ปฏิบัติการที่ 3 การศึกษาโครงสร้างของราก-ลำต้น-และใบพืช

1 ปฏบิ ตั ิการท่ี 3 เรอื่ งการศึกษาโครงสรา้ งของราก ลำตน้ และใบพืช รายวิชา ปฏิบัตกิ ารทางชีววิทยา ผูส้ อน คณุ ครวู ารณุ ี ไชยรงศรี ชื่อ – สกุล.................................................................................... เลขที่.................ห้อง...................... ผลการเรยี นรู้ สามารถทำสไลดเ์ พื่อศึกษาโครงสรา้ งของราก ลำต้น ใบพชื และเปรียบเทยี บโครงสร้างดงั กล่าวของ พชื ใบเลี้ยงคแู่ ละพืชใบเลยี้ งเดี่ยวได้ วตั ถุประสงค์ 1. นกั เรยี นสามารถทำสไลด์สดของราก และลำตน้ พืชได้ 2. นักเรยี นสามารถใช้งานกล้องจลุ ทรรศน์ไดอ้ ย่างถูกต้อง 3. นักเรียนสามารถบอกความแตกต่างของโครงสร้างราก และลำตน้ ของพชื ใบเลย้ี งค่แู ละพืชใบเลีย้ งเด่ียวได้ เนือ้ เยอื่ พชื (Plant tissue) เน้อื เย่ือพชื คือ กลุ่มของเซลล์พืชชนิดเดยี วกันหรอื ต่างชนิดกันทีม่ าทำงานรว่ มกันภายใต้โครงสรา้ งหรอื อวัยวะต่างๆ ของพชื เช่น ราก ลำต้น ใบ เน้ือเย่ือพชื สามารถแบ่งเป็น 2 ประเภทใหญ่ๆ คือ เน้ือเยือ่ เจรญิ (meristematic tissue) และ เน้อื เย่อื ถาวร (permanent tissue) โครงสรา้ งภายในของรากพชื รากของพืชมหี นา้ ทีส่ ำคญั คอื ยดึ ลำต้นให้ตดิ อยู่กับพื้นดิน ทำหน้าทีด่ ูดซึมนำ้ และแร่ธาตุ ๆ จากดิน สง่ ไปยงั ส่วนต่าง ๆ ของลำตน้ รากของพชื บางชนิดทำหนา้ ท่สี ะสมอาหาร รากเช่นนจ้ี ะมีลักษณะเป็นหวั เช่น หวั ไชเทา้ แครอท มันเทศ มันแกว ต้อยตง่ิ กระชาย ถว่ั พู เป็นตน้ รากพชื บางชนดิ มีสีเขยี ว จึงสงั เคราะห์ด้วยแสงได้ เชน่ รากกลว้ ยไม้ รากบางชนิดทำหน้าทคี่ ้ำจนุ (Prop root) เช่นไทรย้อย เตย ลำเจียก โกงกาง รากบางชนิดทำหน้าที่ เกาะ (Climbing root) เชน่ รากพลู พลูด่าง พรกิ ไทย กลว้ ยไม้ เปน็ ตน้ เนอ้ื เยอื่ ของรากพชื ใบเลีย้ งคแู่ ละใบเลยี้ งเด่ยี ว เม่ือตัดตามขวางแลว้ นำไปสอ่ งดูดว้ ยกล้องจลุ ทรรศน์ พบวา่ มี การเรียงตัวของเน้อื เยอ่ื เป็นช้ัน ๆ เรยี งจากด้านนอกเข้าสดู่ า้ นใน ดงั นี้ 2.1. เอพเิ ดอร์มิส (Epidermis) เปน็ เนื้อเยื่อที่อยูช่ ้ันนอกสุดมกี ารเรยี งตวั ของเซลล์เพียงช้นั เดียว แต่เรียงชิดกัน เซลลม์ ผี นังบางไม่มคี ลอโรพลาสต์ มแี วคิวโอลขนาดใหญ่ บางเซลลเ์ ปลย่ี นไปเปน็ เซลล์ขนราก เอพิเดอร์มสิ มีหน้าที่ ปอ้ งกนั อันตรายให้แก่เนื้อเยอ่ื ทีอ่ ยู่ภายในขนรากของเอพิเดอรม์ ิส ชว่ ยดดู น้ำและแรธ่ าตุ และปอ้ งกันไมใ่ ห้นำ้ เขา้ ราก มากเกนิ ไป 2.2 คอร์เทกซ์ (Cortex) อยู่ระหว่างช้นั เอพเิ ดอร์มสิ และสตลี เนอ้ื เยอ่ื สว่ นนี้ประกอบด้วยเซลล์ พาเรงคิมา เปน็ ส่วนใหญ่ เซลล์เหลา่ น้ีมผี นงั บางอ่อนน่มุ อมนำ้ ได้ดีเซลลพ์ าเรงคมิ า ทำหน้าท่สี ะสมน้ำและอาหารประเภท คารโ์ บไฮเดรต ช้ันในสดุ ของคอรเ์ ทกซ์ คอื เอนโดเดอร์มสิ

