4. Pertumbuhan, Kelangsungan Hidup & Kematian Mikroorganisme

Pertu'mbuhah, Kelangsungan Hidup,& Kematian MikroorganismeKELANGSUNGAN HIDUP MIKROORGANISME . Pengukuran Konsentrasi MikrobaDALAM LINGKUNGAN ALAMI Konsentrasi mikroba dapat diukur melalui konsentrasiPopulasi miluoorganisme dalam biosfer secara kasar bersifat sel (jumlah sel yang dapat hidup per unit volume biakan), atau konsentrasi biomassanya (berat kering sel per unitkonstan: Pertumbuhan diimbangi dengan kematian. volume biakan). Dua parameter tersebut tidak selaluKelangsungan hidup setiap kelompok mikroba dalam ekuivalen, karena berat kering rata-rata sel bervariasi padanisianya sebagian besar ditentukan oleh keberhasilan tahapan yang berbeda dalam riwayat suatu biakan. Keduanya tidak mempunyai makna yang sama: Pada studiberkompetisi untuk mendapatkan zar makanan dan adanya genetik mikroba atau inaktivasi sel, konsentrasi se1sekelompok sel yang bertahan hidup selama kekurangan zat merupakan kuantitas yang signifikan; pada studi biokimiamakanan. Semakin banyak bukti yang menyatakan bahwa atau nutrisi mikroba, konsentrasi biomassa adalahbanyak mikroorganisme yang terdapat dalam konsorsia kuantitas yang signifikan.dibenruk dari wakii genus yang berbeda-beda. Milcroorganismelain, sering ditandai sebagai sel tunggal dalam laboratorium, A. KONSENTRASI SELmembentuk koloni yang bersatu dalam lingkungan alami. Jumlah sel yang dapat hidup (Tabel 4-1) biasanya dianggap Sebagian besar pemahaman kami mengenai fisiologi sebagai ukuran konsentrasi sel. Namun, untuk berbagai tujuan, kekeruhan suatu biakan yang diukur dengan caramikroba berasal dari studi lini sel terisolasi yang tumbuh fotoelektrik, dapat dihubungkan dengan jumlah sel yang dapat hidup dalam bentuk kurva standar. Perkiraan visuaipada keadaan optimal, dan pengetahuan rersebur membentuk kasar kadang-kadang mungkin dilakukan: suatu suspensidasar untuk urusan ini. Namun, harus diingat bahwa banyak Escherichia coli yang sedikit keruh mengandung'sekitarmikroorganisme yang berkompetisi pada lingkungan alamiketika berada dalam keadaan stres nuuisi, suatu keadaan yang 107 sel per mililiter, dan suspensi yang cukup keruhdapat mengarah pada keadaan fisiologi yang sungguh berbeda mengandung sekitar 108.sel per mililiter. Dalamdengan yang diobservasi dalam laboratorium. Dan lagi, harus menggunakan ukuran turbidimetrik, harus diingat bahwadisadari bahwa nisia mikroba yang kosong di dalam korelasi antara tingkat kekeruhan dan jumiah yang dapat hidup dapat bervariasi selama pertumbuhan dan kematianlingkungan akan segera terisi. Prosedur kesehatan komunitas suatu biakan; sel dapat kehilangan viabilitasnya tanpayang melenyapkan mikroorganisme patogenik dengan cara menyebabkan kehilangan kekeruhan pada biakan.membersihkan nisianya mungkin kurang berhasil dibandingkandengan metode yang membiarkan nisia itu diisi oleh pesaing Tabel 4-1 . Contoh jumlah yang dapat hidup.nonpatogenik yang berhasil tumbuh. ____t_\"1s_\"T:':n____ :,,. llrl3l 'L\"Tl2{.j,, -ARTI PERTUMBUHAN Tidak diencerkan Terlalu banyakPertumbuhan adalah peningkatan jumlah semua komponen 10, 1 urituk dihitungorganisme secara teratur. Oleh karena itu, penambahan .}ukuran yang terjadi pada saat sel mengambil air ataumenimbun lipid atau polisakarida bukanlah pertumbuhan 10, 510yang sebenarnya. Multiplikasi sel adalah konsekuensi 10,3 t2pertumbuhan; pada organisme uniselular, pertumbuhan 104 6menyebabkan penambahan jumlah individu yang membentuksuatu populasi atau budaya. 1 0-5 1 'Setiap hitungan adalah rata-rata dari tiga lempeng replikasr 52

/PERTUMBUHAN, KELANGSUNGAN HIDUP, & KEMATIAN MIKROORGANISME 53B. De Hsrrls B toMAssA dihasilkan dengan cara memplot logaritme konsentrasi biomassa (8) sebagai suatu fungsi waktu (r).Pada prinsipnya, biomassa dapat diukur secara langsungdengan menentukan berat kering biakan mikroba setelah Perhitungan Konstanta Kecepatandicuci dengan air suling. Pada praktiknya, prosedur tersebut Pertumbuhan & Prediksi Jumlah Pertumbuhanddak praktis, dan peneliti biasanya menyiapkan kurva standar Banyak bakteri berkembang biak dengan cara pembelahanyang menghubungkan berat kering dengan tingkatkekeruhan. Alternatifnya, konsentrasi biomassa dapat biner, dan waktu rata-rata yangdiperlukan unruk popuiasi, atau biomassa, menjadi dua kali lipat disebut waktu generasidiperkirakan secara tidak'langsung dengan cara mengukur atau waktu penggandaan (ro). Biasanya ro ditentukan dengankomponen selular yang penting seperti protein atau dengan menggambarkan sejumlah pertumbuhan pada skalacara menentukan volume yang diisi oleh sel-sel yang telah semilogaritmik sebagai fungsi waktu; waktu yang diperiukanmen gendap dalam suspensi. untuk penggandaan biomassa adalah ro (Gambar 4-1). Konstanta kecepatan pertumbuhan dapat dihitung dariPERTUMBUHAN EKSPONENSIAL waktu penggandaan dengan cara mengganri nilai 2 untukKonstanta Kecepatan Pertumbuhan Brl Bn dan to untuk f, - t.pada persamaan (3), yangKecepatan pertumbuhan sel-sel yang tidak dibatasi oleh menghasilkannutrisi merupakan orde pertama: Kecepatan pertumbuhan