REV Petunjuk mikrobiologi Pertanian 2019

PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PERTANIAN PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS TIDAR 2019

TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PERTANIAN 1. Pada waktu praktikum di laboratorium mikrobiologi, pakaian kerja harus bersih untuk menghindari kemungkinan-keungkinan infeksi, kontaminasi dan sebagainya. 2. Tidak boleh makan, minum, dan merokok di laboratorium, atau makan minum dengan menggunakan alat-alat laboratorium. 3. Dilarang membasahi kertas etiket dengan ludah, memasukkan alat-alat (benda-benda) seperti kertas, pensil dan lain-lain ke dalam mulut (hal ini sering terjadi karena kebiasaan tidak baik). 4. Alat-alat yang dipakai harus dalam keadaan bersih. 5. Alat-alat yang dipakai memindahkan biakan (kultur) seperti ose disterilkan langsung di atas api/lampu spiritus. Jika ada bahan-bahan yang melekat pada alat, bakarlah terus sehingga bahan tersebut menjadi abu dan mudah lepas. 6. Semua benda (bahan-bahan) yang sudah tidak digunakan lagi seperti korek api, kapas, kertas, dan sebagainya harus diletakkan kembali ke tempat tertentu yang telah disediakan di dalam laboratorium. 7. Dilarang membuang biakan yang masih hidup ke dalam bak pencuci atau sembarangan tempat pembuangan, tetapi buanglah di tempat-tempat khusus. 8. Apabila terjadi kecelakaan (tertusuk, terluka, mata kemasukkan sesuatu) laporkan segera kepada pengawas. 9. Setelah pekerjaan selesai, bersihkan semua alat-alat yang telah dipakai menurut ketentuan laboratorium. Meja harus dibersikan dengan di-sinfektan setelah mengerjakan percobaan dengan mikrobia (terutama mikrobia patogen). 10. Sebelum meninggalkan laboratorium matikan gas lampu, air kemudian cucilah dengan air dan sabun sampai bersih. 11. Semua biakan ditumbuhkan (diinkubasikan) di dalam inkubator pada tempat tertentu. 12. Buat catatan-catatan lengkap dari tiap-tiap pekerjaan yang dilakukan, sertai gambar-gambar. 1

13. Menggunakan masker pada saat kegiatan praktikum 14. Jas praktikum hanya digunakan di dalam ruangan laboratorium, jika di luar rlaboratorium dilarang menggunakan jas praktikum 2

1. PENGENALAN TEKNIK ASEPTIS Tujuan : Mahasiswa dapat melakukan kegiatan di laboratorium secara aseptis 3

4

5

6

2. STERILISASI ALAT Berikut ini cara sterilisasi : 1. Pemanasan Pemijaran (dengan api langsung) : Membakar alat pada api secara langsung, contoh : jarum inokulum, pinset, batang L. a. Panas kering : Sterilisasi menggunakan oven (170-180)0C selama 1,5-2 jam. Proses sterilisasi panas kering terjadi melalui mekanisme konduksi panas. Panas akan diabsorpsi oleh permukaan luar alat yang disterilkan, lalu merambat ke bagian dalam permukaan sampai akhirnya suhu untuk sterilisasi tercapai. Pada sterilisasi panas kering, pembunuhan mikroba terjadi melalui mekanisme oksidasi sampai terjadi koagulasi protein sel. Sterilisasi menggunakan cara ini kurang efektif dalam untuk membunuh mikroba sehingga memerlukan suhu yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk alat yang terbuat dari kaca misal : Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan Petri b. Uap air panas bertekanan : Sterilisasi menggunakan autoclave (1210C, tekanan 1,5-2 atm, 15-20 menit). Pada saat melakukan sterilisasi uap bertekanan, sebenarnya dari uap jenuh pada tekanan tertentu selama waktu dan suhu tertentu pada suatu objek terjadi pelepasan energi uap yang mengakibatkan denaturasi atau koagulasi protein sel mikroba sehingga melemahkan aktivitas mikroba. Selain itu, sterilisasi menggunakan autoclave merupakan cara yang paling baik karena uap air panas dengan tekanan tinggi menyebabkan penetrasi uap air ke dalam selsel mikroba menjadi optimal sehingga langsung mematikan mikroba. Sterilisasi ini digunakan untuk alat yang terbuat dari kaca dan bahan/media contoh : Erlenmeyer, tabung reaksi, cawan Petri, PDA, NA. 2. Penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan LAF. disterilkan dengan cara disinari lampu UV. 3. Sterilisaisi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain alkohol. 7