2 2.3 เอนโดเดอรม์ สิ (Endodermis) เปน็ เซลลแ์ ถวเดยี วกันเหมอื นกบั เอพิเดอรม์ ิส เอนโดเดอร์มสิ จะเหน็ ไดช้ ดั เจน ในรากของพชื ใบเล้ียงเดย่ี ว เซลลช์ น้ั น้เี มอื่ มีอายุมากขน้ึ จะมีสารซูเบอลิน (Suberin) หรือ ลกิ นนิ (Lignin) มาเคลือบ ทำใหผ้ นงั หนาข้นึ ทำใหเ้ ปน็ แถบหรือปลอกอยู่ เซลล์แถบหนาดังกล่าว เรยี กว่าแคสพาเรียนสตรปิ (Casparian strip) 2.4 สตลี (Stele) เป็นชั้นท่ีอยู่ถัดจากชัน้ เอนโดเดอรม์ สิ เขา้ ไปในราก สตลี จะแคบกว่า คอร์เทกซ์ สตีล ประกอบด้วยช้ันต่าง ๆ คือ 2.4.1 เพรไิ ซเคิล (Pericycle) ประกอบด้วยเซลล์ พาเรงคมิ า เปน็ สว่ นใหญ่ เซลล์เรียงตัวแถวเดยี ว แต่อาจ มมี ากกวา่ แถวเดยี วก็ได้ ช้นั น้ีอยดู่ า้ นนอกสดุ ของสตีล เพริไซเคลิ พบเฉพาะในรากเท่านน้ั และเห็นชดั เจนในรากพชื ใบเล้ยี งค่เู พริไซเคลิ 2.4.2 มัดท่อลำเลียงหรือวาสควิ ลาร์บนั เดิล (Vascular bundle) ประกอบดว้ ยไซเลม และโฟลเอ็ม ในรากพชื ใบเลยี้ งคู่จะเห็นการเรียงตัวของไซเลมทอ่ี ยใู่ จกลางราก เรยี งเปน็ แฉก (Arch) ชัดเจนและมโี ฟลเอ็มอยู่ ระหว่างแฉกนั้น แฉกทเ่ี หน็ มจี ำนวน 1-6 แฉก แต่โดยทัว่ ไปพบเพียง 4 แฉก สำหรบั รากพชื ใบเลี้ยงเดี่ยวไซเลมมไิ ด้ เข้าไปอย่ใู จกลางราก แต่ยังเรียงตัวเปน็ แฉกและมีโฟลเอ็มแทรกอยู่ระหวา่ งแฉกเช่นเดยี วกัน จำนวนแฉกของไซเลม ในรากพืชใบเลีย้ งเดย่ี วมีมากกวา่ ในรากพืชใบเลี้ยงคู่รากพชื ใบเลยี้ งคู่ยงั มี วาสคิวลาร์ แคมเบยี ม (Vascular cambium) 2.4.3 พิธ (Pith) เปน็ ส่วนใจกลางของราก หรืออาจเรียกว่า ไส้ในของราก ประกอบดว้ ยเซลล์ พาเรงคมิ า ในพชื ใบเลย้ี งเด่ยี วจะเห็นสว่ นนี้ไดอ้ ย่างชดั เจนส่วนในรากพืชใบเลี้ยงคู่ ใจกลางของรากจะเปน็ ไซเลม

3 โครงสรา้ งภายในของลำตน้ พืช ลำต้นพืชใบเลย้ี งคู่ เมือ่ ตัดลำตน้ ของพชื ใบเล้ียงคู่ทยี่ งั อ่อนอยตู่ ามขวาง แลว้ นำมาศึกษาจะพบลักษณะการเรียงตวั ของลำตน้ และรากคล้ายกันและลำต้นมีการเรยี งตัว ดงั น้ี 1) เอพเิ ดอร์มิส ( Epidermis ) อย่ชู ้นั นอกสดุ ปกตเิ ป็นเซลล์เรียงตวั ชั้นเดยี ว ไมม่ ีคลอโรฟิลล์ อาจเปลย่ี นแปลงไป เปน็ ขน หนาม หรอื เซลลค์ ุม ( Guard Cell ) ผวิ ด้านนอกของเอพิดอรม์ ิสมักมสี ารพวกคิวทิน เคลือบอยูเ่ พื่อปอ้ งกนั การระเหยของนำ้ 2) คอร์เทกซ์ ( Cortex ) มีอาณาเขตแคบกว่าในราก สว่ นน้ีสว่ นใหญ่เปน็ เซลล์พาเรงคิมาเรียงตวั กนั หลายช้นั เซลล์ พวกนม้ี ักมีสีเขียวและสังเคราะหด์ ว้ ยแสงไดด้ ้วย นอกจากนี้ยงั ชว่ ยสะสมน้ำและอาหารให้แกพ่ ชื 3) สตลี ( Stele ) ในลำตน้ ฃั้นสองของสตีลจะแคบมากและแบง่ ออกจากช้ันของคอร์เทกซไ์ ดไ้ มช่ ดั เจนนกั และ แตกต่างจากในราก ประกอบดว้ ย 3.1 มัดทอ่ ลำเลียง