ln2=kta (4)(diukur dalam gram biomassayangdihasilkan per jam) adalah k = lt3produk dari konstanta kecepatan pertumbuhan, k, dankonsentrasi biomassa, .B:dB o' (1) \7aktu penggandaan yang cepat berhubungan dengan konstanta kecepatan pertumbuhan yang tinggi. Misalnya,;: waktu penggandaan 10 menit (0,17 jam) berhubungan dengan konstanta kecepatan perrumbuhan 4,1 jam-r. \XZakru Penyusunan kembali persamaan (1) memperlihatkan penggandaan yang relatif lama, yaitu 35 jam berhubunganbahwa konstanra kecepatan pertumbuhan adalah kecepatan dengan konstanta kecepatan pemrmbuhan sebesar 0,02 jam-r.yang dibutuhkan oleh sel untuk menghasilkan lebih banyaksel:k. =-Bdr (2) d8 Konstanta kecepatan pertumbuhan adalah 4,3 jam-l(salah satu nilai tertinggi yang pernah dicatat), berarti bahwasetiap gram sel menghasilkan 4,3 g sel per jam selama periodepertumbuhan tersebut. Organisme yang tumbuh secaralambat dapat memiliki konstanta kecepatan pertumbuhansebesar 0,02 h-1. De ngan konstanta keceparanpertumbuhan ini, setiap gram sel dalam biakanmenghasilkan 0,02 g sel per jam. Integrasi persamaan (1) menghasilkanlnlB:2t ,3logro- Bt = k(tr - to) (3) Bo Bo Logaritma alami dari rasio 81 (biomassa pada waktu I fd 2ta 3fo 4ta[r,J) terhadap Bn (biomassa pada.waktu nol [rr]) setara Waktu penggandaan (fd)dengan produk konstanta kecepatan pertumbuhan (h) dan Gambar 4-1. Pertumbuhan eksponensial. Biomassa (B)perbedaan waktu (1,-t,). Pertumbuhan yang menaati berlipat dua pada tiap waktu penggandaan (td).persamaan (3) disebut eksponensial karena biomassameningkat secara eksponensial terhadap waktu.Pertumbuhan eksponensial yang diplot secara linear dapat

54 / BAB4 Perhitungan konstanta kecepatan pertumbuhan dapat ac)digunakan untuk menentukan jumlah pertumbuhan yang '6 oakan terjadi pada periode waktu tertentu maupun untukmenghirung jumlah waktu yang diperlukan untuk jumlah C q)pertumbuhan tertentu. 6 Jumlah pertumbuhan dalam periode'waktu tertentu ocdapat diprediksi berdasarkan penyusunan kembali Persamaan o)(3), J Arog k(tL -ro) (s) 'o Misalnya, t i,\" a\"p\",l'.\".\",i\"'\" jumlah pertumbuhan Waktuyang akan terjadi jika suatu biakan dengan konstanta Gambar 4-2. Kurva konsentrasi sel.kecepatan pertumbuhan 4,1 jamr tumbuh secara spesies yang sukses bersaing untuk mendapatkan zateksponensial selama 5 1am: makanan dan sukses menghindari pembinasaan oleh predator dan bahaya lingkungan lainnya. Br 4,th-'x5jam log- 'oB- o (6) KURVA PERTUMBUHAN 2'3 Jika suatu n-redium cair ditanami dengan sel-sel mikroba yang Pada contoh ini, peningkatan biomassa adalah 10 e; suatu diambil dari biakan yang sebelumnya telah tumbuh sampaisel bakteri dengan berat kering sebesar 2 x 10 13 g akan jenuh, dan jumlah sel yang dapat hidup permililiter ditentukan secara periodik dan kemudian diplot, biasanyamenghasilkan 0,2 mg biomassa, suatu jumlah yang akan akan didapat suatu kurva seperti yang tertera pada Gambarmemadati 5 mL biakan. Secara jelas, kecepatan Per-tumbuhan ini tidak dapat dipertahankan seiatna periode 4-2. Kurva ini dapat dibahas dalam enam fase, yangwaktu yang lama. Pertumbuhan selama 5 jam berikutnya digambarkan dengan huruf A sampai F (Tabel 4-2).dengan kecepatan yang sama akan menghasilkan 200 kg Fase Penyesuaian (A)berat kering biomassa, atau secara kasar satu ton sel. Fase penyesuaian menggambarkan suatu periode selama sel- sel, yang kekurangan metabolit dan enzim akibat adanya Penyusunan kembali persalnaan (3) lainnya memungkin- kondisi yang tak menguntungkan pada akhir riwayat biakankan penghitungan jumlah waktu yang diperlukan untuk sebeiumnya, beradaptasi dengan lingkungan barunya.sejumiah pertumbuhan tertentu. Pada persamaan (7), Berbagai enzim dan zat- antara terbentuk dan terkumpul sampai mencapai konsentrasi yang memungkinkanseperti yang diperlihatkan di bawah, l/, konsentrasi sel, pertumbuhan dimuiai kembali.menggantikan ,8, konsentrasi biomassa, untuk memungkin- Jika sel diambil dari suatu medium yang sama sekali berbeda, sel-sel tersebut sering kali secara genetik tidak dapatkan perhitungan waktu yang diperlukan untuk tumbuh di daiam medium yang baru. Pada kasus demikian, dapat terjadi suatu penyesuaian yang lama, yang meng-pertambahan jumlah sel tertentu. gambarkan periode yang diperlukan untuk beberapa mutant, -to =-z-,:-lio-g,o(ru,/ru0) (7) Menggunakan persamaan (7), memungkinkan kita, Tahel 4-2. Berbagai fase pada kurva pertumbuhanmisalnya, untuk menentukan waktu yang diperlukan oleh mikroba.organisme yang tumbuh secara lambat dengan konstantakecepatan pertumbuhan 0,02 jam-r untuk tumbuh darisatu sel menjadi suspensi sel yang sedikit keruh dengankonsentrasi 107 sel/mL. .+[, +- 2,3 x7 (n - 0,02 jam ' Bagian rr,KelCepatah ,. Pemecahan persarnaan (8) memperlihatkan bahwa sekitar Kurva, Penyesua ian Akselerasi Pertumbuhan800 jam-sedikit lebih dari sebulan-diperlukan agar A Eksponensial Nolsejumlah pertumbuhan tersebut terjadi. Kelangsungan hidup B Retardasi Bertambah Keseimbangan maksimum Konstanorganisme yang tumbuh secara lambat menunjukkan bahwa D Pen u runan B erku ra ngpersaingan untuk kelangsungan hidup biologik tidak selalu Nol E Negatif (mati)ke arah kecepatan-spesies yang akan berkembang adalah F

