Revvet--vol30--nro1--2019--Completa

ISSN 1668–4834 REVISTA VETERINARIA Volumen 30, número 1, 2019 FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE CORRIENTES, ARGENTINA

Composición e Impresión Imprenta “Vida Correntina” San Martín 734 — Corrientes (3400) Tel/fax: (0379) 44 25 220 Mayo de 2019

Revista veterinaria Rev. vet. 30: 1, 2019  -  ISSN 1668-4834  (on line: ISSN 1669-6840) Registro de la Propiedad Intelectual 5343694 (on-line: 5343693). Indizada en LATINDEX (México, DF), INFOCYT-OEA (Chile), CAB Inter- national (Oxford, UK), Scopus (ELSEVIER, Holanda), Gale Cengage Learning (México), DOAJ ORG. (Lund, Suecia), J-Gate (India) y EBS- CO Publishing (USA). Publicación con índice de impacto registrado por Scimago-Scopus-Elsevier desde el año 2005. Incorporada a SciELO desde 2014 y a REDIB desde 2018. Se edita un volumen con dos números por año (mayo-setiembre). La revista se financia con aportes de la Universidad Nacional del Nordeste y la Facultad de Ciencias Veterinarias, así como aranceles de publicación abonados por los autores. DIRECTOR Dr. José Antonio Coppo ADMINISTRADOR Dr. José Darío Álvarez COMITÉ EDITORIAL Dr. Hugo A. Domitrovic. Universidad Nacional del Nordeste. Argentina Dra. Ofelia Acosta de Pérez. Universidad Nacional del Nordeste. Argentina Dr. Marcial Sánchez Negrette. Universidad Nacional del Nordeste. Argentina Dr. Roberto Armando Jacobo. Universidad Nacional del Nordeste. Argentina Dr. Gustavo Á. Crudeli. Universidad Nacional del Nordeste. Argentina Dr. Jorge O. Errecalde. Universidad Nacional de La Plata. Argentina Dra. Ana Niebylski. Universidad Nacional de Río Cuarto. Argentina Dr. Rubén Eduardo Mentzel. Universidad de La Plata. Argentina Dr. Néstor Auza. Universidad Nac. Centro Prov.Bs.As. Argentina Dr. Carlos Castrillo González. Universidad de Zaragoza. España Dr. Gonzalo Tuñon. Instit. Nac. de Investi. Agropecuaria, Uruguay Dra. Islamey Tebot. Univ. de la República. Montevideo.Uruguay Dra. Diana Rojas Araya. Universidad de Costa Rica. Costa Rica Dra. Nyurky Matheus. Univ. Lisandro Alvarado, UCLA. Venezuela Lic. Cristina F. Algarra. Hospital Veterinario, Univ. Madrid. España Dra. Ruth Zárate Frutos. Universidad Nacional de Asunción. Paraguay Dr. Ramón Martínez. Universidad Nacional de Chile. Santiago de Chile Dra. Betselene Murcia Ordóñez. Universidad de la Amazonia. Colombia Dr. Sabás Hernández. Universidad Nacional de Buenos Aires. Argentina Dr. Luis Alberto Raggi. Universidad Nacional de Chile. Santiago. Chile Dr. Alejandro Córdova. Universidad Aut. Metrop. Xochimilco. México Dr. Carlos E. Suarez. Washington State Univ. Pullman. Estados Unidos ENCARGADOS DE ÁREAS Diagramación y montaje: Ing. Alder Vásquez (h) Idioma inglés: Dr. Pedro A. Zeinsteger Informática: Ing. Martín Romero Garay CUERPO DE CONSULTORES Dr. Roberto Kostlin. Universidad de Munich. Alemania Dr. Colin Holmes. Universidad Massey. Nueva Zelanda Dr. Thomas R. Preston. Univ. Trop. Agricult. Colombia Dr. Carlos Morales. McGill University, Montreal. Canadá Dr. Alberto Cirio. Univ. de la República, Montevideo. Uruguay Dra. Divina Murillo de Silanés. Universidad de Zaragoza. España Dra. Clotilde Branco Germiniani. Universidad de Curitiba. Brasil Dra. María del Carmen Tovar. Universidad de Murcia. España Dra. Aura López de Ortega. Universidad UCLA. Venezuela Dra. María Alejandra Tadich. Universidad de Chile. Chile Dr. Oscar R. Quaino. INTA Rafaela, Santá Fé. Argentina Dr. Ricardo Rodríguez. Universidad de La Plata. Argentina Dr. Julio Idiart. Universidad Nacional de La Plata. Argentina Dr. Víctor Castillo. Universidad de Buenos Aires. Argentina Dr. Néstor Oscar Stanchi. Universidad de la Plata. Argentina Dra. Adriana Duchene. Universidad de Buenos Aires. Argentina Dr. Federico Lüchter. Universidad del Litoral, Santa Fé. Argentina Dr. Guillermo Berra. Instit.Nac.Tecnol.Agropec. (INTA). Argentina Dr. Eduardo J. Gimeno. Universidad Nacional de La Plata. Argentina Dra. Alejandra Capozzo. Instit.Nac.Tecnol.Agropec. (INTA). Argentina Dr. Alejandro Soraci. Univ.Nac.Centro Prov. Buenos Aires. Argentina Publicación oficial de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE), Sargento Cabral 2139, Corrientes (3400), Argentina. Tel/fax: 54 0379 4425753. Correo electrónico: [email protected] | Publicación on line: URL http://www.vet.unne.edu.ar

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Rectora: Prof. María Delfina Veiravé Vicerrector: Dr. Elvio Eduardo Ríos * *Ex Decano de la Facultad de Ciencias Veterinarias UNNE, fallecido el 4/3/2019 luego de una penosa enfermedad Revista Veterinaria agradece el constante apoyo pecuniario brindado por la Universidad Nacional del Nordeste a través de la Secretaría General de Ciencia y Técnica FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Decano: Dr. Alejandro Daniel Báez Vice-Decano: Dra. Gladis Isabel Rebak Secretario Académico: Dr. Manuel Esteban Trujillo Secretaria de Estudios y Asuntos Estudiantiles: Dra. Sara Noemí Ulon Secretario de Extensión y Prestación de Servicios: Dr. Eduardo Gabriel Llano Secretaria Administrativa: Cra. Paola Gisele Salinas Esta revista proporciona un acceso abierto inmediato a su contenido, basado en el principio de que ofrecer al público un acceso libre a las investigaciones ayuda a un mayor intercambio de conocimiento. Esta obra está bajo una licen- cia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial 4.0 Internacional (CC BY-NC 4.0). Revista veterinaria (Rev. vet.) tiene como objetivo difundir resultados de investigaciones científicas y ac- tualizar el conocimiento de temas vinculados directa o indirectamente a las ciencias veterinarias. Publica trabajos referidos a animales de producción, de deporte y de compañía, sin excluir especies silvestres ni animales de laboratorio. Acepta colaboraciones originales de autores argentinos o extranjeros referidas a la morfología, fisiología, nutrición, patología, semiología, farmacología, microbiología, parasitología, inmunología, epidemiología, bromatología, cirugía, genética, producción animal y salud pública, efectua- das en idiomas español e inglés. Los manuscritos son sometidos a arbitraje. La revista aparece en formato convencional y on-line con periodicidad semestral (mayo y setiembre). En 2018 nuestra revista fue incorporada a REDIB, Red Iberoamericana de Innovación y Conocimiento Científico. Revista Veterinaria (Rev. vet.) publishes worldwide contributions on all aspects of veterinary science and related issues, ranging in scope from production to sport and pet animals. Wildlife and laboratory animals are considered as well. Research areas include morphology, physiology, nutrition, pathology, se- miology, pharmacology, microbiology, parasitology, immunology, epidemiology, bromatology, surgery, genetics, animal production and public health. Papers are published in Spanish and English. Manuscripts are submitted to referees prior to publication and they include Original Papers, Short Communications and Reviews. The conventional and on-line formats of Revista Veterinaria are available twice a year (May and September). Los derechos de autor (copyright) de los trabajos publicados han sido cedi- dos a Revista veterinaria. Está permitida la reproducción parcial o total de los artículos con fines científicos, en tanto sea consignada la fuente original. Las opiniones vertidas son de exclusiva responsabilidad de los autores.

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 1, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 Corrientes, Argentina INDICE Rev. vet. 30: 1, 2019 TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN Evaluación de la actividad inmunogénica de una vacuna para anaplasmosis bovina. Lozina, L.; Torioni, E.S.; Barbieri, F.; Del Río, F.; Ríos, E.E. .............................................................. 3 Antioxidant effect of lutein protects against oxidative damage to porcine spermatozoa. Gavazza, M.; Marmunti, M.; Compagnoni M.; Palacios, A. ................................................................. 7 Efecto protector de la vitamina C sobre el estrés oxidativo en ratas con diabetes mellitus. Mendoza, C.; Flores, C.; Melendez, C.; Marquez, Y.C.; Matheus, N. ................................................. 12 Eficacia de levofloxacina en caninos con infecciones cutáneas y urinarias. Casas, L.; Vaz, S.; Landoni, M.F. ......................................................................................................... 17 Comparación de dos métodos de criopreservación de semen porcino. Pérez, M.C.; Petrinelli, A.; Rodríguez, P.C.; Satorre, M.M.; Breininger, E. ....................................... 23 Poliartritis asociada a leishmaniasis en un canino del nordeste argentino. Lockett, M.B.; Llano, E.G.; Maidana, H.R.; Báez, A.D.; Cabrera, W.R. ............................................ 28 Una leche bubalina incrementó la colesterolemia y agravó la ateroesclerosis en conejos. Lertora, W.J.; Villordo, G.I.; Mussart, N.B.; Catuogno, M.S.; S.Negrette, M. .................................... 32 Direct fluorescent antibody test and bacteriological culture for detection of Brucella suis. Estein, S.M.; Bence, A.R.; Cacciato, C.S.; Echavarría, H.M.; Soto, P. ............................................... 39 Interacción genotipo-manejo de la alimentación en la producción de pollos camperos. Dottavio, A.M.; Romera, B.M.; Canet, Z.E.; Di Masso, R.J. ............................................................... 43 Efecto de la fertilización nitrogenada sobre la producción de Cynodon plectostachyus. Méndez, R.; Fernández, J.A.; Yáñez, E.A. ........................................................................................... 48 Molecular genetic diversity of sheep breeds of Pakistan based on nuclear microsatellite loci. Hussain, T.; Musthafa, M.M.; Babar, M.E.; Shaheen, M.; Marikar, F.M. ........................................... 54 Prevalencia de coccidios en pollos de traspatio de Salamanca (Guanajuato, México). Ramos, D.F.; Sahagún, C.A.; Avila, R.A. ............................................................................................. 59 Riesgos ocupacionales en estudiantes de veterinaria en Argentina. Tarabla, H.D.; Molineri, A.I.; Robin, H.; Signorini, M.L. ................................................................... 63 COMUNICACIÓN BREVE Casuística de leishmaniosis canina registrada en Corrientes, Argentina (2014-2016). Maidana, H.R.; P.Gianeselli, M.; Báez, A.D.; Cabrera, W.R.; Llano, E.G. ........................................ 68 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Dermatosis autoinmunes en caninos. Estudio retrospectivo. Sieben, C.; Massone, A.R.; Machuca, M.A. ......................................................................................... 70 Instrucciones a los autores ................................................................................................................ 76 Instructions to authors ...................................................................................................................... 78

2 PREMIOS FISIOLOGÍA 2018 Los “Premios Fisiología” se crearon hace 40 años a instancias del profesor de esa asignatura, Dr. José Anto- nio Coppo, con el objetivo de destacar la labor y dedicación de los alumnos más aplicados del curso. Además de un diploma, los estudiantes reciben libros de estudio y una variada gama de artículos personales e instrumental técnico, conseguidos por donación a través de un arduo esfuerzo del personal de la cátedra. Los mejores promedios de la promoción 2018 (foto) fueron los alumnos Federico Gabriel Otto (El Dorado, Mi- siones), Gabriela Alejandra Rau (San Vicente, Misiones) y Tamara Yoana Gómez (Corrientes), quienes recibieron las distinciones en acto realizado en el anfiteatro de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNNE. Durante el lapso transcurrido desde 1978 fueron sucesivamente galardonados los alumnos Gallardo, Ronco- roni, Castro, Blanco, Kler, Núñez, Terraes, Nery, Kucharuk, Pozzerle, Podestá, Defagot, Poletti, Gutnisky, Alvez, DeVargas, Lavenás, Flam, Trujillo, Cecotti, Gauna, Bulman, Fuser, Fader, Galera, Koscinczuk, Manauta, Alcalá, Mendelak, Cabral, F.Quintana, Bainotti, Tarif, Dutra, Meabe, Tito, Galli, Rojas, Voegeli, Silvero, Delmonte, Ve- rón, Buthay, Santillán, Vignolo, Baldezzari, Oppen, Acosta, Semenza, Misi, Yáñez, Fontana, Cardona, Gómez, Jordán, Teibler, Stegmayer, Rosciani, Rossi, Boujon, Fain, Rivelis, Perone, Torrent, López, Gerula, Acquarone, Breska, Parra, Tuzinkievicz, Quinteros, Escalier, Echeverría, Koza, Basilis, Garnica, Guerra, Tévez, Scarnatto, Maruñak, Logan, Tuñón, Sawczuk, Campos, Anderson, Arletaz, Zeinsteger, Jovanovics, Schreiner, Pentreath, López, Moreyra, Pedotti, Alvarez, Guanziroli, Fioranelli, Segura, Minoli, Zbinden, Laffont, Insfran, Marighetti, Jetter, Comolli, Aguilar, Lazarte, Brem, Prieto, Zorzoli, Acosta, Martínez, Catuogno, Sieburger, Bravo, Frago- so, Viola, Slumczeski, Koch, Fernández, Nenning, Borget, Arralde, Ramírez, Herrero, Dayer, Martínez, Arrio- la, Cáceres, Franeveo, Castruccio, Gutiérrez, Pereson, Cettour, Navarro, Bravo, McLouglin, Libutzki, Obregón, Cowper, Bravo, Pantiú, Monzón, Caramello, Aventín, Dubiel, Olazarri, Gómez, Mohr, Bertuzzi, Casuso, Cettour, Pérez, Bacarezza, Zach, Orquera, Michel, Fracalossi, Escalante, Schmidberger, Fernández, Zalazar, González, Sheridan, Garrido, Jara, Albiach, Jastrzebski, Morales, Guastavino, Hermosi, Rodríguez, Asís, Lorenzo, Vitale, Romero, Trangoni, Hernando, Pucheta, Polo, Guanca, Calderón, Vittar, Lingor, Pedrozo, Sosa, González, Yaya, Gómez, Cainelli, Koberstein, Videnoff, Rojas, Noguera, Zdanowski, Serqueiros, Odriozola, Morel, Maciel, Men- doza, Bravo, Arnica, Navarro y Argoitia. Muchos de ellos se incorporaron como ayudantes de cátedra y, al egresar, abrazaron la carrera docente y las labores de investigación que se realizaban en el campo de la fisiología veterinaria, en ésta y otra facultades del país (en algunos casos del extranjero). Otros optaron por otras asignaturas, o bien por el ejercicio de la profesión y por diversas labores relacionadas con la carrera. En reiteradas oportunidades tuvimos la satisfacción de recibir la visita de muchos de ellos, quienes manifestaron conservar inolvidables recuerdos de su paso por esta Facultad.

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 3-6, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Evaluación de la actividad inmunogénica de una vacuna para profilaxis de la anaplasmosis bovina Lozina, L.1; Torioni, E.S.2; Barbieri, F.1; Del Río, F.1; Ríos, E.E.1 1Dpto. Clínicas, Fac. Cs. Vet., Univ. Nac. Nordeste (UNNE), Cabral 2139, Corrientes 3400, Argentina. 2Instit. Nac. Tecnol. Agropec. (INTA), Rafaela, Santa Fe, Argentina. E-mail: [email protected] Resumen Lozina, L.; Torioni, E.S.; Barbieri, F.; Del Río, F.; Ríos, E.E.: Evaluación de la acti- vidad inmunogénica de una vacuna para profilaxis de la anaplasmosis bovina. Rev. Vet. 30: 1, 3-6, 2019. El objetivo de este trabajo fue formular una vacuna criopreservada para la prevención de la anaplasmosis y evaluar su actividad inmunogénica. Se utilizó una vacuna monovalente de 2,5x107 eritrocitos bovinos infectados con Anaplasma centrale, criopreser- vada en glicerol en dosis de 0,5 ml. Para ello se seleccionaron 20 terneros entre 4-10 meses de edad, libres de anaplasmosis, de un establecimiento ubicado en la Provincia de Corrientes, Argentina. El lote fue dividido en dos grupos iguales, uno recibió la vacuna criopreservada y el otro se utilizó como grupo control sin vacunación. Se tomaron muestras de suero a los 0, 30 y 60 días post-vacunación (dpv) y se evaluó la inmunidad inducida por la vacuna me- diante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en suero. A los 15-30-45 y 60 dpv se analizaron muestras de sangre de 3 terneros de cada grupo para la identificación y diferenciación de Anaplasma sp mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). ELISA resultó negativa para los 20 terneros analizados en el día de la vacunación; a los 30 dpv dos terneros del grupo vacunado resultaron positivos mientras que los terneros del grupo control fueron negativos. A los 60 dpv el 80% de los terneros del grupo vacunado fue positivo al ELI- SA y dos animales del grupo control resultaron sospechosos. La PCR reveló la presencia de A. centrale a los 60 dpv no solo en los tres terneros del grupo vacunado sino también en los tres del grupo control, hecho que podría atribuirse a la transmisión horizontal por iatrogenia o a través de vectores. A. marginale no fue identificado. La falta de detección de anticuerpos específicos a los 60 dpv en dos terneros vacunados, no analizados por PCR, podría respon- der a un período de incubación más prolongado, y hubiera requerido un control posterior. Se concluye que la vacuna monovalente de A. centrale criopreservada confirió una inmunidad adecuada para la profilaxis de la anaplasmosis en terneros, resultando una alternativa válida para establecimientos de zonas libres de garrapatas. Se confirmó la ausencia de A. marginale en el rodeo analizado y la transmisión horizontal de la cepa vacunal. Palabras clave: bovino, anaplasmosis, inmunoprofilaxis, controles ELISA y PCR. Abstract Lozina, L.; Torioni, E.S.; Barbieri, F.; Del Río, F.; Ríos, E.E.: Evaluation of the immu- nogenic activity of a vaccine for the prophylaxis of bovine anaplasmosis. Rev. Vet. 30: 1, 3-6, 2019. The aims of this work were to formulate a cryopreserved vaccine for the prevention of anaplasmosis and to evaluate its immunogenic activity. A monovalent vaccine of 2.5x107 bovine erythrocytes infected with Anaplasma centrale in a dose of 0.5 ml, cryopreserved in glicerol, was used. Twenty calves were selected, ranging from 4 to 10 months-old, free of anaplasmosis, from an establishment located in the Province of Corrientes, Argentina. The batch was divided into two groups, one received the cryopreserved vaccine and the other was not vaccinated (control group). Serum samples were taken at 0, 30 and 60 days after vaccina- tion (dav), and immunity induced by the vaccine was evaluated by ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay). At 15-30-45 and 60 dav, blood samples were analyzed from 3 calves of each group for the identification and differentiation of Anaplasma sp by polymerase chain reaction (PCR). ELISA was negative for the 20 calves analyzed on the day of vaccination; at 30 dav two calves of the vaccinated group were positive while the calves of the control group were negative. At 60 dav, 80% of the calves in the vaccinated group were positive to ELISA and two animals in the control group were suspect. PCR revealed the presence of A. centrale Recibido: 5 junio 2018 / Aceptado: 28 agosto 2018

4 Lozina L. et al.: Vacuna contra anaplasmosis bovina. Rev. Vet. 30: 1, 3-6, 2019 at 60 dav, not only in the three calves of the vaccinated group but also in three animals of the control group. The latter could be attributed to horizontal transmission by iatrogenesis or through vectors. A. marginale was not identified. The lack of detection of specific antibod- ies at 60 dav in two vaccinated calves, not analyzed by PCR, could correspond to a longer incubation period, and later controls should have been performed. It is concluded that the cryopreserved monovalent vaccine of A. centrale confers an adequate immunity for the pro- phylaxis of anaplasmosis in calves, thus being a valid alternative for those establishments of tick-free zones. Absence of A. marginale as well as horizontal transmission of the vaccine strain were confirmed. Key words: bovine, anaplasmosis, immunoprophylaxis, ELISA and PCR controls. INTRODUCCIÓN de solución salina balanceada con glicerol 1,5 M. Esta presentación se formuló a través de la suspensión de La anaplasmosis bovina es una enfermedad in- eritrocitos con la adición de glicerol como criopreser- fecciosa, aguda o crónica, caracterizada por presentar vador. Esta mezcla se envasó en pajuelas y se expuso anemia, ictericia e hipertermia, entre otros síntomas. El a una fase de vapor de nitrógeno líquido, congelando agente causante es la rickettsia Anaplasma marginale, a una tasa de 20°C por minuto en una unidad de con- que invade los glóbulos rojos produciendo su destruc- gelación programable. Cuando la temperatura llegó a ción. Es transmitida por diferentes mecanismos, entre -196°C las pajuelas se trasladaron rápidamente a un ter- otros por infección intrauterina, por picadura de insec- mo de nitrógeno líquido. tos hematófagos, o iatrogénicamente (castración, des- corne o utilización de instrumental contaminado) 7 . Animales. Se seleccionaron veinte bovinos, hem- Los métodos actuales de control de la enfermedad bras, mestizos de Hereford, entre cuatro y seis meses involucran, en primer lugar, al tratamiento farmacológi- de edad. El lote se dividió aleatoriamente en dos grupos co de los animales afectados, mediante oxitetraciclina de diez animales cada uno. El primer grupo fue inocu- o imidocarb. Luego de controlar la erradicación de los lado con la vacuna y el segundo grupo ofició como tes- vectores, como prevención se recomienda la vacunación tigo. Los animales fueron adecuadamente identificados con cepas de Anaplasma centrale, práctica que garanti- con caravanas (Tabla 1), tras lo cual se procedió a la za un estado de fuerte protección inmunológica 9 . inoculación de la vacuna monovalente conservada en El método inmunoprofiláctico constituye una he- termos de nitrógeno líquido a -196ºC. Posteriormente, rramienta importante utilizada en nuestro país, de se envió el lote completo (inoculados y controles) a un comprobada eficacia para controlar el impacto de ana- corral con comedero de autoconsumo. El ensayo expe- plasmosis y babesiosis en los sistemas de producción rimental se llevó a cabo en un campo de la Provincia ganadera. Consiste en aplicar un inmunógeno a base de de Corrientes, a 37 km de Sauce, localidad ubicada por agentes parásitos atenuados de Babesia bigemina, Ba- debajo del paralelo 30°S. besia bovis y Anaplasma centrale, desarrollado por el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Determinación de la actividad inmunogénica e Existen disponibles dos presentaciones de esta vacuna, identificación de Anaplasma sp. Se obtuvieron mues- una fresca (con duración de 7 días) y otra criopreser- tras de suero de todos los animales incluidos en la ex- vada con una viabilidad de 2 años desde la fecha de periencia en los 0, 30 y 60 días post-vacunación. La elaboración. presencia de anticuerpos contra la proteína mayor de En áreas libres de la garrapata Rhipicephalus (Boo- superficie de Anaplasma sp (MSP-5) se determinó me- philus) microplus, la babesiosis no representa un pro- diante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas blema, al contrario de lo que sucede con la anaplasmo- (ELISA competitivo). Asimismo, a los días 15, 30, 45 y sis, requiriendo la utilización de la vacuna ultraconge- 60 se tomaron muestras de sangre con anticoagulante lada conteniendo solo A. centrale 8, 10 . de seis animales, tres de cada grupo, para la identifica- Por lo expuesto, en el presente trabajo se formu- ción y diferenciación de Anaplasma sp mediante reac- ló una vacuna criopreservada para la prevención de la ción en cadena de la polimerasa (PCR anidada). Estos anaplasmosis, evaluándose su actividad inmunogénica. ensayos se realizaron en el Servicio de Diagnóstico Animal de la Estación Experimental INTA (Rafaela, MATERIAL Y MÉTODOS Santa Fe, Argentina), siguiendo el procedimiento des- crito por especialistas en el tema 12 . Vacuna monovalente. La composición cuali-cuan- titativa de cada dosis de 0,5 ml fue de 2,5 x 107 eritroci- Evaluación clínica. Durante todo el ensayo, prin- tos infectados con A. centrale M1, 125 UI de penicilina cipalmente a partir de los 30 días (período de patencia G sódica, 125 μg de sulfato de estreptomicina y 0,5 ml de Anaplasma sp), se observó el estado general de los