Cara kerja : 1. Semua alat dari kaca yang akan digunakan dicuci menggunakan sabun dan dibilas air mengalir sampai bersih selanjutnya dikeringkan. 2. Setelah kering, untuk cawan Petri dibungkus kertas sampul coklat, tabung reaksi dan Erlenmeyer disumbat kapas / aluminium foil / tutup karet. Tahapan ini dilakukan dengan tujuan mengurangi kontaminan yang masuk ke cawan Petri, tabung reaksi dan Erlenmeyer. 3. Semua alat yang telah siap disterilkan menggunakan autoclave dan oven. Selain sterilisasi alat dan media, pada prosedur kerja mikrobiologi dikenal teknik aseptik yang bertujuan untuk mengurangi keberadaan mikroba kontaminan. Teknik aseptik digunakan setiap akan melakukan pekerjaan yang berhubungan dengan mikroba seperti menyemprot seluruh bagian dalam LAF menggunakan alkohol 70%, memijarkan jarum Ose ketika akan digunakan di atas lampu Bunsen, memutar cawan Petri saat dibuka dan mulut tabung reaksi saat dibuka sebelum atau sesudah digunakan di dekat lampu Bunsen. 8

3. PEMBUATAN NUTRIEN CAIR Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran bahan makanan atau nutrient untuk menumbuhkan suatu mikroorganisme. Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhtungan jumlah mikroba. Dalam proses pembuatannya harus disertai proses sterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari adanya kontaminasi pada media (Dwisaputro, 2005). Suatu media dapat menumbuhkan mikroorganisme dengan baik maka diperlukan persyaratan antara lain, media diinkubasikan pada suhu tertentu, kelembababn harus cukup, pH sesuai, dan kadar oksigen yang cukup baik, media untuk pembenihan harus steril, tidak ada penghambat dan tersedia kandungan nutrisi di dalam media (Schlegel, 1994). Penggolongan media berdasarkan sifat wujudnya antara lain, media cair, media padat, media padat yang dicairkan. Media cair merupakan media yang berbentuk cair dan biasa di pakai ialah kaldu yang disiapkan sebagai berikut pada 1 liter air murni di tambahkan 3 g kaldu daging lembu dan 5 g pepton-pepton ialah protein yang terdapat pada daging pada air susu. Pada kedelai dan pada putih telur pepton mengandung banyak N2. Sedangkan kaldu berisi garam-garam mineral yang biasanya keadaan yang demikian ini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu diatas masih harus disaring terlebih dahulu untuk dimasukan kedalam tabung-tabung reaksi Dalam penentuan berhasilnya kultivasi berbagai tipe bakteri, dibutuhkan suatu kombinasi nutrien serta lingkungan fisik yang sesuai, seperti, suhu, atmosfer gas, keasaman atau kebasaan (pH) (Hastuti, 2012). Nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri anatara lain, energi, karbon, nitrogen, belerang dan fosfat. Sumber energi dapat didapatkan dari karbohidrat dan protein. Sumber C juga berasal dari protein dan karbohidrat. Protein misalnya diperoleh dari ekstrak daging atau pepton, sedangkan karbohidrat diperoleh misalnya glukosa, fruktisa dan sakarosa. Nitrogen dan belerang diperoleh dari protein atau asm-asam amino. Kemudian untuk fosfat biasanya dipakai dalam bentuk garam (Sutarma, 2000). Tujuan : Mempelajari prosedur umum untuk merekontrukstitusi (mengembalikan kepada keadaan asalnya) medium berbentuk bubuk (terdehidrasi) dan menaruhnya dalam jumlah yang dikehendaki ke dalam wadah-wadah yang sesuai. 9