/PERTUMBUHAN, KELANGSUNGAN HIDUP, & KEMATIAN MIKROORGANISME 55dalam inokulum untuk memperbanyak diri secukupnya tumbuh secara eksponensial. Dua alat yang telah diciptakan untuk melakukan proses tersebut secarasehingga terlihat adanya peningkatan jumlah sel. otomatis: kemostat dan turbidostat.Fase Eksponensial (C) KemostatSelama fase eksponensial, yang perhitungan matematikanyatelah dibahas, sel-sel berada dalam keadaan stabil. Materi Alat ini terdiri dari suatu tabung biakan yang dilengkapisel baru disintesis dengan kecepatan konstan, tetapi dengan pipa alir dan suatu mekanisme untuk meneteskanmaterial yang baru itu sendiri bersifat katalitik, dan massa medium segar dari tempat penyimpanan dengan kecepatanmeningkat secara eksponensial. Keadaan tersebut terus yang dapat diatur. Medium di dalam tabung biakan diaduk oleh suatu aliran udara yang steril; masing-masing tetesanberlangsung sampai satu dari dua kejadian ini terjadi: medium segar yang masuk menyebabkan satu tetes biakan dialirkan keluar.kehabisan satu atau iebih zat gizi dr dalam medium, atauproduk metabolik toksik berakumulasi dan menghambat Medium dibuat sedemikian.rupa sehingga satu jenis zat makanan membatasi pertumbuhan. Tabung biakan ditanamipertumbuhan. Pada organisme aerob, nutrisi yang sel, dan sel-sel tumbuh sampai zat makanan yang terbatas habis; medium segar dari tempat penyimpanan dibiarkanterbatas biasanya adalah oksigen. Bila konsentrasi sel lebih mengalir dengan kecepatan sedemikian rupa sehingga sel- sel dapat menggunakan zat makanan yang terbatas itu secepatdari sekitar I x 107/mL (pada kasus bakteri), kecepatan penyediaannya. Pada keadaan tersebut, konsentrasi sel tetap konstan dan kecepatan pertumbuhan berbanding luruspertumbuhan akan menurun kecuali jika oksigen dipaksa dengan kecepatan aliran medium.masuk ke dalam medium dengan cara mengaduk atau DEFINISI & PENGUKURAN KEMATIANmemasukkan gelembung-gelembung udara. Bilakonsentrasi bakteri mencapai 4-5 x 10elmL, kecepatan Arti Kematiandifusi olaigen tidak dapat memenuhi kebutuhan walaupun Bagi sel mikroba, kematian berarti hilangnya kemampuanmedium tersebut diberi udara, dan pertumbuhan akan bereproduksi (tumbuh dan membelah) secara ireversibel. Ujimelambat secara progresif. empiris kematian adalah biakan sel di atas medium padat: Suatu sel dianggap mati jika gagai menghasilkan koloni padaFase Keseimbangan Maksimum (E) medium apa pun. Jelaslah bahwa keandalan uji iniPada akhirnya, kehabisan zat makanan atau penumpukanproduk toksik menyebabkan pertumbuhan berhenti secara bergantung pada pilihan medium dan berbagai keadaanmenyeluruh. Namun, pada sebagian besar kasus, terjadi berikut: Biakan yangggo/o selnya tampak \"mati\" dalam hai kemampuannya membentuk koloni pada satu medium dapatpergantian sel pada fase keseimbangan ini: Terjadi terbukti mampu hidup 100% jika diuji pada medium lain. Lagi pula, penemuan beberapa sel yang mampu hidup darikehilangan sel yang lambat akibat kematian, yang spesimen kiinis yang sangat banyak tidaklah mungkindiseimbangkan dengan pembentukan sel baru melalui dilakukan dengan cara pembiakan langsung pada lempengpertumbuhan dan pembelahan. Bila keadaan tersebut biakan, karena cairan sampel itu sendiri dapat menghambatterjadi, jumiah sel total secara lambat akan meningkat pertumbuhan mikroba. Pada kasus demikian, sampelmeskipun jumlah yang dapat hidup tetap konstan. mungkin harus diencerkan lebih duiu menjadi medium caitFase Penurunan: Fase Kematian (F) sehingga memungkinkan pertumbuhan awal dari sel-sel yang mampu hidup sebelum ditanam pada lempeng biakan.Setelah suatu periode waktu pada fase keseimbangan,yang bervariasi sesuai dengan organisme dan keadaan Keadaan inkubasi pada jam pertama setelah perlakuanbiakan, kecepatan kematian meningkat sampai rriencapai di atas juga merupakan faktor penting dalam penentuan \"kematian\". Misalnya, apabila sel-sel bakteri diiradiasi dengantingkat stabil. Perhitungan matematik kecepatan sinar ultraviolet dan segera ditanam pada lempeng biakankematian yang stabil dibahas di bawah ini. Sering kali, di dalam medium apa pun, akan tampak 6ahwa99,99o/o selsetelah sebagian besar sei mati, kecepatan kematian tersebut telah terbunuh. Namun, apabila sel-sel yang diiradiasi tersebut mula-mula diinkubasi terlebih dulu daiammenurun secara drastis, sehingga sedikit sel yang hidup larutan dapar yang sesuai selama 20 menit, penanaman paCadapat bertahan selama beberapa bulan atau bahkan lempeng hanya akan menunjukkan I0o/o yang terbunuh.beberapa tahun. Persistensi tersebut (pada beberapa kasus) Dengan kata lain, iradiasi menenrukan bahwa sel akan 'mati\"dapat mencerminkan pergantian sel, beberapa sel tumbuh jika segera ditanam pada lempeng biakan, tetapi akan hidupdengan zat makanan yang dilepaskan dari sel yang matidan mengalami lisis.PEMELIHARAAN SEL PADA FASEEKSPONENSIALSel-sel dapat dipertahankan pada fase eksponensialdengan mentransfernya secara berulang ke dalam mediumsegar dengan komposisi yang identik sementara sel terus