Lozina L. et al.: Vacuna contra anaplasmosis bovina. Rev. Vet. 30: 1, 3-6, 2019 5 animales y los posibles efectos adversos en respuesta a Tabla 1. Resultados del test ELISA a los 30 y 60 días la inmunización. en grupos inoculado y control. RESULTADOS Y DISCUSIÓN grupo N ELISA 30 dpv ELISA 60 dpv inoculados Los resultados arrojados por el ensayo ELISA se 151 2% N 89% POS midieron en porcentaje de positividad respecto de un controles 152 2% N 4% N suero de referencia positivo. El punto de corte fue de 153 3% N 84% POS 28%. Se tomaron como sospechosos a los valores cer- 154 1% N 97% POS canos al 28%, entre 25 y 40%. El 100% de los animales 155 79% POS 91% POS muestreados al día 0 resultaron negativos. 156 36% POS 84% POS 157 12% N 106% POS El análisis serológico obtenido a los 30 días reveló 158 2% N 2% N que el 20% de los animales inoculados resultaron posi- 159 13% N 103% POS tivos y el 100% de los pertenecientes al grupo control 160 3% N 77% POS fueron negativos. 171 6% N 5% N 172 2% N 3% N Transcurridos 60 días, se pudo determinar que el 173 1% N 3% N 80% de los animales vacunados obtuvieron títulos de 174 12% N 4% N anticuerpos contra Anaplasma sp y 2 animales resul- 175 4% N 27% Sosp taron sospechosos en el grupo control, como indica la 176 6% N 28% Sosp Tabla 1. 177 1% N 5% N 178 2% N 2% N Los resultados obtenidos a partir de la PCR de los 179 10% N 7% N días 15, 30, 45 y 60 se muestran en la Tabla 2. Me- 180 2% N 3% N diante la PCR se pudo confirmar que los animales que resultaron positivos en los ensayos de ELISA, fueron a N: número de caravana; ELISA: ensayo por inmunoabsor- consecuencia de la respuesta de la cepa vacunal en el ción ligado a enzimas; dpv: días post-vacunación; N: negati- sistema inmunológico de los animales. vo; POS: positivo; Sosp; sospechoso. Con estos resultados de PCR también se logró Tabla 2. Resultados de la reacción en cadena de la identificar la presencia de ADN de A. centrale en el polimerasa (PCR) a los 15, 30, 45 y 60 días en grupos grupo control, explicando los valores cercanos al pun- tratado y control (dpv). to de corte, considerados sospechosos en los ELISA. Asimismo, se puede inferir la transmisión mecánica caravana PCR 15 dpv PCR 30 dpv PCR 45 dpv PCR 60 dpv por vectores, ya que las maniobras realizadas con los animales experimentales durante el presente trabajo no 151 A.m. A.c. A.m. A.c. A.m. A.c. A.m. A.c. incluyeron posibles acciones iatrogénicas. 155 157 NN N POS N POS N POS En los animales incluidos en la experiencia no se 171 N POS N POS N POS N POS observaron efectos adversos a la vacuna conteniendo 173 NN N POS N POS N POS cepas vivas de A. centrale M1. La transmisión de A. 175 NN NN N POS N POS marginale es indirecta, con excepción de la que se pro- NN NN N POS N POS duce directamente de la vaca al ternero por vía trans- NN N POS N POS N POS placentaria. La transmisión indirecta se lleva a cabo por medio de artrópodos hematófagos o por instrumen- A.m.: Anaplasma marginale. A.c.: Anaplasma centrale. N: tos u objetos accionados por el hombre 2 . negativo. POS: positivo. Los transmisores de A. marginale en nuestro país de Culicidae 11 y Haematobia irritans 3 actúan como no son conocidos con exactitud. Experimentalmente se transmisores de A. marginale y A. centrale de forma logró la transmisión transestadial de A. marginale con mecánica. Se puede inferir la transmisión mecánica de adultos de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (único la cepa vacunal por estos dípteros, principalmente tá- vector que se encuentra en Argentina) y de Amblyomma banos y mosquitos. neumanni (garrapata de tres huéspedes), que provenían de ninfas alimentadas sobre bovinos con infección pa- La transmisión iatrogénica a través de agujas, des- tente 1, 4 . cornadores, mochetas, pinzas para tatuar, bisturíes, ca- ravaneadores y otros instrumentos, actúan como trans- Sin embargo, un estudio realizado en dos estable- misores mecánicos de sangre infectada con A. centrale cimiento ubicados en la Provincia de Salta (Argentina), y A. marginale, constituyendo ésta una importante uno con R. microplus durante todo el año y el otro con vía de transmisión intra-rodeo pero no entre rodeos 6 presencia esporádica del mismo, mostró que las pri- . En el presente trabajo, se podría descartar esta vía de moinfecciones con A. marginale eran independientes transmisión debido a los recaudos tomados durante el de la presencia del supuesto vector, resultando en tasas experimento. de infección del ganado similares al cabo de un año 2 . Investigadores brasileños demostraron en 2013 la Los dípteros hematófagos como Stomoxys cal- transmisión transplacentaria en un área de inestabili- citrans, ocho especies de Tabanus sp, tres especies

6 Lozina L. et al.: Vacuna contra anaplasmosis bovina. Rev. Vet. 30: 1, 3-6, 2019 dad enzoótica a partir de vacas con infección crónica 2. Fiel C, Nari A. 2013. Enfermedades parasitarias de im- (100% seropositivas por inmunofluorescencia indirecta portancia clínica y productiva en rumiantes. Fundamen- y 63,3% positivas a PCR) y resultando los terneros re- tos epidemiológicos para su prevención y control, Edito- cién nacidos positivos en un 6,7% por PCR 5 . Si bien rial Hemisferio Sur, Montevideo (Uruguay), 752 p. en este caso no se trató de un rodeo de inestabilidad enzoótica, fue necesario realizar el perfil de anticuer- 3. Foil LD, Gorham JR. 2004. Mechanical transmission pos el día 0 a través de ELISA para tener la certeza of disease agents by arthropods. In: Medical Entomology de que los animales utilizados en el ensayo resultasen (Eldridge BF & Edman JD, edit.), Ed. Springer, New York, negativos a títulos de anticuerpos contra anaplasmosis. p. 461– 514. Asimismo, a los 15 dias post-inoculación de pudo iden- tificar A. centrale por PCR. Cabe resaltar la utilidad 4. Gaido AB. 1995. Transmission of Anaplasma marginale de esta herramienta de diagnóstico, ya que a partir de by the three-host tick Amblyomma neumanni under labo- los 15 días es posible evidenciar la presencia del agente ratory conditions. Folia Parasitol 42: 72.  etiológico. 5. Gonzalez HE, Cunha NA, Pappen FG, Farias NA. 2013. En conclusión, surge que la vacuna ultracongelada Transplacental transmission of Anaplasma marginale in de Anaplasma centrale presentó una adecuada activi- beef cattle chronically infected in southern Brazil. Rev dad inmunogénica y no se observaron efectos adversos Bras Parasitol Vet 22: 189-193. o reacciones post-vacunales, en la categoría de anima- les incluidos en el ensayo. 6. Kocan KM, Blouin EF, Barbet AF. 2000. Anaplasmosis control: past, present and future. Ann. NY Acad. Sci 916: Esta vacuna monovalente resultaría interesante 501-509. para su utilización en zonas donde la babesiosis no es endémica y redundaría en beneficios económicos para 7. Luciani C. 2003. Babesiosis y anaplasmosis, la “tristeza el productor, ya que resultaría menos costosa al pres- bovina”. Public. de la Estación Experimental Agropecua- cindir de la tecnología que implica la producción de eri- ria INTA, Colonia Benítez, Chaco, Argentina, p. 5-8. trocitos parasitados con Babesia sp, que actualmente incluye la vacuna trivalente criopreservada. 8. Mangold AJ, Aguirre DH, Guglielmone AA. 1990. Post- thawing viability of vaccines for Bovine babesiosis and Asimismo, cabe resaltar la importancia de imple- anaplasmosis cryopreserved with glycerol. Vet Parasitol mentar medidas de control de los dípteros hematófagos 37: 301-306. cuando se utilizan estos métodos inmuno-profilácticos, ya que está demostrada la transmisión mecánica de la 9. Mangold, AJ. 2005. Prevención de la babesiosis y ana- cepa vacunal. plasmosis. Anales de la Reunión Anual de la Asociación Argentina de Criadores de Braford (Rafaela, Santa Fe, Ar- La combinación de las técnicas de diagnóstico dis- gentina), p. 3-4. ponibles en nuestro país, representan una herramienta invaluable para controlar y tratar adecuadamente esta 10. OIE-World Organisation for Animal Health. 2015. Ma- patología, que provoca grandes pérdidas en nuestros nual terrestre de la OIE, Capítulo 2.4.1: Anaplasmosis bo- rodeos. vina. www.oie.int/es/normas/manual-terrestre/ Agradecimientos. Al MV Sebastián Estigarribia 11. Scoles GA, Broce AB, Lysyk TJ, Palmer GH. 2005. por sus aportes en el presente trabajo. A la Secretaria Relative efficiency of biological transmission of Ana- de Ciencia y Técnica-UNNE y al Laboratorio Litoral plasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Biológicos SRL por el apoyo económico. Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) compared with mechanical transmission by Stomoxys calcitrans (Diptera: REFERENCIAS Muscidae). J Med Entomol 42: 668-675.  12. Torioni S et al. 1998. Detection of cattle naturally infected whit Anaplasma marginale in a region of endemicity by nested PCR and competitive enzyme linked immuno sor- bent assay using recombinant major surface protein-5. J Clin Microbiol 36: 777-782. 1. Aguirre DH et al. 1994. Transmission of Anaplasma mar- ginale with adult Boophilus microplus ticks fed as nymphs on calves with different levels of rickettsemia. Parasite 1: 405-407. 

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 7-11, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Antioxidant effect of lutein protects against oxidative damage to porcine spermatozoa Gavazza, M.1; Marmunti, M.1; Compagnoni, M.2; Palacios, A.1 1Cátedra de Bioquímica; 2Laboratorio Reprod. Anim., Facultad de Cs. Veterinarias, Universidad Nac. La Plata, Buenos Aires, Argentina. E-mail: [email protected] Abstract Gavazza, M.; Marmunti, M.; Compagnoni M.; Palacios, A.: Antioxidant effect of lutein protects against oxidative damage to porcine spermatozoa. Rev. Vet. 30: 1, 7-11, 2019. Boar sperm is especially susceptible to peroxidative damage generated by reactive oxygen spe- cies (ROS). Chemiluminescence was initiated by incubating porcine semen in an in vitro ascorbate-Fe++ system, a technique that allows the evaluation of oxidative stress in these cells. Lutein is known for its antioxidant effects, chemically it is a dihydric derivative of α-carotene and belongs to the group of xanthophylls. The main objective of this study was to investigate the antioxidant effect of lutein on boar spermatozoa. The effect of lutein was analyzed by two methods: 1) by adding lutein: the sperm samples were placed in an in vitro ascorbate- Fe++ system, during 120 min at 37°C adding increasing amounts of lutein (50, 150 and 250 μg) per mg of protein and 2) by incubation with lutein in an in vitro ascorbate-Fe+2 system, for 120 min at 37°C, using spermatozoa obtained from porcine semen samples previously incubated with lutein (0.15 and 0.25 mg/ml) during 24 h at 15°C. In both methods a control group (without lutein) was used. Peroxidation was measured by chemiluminescence using a liquid scintillation counter, the light emission being quantified in cpm (counts per minute). Analyzing the effect of lutein by the two methods, it was observed that the total amount of cpm/mg of protein originated by chemiluminescence was lower in samples obtained from the lutein group than in the control group (without lutein). Total chemiluminescence (cpm total) was lower in samples obtained from the lutein group than in the control group (without lutein), with a significance of p<0.005. Percent inhibition of peroxidation was not concentra- tion dependent. These results would demonstrate that lutein could act as an antioxidant that would protect the membranes of the sperm from oxidative damage. Key words: porcine, spermatozoa, reactives oxygen species, chemiluminescence, lutein. Resumen Gavazza, M.; Marmunti, M.; Compagnoni M.; Palacios, A.: El efecto antioxidante de la luteína protege a los espermatozoides porcinos contra el daño oxidativo. Rev. Vet. 30: 1, 7-11, 2019. El esperma de cerdo es especialmente susceptible al daño peroxidativo generado por las especies reactivas de oxígeno (ERO). La quimioluminiscencia se inició incubando semen porcino en un sistema in vitro ascorbato-Fe++, técnica que permite evaluar el estrés oxidativo en estas células. La luteína es conocida por sus efectos antioxidantes, química- mente es un derivado dihídrico del α-caroteno y pertenece al grupo de las xantofilas. El objetivo principal de este estudio fue investigar el efecto antioxidante de la luteína en esper- matozoides de verracos. El efecto de la luteína se analizó por dos métodos: 1) por adición de luteína: las muestras de espermatozoides se colocaron en un sistema in vitro ascorbato-Fe+2 dependiente, durante 120 min a 37°C adicionando cantidades crecientes de luteína (50, 150 y 250 μg) por mg de proteína y 2) por incubación con luteína: también en un sistema in vitro ascorbato-Fe+2 dependiente, durante 120 min a 37°C se utilizaron espermatozoides obtenidos de muestras de semen porcino previamente incubados con luteína (0,15 y 0,25 mg/ml) duran- te 24 h a 15ºC. En ambos métodos se utilizó un grupo control (sin luteína). La peroxidación fue medida por quimioluminiscencia, utilizando un contador de centelleo líquido, siendo la emisión lumínica cuantificada en cpm (cuentas por minuto). Analizando el efecto de la luteína por los dos métodos anteriormente mencionados, se observó que la cantidad total de cpm/mg de proteína originada por quimioluminiscencia, fue menor en muestras obtenidas del grupo luteína que en el grupo control (sin luteína). Se observó que la quimioluminiscen- cia total (cpm totales) fue menor en muestras obtenidas del grupo luteína que en el grupo Recibido: 14 marzo 2018 / Aceptado: 20 julio 2018

8 Gavazza M. et al.: Antioxidant to porcine spermatozoa. Rev. Vet. 30: 1, 7-11, 2019 control (sin luteína), con una significancia de p<0,005. Los porcentajes de inhibición de la peroxidación no fueron dependientes de la concentración. Estos resultados demostrarían que la luteína podría actuar como un antioxidante que protegería las membranas de los esperma- tozoides del daño oxidativo. Palabras clave: porcino, espermatozoides, especies reactivas de oxígeno, quimioluminis- cencia, luteína. INTRODUCTION cal changes associated with sperm capacitation through the stimulation of a cyclic adenosine monophosphate/ Severe oxidative stress progressively leads to cell protein kinase A phosphorylation cascade, including dysfunction and ultimately cell death. Oxidative stress the activation of extracellular signal regulated kinase- is defined as an imbalance between pro-oxidants and/ like proteins, massive up-regulation of tyrosine phos- or free radicals on the one hand, and anti-oxidizing sys- phorylation in the sperm tail, as well as the induction tems on the other. The oxygen required for living may of sterol oxidation. indirectly be responsible for negative effects; these del- eterious effects are due to the production of free radi- When generated in excess, however, ROS can in- cals, which are toxic for the cells (superoxide anions, duce lipid peroxidation that, in turn, disrupts membrane hydroxyl radicals, peroxyl radicals, hydrogen peroxide, characteristics that are critical for the maintenance of hydroperoxides and peroxinitrite anions) 7 . sperm function 18 , including the capacity to fertilize an egg. Furthermore, the lipid aldehydes generated as Free radical attacks are responsible for cell dam- a consequence of lipid peroxidation bind to proteins in age and the targeted cells are represented by the cell the mitochondrial electron transport chain, triggering membranes, which are particularly rich in unsaturated yet more ROS generation in a self-perpetuating cycle. fatty acids, sensitive to oxidation reactions; DNA is also the target of severe attacks by reactive oxygen spe- The high levels of oxidative stress created as a re- cies (ROS) 7 . sult of this process ultimately damage the DNA in the sperm nucleus; indeed, DNA damage in the male germ High amounts of polyunsaturated fatty acid are line appears to be predominantly induced oxidatively, found in the mammalian spermatozoa membranes, reflecting the vulnerability of these cells to such stress. thereby making them susceptible to lipid peroxidation. Extensive evaluation of antioxidants that protect the Although, free radicals and ROS play major roles in re- spermatozoa against oxidative stress 3 . production, they are strongly associated with oxidative stress. Notably, antioxidant such as vitamin E and C, Porcine semen preserved at 15°C maintained the carotenoids and carnitine have been found beneficial seminal quality for a limited time. In recent years, work in restoring a balance between ROS generation and has been done on the cooling stage, a period in which scavenging activities. There are emerging evidences changes occur in the integrity of the plasma membrane. that herbal products can also boost male reproductive These are especially due to a destabilization in the anti- functions 1 . oxidant system of spermatozoa. This system preserves sperm cells from oxidative stress, which affects their Lutein is a dihydroxylated derivative of α-carotene, survival and fertilizing ability. a chemical compound belonging to the group of xan- thophylls. It is a yellow pigment found in plants, algae, The boar spermatozoon is especially susceptible photosynthetic bacteria and egg yolk. Because animals to peroxidative damage generated by ROS, due to the do not produce lutein, it is included in food supple- high proportion of polyunsaturated fatty acids present ments as an antioxidant. in its membranes. ROS are naturally formed as a by- product of normal oxygen metabolism and are involved Along with zeaxanthin are found in the ocular mac- in physiological sperm functions. When the balance ula, however, these compounds are not transformed between ROS production and detoxification, its neu- into retinol. It is related to the reduction of degenera- tralization by the antioxidants (Ax) is interrupted, ex- tion of the ocular macula, having as effect a better cess ROS creates an oxidative stress, which blocks the vision and prevents the progression of cataracts. It is cellular metabolism and decreases sperm motility. The also considered as a skin filter for light of shorter wave- addition of Ax in refrigeration could minimize sperm length (blue and violet) 6 . damage generated by ROS 21 . Oxidative stress plays a major role in the life and The measurement of the light emission from a death of mammalian spermatozoa. These gametes are chemical reaction is very analytically useful because, professional generators of ROS, which appear to derive under appropriate experimental conditions, the light from three potential sources: sperm mitochondria, cy- output is directly related to the analytical concentra- tosolic L-amino acid oxidases, and plasma membrane tion, thus allowing a precise and sensitive quantitative nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases. analysis. In addition, light emission is usually repre- sented by steady-state kinetics, which simplifies sam- The oxidative stress created via these sources ap- ple handling and measurement procedures. Chemilu- pears to play a significant role in driving the physiologi-

Gavazza M. et al.: Antioxidant to porcine spermatozoa. Rev. Vet. 30: 1, 7-11, 2019 9 minescence has been widely used as an indicator of the Preparation of fresh boar semen samples. An ali- formation of reactive oxygen species in whole cells and quot (1 ml) of semen of each samples was centrifuged organs, allowing the study of a number of pathophysi- at 800x g for 10 min, sperm pellets were separated, and ological conditions related to oxidative stress 18 . washed by resuspending in PBS (phosphate buffer sa- The purpose of this study was analyze the suscep- linum) and recentrifuging (three times). After the last tibility to non-enzymatic peroxidation by the in vitro centrifugation, 1 ml of deionized water was added to addition of different doses of the vegetable antioxidant spermatozoa 9 and they were snap-frozen and stored at lutein on porcine spermatozoa and incubate semen –20°C and used within a week of its preparation, after samples previously with the vegetable antioxidant lu- one cycle of freezing and thawing. All operations were tein and them subject the spermatozoa to a peroxida- performed at 4°C. tion process. Non-enzymatic spermatozoa peroxidation. Che- MATERIALS AND METHODS miluminescence and peroxidation were initiated by adding ascorbate-Fe+2 to spermatozoa preparations 23 . Chemicals. Bovine serum albumin (BSA) (Frac- Spermatozoa samples (1 mg of protein) were incubated tion V) was obtained from Wako Pure Chemical In- at 37°C with 0.01 M phosphate buffer (pH 7.4), 0.4 mM dustries, Japan. L (+) ascorbic acid was from Merck ascorbate, final volume: 1 ml. Laboratories. Lutein was kindly supplied by Sigma Phosphate buffer is contaminated with sufficient Laboratory. All other reagents and chemicals were of iron to provide the necessary ferrous or ferric iron analytical grade from Sigma. for peroxidation (final concentration in the incubation mixture was 2.15 mM) 19 . Pellets were incubated in vi- Animals, handling, evaluation and processing of tro with increasing amounts of lutein (0.05 to 0.25 mg/ ejaculates. Procedures involving animals were in ac- ml) per mg of sperm protein. cordance with the recommendation of the Bioethics In addition, samples of porcine semen previously Committee of UNLP (National University of La Plata). incubated with lutein (0.15 and 0.25 mg/ml) were in- The fresh boar semen samples (n = 6) kept at 15ºC were cubated for 24 h and maintained at 15°C. In all cases, obtained from stallions of the Faculty of Veterinary spermatozoa preparations which lacked ascorbate-Fe+2 Sciences UNLP and of differents commercial estab- (control) were carried out simultaneously. lishments in the province of Buenos Aires, Argentina. Chemiluminescence was measured as counts per Sperm rich ejaculate fractions (cross-breeding) ob- min (cpm) in a liquid scintillation analyzer Packard tained from three boars were collected by gloved-hand 1900 TR. Membrane light emission was determined technique and filtered with gauze during collection and over 120 min period, and recorded as cpm every 10 min evaluated for conventional semen characteristics. Ejac- and the sum of the total chemiluminescence was used ulates that showed progressive motility >70%, viable to calculate cpm/mg protein. cells >70%, normal spermatozoa >80%, and normal acrosomal integrity >80% were used. Protein determination. Proteins were determined Semen concentration was calculated by a manual by the method of Lowry et al. (1951) using BSA as count of sperm cells on a hemacytometer Bürker cham- standard 14 . ber. After evaluation, semen was diluted 1:4 in a com- mercial extender and transferred to 100 ml tubes, con- Statistical analysis. The data were subjected to taining a dose of 6 billion spermatozoa each, cooled to the Student’s t-test. Data were expressed as mean ± 17˚C, and sent by mail, packaged in insulated contain- SD. The 0.05 level was selected as the point of minimal ers under conditions of monitored temperature. The ex- statistical significance. Statistical criterion for signifi- tended semen arrived at the Reproduction Lab., Faculty cance was selected at different p values and indicated of Veterinary Sciences (La Plata, UNLP) the day after in each case. collection. At the laboratory, it was evaluated for semen qual- RESULTS ity: 1) percentage of progressively motile spermatozoa placed under a coverslip in the center of a prewarmed Effect of lutein by addition to the in vitro system 37˚C plate; 2) percentage of viable cells, by eosin-ni- ascorbate-Fe++ on spermatozoa peroxidation. Sper- grosin staining; 3) percentage of normal spermatozoa matozoa incubation in the presence of ascorbate-Fe++ morphology and of acrosomal integrity, by viewing wet resulted in membrane peroxidation as evidenced by mounts of extended semen fixed in buffered 8% glutar- light emission (chemiluminescence) when the control aldehyde solution under a phase contrast microscope at and ascorbate-Fe++ groups were compared. Values a magnification of 1000x. were 339.66 ± 72.01 in the control group while 535.33 ± An aliquot of each of the kept at 15ºC boar samples 65.45 in the ascorbate-Fe++ group. were sent from the Reproduction Lab. to the Biochemi- After incubation of spermatozoa in an ascorbate- cal Laboratory (Faculty of Veterinary Sciences, UNLP). Fe++ system at 37°C for 120 minutes in the presence of increasing amounts of lutein (50 µg, 150 µg and

10 Gavazza M. et al.: Antioxidant to porcine spermatozoa. Rev. Vet. 30: 1, 7-11, 2019 250 µg) per mg protein, the cpm originated from the skeleton 13 , affect the development of the sperm axon 10 light emission was lower in the lutein group than in the and inhibit sperm fusion. ascorbate-Fe++ group. Values were 535.33 ± 65.45 in the ascorbate-Fe++ group while with the addition of 0.05, Porcine semen has high levels of unsaturated fatty 0.15 and 0.25 mg of lutein were 304 ± 17.68, 301.33 ± acids. In previous studies we have shown that these 30.44 and 310 ± 20.85 respectivelly, the significance fatty acids exposed to an in vitro system, in the pres- was p<0.005 (Figure 1). ence of ascorbate, were vulnerable to peroxidation. In the presence of lycopene, a natural antioxidant that has Spermatozoa obtained from porcine semen incu- a high in vitro ability to bind to singlet oxygen, a pro- bation with lutein: chemiluminescence. The values of tective effect against peroxidation was observed, since light emission of spermatozoa obtained from porcine the main unsaturated fatty acids were not affected by semen incubated with lutein (Figure 2) showed statis- this process. tically differences (p<0.005), when the spermatozoa control group (ascorbate-Fe++ without lutein) were com- The main objective of this study was to investigate pared with the spermatozoa incubated group with 0.15 the antioxidant effects of lutein on boar spermatozoa. and 0.25 mg/ml of lutein. In vitro peroxidation research is desirable for the elu- cidation of possible peroxide formation mechanisms in DISCUSSION vivo 8 , since membrane composition causes vulnerabil- ity to peroxidative degradation 17 . Peroxidation is recognized as a harmful process for spermatozoa, leading to loss of motility and reduced Although important studies have been carried out fertilization capacity in spermatozoa of many species, to characterize changes in the structure, composition including man 2 . Peroxidation occurs spontaneously and physical properties of membranes undergoing oxi- in mammalian spermatozoa 12 and is greatly improved dation 5, 15, 16, 20 , it is necessary to know how biologi- in human subfertile ejaculates 4 or in stored semen of cal compounds with antioxidant properties contribute birds 2, 22 . to the protection of specialized membranes against the harmful effects produced by reactive species of oxygen It is believed that the mechanisms by which ROS and other free radicals. disrupt sperm function imply the peroxidation of the polyunsaturated fatty acids present in the sperm plas- The actual evidence shows that lutein has an ef- ma membrane and this process plays an important role fective antioxidant activity 11 , with lutein being able in the pathophysiology of male infertility 2 . ROS in- to improve the biochemical parameters and reduce the crease the fragmentation of DNA 2 , modify the cyto- formation of inflammatory cytokines, thus avoiding oxidative stress. In conclusion, our results agree with the hypothesis that lutein could protect the membranes from oxidative damage. Figure 1. Effect of lutein by addition to the in vitro Figure 2. Spermatozoa obtained from porcine semen system ascorbate-Fe++ on spermatozoa peroxidation. incubation with lutein: chemiluminescence. Results Results are expressed as mean ± SD of six indepen- are expressed as mean ± SD of six independent expe- dent experiments. The values ​o​ f light emission showed riments. After non enzymatic peroxidation, the values ​​ statistically differences (*p<0.005), when the control of light emission showed statistically differences (without ascorbate) and ascorbate-Fe++ (with ascor- (*p<0.005) between the lutein incubated spermatozoa bate-Fe++) spermatozoa membrane groups were com- membrane group compared with the control + ascor- pared. Similarly, differences (*p<0.005) were found bate group (non incubated). when was compared ascorbate-Fe++ with ascorbate and antioxidant addition (0.05, 0.15 and 0.25 mg/ml) sper- matozoa membrane groups.