Bahan dan alat : 1. Maggi/ekstrak daging 2. Pepton 3. NaOH 4. Aquadest 5. Corong gelas 1 buah 6. Tabung reaksi steril 8 buah 7. Pengaduk 1 buah 8. Gelas piala 1 buah Cara kerja: 1. Timbang dengan teliti: a. Maggi / ekstrak daging sebanyak 0,03 gram b. Pepton sebanyak 0,5 gram 2. Masing-masing bahan tersebut dilarutkan dalam 100 cc aquadest sehingga menjadi larutan yang homogen. 3. Panaskan dalam pemanas air hingga larutan medium mendidih, tunggu selama ±5 menit. 4. Dinginkan, tambah dengan 1 tetesan indikator PP kemudian netralkan larutan medium tersebut dengan menggunakan NaOH 1 N sedikit demi seikit sampai berubah menjadi merah jambu. 5. Air yang hilang selama pemanasan supaya diganti dengan menambahkan aquadest sampai volumenya sama seperti semula. 6. Saring dengan kapas / kain penyaring yang bersih, bagi kedalaman tabung reaksi 7. Sterilkan dengan menggunakan autoklaf pada tekanan 1 atm selama 20 menit (temperatur 121oC). 10

4. PEMBUATAN NUTRIEN AGAR Media agar merupakan bahan nutrisi yang disiapkan untuk pertumbuhan mikroba. Agar - agar merupakan kompleks merupakan kompleks polisakarida, dihasilkan oleh alga laut dan digunakan untuk pemadat pada makanan. Keunggulan agar yaitu mencair pada suhu yang sama dengan air, namun tetap dalam keadaan cair sampain suhu 40oC (Munir, 2006). Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan - bahan kompleks lainnya (Munir, 2006). Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. “Selain itu, secara umum nutrient dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk sintesis biologik oranisme baru (Waluyo, 2005). Nutrien agar merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Berdasarkan fungsinya, media dapat dibedakan menjadi enam yaitu: 1. Media Basal (media dasar) adalah media yang digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat media lain yang lebih kompleks. Media ini dapat mendukung pertumbuhan hampir semua jenis mikrobia, contohnya adalah nutrient broth, kaldu pepton, dsb. 2. Media diferensial adalah media yang bila ditumbuhi oleh mikroba yang berbeda, mikroba tersebut akan tumbuh dengan ciri khusus sehingga dapat dibedakan. Contohnya: Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Media Sulfit Indol Motility (SIM), dsb. Dan media differensial merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan kimia atau reagensia tertentu yang menyebabkan mikroba yang tumbuh memperlihatkan perubahan-perubahan spesifik sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya. 11

3. Media selektif adalah media yang memungkinkan suatu jenis mikroba tumbuh dengan pesat, sementara jenis mikroba yang lain terhambat. Contohnya: Media Salmonella Shigella Agar (SSA), Thiosulphate Citrate Bile Salt (TCBS), dsb. Dan media selektif, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu yang akan menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan yang ada dalam suatu spesimen. Inhibitor yang digunakan berupa antibiotik, garamk dan bahan-bahan kimia lainnya. 4. Media diperkaya (enrichment) adalah media yang dirancang untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme. Media tersebut memiliki konstituen nutrisi yang mendorong pertumbuhan mikroba tertentu. Contohnya: kaldu selenit, atau kaldu tetrationat untuk memisahkan bakteri Salmonella thyposa dari tinja, dan edia diperkaya (enrichment media), media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Hal ini dilakukan untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang jumlahnya sedikit dalam suatu campuran berbagai mikroba contoh Chocolate media dan Yeast-Extract-poptasium Nitrat Agar. 5. Media uji(identifikasi) adalah media yang digunakan untuk identifikasi mikroba, medium litmus milk.umumnya ditambah dengan substansi tertentu yang menjadi indikator, misalnya TUJUAN Mahasiswa memahami pembuatan medium nutrient agar BAHAN DAN ALAT 1. Ekstrak daging 5. Corong 1 buah 2. Pepton 6. Tabung reaksi steril 8 buah 3. Agar-agar 7. Pengaduk 1 buah 4. Aquadest 8. Gelas piala 5. Corong 1 buah CARA KERJA 1. Buatlah nutrient cair seperti pada acara praktikum no. 3 2. Timbang agar-agar sebanyak 2 gram untuk setiap 100 cc medium 3. Masukkan agar-agar ke dalam medium kemudian panaskan dalam penangas air selama 20 30 menit sambil diaduk hingga semua agar-agar mencair dan larut 12

4. Aquadest yang hilang selama pemanasanya supaya diganti dengan aquadest sampai volume seperti semula 5. Dalam keadaan panas disaring dengan kapas/kain saring yang bersih 6. Masukkan medium tersebut ke tabung reaksi yang steril sisikan menurut keperluan (+-10 cc) 7. Sterilkan dengaan autoklaf pada tekanan 1 atm (atm 121oC) selama 20 menit. 13