56/ BAB 4A bahwa 9096 sel-sel yang bertahan hidup akan mati dalam J setiap interval 10 menit berikutnya, dan akan diperoleh .E kurva kematian yang serupa dengan kurva pada Gambar =€toc 4 4-3. Jadi, jumlah sel yang mati dalam setiap interval waktu !o adalah fungsi dari jumlah yang seiamat, sehingga kematian E3 populasi berlangsung sebagai proses elaponensial berdasarkan 6 rumus umlrm berikut frz s =soe-kt (9) E So adalah jumiah yang bertahan hidup pada waktu nol, dan S adalah jumlah yang bertahan hidup pada setiap waktu *=9i berikutnya, r. Seperti pada kasus pertumbuhan eksponen- j sial, -k merupakan kecepatan kematian eksponensial bilaJ 10 20 30 40 50 60 fralai ln (S/Su) digambarkan terhadap waktu.E Menit Kurva satu pukulan seperti yang diperlihatkan pada Gambar 4-3A merupakan kurva kinetika inaktivasi khasEEEc6- 4 yang terlihat pada banyak agen antimikroba. Fakta bahwanEoO^ ini merupakan suatu garis lurus dari waktu nol (dosiso nol)-dan bukannya memperlihatkan bahu pada awalE ku1v4-g61x1ti bahwa \"pukuian\" tunggal oleh agen yangEZ menginaktivasi cukup untuk membunuh sel; yaitu, hanya_a satu target yang harus dirusak agar seluruh sel dapat'=cZr diinaktifl<an. Target terse but mungkin merupakano kromosom pada bakteri berinti satu atau membran sel;9 sebaliknya, target itu tidak mungkin suatu enzim atau 0 bagian sel lain yang ada dalam jumlah banyak.Gamhar4-3. Kurva kematian mikroorganisme. A: Kurva Satu sel yang mengandung beberapa salinan t^rget yangsatu pukulan. B: Kurva banyak pukuian. Bagian garis akan diinaktivasi memperlihatkan suatu kurva banyaklurus memperhitungkan sampai 6,5, sesuai dengan 4 x pukulan seperti yang diperlihatkan pada Gambar 4-3B.106 sel.5ehingga, jumlah targetnya adalah 4 x 105, atau Ekstrapolasi dari bagian garis lurus kurva tersebut terhadapempat per sel. ordinat memberikan perkiraan jumlah target (misalnya, 4 pada Gambar 4-38).jika dibiarkan untuk memperbaiki kerusakan akibat Sterilisasiradiasi sebelum ditanam di atas lempeng biakan. Dalam praktik, kita membicarakan \"sterilisasi\" sebagai Jadi, suatu sel mikroba yang tidak dirusak secara fisikhanya \"mati\" dari segi keadaan yang digunakan untuk proses membunuh semua organisme dalam suatu sediaan.menguji kemampuan hidup. Namun, dari pertimbangan di atas, kita lihat bahwa tidakPengukuran Kematian ada satu keadaan pun yang dijamin dapat mensterilkan suatu sediaan. Sebagai contoh, perhatikan Gambar 4-3. PadaBila berurusan dengan mikroorganisme, biasanya kita 60 menit, tersisa satu organisme (100) untuk tiap mililiter.tidak mengukur kematian sei secara individual, melainkan Pada 70 menit, akan tersisa 10-r, pada 80 menit 10-2, dst. Yang dimaksud dengan 10-2 organisme per mililiter ialahmengukur kematian populasi. Keadaan tersebut merupakan bahwa dalam volume total 100 mL, satu organisme akanmasalah statistik Pada setiap keadaan yang dapat menl'e babkan bertahan hidup. Kemudian, berapa lama waktu yang diper-kematian sel, kemungkinan sel tersebut akan mati adalahkonstan untuk tiap satuan waktu. Misalnya, apabila suatu lukan untuk \"mensterilisasi\" biakan? Kita hanya dapat mengatakan bahwa setelah sekian waktu dikerjakan,keadaan menyebabkan 90o/o sel mati dalam 10 menit kemungkinan adanya organisme yang bertahan hiduppertarna, kemungkinan tiap satu sel mati dalam interval 10 dalam 1 mL sesuai dengan kurva pada Gambar 4-3. Setelahmenit adalah 0,9. Oleh karena itu, dapat diharapkan 2 jam, pada contoh di atas, kemungkinannya adalah 1 x i0-6. Ini biasanya akan dianggap sebagai waktu sterilisasi yang aman, tetapi bahan yang berisi 1000 liter mungkin masih mengandung satu organisme yang mampu hidup.

/PERTUMBUHAN, KELANGSUNGAN HIDUP, & KEMATIAN MIKROORGANISME 57 Perhatikan bahwa perhitungan tersebut bergantung Demikian pula, Crdan /, berturur-rurur adalah konsentrasipada kemiringan kurva yang rerap tidak berubah pada kedua dan waktu yang diperlukannya untuk meng,seluruh renrang waktu. Sayangnya, kurva ini sangat sering inaktifkan 99o/o sel. Dari persamaan (10), kita lihat bahwamelengkung ke atas setelah periode wakru tertentu, karenapopulasi menjadi heterogen kepekaannya terhadap agen clntr - c2nf2 (1 1) Cari n, dan dihasilkaninaktivasi tersebut. Ei<strapolasi ini berbahaya dan dapat n_ logfr-logt, (2)menyebabkan kesalahan seperti yang ditemukan pada awal log c, , log C,pembuatan vaksin polio yang steril.Efek Konsentrasi Obat Jadi, n dapat ditentukan dengan cara mengukur kemiringanBila zat antimikroba (obat-obatan) digunakan untuk garis yang dihasilkan bila log r diplot terhadap 1og Cmenginaktifkan sel-sel mikroba, sering dijumpai bahwa (Gambar 4-4). Jlka n.secara eksperimental ditentukankonsentrasi obat yang digunakan berkairan dengan waktu dengan cara ini, K dapat ditentukan dengan menggantiyang diperlukan untuk membunuh suatu bagian rertenru nilai yang diper:oleh untuk C t, dan n pada persamaan (10).dari populasi, seperti terlihat dalam persamaan berikut: c^t = K (10) BERBAGAI AGEN ANTIMIKROBAPada persamaan tersebut, Cadalah konsentrasi obat, r adalah Definisiwaktu