Gavazza M. et al.: Antioxidant to porcine spermatozoa. Rev. Vet. 30: 1, 7-11, 2019 11 Acknowledgements. This work was supported by 12. Lenzi A et al. 2000. Lipoperoxidation damage of sper- Grant 11/V227 of Secretaría de Ciencia y Técnica, Na- matozoa polyunsaturated fatty acids (PUFA): Sacavenger tional University of La Plata, Argentina. mechanism and possible therapies. Front Biosci 5: E1-E2. REFERENCES 13. Lopes S, Jurisicova A, Sun JG, Casper RF. 1998. Reac- tive oxygen species: potential cause for DNA fragmenta- 1. Adewoyin M et al. 2017. Male infertility: the effect of tion in human spermatozoa. Hum Reprod 13: 896-900. natural antioxidants and phytocompounds on seminal oxi- dative stress. Diseases 5: 1-26. 14. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol 2. Aitken RJ. 1994. A free radical theory of male infertility. Chem 193: 265-275. Reprod Fertil Dev 6: 19-24. 15. Naserzadeh P, Hosseini MJ, Arbabi S. 2015. A compari- 3. Aitken RJ. 2017. Reactive oxygen species as mediators of son of toxicity mechanisms of cigarette smoke on isolated sperm capacitation and pathological damage. Mol Reprod mitochondria obtained from rat liver and skin. Iran J Dev 84: 1039-1052. Pharm Res 14: 271-277. 4. Alvarez JC, Storey BT. 1989. Role of gluthatione peroxi- 16. Omotayo TI, Akinyemi GS, Omololu PA. 2014. Possible dase in protecting mammalian spermatozoa from loss of involvement of membrane lipids peroxidation and oxida- motility caused by spontaneous lipid peroxidation. Gam- tion of catalytically essential thiols of the cerebral trans- ete Res 23: 77-90. membrane sodium pump as component mechanisms of iron-mediated oxidative stress-linked dysfunction of the 5. Ayala A, Muñoz MF, Argüelles S. 2014. Lipid peroxida- pump’s activity. Redox Biol 4: 234-241. tion: production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxid Med 17. Shichiri M. 2014. The role of lipid peroxidation in neuro- logical disorders. J Clin Biochem Nutr 54: 151-160. Cell Longev. http://dx.doi.org/10.1155/2014/360438, 18. Spiteller G. 2003. Are lipid peroxidation processes in- 31 pages. duced by changes in the cell wall structure and how are 6. Begoña OA. 2008, Efecto de “nuevos” nutrientes sobre la these processes connected with diseases?. Med Hypoth- eses 60: 69-83. retina y la función visual. Rev Nutr Práct 12: 64-69. 7. Bonnefoy M, Drai J, Kostka T. 2002. Antioxidants to 19. Terrasa A, Guajardo M, Catalá A. 2000. Selective inhi- bition of the non-enzymatic lipid peroxidation of phospha- slow aging, facts and perspectives. Presse Med 31: 1174- tidylserine in rod outer segments by alpha-tocopherol. Mol 1184. Cell Biochem 211: 39-45. 8. Brand MD, Affourtit C, Esteves TC. 2004. Mitochon- drial superoxide: production, biological effects, and acti- 20. Vyssokikh MY, Antonenko YN, Lyamzaev KG. 2015. vation of uncoupling proteins. Free Radic Biol Med 37: Methodology for use of mitochondria-targeted cations in 755-767. the field of oxidative stress-related research. Methods Mol 9. Dandekar SP, Nadkami GD, Kulkami VS, Punekar S. Biol 1265: 149-159. 2002. Lipid peroxidation and antioxidant enzymes in male infertility. J Posgrad Med 48: 186-189. 21. Williams S et al. 2015. Boar semen cryopreservation: Re- 10. Hinshaw DB, Sklar LA, Bohl B. 1986. Cytoeskeletal sults and advances in the technique. Analecta Vet 35: 17-25. and morphologic impact of cellular oxidant injury. Am J Pathol 123: 454-464. 22. Wishart GJ. 1989. Physiological changes in fowl and tur- 11. Larouche D et al. 2016. Evaluation of antioxidant intakes key spermatozoa during in vitro storage. Br Poult Sci 30: in relation to inflammatory markers expression within the 443-454. normal breast tissue of breast cancer patients. Integr Can- cer Ther Nov 30. pii: 1534735416676584 [Epub ahead of 23. Wright JR, Rumbaugh RC, Colby HD, Miles PR. 1979. print]. The relationship between chemiluminescence and lipid peroxidation in rat hepatic microsomes. Archiv Biochem Biophys 192: 344-351.

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 12-16, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Efecto protector de la vitamina C sobre el estrés oxidativo y daño al ADN en ratas con diabetes mellitus Mendoza, C.; Flores, C.; Melendez, C.; Marquez, Y.C.; Matheus, N. Unidad de Investigación en Ciencias Funcionales “Dr. Haity Moussatché”, Fac. Cs. Veterinarias, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, Barquisimeto, Venezuela. E-mail: [email protected] Resumen Mendoza, C.; Flores, C.; Melendez, C.; Marquez, Y.C.; Matheus, N.: Efecto protector de la vitamina C sobre el estrés oxidativo y daño al ADN en ratas con diabetes mellitus. Rev. Vet. 30: 1, 12-16, 2019. La diabetes mellitas (DM) es una enfermedad metabólica de origen endocrino, cuya principal característica bioquímica es la hiperglucemia crónica. Desencadena procesos bioquímicos graves para el organismo como el estrés oxidativo (EO). El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto protector de la vitamina C (VitC) sobre el EO en ratas Sprague-Dawley con DM inducida por Streptozotocina (STZ). Se utilizaron 16 ratas (100 ± 20 g), divididas en 4 grupos: 1) control, 2) STZ (diabéticas), 3) VitC + STZ, 4) VitC. En homo- genizado de hígado se determinó la concentración de malondiahaldehido, dienos conjugados y proteínas totales. Por otra parte se determinaron las actividades de superóxido dismutasa y catalasa. También se midió el daño al ADN hepático por ensayo cometa. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante programa SPSS versión 17.0 para Windows. Se aplicó un Anova y una prueba de comparación múltiple DMS (p<0,05). Se pudo evidenciar que en el grupo de animales tratados con VitC disminuyeron los niveles de glucosa y la generación de EO; también hubo menor daño del ADN por radicales libres. Estos datos permiten inferir que la VitC ejerce una efectiva acción antioxidante y protectora del hígado ante la permanente pro- ducción de radicales libres; además de ser efectiva en la reparación y conservación del ADN. Palabras clave: rata, diabetes mellitus inducida, vitamina C, daño al ADN. Abstract Mendoza, C.; Flores, C.; Melendez, C.; Marquez, Y.C.; Matheus, N.: Protective effect of vitamin C on oxidative stress and DNA damage in rats with diabetes mellitus. Rev. Vet. 30: 1, 12-16, 2019. Diabetes mellitus (DM) is a metabolic disease of endocrine origin, which main biochemical characteristic is chronic hyperglycemia. The aim of this study was to measure the protective effect of vitamin C (VitC) on oxidative stress in Sprague-Dawley rats with DM induced by Streptozotocin (STZ). We used 16 rats (100 ± 20g), divided into 4 groups: 1) control, 2) STZ (diabetics), 3) VitC + STZ, 4) VitC. In liver homogenate, the con- centration of malondiahaldehido, conjugated dienes, and total proteins were determined, as well as the activity of superoxide dismutase and catalase. The ADN damage was measured by comet assay. The results were statistically analyzed using SPSS software version 17.0 for Windows. An Anova test and a multiple DMS comparison (p<0.05) were applied. In the group of animals treated with VitC a decrease in glucose levels was evidenced, as well as in the generation of oxidative stress. Less ADN damage induced by free radicals was also de- termined. It can be infered that VitC is an effective antioxidant and is a liver protector against to the permanent production of free radicals by diverse sources and that it is also effective in the repair and conservation of ADN. Key words: rat, induced diabetes mellitus, vitamin C, ADN damage. INTRODUCCIÓN perglucemia, el cuadro clínico incluye glucosuria, ce- tosis y acidosis, entre otros daños. Existen varios tipos La diabetes mellitus (DM) comprende un grupo de de DM los cuales se deben a una compleja interacción trastornos metabólicos caracterizados por una concen- entre genética, factores ambientales y estilos de vida. tración elevada de glucosa en sangre. Además de la hi- Los de mayor incidencia son los tipos I y II 13 . Recibido: 16 febrero 2018 / Aceptado: 22 junio 2018 En la DM tipo I ocurre destrucción de las células beta del páncreas, lo cual conlleva a una deficiencia re-

Mendoza C. et al.: Vitamina C en ratas diabéticas. Rev. Vet. 30: 1, 12-16, 2019 13 lativa o absoluta de insulina. Esta clase se conoce como Por otro lado, en estos enfermos existe evidencia diabetes inmunomediada y representa del 5 al 10% de de un aumento de la peroxidación lipídica mediada por los casos. La DM tipo II abarca el 90-95% de los casos radicales libres. Los antioxidantes de la dieta juegan un y se caracteriza por grados variables de resistencia a papel importante en la defensa frente al envejecimiento la insulina, trastornos en la secreción de la misma y y las enfermedades crónicas como la DM, el cáncer y la aumento de la producción de glucosa 13 . enfermedad cardiovascular. Estas sustancias inactivan El riesgo de desarrollar DM tipo II aumenta con los RL implicados en el EO e impiden su propagación. la edad, la obesidad y la falta de actividad física 1 . La La suplementación con antioxidantes podría tener un enfermedad, al estar asociada a un incremento en el efecto beneficioso al mejorar la morbimortalidad de riesgo de padecer patologías cardiovasculares, predis- los pacientes diabéticos 5, 6, 7 , de tal forma que podrían pone a una muerte prematura. Asimismo, eleva la posi- prevenir y retrasar el desarrollo de las complicaciones bilidad de sufrir ceguera, insuficiencia renal y amputa- crónicas de la diabetes 6 . ciones de miembros 23 . En esta investigación de corte longitudinal nos Debido a la gran proliferación de este trastorno, planteamos determinar el efecto protector de la vitami- para el año 2025 el número de personas con DM en na C (VitC) sobre el EO en la DM experimental. el continente americano será aproximadamente de 64 millones y el 62% de los casos ocurrirán en América MATERIAL Y MÉTODOS Latina y el Caribe 3 . En Venezuela, el número de per- sonas con diabetes varía entre 460.000 y 1.000.000 2 . Se utilizaron 16 ratas hembras Sprague-Dawley Debido al aumento de su prevalencia, la DM es pertenecientes a la población del Bioterio Central de considerada un problema de salud pública a nivel la Universidad Centroccidental de Barquisimeto (Ve- mundial, tanto en países desarrollados como en vías nezuela). El peso promedio de las ratas fue de 100 g. Se de desarrollo. Su prevalencia actual es de 3,5 a 4,5%. mantuvieron en jaulas individuales, con libre acceso al La incidencia más alta corresponde a Finlandia, donde agua y una dieta comercial estándar, bajo ciclos de luz la prevalencia abarca entre 35 y 40 personas/100.000 de 12 horas. habitantes, casi el doble del índice de Estados Unidos, Las ratas fueron divididas en cuatro grupos: 1 = según fue señalado en 2003. Si se tiene en cuenta el control, grupo 2 = diabéticas (inyectadas con strepto- sub-registro de DM, ella alcanzaría el 6%, del cual 85% zotocina (STZ) a dosis de 60 mg/kg de peso, grupo 3 correspondería a la DM tipo II. En Venezuela, más de = VitC + STZ (tratados con VitC 700 mg/kg via oral + un millón de personas la padecen, de las cuales la mi- STZ) y grupo 4 = tratados con VitC). tad se encuentra sin diagnóstico 9 . En el día 1 del experimento, a todos los animales El estrés oxidativo (EO) se ha relacionado con la se les extrajo una muestra de sangre (sin someterlos a patogénesis de la diabetes mellitus. El aumento de los ayuno), por medio de una punción cardiaca. La sangre radicales libres (RL) agrava la acción de la insulina a se centrifugó a 3500 revoluciones por minuto, durante nivel periférico, contribuye a la disfunción de la célula 15 minutos, a 15°C en una centrífuga Eppendorf 5402 beta pancreática 10, 19, 21 y está implicado en el desarrollo (Westburry, NY, USA). de las complicaciones crónicas 11, 12 . En el plasma se determinó el nivel de glucosa por El organismo mantiene un balance de óxido-reduc- el método enzimático de Trinder (1969) 20 mediante kit ción constante, preservando el equilibrio entre la pro- Qualitest. Estos análisis sanguíneos se repitieron el día ducción de pro-oxidantes que se generan como resulta- del sacrificio. A las ratas de los grupos 2 y 3 se les do del metabolismo celular y los sistemas de defensa an- indujo diabetes por administración de una inyección tioxidantes. La pérdida de tal balance lleva a un estado intraperitoneal de STZ (60 mg/kg por cada 1000 g de de estrés oxidativo, el cual se caracteriza por un aumen- peso corporal) diluida en buffer citrato de sodio. to en los niveles de RL y especies reactivas de oxígeno, A los grupos experimentales 3 y 4 se les adminis- que no alcanza a ser compensado por los sistemas de tró el tratamiento con VitC (700 mg/kg en el agua de defensa antioxidante, causando daño y muerte celular. bebida, durante 6 días), a partir del quinto día de la Esto ocurre en patologías degenerativas de tipo in- inducción de diabetes. Luego de un ayuno de 12 h las feccioso, inmune e inflamatorio, como la DM. La alte- ratas se sacrificaron bajo ligera eterización y se disecó ración del balance entre pro-oxidantes y antioxidantes, el hígado para obtener un homogeneizado del tejido, re- puede tener diversos grados de magnitud. En estados gistrándose su aspecto macroscópico. graves provoca alteraciones en el metabolismo celular, El homogenizado fue mantenido en hielo y en el so- como destrucción de ADN, daño a los transportadores brenadante se determinaron los niveles de las concen- de iones y proteínas a través de membranas y peroxida- traciones de malondialdehido ( MDA) por el test para ción de lípidos 8 . sustancias reaccionantes con el ácido 2-tiobarbitúrico En pacientes diabéticos existe un desequilibrio (técnica de Ohkawa 1979), dienos conjugados (DC) por entre los mecanismos antioxidantes y oxidantes, ha- el método descrito por Wallin (1993) 22 y proteínas to- biéndose demostrado una disminución de los niveles tales mediante el kit BioRad Richmond, basado en el plasmáticos de enzimas antioxidantes, de glutatión y método de Bradford (1976) 4 . de vitaminas antioxidantes.

14 Mendoza C. et al.: Vitamina C en ratas diabéticas. Rev. Vet. 30: 1, 12-16, 2019 Se utilizó como estándar una solución madre de Figura 1. Efecto de la vitamina C sobre la glucemia 1,41 mg/ml de albúmina sérica bovina y luego un trozo de ratas controles y experimentales con diabetes del hígado se homogenizó con sacarosa 0,25 M y se (X±DS). Asterisco indica diferencia significativa diluyó al 10% p/v para centrifugarse a 12.000 rpm a (*p<0,05). 4°C durante 10 minutos. Se separó el sobrenadante con pipeta Pasteur y en él se determinó la actividad de la Figura 2. Efecto de la vitamina C sobre la concentra- superóxido dismutasa (SOD) mediante un kit comercial ción hepática de malon-dialdehido en ratas controles y (Calbiochem). experimentales (X±DS). Asterisco indica *p<0,05. Otro trozo de tejido hepático fue homogenizado quienes señalan que la STZ genera un efecto diabetogé- con la solución buffer provista por el kit Calbiochem y nico en los animales de laboratorio 10, 16 . en el sobrenadante se determinó la actividad de la ca- talasa (CAT) mediante el protocolo de Aebi. Para medir También se ha demostrado que la administración el daño al ADN hepático en ratas ocasionado por la de altas dosis de STZ en animales de laboratorio causa DM, se realizó una electroforesis en células individua- la muerte de las células beta de los islotes de Langer- les (“ensayo cometa”), técnica basada en la capacidad hans del páncreas en 24 h y su administración en dosis de los fragmentos de ADN para ser embebidos en un baja permite realizar el estudio citotóxico de este com- gel de agarosa y responder a un campo eléctrico. La puesto 14 . corrida del extendido de ADN depende directamente del daño del ADN presente en las células. El incremento de la concentración de glucosa oca- siona aumento proporcional de productos de la glico- Es importante mencionar que las lesiones al ADN silación no enzimática, que pueden ser escasamente consisten en rotura de las cadenas después del trata- dañinos si se logra un buen control metabólico, pero miento con álcali o sin éste, e incluso de la combina- en caso contrario generan productos finales de la glico- ción con ciertas enzimas, lo cual incrementa la migra- silación avanzada, con degradación oxidativa y libera- ción de ADN. Esta técnica permite detectar daños en ción de RL que dañan la estructura y funcionalidad de el ADN de una célula en condiciones experimentales las proteínas 17 . de pH alcalino, y permite revelar la presencia de rom- pimiento en una hebra simple o doble del ADN en los El desbalance entre la producción de RL y anti- sitios lábiles a la alcalinidad. oxidantes genera estrés oxidativo, el EO leve puede llevar a la célula a tener más resistencia para injurias Así, las células en estudio son colocadas en agarosa, posteriores en una buena regulación de los sistemas de lisadas y luego sometidas a electroforesis bajo condi- defensa antioxidante. Por el contrario, si el EO es muy ciones específicas. En la lisis, las células pierden sus intenso, afectaría a todos los componentes de la célula proteínas y no son capaces de reparar el ADN dañado. (ADN, lípidos y proteínas) 15 . Durante la electroforesis, el ADN dañado y fragmenta- do migra dentro del gel desde el núcleo hacia la direc- Además del característico cuadro hiperglucemian- ción del ánodo. La cantidad de ADN migrado constitu- te crónico, la DM es responsable de este tipo de com- ye una medida de la extensión del daño. plicaciones, por lo que a lo largo de los años se han bus- cado alternativas terapéuticas para mejorar la calidad La observación del ADN se realizó a través de la de vida de pacientes diabéticos, como es el caso de la tinción con el colorante bromuro de etidium, siendo examinado por fluorescencia de emisión con un filtro de excitación de 515 nm y emisión de 560 nm. Las cé- lulas que contienen ADN dañado aparecen después de la electroforesis con una apariencia de cometa, con una cabeza brillante y una cola. Por el contrario, las células que contienen ADN sin lesión, aparecen con un núcleo intacto y sin cola 18 . Los resultados fueron analizados estadísticamente mediante el programa SPSS versión 17.0 para Windows, aplicándose una prueba Anova y otra de comparación múltiple con diferencia mínima significativa-DMS (p<0,05). RESULTADOS Y DISCUSIÓN El estudio realizado evidenció un aumento de los niveles de glucosa sanguínea en las ratas tratadas con STZ. Los datos confirmaron el efecto diabetogénico provocado por este compuesto, el cual se manifiesta hasta los 7 días post-inducción (Figura 1). Este resul- tado coincide con el obtenido por otros investigadores,

Mendoza C. et al.: Vitamina C en ratas diabéticas. Rev. Vet. 30: 1, 12-16, 2019 15 Figura 3. Efecto de la vitamina C sobre la concentra- Figura 5. Efecto de la vitamina C sobre la concentra- ción hepática de dienos conjugados en ratas controles ción hepática de catalasa en ratas controles y experi- y experimentales (X±DS). Asterisco indica *p<0,05. mentales (X±DS). Asterisco indica *p<0,05. de las complicaciones tardías de la DM; sin embargo hay controversia respecto a si su aumento es asociati- vo o causal de esta enfermedad. Se ha demostrado que existe aumento de RL acompañado de una disminución de agentes antioxidantes en pacientes diabéticos 6 . Los radicales libres son átomos o moléculas que en su último orbital tienen un electrón no apareado; al tra- tar de obtener su estabilidad, puede afectarse la fisiolo- gía de las células al oxidar a los lípidos de membrana, a los carbohidratos, a las proteínas o al ADN, lo cual se- ría un daño causado por el EO 8 . En esta investigación Figura 4. Efecto de la vitamina C sobre la concen- se midió el efecto de la VitC sobre la posible alteración tración hepática de superóxido dismutasa en ratas en el ADN causado por el EO. controles y experimentales (X±DS). Asterisco indica En la Figura 6 se puede observar la migración del *p<0,05. ADN, al formarse una imagen nítida de la “cola del co- meta”, obtenida en los animales diabéticos. Por el con- VitC, la cual -por sus beneficios- ha sido utilizada como trario, la imagen proveniente del grupo control no reve- antioxidante. la migración, ni formación de la cola, mientras que en En esta investigación se midió el efecto protector las provenientes del grupo tratado con VitC se observó de la VitC ante la generación de estrés oxidativo y daño una leve migración y -en algunos casos- imágenes muy al ADN en ratas con diabetes experimental. En cuanto similares al grupo control. Ello permite inferir que la al grado de EO, se pudo apreciar un efecto hepatopro- VitC previene daños en el ADN, característicos en los tector de la VitC, evidenciado por una disminución muy pacientes con diabetes. significativa (p<0,05) de los niveles de MDA (nmoles/ En conclusión, surge que la vitamina C constituye mg de proteínas) en el grupo de diabéticos tratados con un efectivo antioxidante y un importante protector del VitC, al compararlo con el grupo control (Figura 2). En hígado, ante la producción permanente de radicales li- el caso de los DC, productos inicia- les del proceso de lipoperoxidación, se observó una disminución de los mismos en los animales tratados con el antioxidante respecto al con- trol (Figura 3). Al medir la enzima SOD se observó (Figura 4) un aumento sig- nificativo de su actividad (p<0,05) expresada en U/ml en el grupo de animales tratados con VitC, al com- pararlo con el grupo control. En for- ma similar, se obtuvo un aumento significativo en la actividad de CAT (Figura 5). Existe evidencia experimental Figura 6. Electroforesis en células individuales (ensayo cometa). Imáge- que indica que el EO puede deter- nes de cometas encontrados en las muestras hepáticas con y sin tratamien- minar el comienzo y la progresión to de vitamina C (Vit C) en ratas con diabetes experimental (Diab). 40X.

16 Mendoza C. et al.: Vitamina C en ratas diabéticas. Rev. Vet. 30: 1, 12-16, 2019 bres por diversas fuentes, además de ser efectiva en la 11. Forbes JM, Coughlan MT, Cooper ME. 2008. Oxida- reparación y conservación del ADN. tive stress as a major culprit in kidney disease in diabetes. Diabetes 57:1446-1454. Agradecimientos. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tec- 12. Giugliano D, Ceriello A, Paolisso G. 1996. Oxidative nológico (CDCHT) de la Universidad Centroccidental stress and diabetic vascular complications. Diabetes Care Lisandro Alvarado (Venezuela), a través del proyecto 19: 257-267. de Código 014-VE-2012. 13. Harrison T. 2006. Principios de Medicina Interna, 16 ed., REFERENCIAS Mc Graw Hill, Méjico, p. 2367. 1. American Diabetes Association. 2012. Diagnosis and 14. Hugues B, Rodríguez J, García J. 2001. Animales de la- classification of diabetes mellitus. URL: http://www.dia- boratorio en la endocrinología: biomodelos de la diabetes betes.org/diabetes-basics/diagnosis/ mellitus tipo 1. Rev Cubana Endocrinol 12: 168-177. 2. Avilán J. 2004. Epidemiología de la diabetes en Venezue- 15. Kawada J. 1992. New hypotheses for the mechanisms la. Gaceta Méd Caracas, 112: 3-65. of streptozotocin and alloxan inducing diabetes mellitus. Yakugaku Zasshi 112: 773-791. 3. Barceló A, Rajpathak S. 2001. Incidence and prevalence of diabetes mellitus in the Americas. Rev Panam Salud 16. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. 1979. Assay for lipid per- Púb 10: 5. oxidation in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Ann Biochem 95: 351-358. 4. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utiliz- 17. Organización Mundial de la Salud. 2001. Boletín Epide- ing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: miológico 22: 2. URL: http://www.paho.org/spanish/sha/ 248-254. be_v22n2-diabetes.html 5. Brown AA, Hu FB. 2001. Dietary modulation on endo- 18. Patton W, Chakravarthy U, Davies J, Archer D. 1999. thelial function: implications for cardiovascular disease. Comet assay of UV-induced DNA damage in retinal pig- Am J Clin Nutr 71: 673-686. ment epithelial cells. Invest Ophthalmol & Visual Sci 40: 3268-3275. 6. Ceriello A, Motz E. 2004. Is oxidative stress the patho- genic mechanism underlying insulin resistance, diabetes 19. Robertson R, Harmon J, Oanh P, Poitout V. 2004. Beta and cardiovascular disease? The common soil hypothesis cell glucose toxicity, lipotoxicity and chronic oxidative revisited. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24: 816-823. stress in type 2 diabetes. Diabetes 53: 119-124. 7. Ceriello A, Testa R. 2009. Antioxidant anti-inflammatory 20. Trinder P. 1969. Determination of blood glucose using an treatment in type 2 diabetes. Diabetes Care 32: 32-36. oxidase-peroxidase system with a non-carcinogenic chro- mogen. J Clin Path 22: 158-161. 8. Chacín L. 1999. Diabetes en Venezuela. http://www.dia- b e t e s . a l.d i a .c o m /d i a b e t e s _ e n _ve n e z u el a . ht m # s c e n e _1 21. Venereo JR. 2002. Daño oxidativo, radicales libres y anti- [Consulta: 2002, Mayo 27]. oxidantes. Rev Cubana Med Milit 31: 126-133. 9. Dorado CM, Rugerio CV, Rivas SA. 2003 Estrés oxida- 22. Wallin B, Rosengren B, Shertzer H, Camejo G. 1993. tivo y neurodegeneración. Rev Fac Med UNAM 6: 46. Lipoprotein oxidation and measurement of thiobarbituric acid reacting substances formation in a single microtiter 10. Evans JL, Goldfine IP, Maddus BA, Grodsky GM. plate: Its use for evaluation of antioxidants. Analyt Bio- 2003. Are oxidative stress-activated signaling pathways chem 208: 10-15. mediators of insulin resistance and beta-cell dysfunction? Diabetes 52: 1-8. 23. Wen Y, Skidmore JC, Porter MM, Rea CA, Khokher MA, Singh BM. 2002. Relationship of glycation, anti- oxidant status and oxidative stress to vascular endothelial damage in diabetes. Diabetes Obes Metab 45: 305-308.