5. PEMBUATAN MEDIA PDA (POTATO DEXTROSE AGAR) Timbang komponen medium dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut: Kentang 100 gr Glukosa 10 gr Agar plain 10 gr Akuades 500 ml Cara membuat : Kentang dikupas lalu dipotong dadu kemudian ditimbang sebanyak 100 gram. Setelah ditimbang di rebus dalam panci dengan menggunakan air akuades hingga lunak. Setelah mendidih disaring dan di ambil airnya. Sebagian air lainnya lagi digunakan untuk melarutkan agar dan glukosa. Kemudian kedua suspensi di campurkan dan volume dikembalikan menjadi 500 ml, ph diatur 6,8-7,2. Selanjutnya di masukkan kedalam tabung reaksi dan ditutup menggunakan kapas yang dilapisi alumunium foil. Sisanya dimasukkan dalam labu erlenmeyer dan ditutup menggunakan kapas yang dilapisi alumunium foil. Setelah semua terisi lalu tabung reaksi dimasukkan dalam plastik dan diikat menggunakan karet, lalu dimasukkan dalam autoklaf begitu juga dengan sisanya tadi untuk dilakukan sterilisasi selama 30 menit dengan suhu 121oC dan tekanan 15 lbs. 14

6. ISOLASI MIKROBA 1. Sampel dari udara - Buka cawan Petri yang telah berisi media dan letakkan di ruangan selama 5-10 menit. - Tutup dan bungkus serta beri label. - Inkubasikan selama 1 minggu pada suhu kamar/ruang. 2. Sampel dari tanah Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya bisa di sekitar rhizosfer (perakaran) yaitu dekat permukaan sampai ujung perakaran tanaman dengan kedalaman ± 10 cm 1 gram Teknik Pengenceran Bertingkat Bertujuan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yag tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dari pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroba dari pengenceran sebelumnya. Cara kerjanya sebagai berikut : Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9. Setelah sampel 15

masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya sampai homogen. Pengocokan dilakukan dengan cara membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan mikropipet kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa tip mikropipet yang digunakan harus selalu diganti. Teknik Spread Plate (agar sebar) Merupakan teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri dipermukaan agar sehingga diharapkan sel tunggal tumbuh menjadi satu koloni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai berikut : • Ambil suspensi sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. • Batang L atau batang triangle diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas Bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik. • Kemudian disebarkan dengan menggosokkannya pada permukaan agar supaya tetesan suspense merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar. • Hal yang perlu diingat bahwa batang L atau batang triangle yang terlalu panas dapat menyebabkan sel – sel mikroorganisme dapat mati karena panas. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45°c) untuk dituang bersama suspension bakteri kedalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel – sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh di permukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh didalam agar yang tidak banyak begitu banyak oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : • Disiapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan 16

media padat yang masih cair (>45°c). • Diteteskan suspensi sel kedalam cawan kosong sebanyak 1 ml secara aseptis. • Dituangkan media yang masih cair ke cawan kosong, kemudian putar cawan uuntuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media. Tunggu sampai padat kemudian diinkubasi. • Sebaiknya kerja dilakukan secara cepat karena bila agar terlalu lama dibiarkan dalam cawan maka pemadatan akan mempersulit penghomogenan, dan jangan lupa bahwa suhu media saat dituang jangan terlalu tinggi. 3. Sampel dari Daun - Mengambil daun bagian ujung yang sehat - Permukaan atas daun diusap dengan cutton bud - Panaskan bibir petri pada bunsen dengan memutar - cutton bud diusapkan pada permukaan media - Tutup petri secara hati-hati, bibir petri dipanaskan pada api bunsen dnegan memutar, kemudian diberi plastik wrap pada bibir tabung 17