yang diperlukan untuk membunuh sejumlah sel Istilah berikut sering digunakan dalam hubungannyatertentu, dan z serta Kadalah konstanta. dengan agen-agen antimikroba dan penggunaannya. Persamaan tersebur menunjukkan bahwa, misalnya, A. BrosrDapabila z = 5 (seperti untuk fenol), kemudian penggandaankonsentrasi obat akan mengurangi waktu yang diperlukan Istilah umum untuk menggambarkan agen kimiawi,untuk mencapai tingkat inaktivasi yang sama sebanyak 32 biasanya spektrum luas, yang menginaktivasi mikro-kali lipat. Efektivitas suatu obat bervariasi sesuai dengan organisme (Tabel 4-3).konsentrasi pangkat lima menunjukkan bahwa lima molekulobat diperlukan untuk menginaktifkan suatu sel, meskipun B. BAKTERtoSTATTKddak ada bukti kimiawi langsung untuk kesimpulan ini Isdlah spesifik yang menunjukkar sifat biosid yang mampu lJntuk menentukan nilai z bagi setiap obat, ditentukan menghambat multiplikasi bakteri; muitipiikasi dimulai iagikurva inaktivasi untuk tiap beberapa konsentrasi, dan waktu bila agen telah dihilangkan. (lstilah \"fungistatik\" danyang diperlukan oleh setiap konsentrasi untuk menginaktifkan \"sporostatik\" menunjukkan biosid yang berturut-rurutsuatu bagian tetap dari populasi. Misalnya, konsenrrasi menghambat pertumbuhan fungi dan spora.)pertama yang digunakan adalah C, dan waktu yang C. BAKTERISIDALdiperlukan untuk menginaktifkan 99o/o sel adalah r, Istilah spesifik yang menunjukkan sifat biosid yang 2,4 mampu membunuh bakteri. Kerja bakterisidal berbeda dari bakteriostasis hanya dalam hal sifat ireversibelnya; z,u yaitu, organisme yang \"dimatikan\" tidak lagi dapat bereproduksi, meskipun sudah tidak terkena zat itu lagi.=Eco t,o Pada beberapa kasus, agen menyebabkan lisis (melarutkan)E sel-sel; pada kasus lain, sel tetap utuh dan mungkin terus(g aktif secara metabolik. (lstilah \"fungisidal\", \"sporisidal\", dan \"virusidal\" menunjukkan sifat biosid yang mampu6 ,I^'z membunuh fungi, spora, dan virus).E D. STERILISASIJoo ) U,O Proses fisika atau kimia yang menghancurkan atau 0,4 melenyapkan semua kehidupan mikroba secara menyeluruh, termasuk spora. -1,00 1,10 1,20 1,30 E. DtstxrexrlN Log.,o C (dalam bagian per'1000) Berbagai produk atau biosid yang digunakan untukGambar 4-4. Hubungan antara konsentrasi obat danwaktu yang diperlukan untuk membunuh sejumlah membunuh mikroorganisme pada objek atau permukaanpopulasi sel tertentu.

58 / BAB4Tabel 4-3. Beberapa biosid yang umum digunakan untuk antisepsis, disinfeksi, pengawetan, dan berbagai tujuanlainnya.xffig.9I *:t:t:i€t;iz:':z f sll.ge;; }1{RF]!ssglf Aq.aAlkohol cH3-cHoH I antisepsis,disinfeksi, I pengawetan EtanolAldehid rHH O :CCHzCHzCHzC: O I Disinfeksi,sterilisasi, lll I P\"n9t*\"tun Glutaraldehid I [)\"=o Formaldehid tt ---tlBiguanid Klorheksidin , l-\ ,/-\, r| r | t I o { \:/ h ll llN(HcNhH(cH2)6N(HcN)rH a \:,/ ,f cl Antisepsis, aktivitas antiplak, p--e'-nqawetan, disinfeksi NH NHHeksaklorofen \"S;:S\" , Deodoran, pengawetan I I I IAgen petepas halogen i +ocl-,Hocl,cl, I Disinfeksi,antisepsis Senyawa klorin r +1, ___l Senyawa yodium r ISenyawa merkuri I Hg It___oisinfeksiPeroksigen I I Disinfeksi, sterilisasi-oii- ---.1 ---9,- -------l I CH3COOOH IAsam perasetat - l- - -Fe'nFol edann korlesol -l- - - ---- 'I ?* I <\ I oisintetsi,pengawetan ,,lll \'/ I ----'l rrI I -'1Kresol oH I ',,til (-t' I I;;;;;.-.\"'\"-;\";;;; ilIl\./l --;-\i\"-\";. -l;-- I r,IlLRI2R4i IL/ N\ 1l^..- I L--- I Disinfeksi,antisepsis, I P\"ngu*\",un I I I (berla njut)

PERTUMBUHAN, KELANGSUNGAN HIDUP, & KEMATIAN MIKROORGANISME I 59label 4-3. Beberapa biosid yang umum digunakan untuk antisepsis, disinfeksi, pengawetan, dan berbagai tujuanlainnya. (Lanjutan) .:: :i t..:..............1:.. .. ) :..\"......, 1n9.\".I.,',11,,,l:.'- ::r''' :':''-:\"1 ot myl .),,:,r' Pengguha€ln ;,a):,t;',,', .',: F, e.',1. ,-r.:::::'l:: r:r:lii::r .i.. r. ::i 1,, 1. Disinfeksi, antisepsis, pengawetan I -l+Setrimid I r\".I Sterilisasi,.disinfeksi | \". , IlINz\cH\"\" I I L \".\" I I a,- I ,lI I CoHz* J1 l-1II/-(\-l FcH\,N/cHaaIIl+cr- I H:c conrjjBenzalkonium klorida LFase uap r H.:z'C,^/o.-\ CH2 t Etilenoksida t H-C:O I r Hro, Formaldehid - - - - - -l trHlr t Hidrogen peroksida r I -1 - - - 'yang mati. Disinfektan dapat bersifat sporostatik tetapi ultraviolet, dan bahan kimia reaktif DNA. Pada kategoritidak harus bersifat sporisidal. terakhir adalah berbagai agen pengalkil dan senyawa lain yang bereaksi secara kovalen dengan basa purin danF. SEPTIK pirimidin sehingga bergabung dengan DNA atauDitandai dengan adanya mikroba patogenik dalam membentuk ikatan silang antaruntai. Radiasi merusakjaringan hidup. DNA dengan beberapa cara: Sinar ultraviolet, misalnya, menginduksi ikatan siiang antarpirimidin yang berdekatanG. ANTISEPTIK pada salah satu untai polinukleotida, membentuk dimer pirimidin; radiasi pengion menyebabkan pecahnya untaiSuatu biosid atau produk yang menghancurkan atau tunggal dan ganda. Lesi DNA yang diinduksi secara kimiamenghambat pertumbuhan mikroorganism.e yang ada di dan radiasi akan membunuh sel terutama dengan caradalam atau di atas