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 17-22, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Eficacia clínica de levofloxacina en el tratamiento de caninos con procesos infecciosos cutáneos y urinarios Casas, L.1,2; Vaz, S.1; Landoni, M.F.1 1Cátedra de Farmacología General y Clínica; 2Hospital de Pequeños Animales, Facultad Ciencias Veterinarias, UNLP, Calle 60 y 118, La Plata, Argentina. E-mail: [email protected] Resumen Casas, L.; Vaz, S.; Landoni, M.F.: Eficacia clínica de levofloxacina en el tratamiento de caninos con procesos infecciosos cutáneos y urinarios. Rev. Vet. 30: 1, 17-22, 2019. La eficacia y tolerancia de levofloxacina (Floxaday®, Holliday-Scott) para el tratamiento de infecciones dérmicas y de vías urinarias, fue evaluada en caninos. Se incluyeron 26 casos clínicos que fueron tratados con 10 mg/kg vía oral cada 24 horas durante 14 y hasta 21 días. De los 14 casos de afecciones a nivel dérmico, 4 fueron severos y los restantes de severidad intermedia. De los 12 casos de infecciones a nivel urinario, 8 fueron procesos severos, 3 intermedios y uno bajo. La eficacia de los tratamientos fue evaluada aplicando una escala ad-hoc. El tratamiento fue exitoso en el 99% de los casos, observándose curación clínica al día 4 en el 6,25% y al día 7 en el 43,75%. En el día 14 la curación clínica fue registrada en el 99% de los pacientes; solamente uno de ellos requirió un tratamiento de 21 días para alcan- zarla. En la población con infecciones urinarias todos los pacientes respondieron satisfacto- riamente al tratamiento (curación clínica), el 42% lo hizo hacia el día 4 y el 83% al día 7. Al día 14, la curación clínica fue constatada en el 100% de los casos. No se observaron efectos secundarios en ninguno de los pacientes incluidos en el estudio. En caninos, levofloxacina administrada por vía oral a la dosis de 10 mg/kg una vez al día, demostró una excelente efi- cacia y nula aparición de efectos adversos. Palabras clave: canino, levofloxacina, eficacia, dermatitis, infección urinaria. Abstract Casas, L.; Vaz, S.; Landoni, M.F.: Clinical efficacy of levofloxacin on the treatment of dogs affected by skin and urinary infections. Rev. Vet. 30: 1, 17-22, 2019. The efficacy and tolerance of levofloxacin for the treatment of skin and urinary tract infections were evalu- ated in canines. Twenty six clinical cases were included and treated orally with 10 mg/kg every 24 hours for 14 to 21 days. From the 14 cases of skin disorders, 4 corresponded to severe cases and the rest to intermediate severity. From the 12 cases of infections at urinary level, 8 corresponded to severe infections, 3 were intermediate and one was low. Treatment was successful in 99% of the cases of dermatitis. Clinical cure (score 0) was observed at day 4 for 6.25% and day 7 for 43.75% of the animals, respectively. By day 14 clinical cure was observed in 99% of patients. One patient required a 21-day treatment to reach score 0. In the population with urinary infections, all patients responded satisfactorily to treatment (clini- cal cure-score 0), 42% on day 4 and 83% on day 7. By day 14 clinical cure was observed in 100% of patients. No side effects were observed in any of the patients included in the study. Levofloxacin (Floxaday®, Holliday-Scott) administered orally at a dose of 10 mg/kg once a day in canines, demonstrated excellent efficacy with no adverse effects. Key words: canine, levofloxacin, efficacy, dermatitis, urinary tract infection. INTRODUCCIÓN Gram-negativas 6, 13 . Estas drogas alcanzan elevadas concentraciones sistémicas cuando se administran por Levofloxacina es un antimicrobiano perteneciente vía oral. al grupo IIA de las fluoroquinolonas. Los miembros de este grupo han estado disponibles desde mediados de Levofloxacina es el isómero S(-) de ofloxacina. En la década de 1980 y condujeron a importantes avances este contexto, es importante remarcar que de los dos en la terapéutica de infecciones graves por bacterias enantiómeros de ofloxacina [R(+) y S(-)], levofloxacina es el activo (eutómero) desde el punto de vista antimi- Recibido: 28 junio 2018 / Aceptado: 10 octubre 2018 crobiano (Landoni & Albarellos, J Vet Pharmacol The- rap, en prensa, 2018).

18 Casas L. et al.: Levofloxacina en infecciones caninas. Rev. Vet. 30: 1, 17-22, 2019 Las quinolonas son bactericidas de rápida acción, hubieren recibido, dentro del periodo de 14 días previos, que actúan a través de la inhibición de las topoisome- cualquier tipo de tratamiento antimicrobiano o antiin- rasas bacterianas (enzimas que controlan el superenro- flamatorio (glucocorticoides, AINEs); c) caninos con llamiento y desenrollamiento del ADN bacteriano). La enfermedades autoinmunes, neoplásicas o gastroenté- topoisomerasa afectada puede variar según el tipo de ricas; d) hembras preñadas o en lactancia; y e) caninos microorganismo: en gérmenes Gram negativos el sitio con parasitosis intestinal. primario de unión es la topoisomerasa II o ADNgira- sa, mientras que en estafilococos es la topoisomerasa Para el análisis de la incidencia de efectos secunda- IV. Estos contrastes en la afinidad por las enzimas no rios se consideró cada población siguiendo un diseño solo se reflejan en las diferencias en el espectro anti- de grupo paralelo. En casos de no detectarse diferen- bacteriano de cada fluoroquinolona, sino también en cias entre los grupos, se aplicaría un análisis descripti- los mecanismos de resistencia bacteriana que pueden vo del pool de datos obtenidos. expresarse 7 . Al momento de la primera consulta, en todos los Como el resto de las fluoroquinolonas, levofloxa- casos (independientemente de la patología subyacente) cina está especialmente indicada para el tratamiento se procedió a evaluar y registrar en la ficha clínica los de infecciones urinarias, tejidos blandos, vías aéreas datos anamnésicos, incluyendo: raza, peso, sexo, edad, superiores e inferiores, piel, glándula mamaria, osteo- alimento de consumo habitual, antecedentes de enfer- mielitis, peritonitis y septicemias producidas por gér- medades y tratamientos recibidos previamente. Asi- menes Gram negativos (E. coli y otras enterobacterias, mismo se realizó una evaluación clínica general (acti- Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella sp y Bordetella tud, apetito y dolor) y de acuerdo al cuadro patológico, bronchiseptica), también por algunos Gram positivos se continuó con la evaluación particular. aerobios (estafilococos), infecciones por Mycoplasma y bacterias intracelulares, así como algunas micobacte- Las evaluaciones particulares se repitieron los días rias atípicas, estafilococos y Chlamydia/Chlamydophi- 4, 7 y 14 post-tratamiento. Los estudios complementa- la sp 12, 14 . rios propios de cada cuadro patológico se realizaron el día 1 y se repitieron el último día de tratamiento. En Desde el punto de vista farmacocinético, levofloxa- caso de que el responsable médico lo creyera necesario cina posee una excelente absorción oral, con relativa- era posible la realización de estudios complementarios mente baja unión a proteínas plasmáticas en la mayoría en fechas adicionales. de las especies. Como el resto de las fluoroquinolonas, tiene una amplia distribución tisular, con volúmenes de La eficacia clínica de levofloxacina administrada distribución superiores al litro/kg. No sufre metaboli- por vía oral a la dosis de 10 mg/kg/24 h fue evaluada a zación hepática y es excretada en forma activa funda- través de la evolución de distintos parámetros clínicos. mentalmente por orina 3, 7 . Estos parámetros fueron divididos en generales y espe- cíficos de las patologías incluidas en el estudio. El objetivo del presente estudio fue evaluar la efi- cacia clínica de una nueva formulación de levofloxaci- A efectos de aplicar tests estadísticos, se procedió na, aprobada por SENASA en septiembre del año 2017 a graduar los parámetros clínicos incluidos en la eva- (Floxaday®, Laboratorios Holliday-Scott, Argentina), luación, tanto los generales como los específicos. Para administrada por vía oral a la dosis de 10 mg/kg/día ello, se crearon escalas ad-hoc que permitieron generar durante 14-21 días para el tratamiento de piodermias e scores para cada uno de los parámetros. Las escalas infecciones del tracto urinario en caninos. ad-hoc para cuantificar la severidad de las lesiones a través de los parámetros clínicos generales así como MATERIAL Y MÉTODOS de los específicos para cada población en estudio, se presentan en la Tabla 1. Se efectuó un estudio multi-céntrico, multi-investi- gador, paralelo, no randomizado y controlado, aplicán- Población 1. Como se mencionara previamente, dose un diseño del tipo “pre-test/post-test”, siendo rea- esta población estuvo conformada por 14 casos. Del to- lizado por médicos veterinarios de la ciudad de Buenos tal de animales, 10 correspondieron a pacientes machos Aires y del conurbano bonaerense. y los restantes 4, a hembras enteras. El peso promedio de la población estudiada fue de 21,75 kg con un desvío Se incluyeron 26 casos clínicos, divididos en dos estándar de 11,93 kg y una mediana de 25 kg, mientras poblaciones, a saber: la población 1, que incluyó ca- que la edad promedio fue de 3,96 años con un desvío ninos de 1 a 10 años de edad (n=14), con diagnóstico estándar de 3,69 y una mediana de 3,5 años. clínico de piodermia no asociada a enfermedades sub- yacentes endocrinas (hipotiroidismo, hiper-adrenocor- La población incluyó las siguientes razas: schnau- ticismo) y la población 2, constituida por caninos de 1 zer mini, sharpei, caniche, dobermann, boxer, ovejero a 10 años de edad, con diagnóstico clínico de infección alemán, golden retriever y mestizos. en el aparato urinario (n=12). Los diagnósticos definitivos y la severidad de los En ambas poblaciones se excluyeron los pacientes casos incluidos en la población (severidad calificada en que presentaban una o más de las siguientes caracterís- el rango de 1 a 3, equivaliendo 3 a la calificación más ticas: a) cachorros con menos de un año; b) caninos que alta), fueron: un caso de foliculitis superficial (severi- dad 2); un caso de alopecia de color diluido (severidad 3); un caso de furunculosis (severidad 3); seis casos de

Casas L. et al.: Levofloxacina en infecciones caninas. Rev. Vet. 30: 1, 17-22, 2019 19 demodicosis con foliculitis (severidad 2); un caso de Tabla 1. Escalas ad-hoc para cuantificar la severidad demodicosis con piodermia profunda (severidad 2); un de los parámetros clínicos de las diferentes patologías caso de dermatitis alérgica con piodermia (severidad evaluadas. 2); un caso de herida traumática de evolución crónica con miasis (severidad 3); un caso de piodermia (seve- Parámetros clínicos generales ridad 2); y un caso de piodermia perianal con fístula (severidad 3). actitud 0 - normal en reposo 1 - levemente deteriorada Población 2. Del total de 12 casos, 10 correspon- 2 - severamente deteriorada dieron a pacientes machos y los restantes a una hembra 3 - postrado entera y otra castrada. El peso promedio de la pobla- ción estudiada fue de 26,43 kg con un desvío estándar apetito 0 - normal de 22,19 kg y una mediana de 26 kg, mientras que la 1 - leve disminución del consumo edad promedio fue de 7,65 años con un desvío estándar 2 - severa disminución del consumo de 3,15 y una mediana de 7,5 años. 3 - anorexia En la población se incluyeron las siguientes razas: dolor 0 - ausente ovejero belga, pekinés, caniche, lebrel irlandés, dachs- 1 - leve hund, ovejero alemán, pastor suizo y mestizos. Los 2 - moderado diagnósticos definitivos y la severidad de los casos 3 - severo incluidos en la población (calificada en el rango de 1 a 3, equivaliendo 3 a la calificación más alta), fueron: Parámetros clínicos específicos de la población 1 dos casos de infección del tracto urinario (severidad 2); cuatro casos similares al anterior (severidad 3); un prurito 0 - ausente caso de prostatitis (severidad 3); dos casos de cistitis 1 - leve (severidad 1) y tres casos de pielonefritis (severidad 2). 2 - moderado 3 - severo Los datos recogidos fueron analizados estadística- mente, en primer lugar de manera descriptiva, calcu- presencia 1 - pápulas lando medidas de tendencia central y dispersión (media de lesiones 2 - pústulas aritmética y desvío estándar). Posteriormente, las dife- 3 - collaretes rencias entre las puntuaciones a tiempo 0 y los distin- 4 - forúnculos tos tiempos post-tratamiento, con un límite de signifi- 5 - fístulas cación de 0,05 (p<0,05), fueron evaluadas aplicando el 6 - ulceras test de Mann Withney. Todos los análisis estadísticos fueron realizados con el programa GraphPad Prism®. porcentaje corporal 1 ≤10 con presencia 2 ≤25 RESULTADOS de lesiones 3 ≤50 4 ≤75 Por fallas o incumplimiento del protocolo, seis ca- 5 >75% sos debieron retirarse del estudio; cuatro de ellos co- rrespondieron a la población 2 y los restantes a la po- Parámetros clínicos específicos de la población 2 blación 1. Las causas se detallan a continuación: diuresis 0 - normal -Caso 1. No se incluyó la evaluación del día 0. 1 - poliuria -Casos 2, 3 y 4. Tienen score 0 al día 0; no está jus- 2 - polaquiuria/hematuria tificada la indicación del tratamiento. 3 - anuria -Caso 5. No figuran los seguimientos. -Caso 6. No se pudo confirmar la correcta adminis- úlceras en 0 - ausentes tración de la dosis por dificultades en la aceptación de cavidad bucal 1 - presentes la medicación por el paciente. aliento amoniacal 0 - ausente Población 1. De los 14 casos estudiados (Tabla 1 y 1 - presente Figura 1) todos, con excepción del caso 14, finalizaron el tratamiento con la curación clínica de la patología descarga prepucial/ 0 - ausente infecciosa blanco (p<0,05). vaginal (ponderando 1 - serosa fase de ciclo estral) 2 - mucosa ó mucopurulenta En ninguno de los casos clínicos estudiados se ob- 3 - purulenta abundante servó algún tipo de efecto adverso. Cabe aclarar que el paciente 2, que poseía antecedentes de efectos desfa- En el caso 14, una paciente hembra de 8 años con vorables a nivel gastrointestinal con otros tratamientos demodicosis complicada con piodermia, el médico ve- antibióticos orales, no mostró ningún tipo de efecto ad- terinario responsable decidió la finalización del trata- verso a ese nivel. miento el día 14. Si bien la paciente había mostrado me- joría inicial (el día 7 se observó una caída del puntaje de 7 unidades (p<0,05), al considerar que el día 14 no se había profundizado la mejoría, el profesional decidió finalizar el tratamiento e iniciar una interconsulta con un endocrinólogo debido a la sospecha de la presencia de hipotiroidismo. De los pacientes que respondieron satisfactoria- mente al tratamiento (curación clínica, puntuación 0), el 6,25% lo hizo el día 4 y el 43,75% el día 7. Para el día 14 la curación clínica fue observada en el 99% de los pacientes. Solo un paciente (caso 5) requirió un tra- tamiento de 21 días para alcanzar el score 0, o sea cu- ración clínica.

20 Casas L. et al.: Levofloxacina en infecciones caninas. Rev. Vet. 30: 1, 17-22, 2019 Tabla 2. Puntuaciones en los distintos tiempos de eva- Tabla 3. Puntuaciones en los distintos tiempos de eva- luación de los pacientes con infecciones de piel. luación de los pacientes con infecciones urinarias. caso 0 día de tratamiento 21 caso día de tratamiento 4 7 14 0 4 7 14 1 10 9 6 0 NA 1 2200 2 5 5 2 0 ˮ2 220ˮ 3 9 8 5 0 ˮ3 300ˮ 4 5 5 3 0 ˮ4 222ˮ 5 9 4 4 3 05 530ˮ 6 9 5 2 0 NA 6 520ˮ 7 8 5 4 0 ˮ7 331ˮ 8 5 5 0 0 ˮ8 520ˮ 9 5 3 0 0 ˮ9 500ˮ 10 5 5 0 0 ˮ 10 1 0 0 NA 11 3 0 0 0 ˮ 11 100ˮ 12 6 5 0 0 ˮ 12 200ˮ 13 14 14 12 0 ˮX 3,00 1,33 0,25 ˮ 14 13 11 6 6 ˮ EE 0,46 0,35 0,18 ˮ X 7,57 6,00 3,14 0,64 ˮ X: media aritmética, EE: error estándar, NA: no aplicable. EE 0,88 0,93 0,91 0,46 ˮ X: media aritmética, EE: error estándar, NA: no aplicable. requirió un tratamiento de 21 días. Los restantes mos- traron curación clínica (puntuación 0) al día 14 de tra- Población 2. De los 12 casos estudiados (Tabla 3 y tamiento. Figura 2), todos finalizaron el tratamiento con curación clínica de la patología infecciosa blanco (puntuación Levofloxacina, al igual que marbofloxacina, or- final 0). No se reportaron efectos adversos en ninguno bifloxacina y pradofloxacina, posee una sustitución a de los casos clínicos estudiados. nivel del carbono-8. Estas moléculas son denominadas fluoroquinolonas de tercera generación para diferen- De los pacientes que respondieron satisfactoria- ciarlas de las de segunda generación, como ciprofloxa- mente al tratamiento (curación clínica, puntuación 0), cina y enrofloxacina 4 . el 42% lo hizo el día 4 y el 83% el día 7. Para el día 14 la curación clínica fue observada en el 100% de los Las fluoroquinolonas de tercera generación se ca- pacientes. racterizan por una muy alta eficacia frente a bacterias Gram (-), manteniendo una actividad frente a bacterias DISCUSIÓN Gram (+) similar a las de segunda generación 4 . Los presentes resultados reflejan la alta eficacia clínica de En el presente estudio levofloxacina demostró una las fluoroquinolonas de tercera generación. alta eficacia, tanto en patologías a nivel cutáneo como urinario. De la totalidad de casos estudiados solo uno La eficacia de levofloxacina en infecciones con asiento en piel, como la observada en el presente es- tudio, es comparable con la reportada por algunos Figura 1. Evolución de scores clínicos (X±EE) en los distintos tiempos de evaluación en pacientes con infeccio- nes de piel.

Casas L. et al.: Levofloxacina en infecciones caninas. Rev. Vet. 30: 1, 17-22, 2019 21 Figura 2. Evolución de scores clínicos (X±EE) en los distintos tiempos de evaluación en pacientes con infeccio- nes urinarias. investigadores para pradofloxacina 9, 10, 11 y para mar- tiva para el tratamiento sistémico de infecciones con bofloxacina por otros 12 . Sin embargo, tanto para pra- asiento en piel y tracto urinario. La ausencia de efectos dofloxacina como para marbofloxacina se requirieron adversos y su conveniente régimen de administración tratamientos más prolongados (entre 21 y 28 días). (una vez al día por vía oral), la transforman en una va- liosa alternativa terapéutica en caninos. Considerando que las fluoroquinolonas tienen una cinética de muerte bacteriana del tipo concentración Agradecimiento. A la firma Holliday-Scott, Argen- dependiente 8 , esta diferencia podría deberse a la me- tina, por el apoyo económico. nor concentración máxima observada (Cmax) reporta- da en caninos tanto para pradofloxacina (1,2 µg/ml) 2, 5 REFERENCIAS como para marbofloxacina (1,35 µg/ml) 1 , en compara- ción con la reportada para levofloxacina (3,20 µg/ml). 1. Cester CC, Schneider M, Toutain PL. 1996. Compara- tive kinetics of two orally administered fluoroquinolones Las fluoroquinolonas en general, y las de tercera in dog: enrofloxacin versus marbofloxacin.  Rev Med Vet generación en particular, poseen una alta eficacia para 47: 703-716. el tratamiento de patologías a nivel urinario 3 . En el presente estudio, levofloxacina demostró una tasa de 2. Fraatz K, Krebber R, Edingloh M, Heinen E. 2003. curación clínica al día 7 del 83%, alcanzando el 100% Oral bioavailability of pradofloxacin tablets and renal ex- al día 14. Estos resultados reflejan la potencia de levo- cretion in dogs. J Vet Pharm Therap 26: 88-89. floxacina frente a los patógenos más comúnmente aso- ciados a las infecciones del tracto urinario en caninos. 3. Howes C, Tappin S. 2016. Canine urinary tract infec- tions. Companion Anim  21: 100-108. El rango de valores de las concentraciones inhibi- torias mínimas (CIM) para levofloxacina frente a cepas 4. King DE, Malone R, Lilley SH. 2000. New classification de E. coli uropatogénicas multiresistentes con sensibi- and update on the quinolone antibiotics. Am Fam Physi- lidad a enrofloxacina aisladas de caninos, ha sido re- cian 61: 2741-2748. portada entre 0,004 y 0,25 µg/ml 6 . Considerando el valor mayor de CIM, la Cmax de levofloxacina tras su 5. Lees P. 2013. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and administración oral representaría casi 13 veces este va- therapeutics of pradofloxacin in the dog and cat.  J Vet lor; considerando que, como se mencionó previamente, Pharmacol Therap 36: 209-221. levofloxacina pertenece al grupo de antimicrobianos concentración dependiente, dato que explica su eleva- 6. Liu X, Boothe D, Jin Y, Thungrat K. 2013. In vitro po- da potencia. tency and efficacy favor later generation fluoroquinolones for treatment of canine and feline Escherichia coli uro- En conclusión, los resultados del presente estudio pathogens in the United States. World J Microbiol Biot 29: sugieren que Floxaday® es una nueva y eficaz alterna- 347-354.

22 Casas L. et al.: Levofloxacina en infecciones caninas. Rev. Vet. 30: 1, 17-22, 2019 7. Martinez M, McDermott P, Walker R. 2006. Pharma- 11. Restrepo C, Ihrke PJ, White SD, Spiegel IB, Affolter cology of the fluoroquinolones: a perspective for the use in VK. 2010. Evaluation of the clinical efficacy of pradoflox- domestic animals. Vet J. 172: 10-28. acin tablets for the treatment of canine pyoderma.  J Am Anim Hosp Assoc  46: 301-311. 8. McKellar QA, Sanchez SF, Jones DG. 2004. Pharmaco- kinetic / pharmacodynamic relationships of antimicrobial 12. Riddle C, Lemons CL, Papich MG, Altier C. 2000. drugs used in veterinary medicine. J Vet Pharmacol Ther- Evaluation of ciprofloxacin as a representative of veteri- ap 27: 503-514. nary fluoroquinolones in susceptibility testing. J Clin Mi- crobiol 38: 1636-1637. 9. Mueller RS, Stephan B. 2007. Pradofloxacin in the treat- ment of canine deep pyoderma: a multicentred, blinded, 13. Toutain PL, Castillo JR, Bousquet A. 2002. The phar- randomized parallel trial. Vet Dermatol 18: 144-151. macokinetic–pharmacodynamic approach to a rational dosage regimen for antibiotics. Res Vet Sci 73: 105-114. 10. Paradis M et al. 2001. Evaluation of the clinical efficacy of marbofloxacin (Zeniquin) tablets for the treatment of 14. Walker RD. 2000. The use of fluoroquinolones for com- canine pyoderma: an open clinical trial. Vet Dermatol 12: panion animal antimicrobial therapy. Australian Vet J 78: 163-169. 84-90. Revista Veterinaria ingresa a SciELO Revista Veterinaria, publicación oficial de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacio- nal del Nordeste (Corrientes, Argentina), ha logrado acceder al Núcleo Básico de Revistas Científicas Argentinas (Nivel 1), luego de calificar adecuadamente en el Centro Argentino de Información Científica y Tecnológica (CAICYT), según Resolución 2485/14 del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Sobre un puntaje máximo de 33 se obtuvieron 32 puntos. Tal calificación constituye “una garantía de la excelencia de la publicación” (sic) y queda expedita la vía del Portal SciELO (Scientific Electronic Library Online) para los artículos publicados. En tal calificación gravitó positivamente la circunstancia de haber aumentado el índice de impacto (Sci- mago-Elsevier) y haber disminuido las autocitaciones. También se tuvieron en cuenta aspectos como la amplia cobertura de la revista, la calidad científica del Comité Editorial, los criterios de evaluación de los artículos, el origen de los autores (locales 60%, nacionales 13%, extranjeros 27%, en idioma inglés), el adecuado balance entre trabajos científicos originales y reseñas bibliográficas (ambos con alta calidad), así como el estricto cumplimiento de la periodicidad semestral y la favorable acogida por indizadores como Cab, J-Gate, Doaj, Ebsco, Gale Cengage, Infocyt, Latindex y Scopus. Se consolida de esta manera la continuidad de “Revista Veterinaria”, que en su acontecer registra más de 50 años de existencia en nuestra Facultad de Ciencias Veterinarias, entidad que en 2018 cumplió el 98º aniversario de su fundación.

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 23-27, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Comparación de dos métodos de criopreservación de semen porcino. Efectos sobre la calidad seminal Pérez, M.C.1; Petrinelli, A.1; Rodríguez, P.C.1; Satorre, M.M.1; Breininger, E.1,2 1Fac. Cs. Veterinarias, Univ. de Buenos Aires1. Consejo Nac. Investig. Científ.& Técn. (CONICET)2. Chorroarín 280, Buenos Aires, Argentina. E-mail: [email protected] Resumen Pérez, M.C.; Petrinelli, A.; Rodríguez, P.C.; Satorre, M.M.; Breininger, E.: Compara- ción de dos métodos de criopreservación de semen porcino. Efectos sobre la calidad semi- nal. Rev. Vet. 30: 1, 23-27, 2019. Cerca del 40% de la carne roja que se consume en el mundo es provista por los cerdos. Los productores porcinos de nuestro país se encuentran ante el enorme desafío de lograr mejoras productivas con un desarrollo económico sustentable y eficiente, así como implementar tecnologías reproductivas, como la inseminación artificial y la criopreservación de semen. Tales adelantos aún presentan enormes problemas en esta especie. El objetivo de este trabajo fue comparar dos métodos simples de congelamiento para semen porcino, evaluando los parámetros de calidad seminal al momento del descongelado. Las muestras de semen fueron criopreservadas en pajuelas siguiendo el protocolo descripto por Peña y colaboradores en 2003, realizando (grupo tratamiento) o no (grupo control) una modificación en el paso final de congelamiento posterior al envasado en las pajuelas. Las evaluaciones de motilidad y vitalidad se realizaron por microscopía óptica en platina termos- tatizada y por las técnicas de eosina/nigrosina y la combinación del colorante supravital azul tripán con microscopía de contraste interferencial diferencial, respectivamente. La criocapa- citación se evaluó por la técnica fluorescente de clorotetraciclina (CTC). Los resultados de los diferentes experimentos fueron analizados por la prueba t de Student. Las muestras del grupo tratamiento evidenciaron una motilidad significativamente más alta (p<0,05) y una criocapacitación significativamente más baja (p<0,05) que la del grupo control. El porcen- taje de espermatozoides vivos en las muestras del grupo tratamiento (33±3) resultó el doble que el del grupo control (16±2). Nuestros resultados demuestran que el método de congela- miento propuesto permite obtener, al descongelado, muestras de una mayor calidad que las obtenidas al descongelar muestras que hayan sido congeladas con el método tradicional. Palabras clave: porcino, semen, criopreservación, calidad seminal. Abstract Pérez, M.C.; Petrinelli, A.; Rodríguez, P.C.; Satorre, M.M.; Breininger, E.: Comparing two simple cryopreservation methods for porcine sperm. Effect on sperm quality param- eters. Rev. Vet. 30: 1, 23-27, 2019. About 40% of red meat consumed around the world is porcine meat. Argentinean producers face the big challenge of achieving productive im- provements with efficient and sustainable economic development and reproductive technolo- gies, like artificial insemination and sperm cryopreservation (that still has many problems in this specie), seems to be an essential element for achieving them. The aim of this work was to compare two different simple cryopreservation methods for porcine sperm, evaluating sperm quality parameters at the moment of thawing. Sperm samples were cryopreserved following Peña et al. protocol (2003), performing (treatment group) or not (control group) a modification during the final step of cryopreservation after the straws’ packing. Sperm motility and viability of ejaculated and thawed sperm were evaluated by optic microscopy with thermal stage and the combination of the blue trypan supravital technique and differen- tial interferential contrast microscopy, respectively. Cryocapacitation was evaluated by the chlortetracycline technique (CTC). The results of the different experiments were analyzed by t-student test. The samples of the treatment group showed a significantly higher (p<0.05) sperm motility and a significantly lower (p<0.05) cryocapacitation than the control group. The percentage of live spermatozoa in samples of the treatment group (33±3) doubled those in the control group (16±2). Our results demonstrate that the proposed method of cryopreser- Recibido: 13 agosto 2018 / Aceptado: 3 diciembre 2018 Proyecto: Indicadores de calidad y funcionalidad metabólica en gametas porcinas (UBACyT 2014-2017).

24 Pérez M.C. et al.: Criopreservación de semen porcino. Rev. Vet. 30: 1, 23-27, 2019 vation allows obtaining, at thawing, higher quality sperm samples than the ones obtained with the traditional method of cryopreservation. Key words: porcine, sperm, cryopreservation, sperm quality. INTRODUCCIÓN Las inseminaciones utilizando espermatozoides congelados/descongelados resultan en bajas tasas de La carne de cerdo representa hoy cerca del 40% de preñez y escaso tamaño de las camadas, comparadas la carne roja que se consume en el mundo, proyectán- con las obtenidas con semen fresco o refrigerado 3 . dose a nivel mundial un consumo de 15,3 kg/habitante/ año para el 2030 12 . En los últimos años, en nuestro Aún cuando la utilización de la inseminación intra- país se ha incrementado sustancialmente su consumo, uterina junto con la inseminación a tiempo fijo han per- llegando en 2015 a unos 11,30 kg/habitante/año 10 . En mitido obtener mejores resultados 8 , la incorporación tal sentido, los productores porcinos se encuentran ante de esta biotecnología para el desarrollo productivo- el enorme desafío de lograr mejoras productivas con un comercial se encuentra claramente limitada. La utili- desarrollo económico sustentable y eficiente 15 . zación de semen criopreservado no sólo tendría efectos a nivel productivo, como en la introducción de nueva La implementación de tecnologías reproductivas genética, sino también a nivel sanitario 6 . De allí surge resulta un componente esencial para lograr un buen po- la importancia de posicionar no sólo el uso de la IA en sicionamiento productivo 16 . La inseminación artificial porcinos en nuestro país sino también a la criopreser- (IA) es la técnica más importante para el mejoramiento vación de semen, como una tecnología de uso corriente genético de los animales y es una práctica corriente en en esta especie. los principales países productores de cerdos, sustitu- yendo prácticamente a la monta natural con niveles su- El objetivo de este trabajo fue comparar dos méto- periores al 90% en Europa y en EEUU. En Sudamérica dos de congelamiento para semen porcino, evaluando se ha registrado un importante avance en los últimos los parámetros de calidad seminal al momento del des- años, llegando a casi 100% en Chile y 66% en Brasil 9 . congelado. En nuestro país las situación es diferente. Si bien MATERIAL Y MÉTODOS los niveles de producción se han incrementado en un 160% en la última década 10 , el uso de la IA no ha se- Obtención de las muestras de semen. Las mismas guido el mismo camino, mostrando aún bajos niveles se recolectaron por la técnica de mano enguantada de de utilización. En Argentina, la utilización de esta téc- 4 porcinos jóvenes mestizos (Yorkshire x Pietrain), de nica presenta un problema relacionado con el tiempo de probada fertilidad. Los animales utilizados pertenecían conservación de los espermatozoides, que es de aproxi- a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universi- madamente una semana para el semen refrigerado y dad de Buenos Aires, presentaban un estado corporal y que llevaría a problemas en el transporte de las dosis sanitario óptimo y fueron mantenidos bajo condiciones seminales debido a lo extenso de nuestro territorio. uniformes de manejo y alimentación durante el tiempo que duró el estudio. Fueron congelados todos los eya- Una posible solución a este inconveniente se en- culados que presentaron un mínimo de 70% de esper- cuentra en otra biotecnología muy asociada a la IA, que matozoides móviles y un 80% de espermatozoides con es la criopreservación de semen. A diferencia de lo que morfología normal. ocurre en otras especies pecuarias como el bovino, a nivel mundial la IA en porcinos con semen congelado, Congelamiento de las muestras de semen. Ellas sólo se utiliza con fines experimentales, para intercam- fueron criopreservadas en pajuelas siguiendo un proto- bio de material genético entre países o conservación de colo convencional 13 , realizando (grupo tratamiento) o germoplasma de altísimo mérito genético, debido a la no (grupo control) una modificación en el paso final de disminución en las dosis procesadas, la fertilidad y el congelamiento posterior al envasado en las pajuelas. En tamaño de la camada 6, 7, 20 . forma resumida, las muestras a congelar se diluyeron a:a en medio Beltsville Thawing Solution (BTS) antes Algunos investigadores indican que durante el con- de pasar por un período de enfriamiento en dos etapas: gelamiento y descongelamien-to, los espermatozoides primero a temperatura ambiente hasta los 25°C y luego, del porcino presentan cambios en la concentración y en heladera hasta los 15°C. El período de estabilización distribución de transportadores de glucosa, como el se llevó a cabo a esta temperatura durante 2 horas. GLUT-3, en su membrana celular 1 . Su disminución podría explicar la corta viabilidad, alrededor de cuatro Posteriormente, las muestras se centrifugaron a horas, de los espermatozoides descongelados del cerdo. 300G por 3 min, descartando el plasma seminal. El pre- Además la membrana plasmática del espermatozoide cipitado se re-suspendió en diluyente de enfriamiento porcino tiene escasa resistencia al proceso de congela- (lactosa, yema de huevo, penicilina y estreptomicina) ción-descongelación debido a su mayor concentración previamente a la realización de una curva de enfria- de fosfolípidos insaturados 2 .

Pérez M.C. et al.: Criopreservación de semen porcino. Rev. Vet. 30: 1, 23-27, 2019 25 miento desde los 15°C hasta los 5°C en 1,5 horas (mo- evaluó por la técnica fluorescente de cloro-tetraciclina dificando la velocidad de enfriamiento a los 10°C y a (CTC) 4 . Dicha técnica se basa en la capacidad de este los 8°C). Una vez alcanzados los 5°C se realizó una antibiótico de quelar el calcio, indicando mediante fluo- segunda dilución con diluyente de congelamiento (lac- rescencia, la localización de este ión unido a proteínas tosa, yema de huevo, Equex y glicerol), previo al enva- y glicoproteínas de la membrana plasmática 17 . sado de las pajuelas. Luego del envasado, las pajuelas se mantuvieron 4 min a -20°C. La solución de CTC fue preparada diariamente agregando 500 µM de CTC al buffer que contenía NaCl Finalmente, en el grupo “control”, las pajuelas se 130 mM, cisteína 5 mM y Tris 20 mM, pH = 7,8. La congelaron sobre vapores de nitrógeno (3 min) y luego solución se mantuvo protegida de la luz hasta su uti- directamente en nitrógeno líquido, donde se almacena- lización. A 100 µl de la suspensión espermática se le ron hasta su utilización. En el grupo “tratamiento” las agregaron 100 µl de la solución de CTC. Finalmente se pajuelas se congelaron colocándolas durante 1 min so- agregó glutaraldehído 12,5% (v/v) en TRIS-HCl 1 mM, bre una barra de hielo seco (para congelar el sellador) a una concentración final de 0,1% para fijación. Para y luego, 10 min entre dos barras de hielo seco 21 . Las evaluar la fluorescencia se utilizó un microscopio de pajuelas de este grupo también se almacenaron en ni- epifluorescencia Carl Zeiss utilizando 410 ηm de exci- trógeno líquido hasta su utilización. tación de epifluorescencia, con una magnificación de 400x. Determinación de la concentración espermática. La concentración espermática se determinó por hema- Esta técnica detecta cambios en la membrana plas- tocitometría en una cámara de Neubauer de 0,1 mm de mática del espermatozoide determinando tres patrones profundidad. de fluorescencia: fluorescente (F), espermatozoides in- tactos no capacitados que fluorescen en toda su super- Evaluación de la motilidad espermática. La eva- ficie; capacitado (B), espermatozoides intactos y capa- luación de la motilidad del eyaculado y del semen des- citados que perdieron la fluorescencia en la región post- congelado se realizó por microscopía óptica según la acrosomal; y reaccionados (RA), espermatozoides con rutina para inseminación artificial. En cada experien- acrosomas reaccionados que perdieron la fluorescencia cia se evaluó el porcentaje de espermatozoides móviles en las regiones acrosomal y post-acrosomal, expresán- a 37°C, después de 10 min del atemperado, utilizando dola sólo en la pieza intermedia y la cola. microscopia óptica en platina termostatizada. Análisis estadístico: los diferentes parámetros Evaluación de la vitalidad espermática. Se eje- evaluados en las muestras de espermatozoides como cutó a través de dos métodos diferentes: la técnica de el porcentaje de espermatozoides vivos, porcentaje de eosina/nigrosina 14 y la combinación del colorante su- espermatozoides con motilidad progresiva y porcenta- pravital azul tripán con el contraste interferencial di- je de espermatozoides criocapacitados, fueron expre- ferencial 5, 11 . Para determinar el porcentaje de esper- sados como porcentajes promedio ± error estándar de matozoides vivos por la técnica de eosina/nigrosina se la media (SEM). Los resultados de los diferentes ex- prepararon extendidos sobre portaobjetos, mezclando perimentos fueron analizados por el test t de student. una alícuota de semen o suspensión espermática con En todos los casos, un valor de p<0,05 fue considerado el mismo volumen de eosina (1% en citrato de sodio estadísticamente significativo. al 1,92%) y de nigrosina (10% en citrato de sodio al 1,92%) y se contaron 100 células por muestra. RESULTADOS Los espermatozoides muertos o moribundos pre- El análisis estadístico de los resultados de las ex- sentaron un color rosado de diferente intensidad, dado periencias realizadas demostró que el método de con- que la membrana plasmática de los espermatozoides es gelamiento propuesto permite obtener, al descongelado, impermeable a la eosina y sólo son coloreados los es- muestras de una mayor calidad que las obtenidas al permatozoides con serias alteraciones en la permeabili- descongelar muestras que hayan sido congeladas con dad de sus membranas. el método tradicional. Para determinar el porcentaje de espermatozoides Si bien la motilidad de los espermatozoides porci- vivos por la técnica combinada de azul tripán y micros- nos post-descongelado es muy baja (por eso uno de los copía óptica con contraste interferencial-diferencial objetivos de esta línea de investigación fue mejorar los (DIC), a cada alícuota de suspensión espermática se le métodos y los medios usados durante la criopreserva- agregó igual volumen de azul tripán (0,25% en medio ción en esta especie), las muestras del grupo tratamien- TBM-Turkey Baster Method) y se incubó durante 15 to evidenciaron una motilidad significativamente más min. Luego se centrifugó a 600G durante 5 min para alta que la del grupo control (Figura 1). remover el exceso de colorante y se fijó con 5% de for- maldehido en phosphate buffered saline (PBS) a pH 7,4. La criopreservación de las muestras con el méto- do propuesto, prácticamente duplicó la vitalidad de los Evaluación de la criocapacitación espermática. espermatozoides post descongelado. Tanto la vitalidad El porcentaje de espermatozoides criocapacitados se evaluada por la técnica supravital de eosina/nigrosina (Figura 2) como la vitalidad evaluada por azul tripán-

26 Pérez M.C. et al.: Criopreservación de semen porcino. Rev. Vet. 30: 1, 23-27, 2019 Figura 1. Efecto del método de congelamiento sobre Figura 3. Efecto del método de congelamiento sobre la motilidad de espermatozoides porcinos. la vitalidad de espermatozoides porcinos evaluada por C: grupo control; T: grupo tratamiento. Diferentes le- la técnica de azul tripán-DIC. tras indican diferencias estadísticamente significativas, C: grupo control; T: grupo tratamiento. Diferentes le- p<0,05 (n=6). tras indican diferencias estadísticamente significativas, p<0,05 (n= 6). Figura 2. Efecto del método de congelamiento sobre Figura 4. Efecto del método de congelamiento sobre la vitalidad de espermatozoides porcinos evaluada por la criocapacitación de espermatozoides porcinos. la técnica de eosina/nigrosina. C: grupo control; T: grupo tratamiento. Diferentes le- C: grupo control; T: grupo tratamiento. Diferentes le- tras indican diferencias estadísticamente significativas, tras indican diferencias estadísticamente significativas, p<0,05 (n= 6). p<0,05 (n = 6). DIC, fue significativamente mayor en las muestras con- Sin embargo, la aplicación de dichas innovaciones geladas con el método propuesto que en grupo control presenta dos problemas importantes: por un lado, si (Figura 3). bien, en nuestro país, los niveles de producción se han incrementado en un 160% en la última década 18 , el Otro parámetro fuertemente afectado por el méto- 96% de los productores tienen menos de 50 madres 19 do de congelamiento fue la criocapacitación. Las mues- y en su mayoría producen en sistemas con baja inver- tras criopreservadas con el método propuesto (grupo sión y poco tecnificados. Por otro lado, la producción tratamiento) evidenciaron una criocapacitación signifi- de semen criopreservado porcino, para lograr caracte- cativamente menor que las del grupo control (Figura 4). rísticas aceptables de calidad, requiere de la utilización de freezers programables para el congelamiento y otros DISCUSIÓN medios de envasado especiales 22 que no siempre se en- cuentran disponibles en nuestro medio. Las metas de producción para el sector porcino presentadas en el Plan Estratégico Agroalimentario y En nuestro trabajo, hemos probado dos métodos Agroindustrial 19 prevén un incremento en la produc- de congelamiento para espermatozoides porcinos, que tividad superior al 150%. Esta mejoría en el sistema requieren tecnología habitualmente disponible en cual- productivo, para ser eficiente, debe incorporar nuevas quier laboratorio de reproducción de baja complejidad. tecnologías y una adecuada y profesional gestión de Las muestras de semen porcino criopreservado presen- recursos productivos que incluyen a las tecnologías re- tan alteraciones estructurales y funcionales con baja productivas. movilidad y una vitalidad de alrededor del 50% 23 de- bido en parte a que las membranas del espermatozoide

Pérez M.C. et al.: Criopreservación de semen porcino. Rev. Vet. 30: 1, 23-27, 2019 27 porcino son muy sensibles al daño peroxidativo produ- 9. Khalifa T et al. 2014. Highlights on artificial insemina- cido por el congelamiento debido al elevado número de tion technology in the pigs. Mac Vet Rev 37: 5-34. ácidos grasos insaturados presentes en las mismas 2 . 10. Ministerio de Hacienda y Finanzas Públicas. Secretaría De acuerdo a nuestros resultados, con el conge- de Política Económica y Planificación del Desarrollo (Re- lamiento profundo utilizando hielo seco se obtienen pública Argentina). 2016. Informes de cadenas de valor muestras con un adecuado nivel de integridad de mem- Cárnica-Porcina. Año 1, N° 9, p. 36. brana plasmática y acrosomal y bajo nivel de criocapa- citación, pero con baja movilidad, posiblemente debido 11. O’Flaherty C, Beorlegui N, Beconi M. 1999. Reactive a la pérdida de enzimas vinculadas con las vías meta- oxygen species requirements for bovine sperm capacita- bólicas productoras de ATP. Por tal motivo, las mues- tion and acrosome reaction. Theriogenology 52: 289-301. tras criopreservadas obtenidas según el protocolo pro- puesto se podrían utilizar para ensayos de laboratorio 12. OCDE-FAO. 2013. Perspectivas agrícolas 2013-2022, (como protocolos de FIV o ICSI) o para fines producti- Texcoco, México. Universidad Autónoma Chapingo, http:// vos usando medios alternativos de IA como insemina- dx.doi.org/10.1787/agr_outlook-2013-es. ción post cervical o intrauterina profunda, ya que estas técnicas utilizan un bajo número de espermatozoides 22 . 13. Peña FJ, Johannisson A, Wallgren M, Rodriguez MH. 2003. Antioxidant supplementation in vitro improves boar En conclusión, nuestros resultados demuestran que sperm motility and mitochondrial membrane potential af- utilizando un método simple de congelamiento pueden ter cryopreservation of different fractions of the ejaculate. obtenerse, al descongelado, muestras de una mayor Anim Reprod Sci 78: 85-98. calidad que las obtenidas al descongelar muestras que hayan sido congeladas con el método tradicional sobre 14. Pintado B, Fuente J, Roldan ER. 2000. Permeability of vapores de nitrógeno. boar and bull spermatozoa to the nucleic acid stains prop- idium iodide or Hoechst 33258, or to eosin: accuracy on REFERENCIAS the assessment of cell viability. J Reprod Fertil 118: 145- 152. 1. Bonet S et al. 2009. Biotecnología de la reproducción por- cina: estado actual y futuro de las técnicas de análisis se- 15. Pordomingo A, Schang M, Brumori J. 2013. Plan Argen- minal. En: Biotecnología de la reproducción porcina, Ed. tina Innovadora 2020. Documento ref. http://www.argenti- Universidad de Girona, España, p. 18-23. nainnovadora2020.mincyt.gob.ar/?wpf b_ dl=52. 2. Cerolini S, Maldjian A, Surai P, Noble R. 2000. Viabil- 16. Romero C, Alba C, Martinez PC, Pascual MA. 2004. ity, susceptibility to peroxidation and fatty acid composi- Situação atual de novas tecnologías na reprodução de suí- tion of boar semen during liquid storage. Anim Reprod Sci nos. SuínCia 2: 28. 58: 99-111. 17. Saling PA, Storey BT. 1979. Mouse gamete interactions 3. Eriksson BM, Petersson H, Rodriguez MH. 2002. Field during fertilization in vitro: chlortetracycline as a fluores- fertility with exported boar semen frozen in the new flat- cent probe for the mouse sperm acrosome reaction. J Cell pack container. Theriogenology 58: 1065-1079. Biol 83: 544-555. 4. Fraser LR, Abeydeera LR, Niwa K. 1995. Ca(2+)-regu- 18. SENASA, MAGyP. 2014. Anuario 2014. www.produc- lating mechanisms that modulate bull sperm capacitation cion-animal.com.ar/produccion_ porcina /00 -produccion_ and acrosomal exocytosis as determined by chlortetracy- porcina_general/243-Anuario_2014.pdf cline analysis. Mol Reprod Dev 40: 233-241. 19. SENASA. 2016. Porcinos. Año 2016-2017. http://www. 5. Garde JJ, Ortiz N, García A, Gallego L. 1997. Use of senasa.gov.ar/cadena-animal/porcinos/informacion/infor- a triple-stain technique to detect viability and acrosome mes-y-estadisticas. reaction in deer spermatozoa. Arch Androl 39: 1-9. 20. Williams S. 2005. Inseminación artificial en porcinos. En: 6. Gerrits RJ et al. 2005. Perspectives for artificial insemi- Actualización de temas en Reproducción Animal (Bosch, nation and genomics to improve global swine populations. R.), 2da. Ed., Univ.Nac.Río Cuarto, p. 397-417. Theriogenology 63: 283-299. 21. Wu TW et al. 2013. The combinatorial effect of different 7. Iritani A. 1980. 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Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 28-31, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Poliartritis asociada a leishmaniasis en un canino del nordeste argentino Lockett, M.B.1; Llano, E.G.2; Maidana, H.R.3; Báez, A.D.3; Cabrera, W.R.2 1Hospital de Clínicas, 2Cátedra Anatomía II y 3Clínica de Pequeños Animales, Fac. Cs. Veterinarias, UNNE, Cabral 2139, Corrientes (3400), Argentina. E-mail: [email protected] Resumen Lockett, M.B.; Llano, E.G.; Maidana, H.R.; Báez, A.D.; Cabrera, W.R.: Poliartritis asociada a leishmaniasis en un canino del nordeste argentino. Rev. Vet. 30: 1, 28-31, 2019. En una de las etapas de la leishmaniasis se produce una reacción inmunomediada, con for- mación de complejos inmunes que se depositan -entre otros lugares- a nivel articular. El objetivo del presente trabajo fue reportar los hallazgos radiológicos observados en un canino hembra, mestizo, con diagnóstico positivo de leishmaniasis y signos de enfermedad articular, entre otros propios de la infección. Radiológicamente se observaron alteraciones erosivas en las articulaciones de ambos lados del carpo y del tarso. El nordeste argentino es considerado como un área de transmisión moderada a intensa de leishmaniasis, razón por la cual los in- frecuentes signos de presentación de patologías osteoarticulares deben ser tenidos en cuenta en esta enfermedad. La importancia de las manifestaciones radiológicas reside en el hecho de que reflejan la anatomía patológica macroscópica de la enfermedad y permiten identificar la etapa en la que se encuentra la lesión a nivel articular, posibilitando la realización un diag- nóstico diferencial con otras artropatías. Palabras clave: perro, articulación, análisis clínicos, leishmaniasis, radiología. Abstract Lockett, M.B.; Llano, E.G.; Maidana, H.R.; Báez, A.D.; Cabrera, W.R.: Polyarthritis associated to leishmaniasis in a canine of northeastern Argentina. Rev. Vet. 30: 1, 28-31, 2019. In one of the stages of leishmaniasis an immune-mediated reaction occurs, with for- mation of immune complexes that are deposited at the joint level, among other places. The objective of the present work was to report the radiological findings observed in a canine, female, mixed, with a positive diagnosis of leishmaniasis and signs of joint disease. Radio- logically, erosive alterations were observed in the joints of both sides of the carpus and tarsus. The northeastern region of Argentina is considered as a moderate to intense transmission area of leishmaniasis, the infrequent presentation signs of osteoarticular disease must be taken into account. The importance of these radiological manifestations relies in the fact that they reflect the macroscopic pathological anatomy of the disease and allows to identify the stage in which the lesion is located at the articular level, making it possible to carry out a differential diagnosis with other arthropathies. Key words: dog, joint, clinical analysis, leishmaniasis, radiology. INTRODUCCIÓN central, procesos ciliares del ojo y articulaciones, entre otros. Ello provoca una reacción de hipersensibilidad El elemento patogénico primario en la leishmania- tipo III que implica a las estructuras comprometidas, sis canina es la infección y multiplicación del parásito las que desarrollan alteraciones estructurales y funcio- en el sistema fagocítico mononuclear, donde se dise- nales 3, 5 . mina por vía hemática o linfática a todo el organismo. Existe una segunda instancia en el curso de la enferme- En los pequeños animales, la distribución poliar- dad en la cual se produce una reacción inmunomediada, ticular es una característica de las artropatías inflama- que ocasiona la formación de complejos inmunes. torias con base inmune. La mayoría de las restantes enfermedades articulares afectan una o pocas articu- Dichos complejos se depositan en lugares como ri- laciones 6 . ñones, pulmones, plexo coroides del sistema nervioso Solo el 30% de los animales afectados por leishma- Recibido: 15 mayo 2018 / Aceptado: 12 setiembre 2018 niasis desarrollan problemas locomotores. Claudica- ción, artralgia, edema, rigidez articular, paresia, atrofia

Lockett M.B. et al.: Poliartritis en leishmaniasis canina. Rev. Vet. 30 : 1, 28-31, 2019 29 muscular e intolerancia al ejercicio, son algunos de los Para la detección de anticuerpos contra Leishmania síntomas que se pueden manifestar cuando se compro- sp se utilizó un método serológico cualitativo indirec- meten las extremidades por esta enfermedad 3, 4 . to (test rápido inmuno-cromatográfico Kalazar Detect Canine-rK 39). La evaluación radiográfica se realizó en En las artropatías de caninos con leishmaniasis los las articulaciones de carpo y tarso. Se usaron chasis signos radiográficos varían a lo largo del tiempo. Ini- de un tamaño de 24x30 cm con pantalla de fósforo y cialmente puede existir efusión sinovial, distensión de una unidad radiológica portátil de alta frecuencia 100 la cápsula y aumento de los espacios articulares. Más TP.100 mA/110 Kvp. Para el procesamiento de las pelí- tarde, en los procesos erosivos, se produce la destruc- culas se utilizó un procesador digital. ción del cartílago y la reducción del tamaño de los espa- cios articulares. Reacciones periósticas, inflamación de RESULTADOS los tejidos blandos periarticulares y cambios de densi- dad ósea son característicos de los estadios avanzados. Los resultados de laboratorio no revelaron grandes Las articulaciones de las extremidades son afectadas anormalidades en los parámetros hematológicos y bio- en forma bilateral y simétrica 1 . químicos. El recuento de eritrocitos fue de 5.870.000/ mm3, el de leucocitos resultó de 16.700/mm3, la con- El objetivo de la presente comunicación fue repor- centración de hemoglobina arrojó 10,6 g/dl, el hemato- tar los hallazgos radiológicos observados en las articu- crito fue de 35%, proteinemia y uremia revelaron 7,3 g/ laciones de un canino con leishmaniasis en la región dl y 0,35 g/l respectivamente, y las actividades enzimá- del nordeste argentino. ticas de GPT, GOT y fosfatasa alcalina fueron de 16,3; 11,4 y 543 U/L. MATERIAL Y MÉTODOS La evaluación del líquido sinovial mostró un au- En el Hospital de Clínicas de la Facultad de Cien- mento de la celularidad. Las células detectadas fueron cias Veterinarias de Corrientes (Argentina), se presentó neutrófilos (60%), células mononucleares (16%) y lin- a la consulta un canino de raza indefinida, de un año focitos (8%). Tanto en macrófagos como en neutrófi- de edad, con escoriaciones en la punta de las orejas, los, se observaron amastigotes de Leishmania sp en el conjuntivitis, debilidad, caquexia, onicogrifosis, cojera citoplasma. (más manifiesta en miembros posteriores) y respuestas dolorosas al examen de las articulaciones de carpo y El canino dio reactivo ante el método indirecto y se tarso (Figura 1). confirmó el diagnóstico en el método directo, donde se detectó la presencia del amastigotes en la muestra de Se tomaron muestras de sangre de la vena cefálica medula ósea. antibraquial para determinar los valores del hemogra- ma y detectar eventuales modificaciones bioquímicas Radiológicamente se diagnosticó poliartritis erosi- de los parámetros séricos. También se investigó la va multifocal de predominio carpo-tarsal bilateral. En presencia de amastigotes en el líquido sinovial de las la articulación del carpo se observó erosión ósea peri- articulaciones comprometidas, así como en el extremo condral, pérdida de mineralización e irregularidad de distal de la médula ósea de la última costilla, para rea- los bordes articulares, así como aumento del volumen y lizar pruebas ante la sospecha de leishmaniasis. densidad del tejido blando de la zona, con reducción del tamaño de los huesos del carpo (Figura 3). En el tarso se visualizó pérdida de densidad del hueso subcondral, proliferación perióstica periarticular y disminución de la densidad de los componentes óseos de la articulación, los cuales revelaron un trabeculado grosero (Figura 4). Figura 1. Aspecto general del paciente. Nótese el mal Figura 2. Análisis parasitológico de líquido sinovial estado de nutrición, la atrofia muscular y la hinchazón con identificación de macrófagos conteniendo amasti- articular de las extremidades gotes de Leishmania sp. Obj. 100x.