7. TEKNIK INOKULASI a. Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45°c) untuk dituang bersama suspension bakteri kedalam cawan petri kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel – sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh di permukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh didalam agar yang tidak banyak begitu banyak oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : • Disiapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45°c). • Diteteskan suspensi sel secara aseptis kedalam cawan kosong sebanyak 1 ml (diambil dengan mikropipet) • Dituangkan media yang masih cair ke cawan kosong, kemudian putar cawan seperti angka 8 untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media. Tunggu sampai padat kemudian diberi plastic wrap dan diinkubasi. • Sebaiknya kerja dilakukan secara cepat karena bila agar terlalu lama dibiarkan dalam cawan maka pemaddatan akan mempersulit penghomogenan, dan jangan lupa bahwa suhu media saat dituang jangan terlalu tinggi. b. Streak plate 1) Goresan sinabung Cara kerja : sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai 18

setengah permukaan agar 2) Goresan T Cara kerja : bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker. Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag. Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2. Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna. Lakukan hal yang sama pada daerah 3. 19

8. PENGENALAN MORFOLOGI JAMUR DAN BAKTERI Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas dari pada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo. Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (streptococcus), buah anggur (stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay, 1994). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromotofiknya bermuatan positif) (Dwidjoeseputro, 1994). Uji katalase digunakan untuk mendeteksi adanya enzim katalase. Enzim ini teradapat pada sel-sel yang mempunyai metabolism aerobik. Bakteri anaerob tidak mempunyai enzim katalase. Uji katalase merupakan salah satu pengujian biokimia untuk mengidentifikasi bakteri, apakah menghasilkan enzim katalase atau tidak. Enzim katalase dihasilkan oleh beberapa jenis bakteri dalam rangka mencegah oksidasi radikal bebas yang dapat merusak atau membunuh bakteri. Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri dapat menguraikan enzim oksidase atau tidak. Perubaahn warna yang terjadi pada tes trip diamati setelah didiamkan selama 20-60 detik. Apabila terjadi perubahan warna menjadi biru violet maka uji oksidase dinyatakan positif dan menandakan bahwa bakteri tersebut dinyatakan bakteri non enterik, sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna maka uji oksidase dinyataakn negatif dan menandakan bakteri tersebut adalah bakteri enterik (Marlina, 2008). Tujuan : Mahasiswa dapat mengamati morfologi bakteri 20

Bahan dan alat : 1. Isolat Bacillus subtilis 2. Isolat Escherichia coli 3. Isolat jamur 4. H2O2 3% 5. Pipet tetes 6. Kertas oksidase 7. Cat sederhana Aiechl Nielson’s Cabol Fuchsin atau Hucheros Crystal Violet 8. Safranin 9. Minyak Immersi 10. alkohol 96% 11. Alkohol 70% 12. Aquades 13. iodine 14. Gelas benda 15. Mikroskop 16. Bunsen 17. Reagen P-Aminodimetilanilina oksalat 1% Cara Kerja : a. Morfologi Bakteri 1. Ambil secara aseptis dengan jarum ose biakan bakteri B. Subtilis, Escherichia coli dari biakan murni dan diratakan diatas gelas benda yang bersih seluas ± 1 cm2 2. Keringkan di udara 3. Setelah kering, preparat difiksasi dengan cara melakukan di atas api lampu spirtus (6 – 7 kali) 4. Teteskan cat crystal violet dan diamkan 30-60 detik. 5. Buanglah sisa cat dan cuci sisanya dengan air mengalir. 6. Teteskan larutan iodine dan diamkan selama 1-2 menit. 7. Cuci dengan air mengalir, kemudian di decolorisasi (di beri larutan peluntur) dengan alkohol (kira-kira 20 detik, hati-hati jangan sampai berlebihan yang mengakibatkan kesalahan hasil). 2. Cuci dengan air mengalir, tambahkan larutan safranin selama 10-20 detik. 3. Cuci kembali dengan air mengalir, angin-anginkan dan amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak immersi. 4. Gambar bakteri yang terlihat pada mikroskop dengan diberi keterangan mengenai warna sel bakteri dan bentuk sel. b. Pengamatan Morfologi Jamur 1. Gelas benda dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% sampai bebas lemak dan debu. 2. Aquades diteteskan di bagian tengah gelas benda. 3. Biakan jamur diambil (tipis) dengan menggunakan ose dan diletakkan di atas gelas benda yang telah diberi aquades. 21