อยเู่ ปน็ กลุ่มๆ ด้านในเปน็ ไซเลม ด้านนอกเปน็ โฟลเอ็มเรยี งตวั ในแนวรัศมเี ดยี วกนั 3.2 วาสคิวลาร์เรย์ เป็นเนอื้ เยอ่ื พาเรงคมิ าท่ีอยรู่ ะหว่างมดั ท่อลำเลียง เชือ่ มต่อระหวา่ งคอร์เทกซ์และพิธ 3.3 พธิ อยูช่ นั้ ในสุดเปน็ ไส้ในของลำตน้ ประกอบดว้ ยเน้ือเยื่อพาเรงคมิ า ทำหน้าที่สะสมแป้งหรือสารตา่ งๆ เชน่ ผลึกแทนนนิ ( Tannin ) พิธที่แทรกอย่ใู นมัดท่อลำเลียงจะดูดคล้ายรัศมี เรียกวา่ พิธเรย์ ( Pith Ray ) ทำหน้าที่ สะสมอาหาร ชว่ ยลำเลยี งน้ำ เกลอื แร่ และอาหารไปทางดา้ นขา้ งของลำตน้ ลำตน้ พืชใบเลีย้ งเดี่ยว ลำตน้ พืชใบเล้ยี งเดย่ี วสว่ นใหญม่ ีการเจรญิ เตบิ โตข้นั ต้น ( Primary Growth ) เท่าน้ัน มชี ั้นตา่ งๆ เช่นเดียวกบั พืชใบเลี้ยงค่ตู ่างกันท่มี ดั ท่อลำเลียงรวมกนั เป็นกลุม่ ๆประกอบด้วยเซลลค์ ่อนขา้ งกลมขนาดใหญ่ 2 เซลล์ ซึ่งได้แก่ เซลล์ดา้ นลา่ งคือ ไซเลมและเซลล์เลก็ ๆ ดา้ นบนคอื โฟลเอม็ มัดทอ่ ลำเลยี งของพืชใบเลย้ี งเดย่ี วจะกระจาย ทุกส่วนของลำต้น แตม่ ักอยรู่ อบนอกมากว่ารอบในและมัดทอ่ ลำเลียงไมม่ ีเน้ือเย่ือเจรญิ ด้านขา้ งหรอื แคมเบยี มคัน่ อยู่

4 โครงสรา้ งภายในของใบ ใบ คือ อวยั วะของพชื ท่ีเจริญจากข้อทางด้านขา้ งของลำต้นพืช ซ่ึงอาจอยตู่ ดิ กบั ลำตน้ หรือกง่ิ เพ่ือทำหนา้ ที่ ในการสร้างอาหาร ภายในเซลลข์ องใบจะมคี ลอโรฟลิ ลท์ ำหนา้ ทดี่ ดู รบั พลังงานแสงมาใชใ้ นการสงั เคราะหด์ ว้ ยแสง สว่ นใบพิเศษ เป็นใบท่ีเปลยี่ นแปลงไปทำหน้าท่พี ิเศษ นอกจากการทำหนา้ ท่สี งั เคราะห์ด้วยแสงเพ่อื สร้างอาหาร หายใจ และการคายนำ้ สว่ นต่างๆ ของใบเมื่อตัดตามขวา และนำมาส่องดูดว้ ยกล้องจุลทรรศน์พบวา่ ประกอบดว้ ยชั้นต่างๆ 3 ชั้นคือ 1. เอพเิ ดอร์มสิ (Epidermis) เป็นเยอ่ื ห้มุ ใบท่มี ีอยู่ท้ังด้านบนและดา้ นลา่ งของใบประกอบดว้ ยเซลล์แถวเดยี ว และ รปู ร่างสเ่ี หลยี่ มผนื ผ้าเหมือนในลำต้นเป็นเซลล์ท่ีไม่มคี ลอโรพลาสต์ มีควิ ทินเคลอื บท่ดี ้านนอกของผนังเซลลป์ อ้ งกัน การระเหยของนำ้ ออกจาก เอพเิ ดอร์มสิ บางเซลลม์ ีการเปลยี่ นแปลงไปเปน็ เซลลค์ ุม(Guard cell) อยู่กันเป็นคู่ ๆ มี รูปร่างคล้ายเมลด็ ถั่ว หรอื คล้ายไต เซลล์คุม 2 เซลล์จะหนั ดา้ นเวา้ และมีความหนามากกว่ามาประกบกันทำใหเ้ กิด ชอ่ งว่าง เรียกว่า ปากใบหรือรูใบ(Stomata) 2. มีโซฟิลล์ (Mesophyll) อาจเรียกวา่ เป็นส่วนของเนือ้ ใบ หมายถึงส่วนของเน้อื เยื่อท่ีอยรู่ ะหวา่ ง เอพิเดอร์มิส ด้านบน และเอพิเดอรม์ ิส มโี ซฟิลล์แบง่ ออกเป็นสองชัน้ คือ 1) แพลิเซดมีโซฟิลล์ (Palisade mesophyll) เป็นช้นั ท่ีอยใู่ ต้เอพเิ ดอร์มสิ ดา้ นบนเข้ามาในเนอ้ื ใบ ประกอบด้วยเซลลย์ าว และแคบเรียงตง้ั ฉากกบั เอพิเดอรม์ ิส ดา้ นบน (ลกั ษณะคลา้ ยเสาร้ัว) เซลล์เรยี งกนั