30 Lockett M.B. et al.: Poliartritis en leishmaniasis canina. Rev. Vet. 30 : 1, 28-31, 2019 Figura 3. Radiografía de la articulación del carpo con Figura 4. Radiografia latero-lateral de las articulacio- incidencia anteroposterior. Se observa esclerosis sub- nes tarsales izquierda y derecha. Se evidencian zonas condral, trabeculado grosero, alteración de la forma y de osteólisis, colapso articular y reacción perióstica. tamaño de los huesos carpianos. El paciente fue tratado con analgésicos, allopurinol se puede presentar como una infección subclínica, una (10 mg/kg/24 h) y domperidona (0,5 mg/kg/24 h). Du- enfermedad autolimitada o una afección grave no au- rante los 6 meses siguientes se registró una mejoría del tolimitada. El parasitismo tiende a ser más intenso en estado general del animal, tras lo cual empezó a decaer los animales que manifiestan una presentación clínica y el propietario decidió sacrificar al animal. más severa. DISCUSIÓN Existen dudas con respecto a que la presentación inusual de estos signos osteoarticulares guarde rela- La presencia de un infiltrado inflamatorio articular ción con la intensidad de la infección (masiva o de baja compuesto por macrófagos parasitados por Leishmania intensidad) y con la duración del proceso. En el pre- sp, postula que esta invasión parasitaria fue el origen sente caso, si bien no se pudo determinar con certeza de la enfermedad articular. el tiempo de evolución de la enfermedad, se consideró que era avanzada dada la magnitud de las alteraciones La leishmaniasis puede provocar lesiones articula- constatadas 7, 10 . res en los caninos, que aparecen como manifestación de una reacción de hipersensibilidad tipo III, en la cual En un estudio realizado sobre 14 pacientes positi- las enzimas liberadas por las células inflamatorias, si- vos a Leishmania sp con artritis inflamatoria asociada, noviocitos y condrocitos, dañan al cartílago articular el 36% de los casos cursó con monoartritits y el 28% fomentando la aparición de anormalidades erosivas 2, 11 . con poliartritis, siendo el carpo la articulación más comprometida. Ello difiere con los hallazgos del pre- Una de las características de estas artropatías es sente caso, donde los tarsos fueron los más afectados. que las alteraciones radiológicas se aprecian simultá- neamente en las áreas articulares homólogas de ambas En una investigación similar, solamente la mitad partes del cuerpo. Así ocurrió en el presente caso, don- de los caninos estudiados presentó signos radiográficos de las articulaciones del carpo y tarso fueron afectadas evidentes, debido a que la manifestación radiológica de bilateralmente. la poliartritis ocurre en pacientes crónicos. Igualmente, el proceso de la enfermedad es variable en cada indi- Los hallazgos detectados en las imágenes radiográ- viduo, pudiendo evolucionar de forma diferente a pesar ficas fueron similares a los reportados por otros inves- de presentar la misma etiología, debido a factores gené- tigadores, incluyendo la presencia de reacción periósti- ticos, diferencias en el sistema inmunitario o respues- ca, destrucción del cartílago articular, compromiso del tas inapropiadas frente a diversos antígenos 8, 9 . hueso subcondral, inflamación de los tejidos blandos periarticulares y cambios de densidad de los compo- La importancia de estas manifestaciones radiológi- nentes óseos de las articulaciones comprometidas. cas reside en el hecho de reflejar la anatomía patológica macroscópica de la enfermedad y permitir identificar El nordeste argentino es considerado actualmente la etapa en la que se encuentra la lesión a nivel articular, como un área de transmisión moderada a intensa de posibilitando la realización de un diagnóstico diferen- leishmaniosis visceral canina. La variedad de síntomas cial con otras artropatías. y las diferentes manifestaciones que presenta esta en- fermedad tornan dificultoso el diagnóstico clínico, pu- La presencia de una dificultad en la locomoción en diendo confundirse con otras patologías. En los perros un paciente positivo a Leishmania sp tendría que in- ducir la sospecha de una enfermedad inflamatoria de

Lockett M.B. et al.: Poliartritis en leishmaniasis canina. Rev. Vet. 30 : 1, 28-31, 2019 31 la articulación. La cojera puede no estar presente en 4. Graeme A, Nicoll R. 2006. Distal limbs carpus and tarsus. todos los casos de pacientes con artritis asociada con In: BSAVA Manual of canine and feline musculoskeletal leishmaniasis, por lo cual estaría indicado realizar un imaging (Barr FJ, Kirberger RM), 1st ed., Wiley, London, examen ortopédico cuidadoso y un análisis de líquido p. 150-167. sinovial. 5. Lappin MR. 2005. Protozoal and miscellaneous. In: Text- Futuros trabajos con un mayor número de pacientes book of veterinary internal medicine (Ettinger SJ, Feld- deberán realizarse para determinar el valor estadístico man EC), 6th ed., Elsevier, Missouri, USA, p. 644-645. de los hallazgos en la zona y definir si ellos pueden mo- dificar la conducta clínica y terapéutica en los animales 6. Nelson RW, Couto CG. 2010. Medicina interna de peque- afectados. ños animales, 4º ed., Elsevier, Barcelona, p.1127-1140. Agradecimientos. Por su colaboración y aporte en 7. Santos RL, Costa EA, Pangrazio KK. 2010. Genital le- el manejo del paciente, al alumno Eduardo Ariel Mou- sions and venereal transmission of canine visceral leish- chard. maniasis. In: Veterinary Parasitology (LaMann GV), Nova Science Publishers, New York, p. 193-200. REFERENCIAS 8. Sbrana S, Marchetti V, Mancianti F, Guidi G, Bennetti 1. Barreiro A, Villa M. 2014. Interpretación radiológica del D. 2014. Retrospective study of 14 cases of canine arthritis sistema óseo. En: Diagnóstico por imagen en pequeños secondary to leishmania infection. J Small Anim Pract 55: animales (Agut Jiménez A. Ed.), Multimédica Ediciones 309-313. Veterinarias, Barcelona, p. 109-161. 9. Soares AR. 2009. Avaliação radiográfica das articulações 2. Cooper BJ, Valentine BA. 2016. Muscle and tendon. In: dos membros locomotores de cães naturalmente acometi- Pathology of domestic animals (Palmer, Jubb & Kennedy), dos por leishmaniose visceral no município de Araçatuba- 6th ed., Elsevier, USA, vol. 1, p. 240. -SP. Dissertação (mestrado), Universidade Estadual Pau- lista, São Paulo, p. 25-38. 3. Dennis R, Kirberger RM, Wrigley RH, Barr FJ. 2010. Handbook of small animal radiology and ultrasound, 2nd 10. Solano GL et al. 2009. Directions for the diagnosis, clini- ed. (eBook ISBN 9780702043970), Saunders-Elsevier, Ed- cal staging, treatment and prevention of canine leishmani- inburgh, p. 39-42. osis. Vet Parasitol 165: 1-18. 11. Turrel JM, Pool R. 1982. Bone lesions in four dogs with visceral leishmaniasis. Vet Radiol 23: 243-249. Revista Veterinaria obtuvo el máximo nivel de categorización del CAICYT–CONICET Tras el pertinente proceso de evaluación según criterios de calidad editorial, en setiembre de 2005 CAICYT–CONICET ha clasificado a nuestra publicación con Categoría 1 (nivel superior de excelen- cia), con lo cual pasa a integrar el Catálogo Latindex (folio 14022). La Dirección de Revista veterina- ria agradece a quienes colaboraron para obtener tan importante distinción. Ver: http://www.latindex. unam.mx/busquedas/catalogotitulo.html

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 32-38, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Una leche bubalina rica en ácidos grasos trans incrementó la colesterolemia y tendió a agravar la ateroesclerosis en conejos Lertora, W.J.1; Villordo, G.I.1; Mussart, N.B.2; Catuogno, M.S.1; S.Negrette, M.1 1Cátedra de Patología General y Sistemática, 2Hospital de Clínicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Nordeste, Sargento Cabral 2139, Corrientes (3400), Argentina. E-mail: [email protected] Resumen Lertora, W.J.; Villordo, G.I.; Mussart, N.B.; Catuogno, M.S.; S.Negrette, M.: Una le- che bubalina rica en ácidos grasos trans incrementó la colesterolemia y tendió a agravar la ateroesclerosis en conejos. Rev. Vet. 30: 1, 32-38, 2019. Búfalas suplementadas con una mezcla de aceites de girasol + pescado pueden reducir en la leche los niveles de ácidos grasos saturados (AGS), considerados hipercolesterolémicos y pro-aterogénicos, e incrementar los ácidos grasos trans-11 18:1 y cis-9,trans-11 18:2, con propiedades anti-aterogénicas. Este tra- bajo comparó los efectos del consumo de dos leches bubalinas, con baja y alta relación de áci- dos grasos trans (AGt)/AGS, sobre el lipidograma y el desarrollo de ateroesclerosis induci- dos por colesterol en conejos. Veinte conejos neozelandeses, machos, fueron aleatoriamente separados en un grupo control (n=10) que recibió leche con baja relación AGt/AGS (5,3% de AGt y 67,12% de AGS) obtenida de búfalas en sistema pastoril; y un grupo alto trans (n=10) que recibió leche con alta relación AGt/AGS (25,84% de AGt y 45,89% de AGS) obtenida de búfalas con suplementación lipídica en su dieta. La experiencia duró 75 días y, a partir del día 15, todos los conejos fueron desafiados con 0,93 g de colesterol/día, vía oral, a fin de inducir lesiones ateroescleróticas. Los conejos consumieron de manera voluntaria 9293,13 ml y 9930 ml de leche con baja y alta relación AGt/AGS, respectivamente (p 0,404). Los conejos que consumieron leche con alta relación AGt/AGS registraron un leve incremento significativo (p 0,049) del colesterol total (6,08 g/l), cuando se comparó con el grupo control (5,58 g/l). No se detectaron diferencias entre grupos en el colesterol LDL (p 0,073), colesterol HDL (p 0,078) y triglicéridos (p 0,174). Las lesiones ateroescleróticas fueron más extensas en los conejos que consumieron leche con alta relación AGt/AGS, aunque sin significación estadística (p>0,05) cuando se comparó el control. En conclusión, la leche bubalina obtenida con la suplementación lipídica referida en este estudio, incrementó la colesterolemia y tendió a agravar la ateroesclerosis en conejos. Dichos efectos, posiblemente estén relacionados con el alto contenido de AGt de esta leche. Palabras claves: búfalas, ácidos grasos trans, colesterol, ateroesclerosis. Abstract Lertora, W.J.; Villordo, G.I.; Mussart, N.B.; Catuogno, M.S.; S. Negrette, M.: Buba- line milk with a high content of trans fatty acids increased cholesterolemia and tended to aggravate atherosclerosis in rabbits. Rev. Vet. 30: 1, 32-38, 2019. Buffalo heifers supple- mented with a mixture of sunflower oil + fish can produce milk with low level saturated fatty acids (SFA, which are considered hypercholesterolemic and pro-atherogenic), and increase the synthesis of trans-11 18: 1 and cis-9, trans-11 18: 2 fatty acids (with anti-atherogenic properties). This work compared the effects of the administration to rabbits of two bubaline milk, with low and high trans/saturated fatty acids (tFA/SFA) ratio, on the development of atherosclerosis induced by cholesterol. Twenty New Zealand rabbits, males, were randomly separated into a control group (n=10) that received milk with low tFA/SFA ratio (5.3% tFA and 67.12% SFA) obtained from grazing buffalos; and a high trans group (n = 10) that re- ceived milk with high tFA/SFA ratio (25.84% tFA and 45.89% SFA) obtained from buffalos with lipid supplementation in their diet. The experience lasted 75 days and, from day 15, all rabbits were challenged with 0.93 g of cholesterol/day orally, to induce atherosclerotic le- sions. The rabbits voluntarily consumed 9293.13 ml and 9930 ml of milk with low and high tFA/SFA ratio, respectively (p 0.404). Rabbits that consumed milk with a high tFA/SFA ratio increased (p 0.049) serum levels of total cholesterol (6.08 g/l), compared to the control group Recibido: 30 julio 2018 / Aceptado: 23 noviembre 2018

Lértora W.J. et al.: Aterosclerosis en conejos. Rev. Vet. 30: 1, 32-38, 2019 33 (5.58 g/l). No differences were detected between groups in LDL cholesterol (p 0.073), HDL cholesterol (p 0.078) and triglycerides (p 0.174). Atherosclerotic lesions were more exten- sive in rabbits that consumed milk with a high tFA/SFA ratio, although without statistical significance (p> 0.05) compared to rabbits that consumed milk with low tFA/SFA ratio. In conclusion, bubaline milk obtained from animals with lipid supplementation contributed to increase cholesterolemia and tended to worsen atherosclerosis in rabbits. These effects may be related to the high content of tFA of this milk. Key words: buffalos, trans fatty acids, cholesterol, atherosclerosis. INTRODUCCIÓN lémico presenta un patrón lipoproteico similar al del ser humano hipercolesterolémico, con predominio de El relativamente alto contenido de ácidos grasos lipoproteínas de baja densidad (LDL) y una abundan- saturados (AGS) de la leche ha sido el principal moti- te actividad plasmática de la enzima de transferencia vo de crítica de los especialistas en nutrición hacia los de esteres de colesterol, condición que naturalmente lo productos lácteos, asumiendo que los alimentos ricos predispone a la ateroesclerosis 19 . en grasas saturadas elevan la colesterolemia y contri- Al igual que en otras investigaciones, el conejo fue buyen a la ateroesclerosis 6 . Este aspecto resulta im- empleado para estudiar los efectos de la grasa láctea portante ya que según el poder adquisitivo y los hábitos sobre la colesterolemia, perfil de lipoproteínas y lesio- alimenticios de la población, los lácteos pueden aportar nes sudanofílicas en aorta 2, 13 . hasta el 60% del total de grasas saturadas que un ser humano consume diariamente 4 . MATERIAL Y MÉTODOS Consecuentemente, se han desarrollado estrategias nutricionales en el ganado lechero para reducir los ni- Leche bubalina (Tabla 1): Dos leches experimen- veles de AGS de cadena media, con efectos hiperco- tales con diferente perfil de ácidos grasos fueron ob- lesterolémico y aterogénico, e incrementar la concen- tenidas de búfalas con y sin suplementación lipídica. tración de ácidos grasos insaturados (AGI) con efectos La leche control (sin suplementación lipídica) presentó antimutagénico, hipocolesterolémico y ateroprotector baja relación AGt/AGS (5,3 y 67,12%, respectivamente) en la leche 14 . y fue obtenida de búfalas alimentadas con pastura na- Disminuir los niveles de AGS e incrementar los tural y 2 kg de maíz/día. La leche con alta relación AGt/ AGI (particularmente cis-9 18:1; cis-9, trans-11 18:2; AGS (25,84 y 45,89%, respectivamente) fue obtenida trans-11 18:1 y cis-9,cis-12,cis-15 18:3) en la leche y sus de búfalas alimentadas con pastura natural y suplemen- productos, ha mostrado tener efecto hipolipidémico tadas diariamente con una mezcla de 210 ml de aceite en las personas 11, 15 . Sin embargo, otros trabajos no de girasol + 90 ml de aceite de pescado vehiculizado en reportaron efectos sobre la lipemia en personas 3, 16, 18 ; 2 kg de maíz durante 24 días. El contenido de colesterol mientras que otros hallaron un efecto perjudicial en (Laboratorio Físico-Químico, INTI, Buenos Aires) no el lipidograma sérico de conejos 13 y seres humanos 8 , difirió (prueba t bilateral para muestras independientes atribuidos a un sustancial incremento de AGt en la le- = p 0,727) entre la leche control (10,30 ± 2,27 mg/100 g) che. Estas discrepancias se deben a diferencias en la y la leche alta relación AGt/AGS (9,68 ± 2,55 mg/100 g). metodología, características fisiopatológicas de los Animales, administración de leche y diseño ex- individuos y, principalmente, a las diferentes dosis y perimental: Veinte conejos machos Neozelandeses composición de las grasas lácteas experimentales. (suministrados por el Centro de Medicina Comparada, Estas modificaciones en el perfil de ácidos grasos FCV-UNL, Esperanza, Santa Fe), con un peso corporal de la leche fueron exploradas en búfalas mediante la de 2,02 ± 0,25 kg, fueron divididos aleatoriamente en suplementación de su dieta con aceite de girasol + pes- dos grupos de 10 animales, alojados en jaulas metálicas cado. Se consideró que dicha suplementacion mejoró la individuales, en una habitación con temperatura con- calidad nutricional de la grasa láctea bubalina; es decir, trolada (22ºC), con ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y sería más apta para el consumo humano, ya que redujo con acceso al agua de bebida y al alimento balanceado los niveles de AGS e incrementaron los AGI, particu- ad libitum. Los conejos recibieron leche control (gru- larmente de trans-11 18:1 y cis-9, trans-11 18:2, en la po control) y leche alta relación AGt/AGS (grupo alto leche bubalina 9 . trans) durante 75 días. La leche fue administrada en Teniendo en cuenta los antecedentes, este trabajo forma fluida y su consumo fue voluntario; restringien- evaluó el efecto de dos leches bubalinas experimenta- do su consumo diario a un máximo de 200 ml/conejo les, con alta y baja relación AGt/AGS, en el desarrollo hasta el día 45 y a un máximo de 100 ml/conejo hasta el de ateroesclerosis en conejos hipercolesterolémicos. final de la experiencia. Durante los primeros 15 días de Nuestra elección del modelo biológico experimen- la experiencia se determinaron los efectos del consumo tal se fundamentó en que el conejo hipercolestero- de las leches bubalinas sobre el lipidograma sérico en

34 Lértora W.J. et al.: Aterosclerosis en conejos. Rev. Vet. 30: 1, 32-38, 2019 conejos saludables (sin administración de colesterol). Tabla 1. Composición de ácidos grasos en leche de Durante los 60 días posteriores, se indujo hipercoles- búfalas sin suplementación lipídica (leche control) y terolemia mediante la administración de colesterol vía suplementadas con 300 ml/día de una mezcla (70:30 oral (0,93 g de colesterol 94%/conejo/día) y se deter- wt/wt) de aceite de girasol y de pescado durante 24 minaron los efectos del consumo de las leches sobre el días (leche alta relación AGt/AGS). lipidograma sérico y el desarrollo de ateroesclerosis en ácidos grasos leche control leche alta relación aorta en conejos con hipercolesterolemia. Se registró (g/100 g de grasa) AGt/AGS diariamente el consumo de leche y de alimento balan- 3,86 ± 0,38 ceado por animal. El peso corporal se verificó semanal- 4:0 1±0 1,86 ± 0,90* mente. Todos los procedimientos de este estudio fue- 6:0 0,46 ± 0,11* ron aprobados por el Comité de Ética y Bioseguridad, 8:0 0,51 ± 0,09 0,14 ± 0,05* FCV-UNNE, protocolo Nº 017. 10:0 0,99 ± 0,04 0,33 ± 0,05* 10:1 0,03 ±0,01 Extracción de sangre y lipidograma sérico: La ex- 11:0 0,01 ± 0* tracción de sangre se realizó los días 0, 15, 45 y 75 en 12:0 0,01 ± 0 0,01 ± 0 todos los conejos, con ayuno de 8 horas. Se determi- 12:1 1,29 ± 0,49 naron triglicéridos (técnica del glicerolfosfato-oxidasa/ 14:0 0,09 ± 0,02 1±0 peroxidasa, 505 nm), colesterol total (colesterol-oxida- 14:1 8,14 ± 1,07 0,10 ± 0 sa-peroxidasa, 505 nm), colesterol ligado a lipoproteí- 15:0 iso 0,73 ± 0,14 4 ± 0,82* nas de alta densidad (C-HDL) y de baja densidad (C- 15:0 0,30 ± 0,08 0,54 ± 0,05* LDL): por precipitación selectiva de la lipoproteína y 15:1 1,43 ±0,53 0,09 ± 0,02* valoración enzimática de colesterol (reactivos Wiener). 16:0 0,36 ± 0,08 16:1 27,57 ± 2,70 1±0 Necropsia y toma de muestras: Cumplido los 75 17:0 0,21 ± 0,04* días de la experiencia, se procedió a la eutanasia y ne- 17:1 1±0 20,57 ± 0,53* cropsia de los animales. Se disecó la aorta completa, 18:0 1,14 ± 0,38 que fue fijada en formol bufferado al 10% durante 24 trans-8 18:1 0,27 ± 0,08 1±0 horas. trans-9 18:1 21 ± 2,45 1±0 trans-10 18:1 0,49 ± 0,07 0,17 ± 0,05* Cuantificación de lesiones ateroescleróticas en trans-11 18:1 0,26 ± 0,05 15 ± 2,77* aorta: Luego de la fijación, las aortas completas fue- cis-9 18:1 0,26 ± 0,08 1,71 ± 0,49* ron coloreadas con Sudan IV para evidenciar depósitos cis-11 18:1 4,29 ± 1,25 1 ± 0* lipídicos en el estrato intimal. La superficie endotelial trans-9,trans-12 18:2 21,29 ± 1,50 0,96 ± 0,08* fue fotografiada y las imágenes digitales procesadas cis-9,cis-12 18:2 0,67 ± 0,05 22,14 ± 3,44* con el software ImageJ versión 1.47n (U.S. National cis-9,trans-11 18:2 19,14 ± 2,73 Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) para cis-9,cis-12,cis-15 18:3 0,01 ± 0 1,86 ± 0,38* medir el área endotelial total y el área sudanofílica. Las 20:4 (ARA) 0,97 ± 0,05 0,03 ± 0,01* lesiones ateroescleróticas en cada aorta fueron expresa- 20:5 (EPA) 1±0 das en porcentaje de área sudanofílica que ocupaba la 22:6 (DHA) 1±0 3,57 ± 0,79* superficie endotelial total. 0,54 ± 0,14 0,27 ± 0,05* Ʃ AGS 0,09 ± 0,01 0,05 ± 0,02* Histomorfometría de aorta: Un segmento de aor- Ʃ 12+14+16 0,06 ± 0,01 0,05 ± 0,01 ta ascendente (5 mm antes del tronco braquiocefálico) Ʃ cis AGM 0,01 ± 0 fue procesado según la técnica histológica clásica para Ʃ cis AGP 0,01 ± 0 45,89 ± 2,37* bloques parafinados. Se realizaron cortes seriados a Ʃ trans# 67,12 ± 2,07 25,57 ± 0,98* 5 μm que fueron coloreados con hematoxilina y eosi- 23,03 ± 2,43 na (HE) y procesados con una técnica inmunohisto- 37 ± 3,87 1,39 ± 0,07* química (IHQ) para la detección de macrófagos (clon 24,44 ± 1,65 25,84 ± 3,76* 1,67 ± 0,17 5,30 + 1,26 RAM11, dilución 1:50; Dako) y de músculo liso (clon *p valor ≤ 0,05 (prueba t bilateral para muestras indepen- HHF35, dilución 1:100; Dako) como previamente fue dientes). ARA: ácido araquidonico. EPA: ácido eicosapenta- descripto 20 . En las secciones teñidas con HE se midió enoico. DHA: ácido docosahexaenoico. AGS: ácidos grasos en micrómetros, con objetivo de 10x, el espesor intimal saturados. AGM: ácidos grasos monoinsaturados. AGP: (desde la superficie luminal hasta la membrana elástica ácidos grasos poliinsaturados. # La suma no incluye a cis- interna) en el sitio de máximo espesor. Las lesiones en -9,trans-11 18:2. aorta fueron clasificadas en estría grasa (íntima infil- trada con macrófagos espumosos), placa en transición medir el área de lesión intimal en mm2 y el porcentaje (íntima infiltrada con macrófagos espumosos, músculo de macrófagos y músculo liso de dichas áreas. liso y depósito de matriz extracelular) y ateroma (ínti- Análisis estadístico: Los resultados fueron expre- ma con capa fibrosa de músculo liso y matriz extracelu- sados en media ± desvío estándar (±DE). La compa- lar cubriendo un centro de macrófagos espumosos con ración de las medias de la ganancia de peso, consumo focos de necrosis y cristales de colesterol extracelular). de alimento, consumo de leche, área sudanofílica, es- Las secciones inmunoteñidas fueron fotografiadas y pesor intimal, composición de macrófagos y músculo las imágenes fueron procesadas (software ImageJ) para liso de las lesiones, fueron obtenidos con la prueba T

Lértora W.J. et al.: Aterosclerosis en conejos. Rev. Vet. 30: 1, 32-38, 2019 35 Tabla 2. Consumo de leche, alimento balanceado y peso corporal, se- leche con alta relación AGt/AGS, sin gún grupos. diferencias entre grupos (p 0,404). consumo de leche (ml) grupo control grupo alto trans Tampoco se observaron diferencias en- consumo diario de alimento (g) tre los grupos en el consumo de leche peso corporal inicial (kg) 9293,13 ± 1770,74a 9930,00 ± 1557,88a entre los días 1 y 14 (p 0,385), días 15 peso corporal final (kg) 77,19 ± 26,74a 69,25 ± 34,80a y 44 (p 0,181) y días 45 y 75 (p 0,909) ganancia de peso (kg) 2,05 ± 0,23a 2,00 ± 0,27a de la experiencia (datos no mostrados 3,13 ± 0,32a 3,10 ± 0,40a en Tabla 2). El registro del consumo 1,08 ± 0,27a 1,10 ± 0,32a de alimento balanceado no detectó aEn cada columna, medias con una letra común no son significativamente di- diferencias entre los grupos (p 0,486). ferentes (prueba t para muestras independientes, p>0,05). Los conejos de ambos grupos ganaron peso a lo largo de la experiencia, sin Tabla 3. Evolución del lipidograma sérico según grupo. diferencias en peso corporal inicial (p tasa sérica (g/l) tasa basal día 15 día 45 día 75 0,683), peso corporal final (p 0,860) y ganancia de peso (p 0,892). C-total 0,71 ± 0,21 1,01 ± 0,18a 8,44 ± 0,77b c 7,28 ± 1,65d control 0,70 ± 0,21 1,00 ± 0,14a 9,01 ± 0,55b 8,22 ± 0,08c d Lipidograma sérico: Los conejos alto trans que consumieron leche con alta re- lación AGt/AGS registraron un leve C-HDL incremento significativo (p 0,049) del control 0,41 ± 0,08 0,56 ± 0,10a 2,97 ± 0,82b c 2,17 ± 1,04d colesterol total (6,08 g/l), cuando se alto trans 0,36 ± 0,09 0,49 ± 0,12a 3,45 ± 0,11b 2,44 ± 0,66c d comparó con el grupo control (5,58 g/l). C-LDL 0,19 ± 0,11 0,23 ± 0,07a 5,86 ± 1,00b c 4,83 ± 1,59d El colesterol LDL fue más elevado en control 0,14 ± 0,09 0,25 ± 0,11a 6,32 ± 0,27b 5,75 ± 0,10c d el grupo que recibió leche con alta re- alto trans lación AGt/AGS (4,10 g/l) que el grupo 0,48 ± 0,13 0,49 ± 0,16a 0,91 ± 0,55a b 2,47 ± 2,57 b c control (3,64 g/l), pero el incremento triglicéridos 0,57 ± 0,21 0,42 ± 0,14a 2,37 ± 2,13b c 3,12 ± 2,43c no fue significativo (p 0,073). No se control detectaron diferencias en los registros alto trans del colesterol HDL entre los grupos :a,b,c,d Medias con una letra común no son significativamente diferentes (análi- alto trans (2,13 g/l) y control (1,9 g/l) sis de modelos lineales mixtos, p>0,05). (p 0,078). Tampoco se detectaron dife- rencias (p 0,174) en la trigliceridemia para muestras independientes. Se realizó un análisis de los grupos alto trans (1,97 g/l) y control (1,29 g/l). de modelos lineales mixtos para comparar las medias Cuando se evaluó la colesterolemia en el tiempo (Tabla y estudiar el efecto del tiempo de las variables del li- 3), las tasas séricas basales de colesterol total, coleste- pidograma sérico (colesterol total, C-HDL, C-LDL y rol HDL y colesterol LDL se incrementaron en ambos triglicéridos). El modelo con una correlación residual grupos, sin diferencias significativas. Entre los días 45 sin estructura, varianzas residuales heterogéneas en el y 75 se registró un leve descenso de la colesterolemia tiempo y sin efecto aleatorio, fue el seleccionado para en ambos grupos, datos previstos por la restricción en describir los datos del lipidograma sérico. Las diferen- el consumo de leche durante este período. cias entre los grupos fueron declaradas significativas Ateroesclerosis en aorta (Tabla 4): todos los cone- con p≤0,05. jos en ambos grupos desarrollaron lesiones sudanofí- licas en aorta (Figura 1). Los conejos que recibieron RESULTADOS leche con alta relación AGt/AGS desarrollaron mayor extensión del área sudanofílica, del espesor intimal y Consumo de leche, de alimento balanceado y peso del área de lesión intimal en aorta; sin embargo, las corporal (Tabla 2): todos los conejos aceptaron de for- diferencias no fueron significativos (p 0,5776, p 0,2014 ma voluntaria ambos tipos de leche. A lo largo de la y p 0,283, respectivamente). En la evaluación microscó- experiencia, cada conejo consumió 9293,13 ± 1770,74 pica, todos los conejos de ambos grupos desarrollaron ml de leche bubalina control y 9930 ± 1557,88 ml de lesiones ateroescleróticas del tipo placas en transición Tabla 4. Efectos de leches bubalinas con baja (control) y alta relación AGt/AGS (grupo alto trans) en el desarro- llo de ateroesclerosis en aorta de conejos hipercolesterolémicos. grupo área sudano-fílica espesor intimal área de lesión área de macrófagos área de músculo liso (%) (µm) intimal (mm 2) (%) (%) control alto trans 21,48±16,54a 261,51±162,84a 0,757±0,40a 21,90±13,40a 45,65±12,90a 26,38±17,88a 305,82±176,19a 1,343±0,96a 21,67±11,98a 45,92±16,79a a: En cada columna, medias con una letra común no son significativamente diferentes (prueba t para muestras independien- tes, p>0,05).

36 Lértora W.J. et al.: Aterosclerosis en conejos. Rev. Vet. 30: 1, 32-38, 2019 alto AGt control Figura 1. Lesiones sudanofílicas en aortas de conejos hipercolesterolémicos que consumieron leche bubalina con baja (control) y alta relación AGt/AGS (alto AGt). en la aorta ascendente (Figura 2). En dichas lesiones, el AGt/100g de lípidos, en ambos tipos de dietas) tuvieron porcentaje del área ocupada por macrófagos y células similar efecto sobre la lipemia (incrementos del coles- musculares lisas no difirió entre los grupos (p 0,945 y terol total, C-LDL, C-HDL y triglicéridos), a pesar de p 0,840, respectivamente). su distribución isomérica diferente (trans-11 18:1 com- prendió el 76,5% del total de isómeros trans 18:1 en la DISCUSIÓN grasa rumiante; mientras trans-6-8, trans-9 y trans-10 18:1 fueron los más abundantes en la grasa vegetal hi- La reducción de los AGS y el incremento de los AGI drogenada) 12 . en la leche lograron mejorar el lipidograma sérico de personas 7, 10 y ratas 1 . Así, personas normolipidémicas El grupo que consumió leche con alta relación AGt/ que consumieron grasa láctea reducida en AGS (63,3%), AGS registró mayor extensión de lesiones ateroescleró- con un incremento moderado de AGt (4%), cis-AGMI ticas en aorta y, aunque estas variables no alcanzaron el (25,6%), cis-AGPI (2,87%) y cis-9,trans-11 18:2 (0,67%) nivel de significación estadística, están en concordan- durante 21 días, redujeron su colesterol total y coles- cia con el incremento del colesterol total registrado en terol-LDL, comparadas con el grupo de personas nor- este grupo de conejos. La falta de efecto ateroprotector molipidémicas que consumieron grasa láctea comercial de la leche con alta relación AGt/AGS de la presente (72% de AGS, 2,9% de AGt, 19,5% de cis-AGMI, 2,21 experiencia, concuerda con los efectos perjudiciales % de cis-AGPI y 0,42% de cis-9,trans-11 18:2) 7 . de la grasa láctea con altos niveles de AGt (11,8% de trans-10 C18:1 y 1,8% de trans-11 18:1) y reducida en Similar respuesta del lipidograma sérico fue regis- AGS (41,9%) reportado previamente en conejos 2, 13 . trada en personas con moderada hipercolesterolemia al suplementar su dieta durante 21 días con 90 g/día A diferencia de nuestros resultados, otros han de- de queso de oveja naturalmente enriquecido con cis- mostrado que la grasa láctea con bajos niveles de AGS 9,cis-12,cis-15 18:3 (2,1%), cis-9,trans-11 18:2 (2,8%) y y altas concentraciones de AGI son menos aterogénicas. trans-11 18:1 (6,3%) y bajo contenido de AGS (46%), Hámsteres hiperlipidémicos alimentados con grasa cuando se comparó con un queso control (cis-9,cis- láctea reducida en AGS (66,77%) y enriquecidas con 12,cis-15 18:3: 0,6%, cis-9,trans-11 18:2: 1%, trans-11 trans-11 18:1 (4,85%), cis-9,trans-11 18:2 (2,38%) y cis- 18:1: 1,7% y AGS: 59%) 10 . 9,cis-12,cis-15 18:3 (1,22%) (leche bovina de sistema pastoril) presentaron 25% menos depósito de coleste- Por el contrario, nuestros resultados demostraron rol en aorta con relación a los hámsteres alimentados que una leche reducida en AGS (45,8%) y con un sus- con grasa láctea comercial (de bovinos alimentados tancial incremento de AGt (25,8%) indujo un leve pero con henificados y ensilados), con mayor concentración significativo incremento del colesterol total plasmático de AGS (72,05%) y bajos niveles de AGI (0,97% de en conejos, al compararla con el grupo de conejos que trans-11 18:1 0,37% de cis-9,trans-11 18:2 y 0,3% de recibió leche control (67% de AGS y 5,3% de AGt). cis-9,cis-12,cis-15 18:3). Nuestros resultados concuerdan con los reportados Dicho efecto ateroprotector fue atribuido al mejor en seres humanos y cobayos que recibieron lácteos con perfil de lipoproteínas séricas (bajo niveles de C-LDL, alta relación AGt/AGS. En humanos, los AGt de origen altos niveles de C-HDL y baja relación C-LDL / C- rumiante, cuyo principal isómero es trans-11 18:1, tu- HDL) y a la menor reacción inflamatoria de la aorta vieron un efecto neutro en los lípidos plasmáticos cuan- (menor expresión de VCAM-1, IL-1 y COX-2 en aorta) do la ingesta fue baja (0,8% de calorías/día aportado inducidos por la mayor concentración de AGI 17 . por AGt) o moderada (1,5% de la ingesta calórica diaria aportada por AGt); mientras que causó hipercolestero- Nuestros resultados tienden a sostener el concepto lemia e incrementó las subfracciones aterogénicas de que un sustancial incremento de AGt en la leche pue- las lipoproteínas cuando su ingesta fue alta (3,3% o de inducir incrementos en la colesterolemia y contra- 3,7% de la ingesta calórica diaria aportada por AGt) 5, 8 . rrestar el efecto ateroprotector que se procura con la reducción de los AGS e incremento del cis-9,trans-11 En cobayos hipercolesterolémicos, dos dietas con 18:2. No obstante, no puede descartarse que la ligera altas dosis de AGt industriales y AGt rumiante (~15 g reducción de cis-9,cis-12,cis-15 18:3 también pudo con-

Lértora W.J. et al.: Aterosclerosis en conejos. Rev. Vet. 30: 1, 32-38, 2019 37 tribuir a la ausencia de efecto ateroprotector de la leche có la colesterolemia y tendió a incrementar las lesiones bubalina con alta relación AGt/AGS. ateroescleróticas en conejos. Dichos efectos estuvieron posiblemente relacionados con el alto contenido de AGt En conclusión, la leche bubalina obtenida con la su- de la leche de búfalas. plementación lipídica referida en este estudio, perjudi- ab cd ef Figura 2. Efectos del consumo de leches bubalinas con baja relación AGt/AGS (a, c y e) y con alta relación AGt/AGS (b, d y f) en el desarrollo de ateroesclerosis en conejos hipercolesterolémicos. a: Aorta ascendente de conejo control con engrosamiento del estrato intimal debido a infiltración de macrófagos espumosos y células musculares lisas (placa en transición). b: El consumo de leche con alta relación AGt/AGS no modificó el tipo de lesión ateroesclerótica, clasificada como placa en transición (H-E, obj. 10x). c: Inmunomarcación de macrófagos en lesión intimal de aorta ascendente de conejo control. d: La leche con alta relación AGt/AGS no modificó la infiltración intimal de macrófagos (anticuerpo RAM11, obj. 5x). e: Inmunomarcación de células musculares lisas en lesión intimal de aorta ascendente de conejo control. f: La leche con alta relación AGt/AGS no modificó la infiltración intimal de células musculares lisas (anticuerpo HHF35, obj. 5x).

38 Lértora W.J. et al.: Aterosclerosis en conejos. Rev. Vet. 30: 1, 32-38, 2019 REFERENCIAS 12. Rice BH, Kraft J, Destaillats F, Bauman DE, Lock AL. 2010. Ruminant-produced trans-fatty acids raise plasma 1. Anadón A et al. 2010. Acute oral safety of dairy fat rich total and small HDL particles concentrations in male in trans-10 C18:1 versus vaccenic plus conjugated linoleic Hartley guinea pigs. J Nutr 140: 2173-2179. acid in rats. Food Chem Tox 48: 591-598. 13. Roy A et al. 2007. Butters rich either in trans-10-C18:1 or 2. Bauchart D et al. 2007. Butters varying in trans 18:1 and in trans-11-C18:1 plus cis-9, trans-11 CLA differentially cis-9,trans-11 conjugated linoleic acid modify plasma li- affect plasma lipids and aortic fatty streak in experimental poproteins in the hypercholesterolemic rabbit. Lipids 42: atherosclerosis in rabbits. Animal 1: 467-476. 123-133. 14. Shingfield KJ, Chilliard Y, Toivonen V, Kairenius P, 3. Brown AW, Trenkle AH, Beitz DC. 2011. Diets high in Givens DI. 2008. Trans fatty acids and bioactive lipids in conjugated linoleic acid from pasture-fed cattle did not al- ruminant milk. Adv Exp Med Biol 606: 3-65. ter markers of health in young women. Nutr Res 31: 33-41. 15. Tholstrup T et al. 2006. Effects of butter high in ruminant 4. Gagliostro GA. 2007. Producción de lácteos con alto im- trans and monounsaturated fatty acids on lipoproteins, in- pacto sobre la salud humana. Tecnología láctea latinoa- corporation of fatty acids into lipid classes, plasma C-re- mericana, 45:56-63. active protein, oxidative stress, hemostatic variables, and insulin in healthy young men. Am J Clin Nutr 83: 237-243. 5. Gebauer SK, Destaillats F, Dionisi F, Krauss RM, Baer DJ. 2015. Vaccenic acid and trans fatty acid isomers from 16. Tricon S et al. 2006. Effects of dietary products naturally partially hydrogenated oil both adversely affect LDL cho- enriched with cis-9,trans-11 conjugated linoleic acid on lesterol: double-blind, randomized controlled trial. Am J the blood lipid profile in healthy middle-aged men. Am J Clin Nutr 102: 1339-1346. Clin Nutr 83: 744-753. 6. Haug A, Hostmark AT, Harstad OM. 2007. Bovine milk 17. Valeille K et al. 2006. The natural concentration of conju- in human nutrition: a review. Lipids Health Dis 6: 25. gated linoleic acid, cis-9, trans-11, in milk fat has antiath- erogenic effects in hyperlipidemic hamsters. J Nutr 136: 7. Malpuech BC et al. 2010. Differential impact of milk 1305-1310. fatty acid profiles on cardiovascular risk biomarkers in healthy men and women. Eur J Clin Nutr 64: 752-759. 18. Venkatramanan S et al. 2010. Milk enriched with conju- gated linoleic acid fails to alter blood lipids or body com- 8. Motard BA et al. 2008. Study of the effect of trans fatty position in moderately overweight, borderline hyperlipid- acids from ruminants on blood lipids and other risk factors emic individuals. J Am Coll Nutr 29: 152-159. for cardiovascular diseases. Am J Clin Nutr 87: 593-599. 19. Yin W et al. 2012. Plasma lipid profiling across species 9. Patiño EM et al. 2017. Perfil de ácidos grasos en leche de for the identification of optimal animal model of human búfalas alimentadas con pastura natural y suplementadas dyslipidemia. J Lipid Res 53: 51-65. con aceites de girasol y pescado. Rev Vet 28: 19-26. 20. Zhang C et al. 2010. A practical method for quantifying 10. Pintus S et al. 2013. Sheep cheese naturally enriched in atherosclerotic lesions in rabbits. J Comp Path 142: 122- α-linolenic, conjugated linoleic and vaccenic acids im- 128. proves the lipid profile and reduces anandamide in the plasma of hypercholesterolaemic subjects. Br J Nutr 109: 1453-1462. 11. Poppitt SD et al. 2002. Lipid-lowering effects of a modi- fied butter-fat: a controlled intervention trial in healthy man. Eur J Clin Nutr 56: 64-71.

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 39-42, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Direct fluorescent antibody test and bacteriological culture for detection of Brucella suis in swine tissues Estein, S.M.1,6; Bence, A.R.2,5; Cacciato, C.S.3,5; Echavarría, H.M.4; Soto, P.3,4 1Lab.Inmunología CIVETAN-CONICET, 2Dep.Fisiopatología, 3Lab.Microbiología, Fac.Cs.Vet.UNCPBA, Tandil, Buenos Aires, Argentina. 4Lab.Tandil. 5Comisión Investig.Científ. (CICPBA). 6Consejo Nac.Investig.Científ.Técn. (CONICET). E-mail: [email protected] Abstract Estein, S.M.; Bence, A.R.; Cacciato, C.S.; Echavarría, H.M.; Soto, P.: Direct fluorescent antibody test and bacteriological culture for detection of Brucella suis in swine tissues. Rev. Vet. 30: 1, 39-42, 2019. Methods available for detection of Brucella sp from different specimens include bacteriological culture or detection of specific DNA fragments by polymerase chain reaction. The use of fluorescein-labeled anti-Brucella globulin for demonstrating this antigen in animal tissues is a simple, easy, reproducible, cheap and fast technique. The aim of this work was to evaluate the gamma globulin fraction of polyclonal anti-Brucella abortus serum labeled with fluorescein iso-tio-cyanate (FITC-labeled antibody): 1) against different smooth and rough Brucella sp, 2) against bacterium of other genus, and 3) to compare direct fluorescent antibody test results with bacteriological culture for the detection of B. suis in different tissues from in- fected animals. This conjugate stained all Brucella sp with different intensities but it did not stain any heterologous bacterium tested. Background fluorescence associated with its use on smears from infected sources of different specimens was particularly low. Most of the infected tissues showed the presence of yellowish-green fluorescent organisms with brucella morphology. The tested FITC-labeled antibody allows a quick, effective and inexpensive diagnosis of brucellosis. Key words: swine, Brucella sp, fluorescein-labeled anti-Brucella globulin, smear, sensitivity, specificity. Resumen Estein, S.M.; Bence, A.R.; Cacciato, C.S.; Echavarría, H.M.; Soto, P.: Comparación del test directo de anticuerpos fluorescentes y el cultivo bacteriológico para detección de Brucella suis. Rev. Vet. 30: 1, 39-42, 2019. El diagnóstico de brucelosis se apoya en el cultivo bacterioló- gico o en la detección de fragmentos de ADN de la bacteria mediante la reacción en cadena de la polimerasa. El empleo de una inmunoglobulina anti-Brucella conjugada a fluoresceína para la detección de este antígeno en tejidos constituye una técnica simple, fácil, reproducible, econó- mica y rápida. El objetivo de este trabajo fue evaluar la fracción gammaglobulínica de un suero policlonal anti-Brucella abortus marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC), 1) contra dis- tintas especies lisas y rugosas de Brucella sp, 2) contra bacterias de otros géneros, y 3) comparar los resultados obtenidos con la inmunofluorescencia directa y el cultivo bacteriológico para la detección de B. suis en distintos tejidos de porcinos infectados. Este conjugado detectó todas las brucelas con distinta intensidad de fluorescencia, pero no hubo fluorescencia inespecífica cuando se ensayaron las bacterias de otros géneros. La fluorescencia de fondo en muestras de los distintos tejidos infectados fue baja. La mayoría de los tejidos infectados mostraron la presencia de microorganismos verde-fluorescentes con la morfología de las brucelas. El anticuerpo conju- gado a FITC permitió un diagnóstico de brucelosis rápido, efectivo y económico. Palabras clave: cerdo, Brucella sp, fluoresceína anti-Brucella globulina, impronta, sensibili- dad, especificidad. INTRODUCTION ses include isolation of these bacteria by culture and identification by biochemical tests, or detection of DNA Brucellosis is caused by gram-negative Brucella sequences by polymerase chain reaction (PCR). sp and is one of the most widespread zoonoses and an economically important disease 1 . Direct diagno- Cultural examination takes a long time and is not always suitable even on selective media, because of Recibido: 2 noviembre 2018 / Aceptado: 20 diciembre 2018. Proyectos 03/H278-C(SeCAT UNCPBA) y PIP0569 (CONICET)

40 Estein S.M. et al.: Detection of Brucella suis. Rev. Vet. 30: 1, 39-42, 2019 overgrowth by contaminating organisms 3 . PCR is an Polyclonal anti-Brucella abortus serum. Poly- extremely powerful technique but requires DNA ex- clonal anti-B. abortus serum was produced by labora- traction from samples and the use of specific equipment. torio biológico de Tandil (Biotandil SRL). Briefly, spe- cific antibodies against B. abortus were purified from The direct fluorescent antibody test (DFAT) ap- the serum of hyperimmunized goat. Goat was immu- pears to offer a specific and quick alternative to the nized with inactivated B. abortus S19 suspension four Gram or stamp stains onto smears from tissues or sus- times by intramuscular via. The gamma globulin frac- picious colonies 2 . DFAT is a common laboratory tech- tion from the serum was precipitated by the addition of nique, which is based on the use of specific antibodies ammonium sulphate. This fraction was conjugated to chemically conjugated to fluorescent dyes. The fluores- FITC as previously described by other investigators 9 . cence can be visualized by a fluorescence microscope used for the routine diagnosis(e.g. diagnosis of campy- Determination of conjugate specificity. To de- lobacteriosis) 7 . termine the specificity of the fluorescent conjugate, it was diluted in Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 8 The aim of this work was evaluate the gammaglob- at the following 10 dilutions: 1/25, 1/50, 1/100, 1/150, ulin fraction of polyclonal anti-Brucella abortus serum 1/200, 1/300, 1/400, 1/500 and 1/600. Ten microliters labeled with fluorescein iso-tio-cyanate (FITC-labeled of each bacterial suspension was smeared in each one antibody): 1) against different smooth and rough Bru- of 12 wells printed with ink per glass slide and was air- cella sp; 2) against bacterium of other genus; and 3) to dried at 37°C. Smears were fixed with absolute ethanol compare DFAT results with bacteriological culture for at 37°C and then rinsed with distilled water. Twenty the detection of B. suis in different tissues from sero- microliters of each conjugate dilution were added to positive pigs. each reaction site on the slides. Reaction was allowed to proceed in a moist atmosphere at 37°C for 1 hour. MATERIAL AND METHODS Conjugate was rinsed off with PBS three times and then with distilled water once. Cover slips were mount- Serological tests. Serum samples from aborted ed with buffered glycerol (pH 8) and were examined sow and boar were analyzed by Buffer Plate Agglutina- by fluorescence microscopy with incident lamination tion test (BPAT), Bengal Rose Test (RBT) and Fluo- rescense Polarization Assay (FPA) following supplier Table 1. Bacteriological culture and DFAT in different instructions (Laboratorio Biológico de Tandil, Argen- tissues from fetal swine tissues, aborted sow and boar tina). Results were interpreted according to the proce- with positive serology. dures recommended by Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) 8 . origin tissues DFAT bact.culture fetal Tissue samples, bacteriological culture. Material female liver of F1 positive positive from fetal tissues, aborted sow and boar from brucello- spleen of F1 positive positive sis endemic farm were submitted for routine diagnosis male liver of F2 positive positive and were used in this study. Samples were taken of 4 spleen of F2 positive positive liver and spleen fetal tissues; placenta, spleen and liver liver of F3 positive positive from an aborted sow; and spleen, liver, testes, seminal spleen of F3 positive positive glands, prostate and bulbouretral glands, epididymis liver of F4 positive positive (head, body and tails), right and left testes and cervical spleen of F4 positive positive and inguinal lymph nodes from a boar. Each sample placenta positive positive was homogenized in saline solution and was seeded cervical lymph. negative negative onto skidrow and tryptone soy agar added with yeast inguinal lymph. negative positive (TSAYE) media. Plates were incubated in 10% of CO2 spleen positive positive at 37ºC for ten days. Suspected colonies were identi- liver negative negative fied by Gram staining, catalase, oxidase, urease, nitrate right teste positive positive reductase tests and SH2 production 4 . left teste negative negative spleen negative positive Smears. Impression smears from all tissue samples liver negative positive were made onto glass slides and allowed to air-dry. seminal glands negative negative Procedure to staining was detailed in “determination prostate gland positive positive of conjugate specificity” using the optimal dilution of left head of ep. negative negative the fluorescein conjugate determined by check board right head of ep. positive positive titration against different smooth Brucella sp (1:200). leftbody of ep. negative negative Only the presence of individual or clumping yellowish- rightbody of ep. positive positive green fluorescent organisms with the morphological lefttail of ep. negative negative characteristics of Brucella sp was considered posi- righttail of ep. positive positive tive. Control smears of smooth B. abortus suspensions were included in each series of tests. A suspension of DFAT: direct fluorescent antibody test; bact.: bacteriologi- B. abortus strain was included, as positive control of cal; ep: epididymis; F1 to F4: fetal organs. the reaction.