4. Ose sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol, dibiarkan sebentar dan dibakar hingga membara agar ose menjadi steril. 5. Gelas benda yang sudah diberi jamur dan aquades ditutup dengan gelas penutup dan diusahakan tidak terdapat gelembung udara di dalam preparat. 6. Preparat diamati dengan perbesaran lemah terlebih dahulu. 7. Jamur yang ukuran kecil dilanjutkan dengan perbesaran sedang. 8. Amati bagian jamur yang diinginkan dengan perbesaran kuat dengan ditambah minyak immersi, khususnya untuk pengamatan bentuk dan struktur spora atau konidia. 9. Hasil pengamatan digambar dan diberi keterangan lengkap. c. Uji Katalase 1. Mengambil koloni bakteri bakteri B. Subtilis, Escherichia coli dengan jarum ose secara aseptis 2. Inokulasikan pada gelas benda pada dua titik dengan salah satunya sebagai control 3. Ambil H2O2 3% menggunakan pipet tetes dan teteskan pada gelas benda secukupnya di salah satu titik 4. Amati jika ada gelembung setelah beberapa saat penetesan larutan H2O2 3% maka hasil uji positif, sedangkan jika tidak ada gelembung maka hasilnya negative. c. Uji Oksidase 1. Siapkan 2 gelas benda. 2. Letakkan kertas oksidase pada masing-masing gelas benda tersebut. 3. Teteskan Reagen P-Aminodimetilanilina oksalat 1% pada dua buah kertas tersebut. 4. Ambil biakan cair B. Subtilis dan Escherichia coli, teteskan pada masing- masing kertas. 5. Amati perubahan yang terjadi. 6. Jika warna berubah menjadi biru violet maka hasil uji positif, jika tidak terjadi perubahan warna maka hasil negative. 22

9. PEWARNAAN BAKTERI SECARA GRAM Pada dasarnya pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi gelap, zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga bakteri tampak transparan dengan latar belakang hitam. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif atau pewarnaan asam dapat terjadi karena senyawa pewarnaan berwarna negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel bakteri. Oleh karena itu dinding sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin. (Hadiotomo, 1990). Pada pewarnaan negatif, lingkungan yang berwarna hitam disebabkan oleh pewarna yang digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini telah sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa zat pewarna asam membawa suatu muatan negatif, maka pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga zat warna ini akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan tetap berwarna bening (Alcamo,1996). Selain itu, disebutkan juga pustaka bahwa bakteri merupakan organisme mikroseluler yang pada dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin) yang bermuatan negatif tidak akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai adalah lingkungan luarnya saja (Entjang, 2003). Di lain sisi Lay (1994) juga menyatakan bahwa beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan. Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24- 48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991). 23

Tujuan : Mahasiswa dapat melakukan pengecatan negatif pada bakterin Bahan dan alat : 1. Isolat Bacillus subtilis 2. Isolat Escherichia coli 3. Gelas benda + cover glass 4. Larutan Negrosin Cara Kerja : 1. Teteskan larutan Negrosin di atas gelas benda yang bersih, campurkan dengan sedikit bakteri dari biakan murni dengan jarum ose. 2. Ratakan tetesan ini dengan gelas benda lain atau dapat digunakan jarum ose, preparat harus tipis. 3. Keringkan preparat di udara kemudian periksa dengan perbesaran kuat dengann minyak Imersi. 4. Gambar apa yang terlihat Gambar : 24

10. PENGIKATAN N OLEH BAKTERI SIMBIOSIS Fiksasi N secara simbiosis dilakukan oleh Rhizobium yang biasanya bersimbiose dengan tanaman leguminose / kacang – kacangan seperti kedelai, kacang tanah dan sejenis kacang yang lainnya. Sebelum bakteri ini melakukan fiksasi mula – mula bakteri masuk kedalam akar tanaman kacang – kacangan itu. Bakteri mula – mula masuk melalui ujung dari bulu – bulu akar yang kemudian akan membentuk benang yang akan menerobos sel - sel akar dan berkembang. Akar tanaman akan terinfeksi oleh bakteri tersebut sehingga sel – sel itu akan membesar dan kecuali itu akan berakibat menaikkan pembelahan sel sehingga akan menimbulkan pertumbuhan yang abnormal pada akar dengan terbentuknya suatu tonjolan – tonjolan yang disebut nodul. Dengan demikian akan terbentuk sistem yang terdiri dari tanaman, bakterindan tonjolan – tonjolan yang bersama - sama membentuk sistem yang dapat memfiksasi nitrogen. Hal tersebut disebut proses yang bersimbiosebaik tanaman. Ataupun bakteri memperoleh keuntungan dari simbiose tersebut. Bakteri dapat mengubah nitrogen bentuk gas yang tidak dapat dimanfaatkan oleh tanaman menjadi bentuk nitrogen yang larut. Sedangkan bakterinya juga mendapatkan zat makanan dari dalam tanaman. Jenis Rhizobium ini hanya dapat memfiksasi nitrogen dengan bekerja sama dengan tanaman kacang – kacangan. Tidak semua spesies Rhizobium dapat membentuk nodul dan fiksasi N dengan semua jenis kacang – kacangan. Kemungkinan ada spesies Rhizobium yang efektif terhadap satu jenis kacang – kacangan tetapi kurang efektif pada jenis yang lain. Tujuan : Mahasiswa dapat mengisolasi dan mengamati bakteri pengikat N secara simbiotik Bahan dan alat : 1. Bintil akar tanaman Leguminoceae yang berwarna merah atau hijau 2. 1 tabung medium yeast manitol 3. Yeast manitol agar miring 4. 1 tabung berisi aquades steril 5. Larutan HgCl2 0,1% 6. Alkohol 95% 25