jaringan hidup. mengganggu replikasi DNA. Lihat Bab 7 untukH. ASEPTIKDitandai dengan tidak adanya mikroba patogenik. pembahasan sistem perbaikan DNA.I. PENGAWETAN B. DENATURASI PROTEINPencegahan muitiplikasi mikroorganisme pada produk- Protein terdapat dalam bentuk tiga dimensi dan berlipat-produk yang diformulasikan, termasuk obat-obatan dan lipat, yang ditentukan dengan ikatan disulfida kovalen intramolekul dan sejumlah ikatari nonkovalen seperti ikatanmakanan. ionik, hidrofobik, dan hidrogen. Bentuk ini disebut struktur tersier protein; yang mudah terganggu oleh sejumlah agenJ. ANTIBIOTIK kimia atau fisik, menyebabkan protein menjadi tidak berfungsi. Kerusakan struktur tersier protein disebutSenyawa organik sintetik atau yang terdapat secara alami yang denaturasi protein.menghambat atau menghancurkan bakteri tertentu, biasanyapada konsentrasi rendah. C, KERUSAKAN MEMBRAN ATAU DINDING SELCara Kerja Membran sel bekerja sebagai sawar yang selektif,A. MERUSAK DNA memungkinkan beberapa zat terlarut untuk melewatinyaSejumlah agen antimikroba bekerja dengan cara merusak dan menahan z^t lainnya. Banyak senyawa yang ditransporDNA; termasuk di dalamnya adalah radiasi pengion, sinar secara aktif melalui membran, menjadi terkonsentrasi dalam sel. Membran juga merupakan tempat enzim yang terlibat dalam biosintesis komponen selubung sel' Zat

60 / BAB4yang berkumpul pada permukaan sel dapat mengubah atau antara enzim dan substrar. Zat kimiayang bergabungsifat fisika dan kimia membran, mencegah membran dengan mineral-mineral tersebut sekali lagi akan mencegahberfungsi dengan normal sehingga akan membunuh atau perlekatan koenzim atau substrar; misalnya, karbon monoksida dan sianida bergabung dengan atom besi dari'menghambat sel. enzim yang mengandung hem dan mencegah fungsinya dalam respirasi. Dinding sel bekerja sebagai struktur pembe ri bentuk sel,melindungi sel terhadap lisis osmotik. Oleh karena itu, Antagonis kimia dapat dibahas dengan baik dalam duaberbagai agen yang menghancurkan dinding (misal, lisozim) topik: antagonis dalam proses penghasil energi, dan antagonisatau mencegah sintesis normalnya (misal, penisilin) dapat proses biosinietik. Antagonis pada proses penghasil energimenimbulkan lisis sel. meliputi racun-racun enzim pernapasan (karbon monoksida, sianida) dan fosforilasi oiaidatif (dinitrofenol) ; antagonisD. PEMBUANGAN GUGUS SULFHIDRIL BEBAS proses biosintetik meliputi analog pembentuk protein (asam amino) dan asam nukleat (nukleotida). Pada beberapa kasus,Protein enzim yang mengandung sistein mempunyai rantai analog mencegah penggabungan metabolit normal (misal,samping yang berakhir pada gugus sulfhidril. Selain itu, 5-metil-triptofan mencegah penggabungan triptofan kekoenzim seperti koenzim A dan dihidrolipoat mengandung dalam protein), dan pada kasus lain analog menggantikangugus sulfhidril bebas. Enzim dan koenzim semacam ini tidak metabolit normal dalam makromolekul, menyebabkandapat berfungsi kecuali jika gugus sulfhidrilnya tetap bebas makromolekul menjadi tidak berfungsi. Penggabungan p-dan tereduksi. Dengan demikian, berbagai agen pengoksidasi fluorofenilalanin di tempat fenilalanin pada protein adalahmengganggu metabolisme dengan membentuk ikatan suatu contoh jenis antagonisme pada proses biosintetik.disulfida antar gugus sulfhidril yang berdekatan: Pembalikan Aksi Antibakteri R-5H+HS-R -2H >R-s-s-R Pada bagian definisi, telah ditekankan bahwa kerja Banyak logam seperti ion me rkuri juga dapat mengganggu bakteriostatik, berdasarkan definisi, bersifat reversibel.dengan bergabung bersama sulfhidril: Pembalikan dapat dihasilkan dengan beberapa cara.R_sH cIl ------>RR_,SS/' Ho + 2HClR_SH+ HIq' A. PEMUSNAHAN AGEN cl Bila sel-sel yang dihambat oleh adanya agen bakteriostatik Terdapat banyak enzim sulfhidril dalam sel; oleh karena dipisahkan dengan sentrifugasi, dicuci seluruhnya dalam alat sentrifugasi, dan disuspensi ulang dalam mediumitu, agen-agen pengoksidasi dan iogam berat dapat pertumbuhan segar, sel akan bermultiplikasi kembali secara normal.menimbulkan kerusakan yang luas. B. PEMBALIKAN oLEH SUBSTRATE. ANTaeoNISHE KIMIA Bila antagonis kimia dari jenis analog berikatan denganGangg t\"n suatu agen kimia terhadap realai normal antara enzim secara reversibel, antagonis dapat digantikan dengan menambahkan substrat normal dalam konsentrasienzim spesifik dan substratnya dikenai sebagai \"antagonismekimia.