอ้ ง ระยะเวลาการเกบ็ รกั ษา 1 เดอื น 6.1.2 4 % Phosphoric acid ปเ ปต 4.7 ml ของ 85% Phosphoric acid ใสล่ งในขวดวัดปรมิ าตร ขนาด 100 ml ท่มี นี า�้ กรองอยู่ประมาณ 2 ใน 3 ของขวดเขย่าขวดเบาๆ ปรับ ปรมิ าตรด้วยน�า้ กรอง เก็บไวใ้ นขวดแก้ว ทีอ่ ุณหภมู หิ ้อง ระยะเวลาการเกบ็ รักษา 1 เดอื น 6.1.3 5 % Methanol in 2 % Ammonium hydroxide ปเ ปต 5 ml Methanol ใสล่ งในขวดวัดปรมิ าตรขนาด 100 ml ปรับ ปรมิ าตรด้วย 2 % Ammonium hydroxide เก็บไวใ้ นขวดแกว้ ท ี่ อุณหภมู ิหอ้ ง ระยะเวลาการเก็บรกั ษา 1 เดอื น 6.1.4 20 % Methanol in 2 % Ammonium hydroxide ตวง 20 ml Methanol ด้วย กระบอกตวง ขนาด 25 ml ใสล่ งในขวดวดั ปรมิ าตรขนาด 100 ml ปรบั ปรมิ าตรด้วย 2 % Ammonium hydroxide เก็บไว้ในขวดแก้วท่ีอุณหภูมหิ ้อง ระยะเวลาการเกบ็ รักษา 1 เดอื น 6.2 การเตรียมสารมาตรฐาน 6.2.1 สารละลายมาตรฐาน Methamphetamine  Stock solution ( MS1000 ) : ชั่งสารมาตรฐาน Methamphetamine hydrochloride ใหม้ ีน้�าหนกั 10 mg ของเมทแอมเฟตามนี ลงใน ขวดวัดปรมิ าตรขนาด 10 ml ปรับปริมาตรดว้ ย Methanol ( HPLC grade )  Intermediate stock solution ( MS100 ) : ปเปต 1 ml ของ MS 1000 ใส่ในขวดวดั ปรมิ าตรขนาด 10 ml ปรับปรมิ าตรด้วย Methanol ( HPLC grade )

40 วิธีมาตรฐานสาํ หรบั การตรวจพสิ จู นสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลม ท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 6.2.2 สารละลายมาตรฐาน Amphetamine  Stock solution ( AS1000 ) : ช่งั สารมาตรฐาน Amphetamine sulfate ให้มนี ้�าหนกั 10 mg ของ Amphetamine ลงในขวดวดั ปรมิ าตรขนาด 10 ml ปรบั ปรมิ าตรดว้ ย Methanol ( HPLC grade )  Intermediate stock solution ( AS100 ) : ปเปต 1 ml ของ AS 1000 ใส่ในขวดวดั ปริมาตรขนาด 10 ml ปรบั ปรมิ าตรด้วย Methanol ( HPLC grade) 6.2.3 สารละลายมาตรฐาน Phentermine  Stock solution ( IS1000 ) : ชง่ั สารมาตรฐาน Phentermine hydrochloride ใหม้ ีนา�้ หนกั 10 mg ของ Phentermine ลงในขวดวดั ปรมิ าตรขนาด 10 ml ปรบั ปริมาตรด้วย Methanol ( HPLC grade )  Intermediate stock solution ( IS100 ) : ปเ ปต 1 ml ของ IS1000 ใส่ในขวดวดั ปรมิ าตรขนาด 10 ml ปรบั ปริมาตรดว้ ย Methanol ( HPLC grade ) 6.2.4 Working standard solution ( for spiked urine ) ( WS ) เตรยี ม 7 WS ใน Methanol ( HPLC grade ) สา� หรับ spiked urine calibration curve ดงั ตาราง: WS W( nSgC/monlc). AS10(m0 tl)aken MS10(m0 lt)aken final(mvoll)ume WS1 1,000 100 100 10 WS2 3,000 300 300 10 WS3 5,000 500 500 10 WS4 10,000 1,000 1,000 10 WS5 15,000 150 ( AS 1000 ) 150 ( MS 1000 ) 10 WS6 30,000 300 ( AS 1000 ) 300 ( MS 1000 ) 10 WS7 40,000 400 ( AS 1000 ) 400 ( MS 1000 ) 10 * System suitability solution : ปเ ปต 100 ml ของ WS4 และ 10 ml ของ IS100 ใส่ในหลอดทดลอง แล้วน�าไประเหยแหง้ จากนัน้ นา� ไปทา� derivatization

วิธมี าตรฐานสําหรับการตรวจพิสจู นส ารเสพติดในปสสาวะ เลมท่ี 1 41 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 6.2.5 spiked urine calibration curve ( CS ) CS* P(Cngc/omnlc). WS(mtalk)en from solution udrirnu(emgtfla)rkeeen CS1 100 100 WS1 900 CS2 300 100 WS2 900 CS3 500 100 WS3 900 CS4 1,000 100 WS4 900 CS5 1,500 100 WS5 900 CS6 3,000 100 WS6 900 CS7 4,000 100 WS7 900 * เตรียม Certified drugs free urine 1 ml, zero sample ( Certified drugs free urine 1 ml+ IS 10 ml ) และ CS อย่างละ 1 ซ้�า 6.2.6 Working standard solution for QC samples ( WSQC ) เตรียม 3 WSQC ใน Methanol ( HPLC grade ) ส�าหรบั spiked urine QC sample ดังตาราง: WSQC WSQC Conc. AS100 taken MS100 taken Final volume (ng/ml) (ml) (ml) (ml) WSQCL 2500 250 250 10 WSQCM 25,000 250 ( AS1000 ) 250 ( MS1000 ) 10 WSQCH 40,000 400 ( AS1000 ) 400 ( MS1000 ) 10

42 วิธีมาตรฐานสําหรบั การตรวจพสิ จู นสารเสพตดิ ในปส สาวะ เลมท่ี 1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย 6.2.7 QC samples ( QC ) QC* QC conc. WSQC taken from solution drug free urine (ng/ml) (ml) taken(ml) QCL 250 100 WSQCL 900 QCM 2,500 100 WSQCM 900 QCH 4,000 100 WSQCH 900 * เตรียม QC sample ความเข้มขน้ ละ 2 ซ�้า 6.3 เตรยี มวสั ด/ุ อปุ กรณ์ 6.3.1 นา� ตัวอยา่ งปัสสาวะออกจากตเู้ ยน็ วางไว้ให้เยน็ ที่อุณหภูมิห้องก่อนท�าการ วเิ คราะห์ 6.3.2 เขยี นเลขล�าดับตวั อย่างปสั สาวะหรือเลขที่ตวั อย่างและ QC sample บน วัสด ุ อุปกรณท์ ต่ี ้องใช้ เชน่ test tube, SPE column, vial ขนาด 2 ml เป็นต้น 6.3.3 เปด เครื่อง heating box ตง้ั อณุ หภูมิประมาณ 65ºC โดยใส่เทอร์โมมิเตอร์ ไวช้ อ่ งส�าหรบั ใส่เทอรโ์ มมิเตอร์ 6.4 การเตรียมตัวอยา่ ง ( sample preparation ) 6.4.1 Pretreatment  ปเปตตวั อย่างปสั สาวะ 1 ml ใส่ใน test tube  เติม Phentermine (internal standard) 100 µg/ml 10 µl ( ยกเว้น certified drugs free urine sample )  เติม 1 ml 4% Phosphoric acid เขยา่ บน vortex mixer ประมาณ 1 นาที

วธิ มี าตรฐานสําหรับการตรวจพสิ จู นส ารเสพตดิ ในปสสาวะ เลมท่ี 1 43 กรมวทิ ยาศาสตรก ารแพทย 6.4.2 Extraction  condition column - เตมิ 2 ml Methanol ( AR grade ) - เตมิ 2 ml น�า้ Milli-Q water  load sample - เทตัวอย่าง ทงั้ หมดจาก pretreatment ลงใน SPE  wash column - เตมิ 2 ml 5 % Methanol in 2 % Ammonium hydroxide - เตมิ 2 ml 20 % Methanol in 2 % Ammonium hydroxide - dry column ให้แหง้ โดยการเพ่มิ pressure ของ vacuum pump ใหอ้ ยู่ในช่วง 10 - 15 Hg เปน็ เวลา 5 นาที  elute Sample - เตมิ 3.0 ml Methanol ( HPLC grade ) - น�าตัวอยา่ งท ่ี elute ไประเหยให้แหง้ ดว้ ย N2 ( Temp 50 °C ) 6.4.3 Derivatization เตมิ Ethyl acetate ( HPLC grade ) 150 µl และ PFPA 50 µl ปด จกุ test tube แลว้ พันทับดว้ ย paraffin เพ่อื ป้องกนั การระเหยตวั ของสารจาก ความร้อน นา� ไป heat บน heating block ท ่ี 65 ºC เปน็ เวลา 25 นาที แลว้ นา� ออกจาก heating block ตงั้ ไวใ้ หเ้ ยน็ ระเหยแหง้ จากนนั้ เตมิ Ethyl acetate ( HPLC grade ) 100 µl vortex และถา่ ยใส่ Vial ขนาด 2 ml ที่มี insert ขนาด 200 µl