7. Cawan petri steril 8. Gelas benda 9. Jarum ose 10. Pinset Cara Kerja : 1. Ambil bintil akar yang berwarna merah atau hijau dan cuci dengan air saluran sampai bersih 2. Pindahkan bintil akar terseebut dengan pinset kedalam cawan petri berisi 95% alkohol selama 2 menit. 3. Ambil bintil akar tersebut dan pindahkan kedalam tempat yang berisi HgCl2 selama 3 menit. 4. Pindahkan bintil akar tersebut kedalam tempat yang berisi air steril dan cuci dengan air mengalir steril sampai HgCl2 hilang. 5. Cairkan 2 tabung dari nutrien agar dengan penangas air 6. Biarkan agar mendingin sampai ± 900 C, tuangkan kedalam cawan petri steril dan biarkan mengeras / dingin. 7. Peganglah salah satu sisi gelas benda hati – hati di atas api lampu spirtus 8. Letakkan di atas meja dengan bagian yang telah dipanggang terletak di bagian atas 9. Hancurkan bintil akar dengan meletakkan dibagian tengah dari gelas benda yang telah dibakar dan letakkan gelas benda yang lain diatasnya lalu tekanlah dengan kuat. 10. Pisahkan gelas benda dan tambahkan setetes aquades steril pada bintil akar yang telah dihancurkan dan campurkanlah. 11. Ambil suspensi bakteri dengan jarum ose dan goreskan diatas permukaan agar pada cawan petri beberapa kali. 12. Inkubasikan cawan petri tersebut pada suhu 0 selama 5 – 10 hari dalam 25 C keadaan berbalik 13. Buatlah preparat dari suspensi bintil akar dan buatlah pengecatan negatif setelah tumbuh amati dengan mikroskop. 14. Bandingkan dengan preparat dari koloni yang tampak pada agar dalam cawan petri 15. Ambil secara aseptik dengan ose steril sedikit koloni bakteri Rhizobium dan pindahkan kedalam medium agar miring 16. Inkubasikan dalam suhu 250C selama 5 – 10 hari 17. Setelah tumbuh periksalah kembali secara mikroskopis dengan pengecatan sederhana. 26

11. BAKTERI PENGIKAT NITROGEN SECARA NON SIMBIOSIS Sejumlah bakteri mempunyai kemampuan untuk menggunakan gas N2 yang larut. Perubahan ini dikenal dengan fiksasi N. Ada dua golongan mikrobia yang mempunyai peranan dalam proses ini 1. Golongan yang hidup secara bebas dalam tanah yang disebut golongan non simbiotik 2. Golongan mikrobia yang hidup dan bekerjasama dengan tanaman jenis kacang-kacangan yang disebut golongan simbiotis Non simbiotis biasanya dilakukan oleh beberapa species dari Azotobacter. Bakteri Azotobakter mempunyai bentuk sel yang oval (elip) dan sifatnya aerobik. Fiksasi nitrogen non simbiotik selain dilakukan oleh Azotobacter juga dilakukan oleh Clostridium pastiridium. Kecuali organisme tersebut juga ada organisme lain yang mempunyai kemempuan memfiksasi nitrogen secara non simbiotik dan beberapa jenis ini termasuk antara lain bakteri Rhodomikrobacterium dan Chlorobacterium. Tujuan : Mahasiswa dapat mengisolasi dan mengamati bakteri pengikat N non simbiosis. Bahan dan alat : 1. Beberapa macam tanah pengikat N pertanian 2. Tepung kanji 3. Aquadest steril 4. Cawan petri steril 2 buah 5. Mortal dengan alu steril 6. Gelas benda 7. Jarum ose Cara kerja : 1. Timbang 100 gram dari tiap macam tanah pertanian yang telah dihaluskan 2. Campur dengan 3 gram tepung kanji 3. Campuran tersebut diberi aquadest steril hingga merupakan suatu pasta 27