\" Antagonis bekerja dengan cara bergabung dengan tinggi. Hal semacam ini disebut \"inhibisi kompetitif\".beberapa bagian dari holoenzim (apoenzim protein, aktivatormineral, atau koenzim), sehingga mencegah perlekatan Perbandingan konsentrasi inhibitor terhadap konsentrasi substrat yang membalikkan inhibisi disebut indekssubstrat normal. (\"Substrat\" di sini digunakan dalam arti antimiftroba; indetr<s biasanya sangat tinggi ( 100-10.000),luas, mencakup kasus yang inhibitornya bergabung dengan yang menunjukkan afinitas enzim yang sangat besarapoenzim, sehingga mencegah perlekatan koenzim pada terhadap substrat normalnya.substrat). C. INAKTIVAsI AGEN Antagonis bergabung dengan suatu enzim karena afinitas Suatu agen sering kali dapat diinaktivasi dengankimianya terhadap tempat penting pada enzim tersebut.Enzim melakukan fungsi katalitiknya karena sifat afinitasnya menambahkan suatu zat ke dalam medium yang dapatterhadap substrat alaminya; oleh karena itu, setiap senyawa bergabung dengan agen tersebut, dan mencegah terjadinya penggabungan antara agen dengan bagian-bagian sel.yang secara struktural menyerupai substrat pada aspek Misalnya, ion merkuri dapat diinaktivasi denganpenting ini juga mempunyai afinitas terhadap enzim tersebut. penambahan senyawa sulfhidril seperti asam tioglikolatJika afinitas ini cukup besar, \"analog\" akan menggantikan ke dalam medirrm.substrat normal dan menghalangi reatr<si yang biasa terjadi. Banyak holoenzim yang mengandung ion mineralberlaku sebagai suatu jembatan antara enzim dan koenzim

PERTUMBUHAN, KELANGSUNGAN HIDUP, & KEMATIAN MIKROORGANISME / 61D. PROTEKSI TERHADAP LIsIs cepat melawan bakteri vegetatif, virus, dan fungi tetapi tidak bersifat sporisidal. Aktivitasnya akan optimal bilaLisis osmotik dapat dicegah dengan membuat medium diencerkan dengan air hingga konsentrasinya menjadiisotonik terhadap protoplas bakteri yang telanjang.Diperlukan konsentrasi sukrosa sebesar l0-20o/o. Pada 60-900/0.keadaan tersebut, protoplas yang diindulsi oleh penisilintetap dapat hidup dan terus tumbuh sebagai bentuk L. B. ALDEHIDResistansi Terhadap.Berbagai Agen Glutaraldehid digunakan untuk disinfeksi dan sterilisasil\ntibakteri endoskop dan peralatan bedah pada temperatur rendah. Biasanya digunakan sebagai iarutan 2o/o untuk mencapaiKemampuan bakteri untuk menjadi resistan terhadap agen aktivitas sporisidal. Formaldehid bersifat bakterisidal,antibakteri merupakan faktor penting dalam pengendalian sporisidal, dan virusidal.bakteri. Cara bakteri dapat memperoleh sifat resistensi inidibahas pada Bab 7 dan 10. C. BIGUANIDBerbagaiAgen Fisika Klorheksidin secara iuas digunakan untuk mencuci tangan dan berbagai produk oral serta sebagai disinfektan danA. PANAs pengawet. Mikobakteri umumnya sangat resistan terhadap biguanid.i)emakaian panas adalah tindakan paling sederhana untukmensterilisasi bahan, asalkan bahan tersebut tahan terhadap D. BISFENOLke rusakan akibat panas. Gmperatur 100 0C akan membunuhsemua bakteri kecuali bentuk spora dalam waktu 2-3 menit Bisfenol secara luas digunakan untuk sabun dan agen pencucidalam biakan pada skala laboratorium; temperatur I21 0C tangan antiseptik. Pada umumnya, bisfenol adalah agen yangselama 15 menit digunakan untuk membunuh spora. berspektrum luas tetapi mempunyai sedikit efek terhadapPenguapan sering digunakan, karena bakteri lebih cepar matidalam keadaan yang lembab dan karena uap merupakan cara Pseudomonas aeruginosa dan kapang. Triklosan danuntuk menye barkan panas ke semua bagian tabung ste rilisasi.Uap harus dipertahankan pada tekanan 15 lb/sq di atas heksaklorofen bersifat bakterisidal dan sporostatik.tekanan atmosfer untuk mendapatkan temperarur sebesar E. BERBAGAI AGEN PELEPAS HALOGENI2l 0C; autoklaf atau panci bertekanan digunakan untuk Jenis agen pelepas klorin yang paling penting adalah natriumtujuan ini. Untuk mensterilkan bahan-bahan yang harus hipoldorit, ldori n diokida, dan narriu m dildoroisosianurat,tetap kering, tersedia oven listrik yang mengedarkan udara yang merupakan agen-agen pengoksidasi yang menghancurkan aktivitas selular protein. Asam hipoklorat adalah senyawapanas ; karena panas kurang efektifuntuk bahan yang kering, aktif yang menyebabkan efek bakterisidal dan virusidal daribiasanya digunakan temperatur 160-170 0C selama I jam senyawa-senyawa ini. Pada konsentrasi yang lebih tinggi, senyawa-senyawa ini bersifat sporisidal. Yodium secara cepatatau lebih. Pada keadaan yang dijelaskan di atas (yaitu, temperatur bersifat bakterisidal, fungisidal, tuberkulosidal, virusidal, dansangat tinggi yang digunakan dalam jangka waktu lama), sporisidal. Iodofor (misalnya, povidon-iodin) adalahpanas bekerja dengan cara mendenaturasi protein sel danasam nukleat serta dengan cara merusak membran sel. kompleks yodium dan agen atau karier pelarut, yang berlaku sebagai sumber I, aktif.B. RADIAsI F. DERIVAT LOGAM BERATSinar ultraviolet dan radiasi pengion mempunyai berbagaikegunaan sebagai agen sterilisator. Cara kerjanya telah Sulfadiazin perak, suatu kombinasi dari dua agen antibakteri,dibahas di atas. Ag. dan sulfadiazin, mempunyai aktivilas spektrum luas. SifatBerbagaiAgen Kimia inhibisinya mungkin disebabkan oleh ikatannya dengan komponen sel seperti DNA.Struktur kimia dan penggunaan biosid diperlihatkan padaTabel4-3. G. PERoKSIGENA. ALKOHOL Hidrogen peroksida mempunyai aktivitas spektrum luasEtil alkohol, isopropil alkohol, dan z-propanol melawan virus, bakteri, ragi, dan spora bakteri. Aktivitas sporisidal memerlukan konsentrasi HrO, yan1 lebih tinggimemperlihatkan aktivitas antimii<roba spektrum iuas yang (10-30o/o) dan waktu kontak yang lebih lama. H. FENoL Fenol dan berbagai senyawa fenolat mempunyai sifat andseptik, disinfektan, atau pengawet.