เปน็ แถวอัด แนน่ อาจจัดตัวเรียงเป็นแถวเดียวหรือหลายแถวข้นึ อยู่กับชนิดของพืช ภายในเซลล์เหลา่ นม้ี ี คลอโรพลาสต์อยู่กนั อย่างหนาแน่นเต็มไปหมด 2) สปันจีมีโซฟิลล์ (Spongy mesophyll) เปน็ ช้ันท่ีอยู่ถัดจากแพลิเซดมโี ซฟิลล์ เข้าไปอีกจนถึง เอพเิ ดอร์มสิ ดา้ นลา่ ง เป็นเซลลท์ ี่อยูก่ ันอย่างหลวม ๆไม่เปน็ ระเบยี บ เซลล์มรี ปู รา่ งค่อนข้างกลม มชี อ่ งว่างระหว่าง เซลล์มาก ผวิ เซลล์จึงมโี อกาสสัมผสั กับอากาศได้มาก ทำให้แกส๊ ตา่ ง ๆ แพร่เขา้ ออกไดส้ ะดวก ในแต่ละเซลลม์ ี ปริมาณ คลอโรพลาสต์ น้อยกวา่ เซลล์ในชัน้ แพลเิ ซดมีโซฟิลล์จงึ ทำใหด้ า้ นลา่ งของใบมสี เี ขยี วน้อยกวา่ ด้านบนของใบ

5 3. มัดท่อลำเลยี ง (Vascular bundle) คือส่วนของเสน้ ใบขนาดต่าง ๆกันท่ีอย่ภู ายในเนื้อใบนนั่ เอง มดั ท่อลำเลยี ง ประกอบดว้ ย ไซเลม และโฟลเอ็มมาเรียงติดต่อกนั เปน็ เสน้ ใบ มดั ท่อลำเลียงมกี ลุม่ เซลลท์ เี่ รียกวา่ บนั เดิลชที (Bundle sheath)ลอ้ มรอบ จึงทำให้มัดท่อลำเลยี งมีความแข็งแรงเพมิ่ ขึ้น บันเดิลชที ตอนที่ 1 โครงสรา้ งของราก ลำต้น วสั ดุ และอปุ กรณ์ 1. กล้องจลุ ทรรศน์ 2. สยี ้อมซาฟรานิน หรือสผี สมอาหารสีแดง 3. พชื ศกึ ษาท้งั พชื ใบเลีย้ งคแู่ ละพชื ใบเล้ยี งเด่ียว เชน่ ลำตน้ หมอนอ้ ย ลำต้นหญา้ รากถั่ว รากพทุ ธรกั ษา รากหญ้า 4. ใบมีดโกน 5. จานเพาะเชือ้ และนำ้ 6. เขม็ เขีย่ ปลายแหลม หรือพกู่ นั 7. สไลด์ และกระจกปิดสไลด์ 8. หลอดหยดสาร 9. กระดาษทชิ ชู

6 วธิ ีการทดลอง 1. นำโครงสรา้ งของพชื ทต่ี ้องการศกึ ษา (ราก หรือลำต้น) มาลา้ งให้สะอาด 2. นำชิ้นส่วนของราก และลำตน้ พืชมาตดั ตามขวางดว้ ยใบมีดโกน เรยี กวิธีน้วี ่า Free hand section โดยถือชิ้นสว่ นของ ราก หรือลำตน้ พชื ไว้ระหวา่ งนวิ้ ชแี้ ละนิ้วหัวแมม่ อื ข้างซ้ายจากนั้นใชใ้ บมีดโกนแตะนำ้ ให้เปียกชุม่ เพอ่ื ลดความฝืดเวลาเฉือน จากน้ันใชใ้ บมดี โกนเฉือนลำต้น หรอื รากพืช เข้าหาตวั เอง ให้ได้ช้ินบางๆ หลายๆ ชนิ้ แล้วนำใบมีดโกนไปจุ่มลงลงในน้ำ 3. ใชพ้ กู่ นั เลือกชิน้ ส่วนของเนื้อเยอ่ื พชื ทล่ี อยน้ำมสี ีเขยี วอ่อนๆ (ย่ิงใสยง่ิ ดี) วางลงบนแผ่นสไลด์ หยดน้ำ เลก็ น้อย เพ่ือไมใ่ หแ้ ห้ง นำไปส่องดูดว้ ยกล้องจุลทรรศนด์ ว้ ยเลนสว์ ตั ถกุ ำลังขยายตำ่ สดุ เลอื กชิ้นส่วนที่มคี วามบาง สม่ำเสมอ ไม่มรี อยเฉือน เห็นเน้อื เย่ือต่างๆ ชดั เจน 4. จากนนั้ นำมายอ้ มดว้ ยสี Safranin O ประมาณ 20 -30 วินาที จงึ ลา้ งสอี อกโดยหยดน้ำลงบนชิ้นเนอื้ เยอ่ื พืชแลว้ ใชก้ ระดาษทิชชูซับออก หรือใช้พู่กนั เข่ียมาล้างในนำ้ กลั่นในจานเพาะเชื้อ จนไม่มสี ีละลายออกมา 5. หยดน้ำเลก็ นอ้ ย ปดิ ด้วยกระจกปดิ สไลด์ ระวังอย่าให้มีฟองอากาศ โดยเอียงกระจกปิดสไลด์ ใหข้ อบอกี ด้านหนึง่ ของกระจกปดิ สไลด์ แตะกับหยดนำ้ ประมาณ 45 องศา ขอบอกี ด้านหน่งึ ของกระจกปดิ สไลด์วางพาดบน เข็มเข่ียปลายแหลม ค่อยๆ ลดระดับของเขม็ เขีย่ ลงมาพร้อมๆ กับค่อยๆ เล่ือนปลายเขม็ เขีย่ ออกจากกระจกปดิ สไลด์ จนกระจกปิดสไลดป์ ิดแนบสนิทกับแผ่นสไลด์พอดี ใช้ทชิ ชูซบั น้ำและสยี ้อมใหเ้ รยี บร้อย และเช็ดดา้ นล่างแผน่ สไลด์ ใหแ้ ห้ง 6. นำแผ่นสไลด์ทเ่ี ตรียมได้ ไปตรวจดูด้วยกล้องจลุ ทรรศน์ โดยเริ่มตน้ ดดู ว้ ยที่ เลนส์ใกล้วตั ถุกำลังขยาย ตำ่ สุด ไปจนถึง 40 x 7. เปรยี บเทียบความแตกต่างโครงสร้างรากของพชื ใบเล้ยี งคู่และพชื ใบเล้ียงเดยี่ ว

7 บันทึกผลการทดลอง รากพืชใบเลี้ยงคู่ รากพืชใบเลย้ี งเดี่ยว ชื่อพชื .................................. กำลงั ขยาย........................ ชอ่ื พืช.................................. กำลงั ขยาย........................ ลำตน้ พชื ใบเลย้ี งคู่ ลำตน้ พชื ใบเล้ียงเด่ียว ชื่อพืช.................................. กำลังขยาย........................ ชอื่ พืช.................................. กำลงั ขยาย........................

8 สรปุ ผลการทดลอง ............................................................................................................................. .......................................................... ....................................................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................................................. .......................... ........................................................................................................ ............................................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ตอนท่ี 2 โครงสร้างของใบ วธิ ีการทดลอง ใชว้ ัสดุอุปกรณ์ และมีขัน้ ตอนการทำสไลดป์ ฏบิ ตั ิเชน่ เดยี วกับราก และลำตน้ แต่ในขนั้ ตอนการตดั เนื้อเยอ่ื มี 2 วธิ ี ได้แก่ 1) มว้ นใบพืชเข้าหากนั แล้วตดั แบบ Free hand section 2) ตัดใบพชื เป็นชิน้ เลก็ ๆ แล้วนำไปแทรกในแครอทที่หั่นเปน็ แท่งสีเหล่ยี มผืนผ้าขนาดตามท่ีตอ้ งการ กอ่ นจะตดั เน้ือเย่ือผา่ นชนิ้ แครอท บนั ทึกผลการทดลอง ใบพืชใบเล้ียงเดี่ยว ใบพชื ใบเลย้ี งคู่ ชอ่ื พชื .................................. กำลงั ขยาย........................ ชอื่ พืช.................................. กำลงั ขยาย........................

9 สรุปผลการทดลอง ............................................................................................................................. .......................................................... ....................................................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................................................. .......................... ........................................................................................................ ............................................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ....................................................................................................................................................................................... คำถามทา้ ยกจิ กรรม 1. รากพืชใบเลยี้ งคู่และพืชใบเล้ยี งเดยี่ วมคี วามแตกตา่ งกันอย่างไร ....................................................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ................................................................................................................................................... .................................... .............................................................................................. ......................................................................................... 2. ลำตน้ พืชใบเลยี้ งคู่และพืชใบเล้ยี งเดี่ยวมคี วามแตกตา่ งกันอยา่ งไร ............................................................................................................................. .......................................................... ....................................................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................................................. .......................... 3. ใบพืชใบเล้ยี งค่แู ละพืชใบเล้ียงเดย่ี วมคี วามแตกต่างกนั หรือไม่ อยา่ งไร ............................................................................................................................. .......................................................... ....................................................................................................................................................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................. .......................................................... ............................................................................................................................................................. ..........................