4. Masukan pasta tersebut kedalam cawan petri 5. Dari tiap macam- macam tanah dibuat sebuah kontrol 6. Permukaanya dihaluskan dengan pertolongan gelas benda 7. Inkubasikan selama 3 hari 8. Amati koloni – koloni Azotobakter yang tumbuh pada permukaan dan periksa morfologi sel Azotobacter dengan pengecatan negative. 28

12. PENGARUH ZAT KIMIA TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBA Tujuan : Mahasiswa dapat mengamati pengaruh zat kimia terhadap pertumbuhan bakteri Bahan dan alat : 1. Biakan murni dari Bacillus subtilis dan Escherichia coli 2. Biakan murni jamur 3. Enam tabung nutrien agar 4. Empat cawan petri steril 5. Empat buah kertas filter yang bilat 1 cm 6. Larutan a. Phenol 10 % d. HgCl2 0,1 % f. Chlorampenicol b. Alkohol 96 % e. Yodium 10 % g. Fungisida c. Pestisida (EC) 7. Petri steril 8. Jarum ose Cara kerja : 1. Cairkan tabung nutrien dalam penangas air, dibiarkan mendingin hingga 0 suhunya kurang lebih 45 C. kemudian masing- masing inoculum dengan biakan murni dari Bacillus subtilis dan Escherichia coli untuk kemudian dituangkan dalam masing-masing cawan petri. 2. Setelah agar menjadi padat pada permukaan dari agar tersebut diletakkan kertas filter yan masing-masing telah dicelupkan kedalam larutan Phenol 10 %, Alkohol 70 %, HgCl2 0,1 %, Yodium 10 %, Chlorampenicol dan pestisida. 3. Inokulasikan biakan jamur pada media yang sudah padat menggunakan ose. 4. Pada permukaan dari agar tersebut diletakkan kertas filter yang telah dicelupkan ke dalam larutan fungisida. 5. Inkubasikan pada suhu 300 C dalam 48 jam 29

6. Lakukanlah pengamatan dan catat diameter penghambat dari masing- masing larutan. Gunakan tabel sebagai berikut : Zat Kimia Diameter Daerah Penghambat B. Subtilis (mm) E. Coli (mm) Jamur PHENOL ALKOHOL HgCl2 (dst) 30

Sumber Pustaka : Dwidjoseputro, D. 2002. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Hastuti, Sri Utami. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Penebar Swadaya: Jakarta Schlegel. Hans E, 1994. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta : Gajahmada University Pers Sutarma,2000 Jurnal Teknik Pembuatan Kultur Media Bakteri, Yusuf Hidayat dan Sutarma,Balai Penelitian Veteriner, JL.R.E Martadinata,30 Bogor 16114 E. Munir. 2006. Bahan Ajar : Mikrobiologi. USU-Press, Medan Sutedjo,N.M; A.G. Kartasapoetra; S.Satroatmojo.1996. Mikrobiologi Tanah. Penerbit Trinika Cipta, Jakarta. Waluyo, Lud. 2005. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang. Alcamo, I E. 1996. Fundamentle of Microbiology. Farmingdle : Addison Wesley Publishing Company Dwidjosapoetro. 1994 . Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan -----------------. 1998. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan -----------------. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan. Bandung : Citra Aditya Bakti Hadioetomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakrta : PT Gramedia Lay. 1994. Menghitung Mikroba pada Bahan Makanan, cakrawala (Suplemen Pikiran Rakyat untuk Iptek). Bandung : FMIPA ITB Marlina. 2008. Identifikasi Bakteri Vibrio parahaemolyticus dengan Metode Biologi dan Deteksi Gen Toxrnya secara PCR. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi. 13 (1). Pelczar, Michael. 2007. Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Gramedia Waluyo, Lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press Wheeter , Volk W.A.F.,1998. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Erlangga 31

32

33

34