Estein S.M. et al.: Detection of Brucella suis. Rev. Vet. 30: 1, 39-42, 2019 41 Table 2. Fluorescence intensities against different bacterium after incubation with fluorescein-labeled anti- Brucella globulin. bacteria anti-Brucella fluorescent conjugate dilutions 1/25 1/50 1/75 1/100 1/150 1/200 1/300 1/400 1/500 1/600 Brucilla abortus 544 (S) +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ B. melitensis H38 (S) +++ ++ ‫ ׀‬++ ‫ ׀‬++ ‫ ׀‬++ ‫ ׀‬++ ‫ ׀‬++ + ‫ ׀‬+ ‫ ׀‬+ ‫׀‬ B. suis 1330 (S) +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ B. canis RM6/66 (R) ++ ‫ ׀‬++ ‫ ׀‬++ ‫ ׀‬++ ‫ ׀‬+ ‫׀‬ +‫׀‬ + + + + B. canis M- (R) +‫ ׀‬+‫׀‬ + + ‫׀‬ - - - - - B. ovis REO 198(R) +‫ ׀‬+‫׀‬ + ‫׀‬ - - - - - - Actinobacillus seminis ---------- Campylobacter fetus ‫׀‬--------- Escherichia coli ---------- Histophilus somni ---------- Mannheimia haemolytica ---------- Proteus vulgaris ---------- Corynebacterium pseudoTBC ‫׀‬ ‫׀‬ ‫׀‬ ‫׀‬ - - - - - - Staphylococcus aureus ---------- Trueperella pyogenes ‫ ׀ ׀׀‬- - - - - - - - Fluorescence intensity of conjugate: (+++) extremely positive reaction, (++ ‫ )׀‬strongly positive reaction, (++) mild reaction, (+) moderate reaction, (+ ‫ )׀‬weakly positive reaction, (‫ )׀‬weak reaction, (-) negative reaction. at 100x (Zeiss–Primo Star). The highest conjugate dilu- However, fluorescent conjugate reacted with strong tion at which fluorescence was detected in each bacte- to weak intensity and in low dilutions against B. ca- rial smear was taken as a final end point. nis or B. ovis reference strains. No fluorescent bacteria were seen in preparations from other Gram positive or Bacteria. To check cross-reactivity of the fluo- Gram negative bacteria that can cause serological cross rescent conjugate, individual suspensions of different reaction with Brucella sp in different domestic animals. smooth (Brucella abortus 544, B. melitensis H38, B. suis 1330) and rough Brucella strains (B. canis RM6/66, Substantial concordance was observed between B. canis (M-), B. ovis REO 198), other Gram negatives bacteriological culture (gold standard) and DFAT (Actinobacillus seminis, Campylobacter fetus, Esch- (kappa=0.6923; (IC 95% 0.47-1)). Tissue smears from erichia coli, Histophilus somni, Mannheimia haemo- pigs infected with Brucella sp showed the presence of lytica, Proteus vulgaris) and Gram positives (Coryne- yellowish-green fluorescent organisms of brucella mor- bacterium pseudotuberculosis, Staphylococcus aureus, phology located in clumps or individual particles (Fig- Trueperella pyogenes (ex-Arcanobacterium) bacteria ure 1: D and E). Occasionally, in all types of prepara- were inactivated and were prepared in phenol saline so- tion, isolated particles showing yellowish fluorescence lution. After that, density of each bacterial suspension or indistinct patches showing similar fluorescence were was adjusted to match turbidity standard of 0.5 McFar- observed. land units (approximately 1.5 x 108 bacteria). DISCUSSION Statistical analysis. The kappa index of concor- dance between bacteriological culture and DFAT was Although a presumptive diagnosis of brucellosis determined by EPIDAT 4.2 can be made by demonstrating high or rising antibody titers to Brucella antigens, isolation of the organism RESULTS from fluids or tissue cultures is the only irrefutable proof of the disease 4 . Serum samples from aborted sow and boar were positive in the three techniques used to evaluate the On the basis of the actual work we confirm that presence of anti-Brucella antibodies. Tissue samples DFAT with this FITC-labeled anti-B.abortus conjugate were seeded in a base and selective media. Bacterio- allows safe and quick detection of Brucella sp onto logical results and DFAT assayed onto tissue smears smears of specimen or tissue from suspicious animals are shown in Table 1. or from isolated colonies of brucella. The results obtained after incubation of FITC-la- In addition, the direct binding of the polyclonal an- beled anti-B. abortus conjugate with different bacte- tibody to specific epitopes reduces the number of steps rial suspensions are shown in Table 2. Extremely posi- in the procedure, saving time and reducing non-specif- tive and strongly positive reactions were observed in ic background signal 6 . This also limits the possibil- high dilutions of conjugate against all tested smooth B. ity of antibody cross-reactivity and possible mistakes abortus, B. suisand, and B. melitensis reference strains throughout the process. (Figure 1: A, B, and C).

42 Estein S.M. et al.: Detection of Brucella suis. Rev. Vet. 30: 1, 39-42, 2019 Figure 1. Direct fluorescence antibody test with polyclonal FITC conjugated anti-B. abortus serum. A, B, C: suspension of Brucella suis 1330. D: swine epididymal smear infected with B. suis biovar 1. E: smear from prostate gland (100x immersion oil). Since already it has been demonstrated by other 4. Alton GG, Jones LM, Angus RD, Verger JM. 1988. Se- authors, the use of this technique as a first step for di- rological methods. Techniques for the Brucellosis labora- agnostic would allow much quicker results than bacte- tory. Ed. Institut National de la Recherche Agronomique, riological culture whose time is extensive and where Paris, p. 157-167. isolation is subject to viability of the bacterium and to the employment of selective culture media that prevent 5. Corbel MJ. 1973. The direct fluorescent antibody test for the growth of contaminants 5 . detection of Brucella abortus in bovine abortion material. J Hyg 71:123-129. Acknowledgements. We thank Drs. N.Guida (UBA) and F.Paolicchi (INTA Balcarce) for the 6. Fritschy J, Härtig W. 2001. Immunofluorescence. strains provided, and J.Garcia, B.Riccio, G.Yaniz, doi:10.1038/npg.els.0001174. https://onlinelibrary.wiley. P.Dominguez and M. Indart by the technical help in com/doi/10.1038/npg.els.0001174 the necropsies. 7. Mellick PW, Winter AJ, McEntee K. 1965. Diagnosis of REFERENCES vibriosis in the bull by the use of the fluorescent antibody technique. Corn Vet 55: 280-294. 1. Adone R, Pasquali P. 2013. Epidemiosurveillance of bru- cellosis. Rev Sci Tech 32: 199-205. 8. Nicola A, Elena S. 2009. Manual de diagnóstico serológi- co de la brucelosis bovina, Ed. SENASA, Buenos Aires, p. 2. Ajai CO, Cook JE, Dennis SM. 1980. Diagnosing ovine 95. epididymitis by immunofluorescence. Vet Rec 107: 421- 424. 9. Soto P, Di Rocco MJ. 1984. Campylobacteriosis bovina. Prevalencia en diversas zonas de la República Argentina. 3. Al Dahouk S, Tomaso H, Nöckler K, Neubauer H, Fr- Rev Investig Agropec 19: 273-279. angoulidis D. 2003. Laboratory-based diagnosis of bru- cellosis-a review of the literature. Part I: Techniques for direct detection and identification of Brucella sp Clin Lab 49: 487-505.

Revista Veterinaria Rev vet 30 (1): 43-47, 2019 ISSN (papel): 1668-4834 www.vet.unne.edu.ar ISSN (on line) 1669-6840 vet.unne.edu.ar/uploads/revista….pdf Interacción genotipo-manejo de la alimentación en la producción de pollos camperos Dottavio, A.M.1,3; Romera, B.M.1; Canet Z.E.1,2; Di Masso R.J.1,3 1Cátedra Genética, Fac.Cs.Vet.Univ.Nac.de Rosario (Casilda, Argentina). 2INTA Pergamino. 3CIC (Univ. Nac. Rosario-UNR). E-mail: [email protected] Resumen Dottavio, A.M.; Romera, B.M.; Canet, Z.E.; Di Masso, R.J.: Interacción genotipo-ma- nejo de la alimentación en la producción de pollos camperos. Rev. Vet. 30: 1, 43-47, 2019. La producción de carne aviar en sistemas de manejo semi-intensivo es una modalidad ecoló- gica que contempla aspectos vinculados con el bienestar animal. El pollo Campero es un ave con menor velocidad de crecimiento que los parrilleros comerciales, destinado a la produc- ción de carne. El esquema tradicional de alimentación incluye la utilización de tres tipos de alimentos especialmente formulados a tal fin (iniciador, crecimiento y terminador), lo cual introduce complicaciones en el manejo, particularmente en lo referido a la disponibilidad del alimento “crecimiento” para los pequeños productores. Una alternativa que facilitaría el manejo de estas aves es un esquema basado en sólo dos tipos de alimentos: iniciador y termi- nador. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del cambio del manejo tradicional de la alimentación por uno alternativo reemplazando el alimento “crecimiento” por una mezcla de iniciador y terminador, en dos genotipos de pollo Campero con diferente velocidad de crecimiento: el híbrido experimental de tres vías Campero Casilda y el híbrido simple Cam- pero INTA. La evidencia indicó que el cambio en el manejo de la alimentación no afectó el crecimiento, la relación de conversión ni los caracteres a la faena. Ambos grupos genéticos se comportaron de manera equivalente, pudiendo obviarse la inclusión de la categoría “cre- cimiento” si se la reemplaza por una mezcla de iniciador y terminador. Palabras clave: pollos, peso corporal, eficiencia alimenticia, caracteres a la faena, cruza- miento de tres vías. Abstract Dottavio, A.M.; Romera, B.M.; Canet, Z.E.; Di Masso, R.J.: Genotype x feeding regimen interactions in free-range chicken production. Rev. Vet. 30: 1, 43-47, 2019. Poultry meat production in semi-intensive management systems is an ecological modality that takes into account aspects related to animal welfare. Campero chicken is a bird with a slower growth rate than commercial broilers destined to the production of meat in this type of systems. The traditional feeding scheme includes the use of three types of food specially formulated for this purpose (starter, grower and finisher) which introduces management complications, par- ticularly in relation to the availability of grower food for small producers. An alternative that would facilitate feeding management is a scheme based on only two types of food: starter and finisher. The aim of this work was to evaluate the effect of changing the traditional feed- ing scheme by an alternative one, replacing grower food with a mix of starter and finisher, in two genotypes of chicken with a different growth rate: the experimental three-way cross Campero Casilda and the two-way cross Campero INTA. The evidence indicates that the proposed change in the traditional feeding management does not affect body growth, feed conversion ratio and productive traits at slaughter, and that both genetic groups behave simi- larly, when grower diet is replaced by a mix of starter and finisher. Key words: chicken, body weight, feed efficiency, slaughter traits, three-way cross. Recibido: 13 junio 2018 / Aceptado: 18 octubre 2018 Proyecto Vet 181, SCyT-UNR. Resultados presentados durante 2015 en congresos de Casilda, Mar del Plata y Rosario (Argentina).

44 Dottavio A.M. et al.: Producción de pollos. Rev. Vet. 30: 1, 43-47, 2019 INTRODUCCIÓN Sintética materna A - 75% Cornish Red + 25% Rhode Island Red; Sintética materna ES - 87,5% Cornish Red La denominación avicultura alternativa hace re- + 12,5% Rhode Island Red, Sintética materna E - 50% ferencia a cualquier modalidad de producción avícola Cornish Red + 50% Rhode Island Red; Sintética pater- que difiera de la convencional, e involucra sistemas na AH’ - población mejorada por velocidad de creci- menos intensivos con miras a la obtención de produc- miento y eficiencia de conversión de alimento a partir tos diferenciados de los tradicionales, por su calidad de la sintética AH [50% Hubbard + 50% estirpe Anak y/o por el modo de crianza de las aves, contemplando (grises)] y Sintética paterna AS - 50% Cornish Red + además aspectos vinculados con el bienestar animal 3 . 50% Cornish Blanco. El pollo Campero INTA1 es un tipo de ave desti- El día del nacimiento, las aves se sexaron por ins- nada a la producción de carne en este tipo de sistemas, pección de la cloaca, se vacunaron contra la enfer- criado en base a un protocolo, en semi-cautiverio y con medad de Marek, se identificaron con una banda alar un esquema de alimentación que incluye la utilización numerada y se trasladaron a la Facultad de Ciencias de tres tipos de raciones: iniciador, crecimiento y ter- Veterinarias de la Universidad Nacional de Rosario minador. Este pollo ha sido desarrollado como una al- (Argentina) donde fueron sometidas al manejo y al plan ternativa para pequeños productores, donde las opcio- sanitario establecido en el protocolo de certificación nes genéticas comerciales muestran desajustes ante un del pollo Campero INTA 1 . ambiente no totalmente acorde a sus exigencias, permi- tiendo satisfacer una demanda creciente por productos Hasta los 35 días de edad se criaron a galpón como naturales con un valor agregado diferencial . un grupo único con una densidad promedio de 15 aves/ m2 y a partir del día 36 y hasta la faena a los 84 días de Por intermedio del Programa Prohuerta este po- edad, permanecieron en galpones con acceso a parque llo es distribuido por el INTA Pergamino y una red de con una densidad promedio de 8 aves/m2 y 2 aves/m2, multiplicadores, para el autoconsumo de familias con respectivamente. necesidades alimentarias insatisfechas y venta de ex- cedentes en ferias locales. El alimento crecimiento pre- Se evaluaron dos manejos de alimentación: tradi- senta problemas de disponibilidad en las diferentes zo- cional (MT- 40 aves de cada genotipo) basado en la uti- nas donde se distribuye –marginales para la avicultura lización de tres tipos de alimento (Iniciador: 0 a 35 días industrial– por lo que su reemplazo implementando un de edad, Crecimiento: 36 a 56 días de edad y Termina- manejo con sólo dos tipos de alimento, podría simplifi- dor: 57 a 83 días de edad) y alternativo (MA- 40 aves car la cría de estas aves. de cada genotipo) basado en sólo dos tipos de alimento (Iniciador y Terminador, según el siguiente detalle: Ini- Dado que el alimento representa el principal com- ciador (100%) 0-28 días de edad; Iniciador (75%) + Ter- ponente del costo de producción y, en el caso del pollo minador (25%) 29-42 días de edad; Iniciador (50%) + Campero, la menor tasa de crecimiento de las aves con- Terminador (50%) 43-56 días de edad; Iniciador (25%) lleva a un deterioro de la relación de conversión alimenti- + Terminador (75%) 57-70 días de edad y, por último, cia, las interacciones genotipo x manejo de alimentación Terminador (100%) 71-83 días de edad. adquieren relevancia por su impacto en la rentabilidad de las explotaciones dedicadas a producirlo. La formulación de las raciones se llevó a cabo se- gún exigencias del protocolo mencionado, con la si- El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del guiente composición: Iniciador - proteína 18,5%, calcio cambio de manejo de la alimentación sobre las varia- 0,9%, fósforo total 0,75%, fósforo disponible 0,47%, bles productivas habitualmente analizadas como sa- energía metabolizable aves 3150 kcal., metionina + lidas en estos sistemas de producción, en machos de cistina 0,72% y lisina 0,94% y Terminador - proteína pollo Campero derivados de dos modelos genéticos de 15,09%, calcio 0,85%, fósforo total 0,6%, fósforo dis- cruzamientos terminales. ponible 0,38%, energía metabolizable aves 3350 kcal., metionina + cistina 0,60% y lisina 0,75%. MATERIAL Y MÉTODOS El peso de cada ave se registró a intervalos semana- Se utilizaron pollos machos de los grupos genéti- les entre el nacimiento y la faena. Los datos longitudi- cos: Campero Casilda y Campero INTA. Campero Ca- nales peso corporal-edad se ajustaron por regresión no silda es un cruzamiento experimental de tres vías entre lineal con el modelo sigmoideo de Gompertz 5 : W (t) = gallos de la sintética paterna AH’ y gallinas derivadas A exp (-b exp (- k t)), donde: W (t) = peso corporal (g) en del cruzamiento simple entre gallos y gallinas de las el tiempo t, A = peso corporal asintótico (peso corpo- sintéticas maternas A y ES, respectivamente. ral promedio cuando t tiende a infinito), b = parámetro de posición, constante de integración sin significado Campero INTA es un cruzamiento simple entre ma- biológico, que ajusta para aquellos casos en que t es chos de la sintética paterna AS y hembras de la sintética distinto de cero, k = tasa de maduración (velocidad de materna E. Las poblaciones sintéticas intervinientes se aproximación al valor A) y t = tiempo en semanas. La generaron y mantienen en el Núcleo genético de la Sec- bondad del ajuste se evaluó a partir de la convergencia ción Avicultura del INTA “Ing. Agr. Walter Kugler”, en en una solución, el valor del coeficiente de determina- Pergamino (Argentina). La constitución genética teóri- ción no lineal (R2) y el comportamiento aleatorio de los ca de las mismas (Bonino, comunicación personal) es: residuales (test de rachas).

Dottavio A.M. et al.: Producción de pollos. Rev. Vet. 30: 1, 43-47, 2019 45 A los efectos del tratamiento estadístico de los da- terminación no lineal (R2) superó el valor de 0,90 y los tos, los estimadores de los parámetros A y k se consi- residuales mostraron una distribución aleatoria. No se deraron como nuevas variables aleatorias. A partir de observaron efectos significativos de la interacción gru- los 36 días de vida, un grupo representativo de 40 aves po genético por manejo de la alimentación (F= 0,34; P= de cada grupo genético (20 por cada manejo de la ali- 0,558) sobre el valor promedio del estimador de peso mentación) se alojó en jaulas individuales. Luego de un corporal asintótico. período de siete días de acostumbramiento, cada ave fue pesada semanalmente, se calculó su aumento me- El grupo genético no representó una fuente signi- dio diario de peso (AMD) y se determinó su consumo ficativa de variación con respecto a esta variable (F= medio diario individual de alimento (CMD) a partir del 1,55; P= 0,216) como así tampoco lo fue el manejo de registro de la diferencia entre una cantidad fija ofrecida la alimentación (F= 0,85; P= 0,359). Con respecto a la y la cantidad remanente en el comedero al día siguiente. tasa de maduración, la interacción tendió a ser signi- ficativa (F= 2,93; P= 0,0898) debido a un mayor valor El comportamiento de la relación de conversión promedio del estimador en Campero Casilda con ma- (RC:CMD/AMD) y las variables que la determinan nejo tradicional y un menor valor del mismo en Campe- se evaluó entre los 42 y 77 días de edad. Las aves se ro INTA con manejo alternativo. faenaron en la Sección Avicultura del INTA Pergami- no (Argentina). En 30 aves de cada grupo genético y No se observó efecto significativo del manejo de manejo de alimentación, se determinó el peso corporal la alimentación sobre la velocidad de aproximación al pre-faena, el peso eviscerado, el peso de la pechuga con peso asintótico (F= 0,11; P= 0,737) mientras que el gru- hueso y pata-muslo derecho y el peso del depósito gra- po genético afectó significativamente a este carácter so abdominal como estimador del contenido de grasa (F= 27,9; P< 0,0001) correspondiendo valores mayores corporal. a las aves del cruzamiento experimental de tres vías. Los porcentajes de pechuga, pata-muslo y grasa La Tabla 2 presenta los valores de relación de con- abdominal se calcularon como proporción del peso versión y variables asociadas que determinan su valor, corporal eviscerado. El rendimiento de la canal (%) se en los dos genotipos, en cada manejo de alimentación. calculó como [(peso corporal eviscerado / peso vivo pre-faena) x 100]. Los efectos del grupo genético, el No se observó efecto estadísticamente significati- manejo de la alimentación y la interacción simple entre vo de la interacción simple grupo genético x manejo ambos sobre las diferentes variables respuesta, se eva- de la alimentación sobre la RC (F=0,10; P=0,758), el luaron con un análisis de la variancia correspondiente a AMD (F=0,20; P=0,656) y el CMD (F=0,05; P=0,817) un experimento factorial 2x2. Se consideraron signifi- lo que posibilitó la interpretación de los efectos direc- cativos los efectos con probabilidades asociadas ≤ 0,05. tos de los factores principales. Tampoco se presentaron efectos estadísticamente significativos del grupo gené- RESULTADOS tico (RC: F=1,18; P=0,282), (AMD: F=0,86; P=0,357), (CMD: F=1,49; P=0,226), ni del manejo de la alimen- La Tabla 1 presenta los valores de los estimadores tación (RC: F=0,00; P=1,00), (AMD: F=0,00; P=0,973), de los parámetros de la función de Gompertz. Se ob- (CMD: F=0,04; P=0,841) sobre las tres variables ana- servó convergencia en el ajuste, el coeficiente de de- lizadas. Los valores de los caracteres estudiados a la faena se resumen en la Tabla 3. Tabla 1. Estimadores de la función de Gompertz aplicada al ajuste de los datos peso corporal-edad cronológica en ambos genotipos. Campero Casilda Campero INTA manejo tradicional manejo alternativo manejo tradicional manejo alternativo peso asintótico A (g) 4777 ± 92,5 4917 ± 88,1 4947 ± 94,0 4978 ± 96,6 tasa de maduración k (g-1) 0,2227 ± 0,00411 0,2157 ± 0,00349 0,1988 ± 0,00282 0,2035 ± 0,00312 Todos los valores corresponden a la media aritmética ± error estándar. Tamaño muestral: n = 40 aves por subgrupo genoti- po-manejo de la alimentación. Tabla 2. Relación de conversión y variables asociadas de dos genotipos de pollos Campero bajo dos manejos de la alimentación. Campero Casilda Campero INTA manejo tradicional manejo alternativo manejo tradicional manejo alternativo CMD (g/día) 162,7 ± 2,44 164,1 ± 4,15 159,5 ± 3,04 159,4 ± 3,06 AMD (g/día) relac. conv. 49,9 ± 1,28 49,2 ± 1,88 47,9 ± 1,25 48,5 ± 1,31 3,28 ± 0,061 3,37 ± 0,086 3,35 ± 0,052 3,30 ± 0,053 relac.conv.: relación de conversión. Todos los valores corresponden a la media aritmética ± error estándar. Ta- maño muestral: n = 20 aves por subgrupo genotipo – manejo de la alimentación.

46 Dottavio A.M. et al.: Producción de pollos. Rev. Vet. 30: 1, 43-47, 2019 Tabla 3. Caracteres a la faena en dos genotipos de pollos Campero bajo dos manejos de la alimentación. Campero Casilda Campero INTA manejo tradicional manejo alternativo manejo tradicional manejo alternativo peso prefaena (g) 3274 ± 33,2 3213 ± 44,6 3137 ± 44,2 3126 ± 38,4 peso eviscerado (g) prop.de pechuga (%) 2367 ± 30,70 2313 ± 34,15 2258 ± 33,2 2227 ± 36,4 prop. patamuslo (%) prop.grasa abdom.(%) 26,2 ± 0,26 26,0 ± 0,41 26,0 ± 0,33 25,6 ± 0,21 rendimiento (%) 15,9 ± 0,39 16,0 ± 0,16 15,3 ± 0,16 15,6 ± 0,14 2,17 ± 0,198 2,08 ± 0,146 2,56 ± 0,116 2,28 ± 0,309 72,3 ± 0,30 72,0 ± 0,24 72,0 ± 0,24 71,2 ± 0,31 Todos los valores corresponden a la media aritmética ± error estándar. Tamaño muestral: n = 30 aves por subgrupo genotipo – manejo de la alimentación. No se observaron efectos estadísticamente signifi- miento de estos genotipos cobra importancia dada su cativos de la interacción grupo genético x manejo de la condición de aves destinadas a la producción de carne alimentación sobre ninguno de los caracteres evalua- y su dinámica resulta de la combinación entre el peso dos. El efecto del grupo genético fue estadísticamente asintótico y la tasa de aproximación al mismo. significativo para el peso corporal pre-faena (F= 7,68; P=0,007), el peso eviscerado (F= 11,6; P=0,001) y el Pese a crecer hacia pesos asintóticos similares, la rendimiento a la faena (F= 3,56; P=0,063). mayor tasa de maduración del cruzamiento experimen- tal de tres vías determina que, independientemente del Si bien las aves Campero Casilda tendieron a mos- manejo de la alimentación, las aves de este grupo ge- trar mayor proporción de pechuga (Campero Casilda: nético sean ligeramente más pesadas que las del geno- 26,1% vs Campero INTA: 25,8%) y menor proporción tipo de referencia a la edad de faena. En relación a la de grasa abdominal (Campero Casilda: 2,13% vs Cam- conversión de alimento en biomasa, su caracterización pero INTA: 2,42%) dichas diferencias no alcanzaron adquiere relevancia debido a particularidades que dife- significado estadístico. Sólo se observó efecto estadís- rencian a las poblaciones de crecimiento lento de aque- ticamente significativo del manejo de la alimentación llas empleadas en la avicultura industrial. en el caso del rendimiento a la faena (F= 3,81; P=0,055) que resultó mayor bajo manejo tradicional. La menor tasa de aumento de peso diario obser- vada respecto de las líneas comerciales y una edad de DISCUSIÓN faena que prácticamente duplica a la del broiler indus- trial, contribuyen a un deterioro de la conversión de De acuerdo a especialistas en el tema 10 , la expre- alimento en carne. sión interacción genotipo x ambiente se utiliza para describir aquellas situaciones en las cuales diferentes De todos modos, en estos sistemas productivos la genotipos responden de manera diferencial ante un eficiencia no siempre es evaluada en términos de máxi- cambio de ambiente, lo que podría atribuirse a varia- ma ganancia de peso y conversión 6 debiendo conside- ciones relativas en las contribuciones individuales o rarse otras variables tales como la modalidad de crian- niveles de expresión de los genes involucrados en la za en relación a demandas particulares del mercado determinación de un carácter. consumidor y la calidad del producto ofertado 11 que en algunos casos justifican llegar con mayores pesos La producción de carne de cualquier especie de de faena 9 e incluso no estar sujetos a lograr un objeti- interés económico se basa en el crecimiento de los in- vo de conversión sino a considerar en el análisis todas dividuos utilizados, proceso afectado por el ambiente las variables que determinan la mejor relación costo/ nutricional y factores hormonales con funciones regu- beneficio 2 . latorias que intervienen en la conversión de los nutrien- tes y en sus modalidades de almacenamiento 4 . Los valores de relación de conversión observados en este estudio, oscilaron entre un máximo de 3,35 para Dado que el balance hormonal depende de factores Campero INTA y un mínimo de 3,28 en Campero Ca- genéticos y también de la dieta de las aves, la combina- silda, ambos criados con manejo tradicional. Si bien ción de ambos puede dar lugar a interacciones signifi- los mismos no difieren de los informados en estudios cativas. Diferentes autores han investigado la presencia previos llevados a cabo en cruzamientos experimenta- de interacciones genotipo x dieta y sus efectos sobre les de crecimiento más lento y se encuentran dentro del algunos caracteres productivos en parrilleros comer- rango comunicado para pollos Label Rouge por otros ciales 7, 12 . autores 8 , superan a los habituales en el modelo pro- ductivo intensivo, lo que implica mayores costos de Los genotipos evaluados en este trabajo difieren en alimentación y, en consecuencia, un mayor precio de relación a la estrategia genética utilizada para generar- venta del producto final. los y en su velocidad de crecimiento, lo cual dado el esquema simplificado de alimentación propuesto, po- Por último, y en relación a la proporción de cor- dría derivar en interacciones genotipo x manejo de la tes valiosos y de rendimiento a la faena, los valores alimentación. La caracterización del patrón de creci- observados son los esperados en este tipo de aves de crecimiento más lento. Considerando la propuesta de