62 / BAB4I. SENYAwA AHoNIUM KUATERNER 3;, i Kerjr',a gen:ag e-n atau proiei nia nakah I yang' da patSenyawa ini mempunyai dua regio di dalam struktur d iba lik?molekularnya, satu gugus penolak air (hidrofobik) dansatu gugus penarik air (hidrofilik). (A) Disinfektan (B) Agen bakterisidal Detergen kationik, seperti yang ditunjukkan oleh (D) oi!a!i k' :',:,,t:,,,:,,',,:t:.::.::lCl,'',Ageh,,:,bakt gf !senyawa amonium kuaterner (SAK), adalah antiseptik dandisinfektan yang berguna. SAK telah digunakan untuk Autoklaf pada suhu 12li] lcriisalariia,1 5 menitberbagai tujuan klinis .(misal, disinfei<si praoperasi untuk (E) Pemanasan kering padt::iuh 160.170 oCkulit yang tidak rusak) serta untuk membersihkan selama 1 jampermukaan yang keras. Senyawa tersebut bersifat r:lril:l4;,, rrKetep__atanr,-peitUm.bU han rr'bakteii se['ama-t..t\" ],',sporostatik; menghambat pertumbuhan spora tetapi tidakmenghambat proses germinasi yang sebenarnya. SAK juga (A),,irlrr,ri.:.:r'. eksBoneh3ial. peitunibuhan'ladatah,..bersifat mikobakteriostatik dan mempunyai efek pada Nolselubung lipid tetapi bukan untuk virus yang tidak (B) Meningkatberselubung lipid. (C) Konstan Mel rurl-',.;.-,.,,',r.:. (D).,.,:,rJ. STERILAN FASE UAP :,,,,r,,:.:Alat-alat kesehatan dan bedah yang sensitif terhadap panas ,'i r: (E)':1liNqgatif :.,,' '' ::::dapat disterilisasi secara efektif dengan sistem fase uapyang menggunakan etiien oksida, formaldehid, hidrogen ,',,:',i;.l,,fitiOiia n',\"p'eiit.* U 0 han ba kte ii. :re I aiir a f as e ,peroksida, atau asam perasetat. (A),;',,',;'';l.te.seimbangan, lnaksi mum ada] ah,,,,,rl'.,',',,.,,1,,,,,,r,Berbagai Agen Kemoterapi Nol (B) MeningkatSifat alami dan cara kerja obat-obat ini dibahas dalam (C) KonstanBab 10. t:1,,;(2E1);'(NDeg)a,,ti'f,.,Me.nu.r:un,.,.,,::,.,'-. ..1,.,,,, 1.A 4.C , .;..:;.. ..: t, .;:1::',:2;g.:..,1:1' !,;:'p':,::;,.:-;:::,',..111;:;11'1L:::::. .. ...,.,,.. 3.C : \":$:ll:'r' I ; ^Wffit$S'*ffi.*r\".ffi ;ffixi,:'\" iaoi;;n,1;;;;;mpqja:.n.aini,ia:,):'ttr'.u;..q.enE!n KEPUSTAKAANsep0f iih::rjch ai iahi i:\"c6 ii' :y,en g. 119,!u!',,ke1,.d,9 lam Buhukahd u nSr.kemihnya rsae!'berh0b'uaganrie,kiUal,..,.glit',:.::,.; idli tteijebut..lp66rpii1:iy-a i',waktu..rr:!€g-eng,ra!i:?9 Block SS (editor): Disinfection, Sterilization, and Preseruation, 5th ed. Lippincott Williams and Wilkins 2001. me nii;' Setelah,'s'el a n g'20 menit;,: 6:.io mai{d,::lie' :l\it-6fbset,io g a r itrn i k, pe rtu m b u h an. Setelah 1l, :1t: Gerhardt P et al (editors): Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology, 1981.pertumbuhEn, logaritmik, :j umlah totali iet'adalahI ,,' (A) 2550 .li. i Kjelleberg S (editor): S/oruolion in Bacteria. Plenum Press, 1993., :-,:r, (B).r,,,,501? : ,.,::'. Olmstad RN (editor): APIC Infection Control and Applied Epidemiology: Principles and Practices. Mosby Year Book, 1996.:,t,:u].{C}.::i.90,::.::'i:r::t]ir,: .',' Russell AD, Hugo WB, Ayliffe GAJ (editors): Principles and Practice of,,, :::.trr'{D):':,r'1 028ii.i\"':... Disinfection, Preseruation and Sterilization, 3rd ed. Blackwell Scientifi c Publications, 1999.(E)'i,r,,, 11.000.000 Artihel & Tinjauan2; Seora n g'pe re mpr in. oa.usii i.j r:tin:u n rdr.iOiaiiwii at'.d1, irUumah sakit untuukkmm-eennddaapoaatktkaann ppeenngoOobb.aat6tan:n$e-Cara Donohue WD: The cell cycle of Escherichia coll. Annu Rev Microbiol 1993;47:199.,, Iniiavena,lerhadap] abiesnya yang, diiebabkanpeh r :: .:. dSatanp:h:pyaloiiceot'srk--eJ{luqaqfr€duesiiiittsryqmteleahhspaeknilgrroubaa,nlagd'drtei itreumbuahtr.:.t:.,l,l.,.:,:.' Kjelleberg S et a1: The transient phase between growth and nongrowth of',1 sakii peilu'didisinfekii; Seratus sel]5 auieus'lelpqjan i heterotrophic bacteria. Annu Rev Microbiol 1987,4L:25,, de_ngan,dif i0f ektqn :Sctplah.1 0 men i-ti90 a/a sel' matri.;:.,::,,:',:,:,: Kolter R, Siegels DA, Tormo A: The stationary phase ofthe bacterial life.Bera pb.,tia nVe k ie.' l,ya ng,, tste0:, h! cycle. J Bacteriol 1992;17 4:3 45. d up :,:Qt-Elnh,.,20 ., McDonnell G, Russell AD: Antiseptics and disinfcctants: Activity, action, ,:,'men it?,,,,]rL\"'' and resistance. Clin Microbiol Rev 1999;12:147.' (A) 500, Sancar A, Sancar GB: DNA repair enzymes Annu Rev Biochem:,r(g) ' 100:: 1988;57:29.',,(C) :' ,10 I .:il Siegels DA, Kolter R: Life after log. J Bacteriol 1992;174:345.,irr:r(D) l, :, 1,,r,::r:r :.i,',,,.(e),,',,,,,0.,;;1..1,: