คู่มือการตรวจวินิจฉัยโรคหนองในทางห้องปฏิบัติการทางการแพทย์.

การทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุุลชีพี ของเชื้�อ้ N. gonorrhoeae การทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุุลชีีพของเชื้้�อ N. gonorrhoeae มีีการ ดำำ�เนินิ การหลายขั้�นตอน คืือ 1. การเตรีียมเชื้�้อ นำำ�เชื้ �อ N. gonorrhoeae ที่่�ได้้หลัังจากการวิินิิจฉััยหรืือที่่� subculture มาจาก Storage Stock ที่่จ� ะทดสอบความไวต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีพี มาเพาะเลี้ย� งบนอาหาร เลี้ย� งเชื้อ� ชนิดิ nonselective medium เช่่น chocolate agar โดยอบเพาะเลี้�ยงที่่� ท3ี่่6ไ� ด±้ม้1าoลCะใลนาย5ล-1ง0ใน%MCuOl2leหrรืือHicnatnodnlebrjaorthเป็เ็นทีเวยี ลบาค1วา8ม-2ขุ่4น� ชใั่่หว� ้ไ้โดม้ค้ง วจาามกนเัข้้้น�้ม ขน้้นำ�ำ เโทค่่าโกลับันี ี 0.5 McFarland No.1 หากวััดด้ว้ ยเครื่อ� ง spectrophotometer ที่่� 640 nm จะได้ค้ ่่า absorbance เท่่ากับั 0.15 2. สารต้า้ นจุุลชีีพ สารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่แ� นะนำ�ำ ให้ใ้ ช้ท้ ดสอบกับั เชื้อ� N. gonorrhoeae ตามเกณฑ์์ CLSI คือื - Penicillins ได้้แก่่ penicillin - Cephalosporins ได้แ้ ก่่ ceftriaxone และ cefixime - Tetracyclines ได้แ้ ก่่ tetracycline - Fluoroquinolones ได้แ้ ก่่ ciprofloxacin - Aminocyclitols ได้้แก่่ spectinomycin - Macrolide ได้้แก่่ azithromycin คู่ม�่ ืือการตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน 95 ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

3E.p วsิิธiีlีoกmารeทteดrสอteบsคtว(าEมtไeวsตt่อ่) สโดายรตว้ธิ้าีนEจุลุ teชีsีtพ เปนì วิธีทท่ี ำไดèงาõ ยกวาõ วธิ ี agar dilutio n มีีวิิธีีการทดสอบได้้ทั้้�งแบบกึ่่�งปริิมาณวิิเคราะห์์ เช่่น disk diffusion meth3o.1d. แแลบะบแกบึ่งบปปริมริามิ ณาณววิเิคเิ รคาระาหะ หเ์ช์ เõนช่่นdiasgkadrifdfuilusitoionnmmetehtohdodทแดลสอะบEโpดsยilometer test (E teใsชt)è โsดteยrวiิlธิeีี Eswtaebstจเปุõม็น็ ลวงิิธใีทีนี่่ท� ำsำ�uไsดp้้ง่eาnยsกiวo่่nาวิsิธoีี laugtaiorndi(lเuชtื้อio)nที่ปรับ ค3ว.1าม ขแุõนบบแกลึ่èว่ง� หปมริมิุนาsณwวิaเิ bครหาละาห์ย์ เๆช่่นครdั้งisเkพdื่อiใfหfuèเsชiื้อoซnึมmเขeèาtใhหoèทdั่วทแดตสะอบโดยใช้้ sterile swsawba จุb่่�มกลับงใผนิวดsèาuนspในeขnอsงioหnลอsoดlแuลtèวioหnมุน(เชใื้ห�อè)s ทwี่่�ปabรับั พคอวหามมาขุ่ด�นๆแลน้้วำมหามุุน swab หลายๆ ครัป้�ง=ายเพืเ่่ป�อìนให้3เ้ ชื้รอ� ะซึนึมาเบข้้าบใหน้ท้อั่่�วาหแาตระเลี้ยswงเaชbื้อ ชกันับิดผิวิGดC้า้ aนgใaนrขbอaงsหeล+อด1แ%ล้้วหมุนุ ให้้ swab พอหdมefาinดeๆd นำg�ำ rมowาปt้h้ายsเuป็pน็ pl3emระeนnาtบแ ลบèวนนอำาหdาisรkเลีว้�ยางงเบชื้นอ� ชผนิวิหดิ นGèาCขอaงgar base + 1% defiอnาeหdาgรrเoลwี้ยงtเhชsื้อu(pหpèาlมeทmิ้งeไวnèเtกแินล้ว้1น5ำ�ำ น dาiทskี) วถาèางใบชèจนาผินวิ เหพนา้า้ะขเชอื้องอขานหาาดรเลี้ย� งเชื้อ� เไไ(แหปมม่ล่้็่่้็คคน้า้วมววเแวรรทปิล้วว้�งลาาาไผงงว้2ลiเชเเ้เndสพวd0กตนhิèนiลาi-sิานsิดi2ะผkbามk4เõาiเ(ชt1เน2 กรเiกชื้อoก5ัิ0ูศป่ิณิน่ขnนิ-�วูนท2ฑนนโ9ย์z่ี 4มา4ข์า5oกดงชทอ.nชลี1เชนงี)สeาัิ่แ1วน ิดงèนิถC)ลโแิด ้ผ1มL ะแล(้าร0ถõาSูงนใèวลู้ปำน0ชIแำè�า้้วแศท้จ(ปีใมmน่ต่ชลูน�าล้าำา5จ้mนะยผวไร.ัากน1ปัเดลานคพไล1ตง่ำม่iเาาท)าnมีาพ่õคง่ะมc�แเาาว5สเเu1ล้วชะรกื้.้น้b52ว้วัเดณ�อชผ0aืน)า่้คข่ำฑ�อtงาำ�meนõ านขขไdปเานอทmศiูสsูดงานี่ kiè นเnด3ไยCสเม์6ผc้เก์กLส้นõ±คuõ้าSินลน้ ผว1bI่นา่รผ°4าa่(งCศ่ตวานtขชาูาeนนศ5องนูร ูศย%ทูนางีิดูd่นง่กย� iท์iยsถ3Cลn์ก์kี่ èก์า6Oาh5ลใ±ลเง.ช2iาก2bา1ขเèจงิน)งปi°อาtCiìนน19oง1055n0%0zmmoCnOmme2 แรููป1รลูป0ะที0่ท�่ 15่ีm55.10.m111m รแููรmลปปู ะแแบ1บบ5บ0กกาาmรรวmวาางง ddiisskk บบนนจจาานนเพเพาาะะเชเชืือ้้�อขขนนาดาดเสเนèส้ผน้ าõผ่น่าศนูนศููยนกยล์์กาลงาง 100 mm 97 96 คู่�ม่ ือื การตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้้องปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

เพาะเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิด GC agar base + 1% defined growth supplement เชõนเดียวกับวิธี disk diffusion method เ พาะเลี้ย�3ง.2บ นอแาบดแหบลèาานèวปรนเหรลิีำ้ิมนย� แาึง่งผณเเชõนืคว้อ�ิลEชิเือคนtบิรeดิ าไ sวGะtèดหCท์èว์ี่มaยโgีคดสaุณยาrรวสbิติธมaีèาีบsนEeัตจิไ+tุมลe1õดชs%ูดีพtซทdทับี่มeดนีคfสi้ำnวขอาeนบมdาโเดgขดrèมยo5กข×wèาน5tร0hลใดชsm้ลu้เชmืpง้ �ออpยแโlดeõาลmยงะกeาnรt เช่่นเดียี วกับั วิธิ ีี ตdõอisเkนdื่อiงffจuาsกioคnวาmมเeขtèมhขoèนdมแาลก้ว้ ไนปำ�ำ หแาผ่น่นèอEย tอeีกsดt ทèาี่่นม� ีหคี ุนณุ ึ่งสมมีตบัวัตั เิลไิ มข่่แดูลูดะซับั น้ำ��ำ ขนาด 5×50 mสเmกลโบดอยกด้ค้าõานคหวนึา่่�งมเคเขลืèมือขบèนไวข้้ดอ้้วงยสสาารรตต้èา้านนจจุุลุลชชีีพีพทที่่�ีม่ตีีคำวแาหมนเขõง้้มตขõา้้งนๆลดลง อย่่างต่่อเนื่่�องจ(าcกoคnวtiาnมuเoข้u้มsข้c้นoมnาcกeไnปtหraาtนio้้อnยg rอaีีกdดi้e้าnนt)หวนึ่า่�งงมบีีตนััวผเิวลหขนแèาลขะอสงเอกาลหบาอร กค่่า ความเข้้มข้้นขอเพงาสะาเรชตอ้ื ้้า(นรูปจุทุลี่ช5ีีพ.1ท2ี่่)�ตำหำ�èาแมหทน่้งิ ่ไงวต่เè่กางนิ ๆ15(cนoาnทtี iแnลuวè oนuำsไปอcoบnเพcาeะnเลtยี้raงtion gradient) วางทบี่น3ผ6ิิว±ห1°นC้้าข5อ%งอCาOห2าเรปเìนพเาวะลเาชื้�อ20(-ร2ููป4ทีช่่� ั่ว5โ.ม1ง2)แ ลห้ะ้าอมõาทนิ้้�งคไõาว้้เMกิินIC 1จ5ากนาทีี แจลา้กว้ จนุำุำ�ดไคปวอาบมเเพข้จหา้มุดยะขคดเ้ล้นีว้ย�านำ้ ้มง้อแทเี่ขย่ล� èม3ทวè ี่6ขแ่�ส±èนปุุดน1ทลี่°ผèอ่C�แลยตทบ5า%ี่สคมุดทเีทCกีเรี่แณOีียบ2ฑไคเขมป่ท่อ็สน็ีเงราเียวมCไลLามาSรõสIถ2า(เม0ตจรา-า2ิรริญ4ถาง เไชจัท่ด่้รว� ่ี้ติญ5โมร.ไ2งงด)ปèตแลรลงาะปยอ่ล่ราููาปนยหคร่่ายูปดMน้ำICำ�� แล้้วแปลผลตามเกณฑ์์ของ CLSI (ตารางที่่� 5.2) รูปู ที่�่ 15ร5.ูป10ท2m่ี ร5ููป.m1แ2บรบูปกแาบรบวากงารEวtาeงsEt tบeนsจtาบนนเพจาานะเเพชื้อ�าะขเนชา้ือดขเนส้าน้ ดผเ่่สาèนนผศููõานนย์ศก์ ูนลยากงล1า0ง0 mm และ 100 mm และ 150 mm 3.3. แบบปริมิ าณวิเิ คราะห์์ โดยวิธิ ีี agar dilution method วิธิ ีนีี้้เ� ป็น็ วิธิ ีมี าตรฐาน อ้า้ งอิงิ (reference method) ทดสอบโดยการเตรียี มอาหารเลี้ย� งเชื้อ� ที่่ม� ีสี ารต้า้ น9จ8ุลุ ชีพี ที่่ต� ้อ้ งการทดสอบในความเข้ม้ ข้น้ ต่่างๆ จากนั้้น� นำ�ำ เชื้อ� N. gonorrhoeae ที่่เ� ตรียี มไว้ม้ า ใส่่ในหลุุมๆ ละ 500 µl จากนั้้�นนำำ� multipoint inoculator แตะเชื้�อในหลุุมแล้้ว นำ�ำ ไปแตะบนผิวิ อาหารเลี้ย� งเชื้อ� ปลายของ multipoint inoculators จะถ่่ายโอนเชื้อ� มา ได้้ประมาณ 1 µl ทำำ�ให้้ได้้เชื้อ� ในแต่่ละจุุดประมาณ 104-105 CFU การเพาะเชื้�อนี้้ค� วร คู่ม่� ืือการตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน 97 ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

เริ่�มจากเพาะเชื้ �อในจานอาหารที่่�ไม่่มีีสารต้้านจุุลชีีพก่่อน เพื่่�อตรวจสอบความมีีชีีวิิต (viability) และความบริิสุุทธิ์� (pure culture) ของเชื้ �อที่่�ทดสอบ ตามด้้วยอาหาร เพาะเชื้ �อที่่�มีีสารต้้านจุุลชีีพเข้้มข้้นน้้อยที่่�สุุดไปยัังจานเพาะเชื้ �อที่่�มีีสารต้้านจุุลชีีพ เข้ม้ ข้น้ สููงขึ้น�้ ตามลำ�ำ ดับั แล้ว้ นำ�ำ ไปแล้ว้ นำ�ำ ไปอบเพาะเลี้ย� งที่่� 36±1°C 5% CO2 เป็น็ เวลา 20-24 ชั่่�วโมง และอ่่านค่่าความเข้้มข้้นของสารต้้านจุุลชีีพน้้อยที่่�สุุดที่่�แบคทีีเรีียไม่่ เจริิญเป็น็ ค่่า MIC แล้ว้ แปลผลตามเกณฑ์ข์ อง CLSI (ตารางที่่� 5.2) ตารางที่�่ 5.2 ตารางแปลผลการทดสอบความไวต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีพี ของเชื้อ� N. gonorrhoeae (CLSI guideline 2019 M100) Antimicrobial Disk Interpretive Interpretive Agent Content Categories and Zone Categories and MIC Breakpoints, µg/ml Diameter Break- points, nearest whole mm S I RS I R Penicillin 10 units ≥47 27-46 ≤26 ≤0.06 0.12-1 ≥2 Tetracycline 30 µg ≥38 31-37 ≤30 ≤0.25 0.5-1 ≥2 Spectinomycin 100 µg ≥18 15-17 ≤14 ≤32 64 ≥128 Ceftriaxone* 30 µg ≥35 - - ≤0.25 - - Cefixime* 5 µg ≥31 - - ≤0.25 - - Ciprofloxacin 5 µg ≥41 28-40 ≤27 ≤0.06 0.12- ≥1 0.5 Azithromycin** - - - - ≤1 - - 98 คู่่�มืือการตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิิบัตั ิิการทางการแพทย์์

หมายเหตุุ : *Ceftriaxone และ cefixime เป็็นยาที่่�พบการดื้ �อยาน้้อยมาก หากทดสอบ disk diffution แล้ว้ พบว่่าได้้ขนาด zone ของยา ceftriaxone และ cefixime น้้อยกว่่า 35 และ 31 ตามลำ�ำ ดับั หรือื ค่่า MIC มากกว่่า 0.25 ให้ต้ รวจซ้ำ��ำ ถ้า้ เหมือื นเดิมิ ให้ร้ ายงานเป็น็ Nonsusceptible (NS) แล้้วส่่งเชื้ �อมาเก็็บไว้้ยัังส่่วนกลาง เพื่่�อทำำ�การตรวจสอบ/ วิิจััยต่่อไป (ทั้้�งนี้้�ในประเทศไทยยัังไม่่เคยพบการรายงานการเริ่�มดื้�อยา “NS” ของยา ดัังกล่่าวมาก่่อน) **Azithromycin ใช้้แปลผลเมื่อ� ขนาดยาที่่ใ� ช้้รัักษาคืือ 1 g และรัักษาร่่วมกัับยาตัวั อื่�น เช่่น ceftriaxone 4. การควบคุุมคุุณภาพการทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุุลชีีพ การควบคุุมคุุณภาพในการผลิิตอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อ GC agar base +1% defined growth supplement และการทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุลุ ชีพี จะใช้เ้ ชื้อ� สายพัันธุ์ � มาตรฐาน ดัังภาคผนวก 5. การรายงานผลการทดสอบความไวต่่อสารต้า้ นจุุลชีีพ เมื่ �อแปลผลการทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุุลชีีพชนิิดต่่างๆ แล้ว้ สามารถ รายงานผลการทดสอบสารต้้านจุลุ ชีีพแต่่ละชนิดิ ได้้ ดังั นี้้� 5.1 การแปลและรายงานผลต่่อยากลุ่�ม quinolone การดื้ �อยากลุ่่�ม quinolone เช่่น ciprofloxacin นั้้�นมัักดื้้�อยาโดยยีีนที่่� อยู่บ� นโครโมโซม ซึ่่ง� สามารถทดสอบได้โ้ ดยการวาง disk เพื่่อ� หา resistant strain หรือื quinolone-resistant N. gonorrhoeae (QRNG) ได้โ้ ดยอาจจะไม่่ต้อ้ งทดสอบหาค่่า MIC แปลผลการทดสอบดัังแสดง คู่�่มือื การตรวจวิินิิจฉััยโรคหนองใน 99 ทางห้อ้ งปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

Ciprofloxacin (Disk) ขนาด zone ขนาด zone ขนาด zone ≥ 41 mm 28–40 mm ≤ 27 mm รายงานผล (S) รายงานผล (I) รายงานผล (R) หรอื QRNG* Strain รููปที่่� 5.13 ผัังการแปลผลการทดสอบความไวต่่อยา ciprofloxacin ของเชื้้�อ N. gonorrhoeae ชนิดิ disk 5.2 การแปลและรายงานผลต่่อยา penicillin กลไกการดื้อ� ยา penicillin ของเชื้อ� N. gonorrhoeae นั้้น� พบเป็น็ การดื้อ� ยา โดยยีนี ที่่อ� ยู่บ� นพลาสมิดิ หรือื ที่่เ� รียี กกันั ว่่า penicillinase producing N. gonorrhoeae (PPNG strain) ซึ่่�งหากเชื้้�อมีียีีนดื้้�อยานี้้�อยู่ �บนพลาสมิิดจะสามารถผลิิตเอนไซม์์ ß-lactamase ทำ�ำ ลายโครงสร้า้ งของยา penicillin ทำ�ำ ให้้ยา Penicillin ไม่่สามารถ ฆ่า่ เชื้�อได้ ้ การตรวจเอนไซม์น์ ี้้�ทำำ�ได้้ง่ายโดยทดสอบกัับ BCP reagent หรือื nitrocefin test โดย BCP reagent มีสี ่่วนผสมของยา penicillin อยู่� หากเชื้อ� สามารถผลิติ เอนไซม์์ มาทำำ�ลายโครงสร้้างของยา penicillin ได้้ จะทำำ�ให้้เกิิดกรด เปลี่ �ยนสีี indicator ทำำ�ให้ก้ ลายเป็็นสีีเหลือื ง 100 คู่�ม่ ือื การตรวจวิินิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้้องปฏิิบัตั ิิการทางการแพทย์์

ในกรณีีทีผี ลการทดสอบ ß-lactamase positive - ให้้รายงานเป็็น resistance ชนิิด PPNG (penicillinase producing N. gonorrhoeae) ดื้้อ� ยา penicillin โดยมียี ีีนอยู่�บนพลาสมิดิ ในกรณีีทีีผลการทดสอบ ß-lactamase negative ให้น้ ำ�ำ มาทดสอบการดื้�อยา ต่่อด้ว้ ย penicillin disk diffusion เพื่่�อตรวจว่่า เชื้อ� non penicillinase producing N. gonorrhoeae (non PPNG) ให้ผ้ ลการทดสอบต่่อยา penicillin ซึ่่ง� แปลผลเป็น็ ดังั นี้้� - ขนาด zone ≥ 47 mm ให้ร้ ายงานผล susceptible - ขนาด zone 27-46 mm ให้ร้ ายงานผล intermediate - ขนาด zone ≤ 26 mm ให้้รายงานผล resistant หรืือ chromosomally- mediated N. gonorrhoeae (CMRNG) การดื้อ� ยา penicillin โดยมียี ีนี อยู่บ� นโครโมโซม Penicillin (Disk) ขนาด zone ขนาด zone ขนาด zone ≥ 47 mm 27–46 mm ≤ 26 mm รายงานผล (S) รายงานผล (I) รายงานผล (R) หรอื CMRNG* Strain รููปที่�่ 5.14 ผังั การแปลผลการทดสอบความไวต่่อยา penicillin ของเชื้อ� N. gonorrhoeae ชนิดิ disk คู่�่มืือการตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน 101 ทางห้้องปฏิิบัตั ิิการทางการแพทย์์

5.3 การแปลและรายงานผลต่อ่ ยา tetracycline 5.3.1 ทดสอบด้ว้ ยวิธิ ีี disk diffusion สามารถแปลและรายงานผลการ ทดสอบดัังนี้้� - ขนาด zone ≥ 38 mm ให้้รายงานผล susceptible - ขนาด zone 31-37 mm ให้ร้ ายงานผล intermediate - ขนาด zone ≤ 30 mm ให้ร้ ายงานผล resistant แต่่ถ้้าขนาด zone < 19 mm สงสัยั TRNG (high-level tetracycline-resist- tant N. gonorrhoeae) ต้้องทดสอบหาค่่า MIC เพื่่�อการยืืนยันั Tetracycline (Disk) ขนาด zone ขนาด zone ขนาด zone ≥ 38 mm 31–37 mm ≤ 30 mm รายงานผล (S) รายงานผล (I) รายงานผล (R) รููปที่่� 5.15 ผัังการแปลผลการทดสอบความไวต่่อยา tetracycline ของเชื้้�อ N. gonorrhoeae ชนิดิ disk 102 คู่่ม� ือื การตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้้องปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

5.3.2 ในกรณีีที่่ท� ดสอบด้ว้ ยวิิธีี แบบปริมิ าณวิเิ คราะห์์ สามารถแปลผล การทดสอบดังั นี้้� (หาค่่า MIC) สามารถแปลและรายงานผลการทดสอบหาค่่า MIC ดังั นี้้� - ค่่า MIC ≤ 0.25 µg/ml ให้้รายงานผล susceptible (เป็น็ non TRNG ด้้วย) - ค่่า MIC 0.5-1 µg/ml ให้้รายงานผล intermediate (เป็น็ non TRNG ด้้วย) - ค่่า MIC 2-8 µg/ml รายงานผล resistant หรือื TetR (low- level tetracycline-resistant N. gonorrhoeae) ซึ่่ง� เชื้อ� ดื้้อ� ยา tetracycline ในความเข้้มข้้นต่ำำ�� โดยมีียีีนควบคุุมอยู่่�บน โครโมโซม (เป็็น non TRNG ด้้วย) - ค่่า MIC ≥ 16 µg/ml รายงานผล resistant หรืือ TRNG (high-level tetracycline-resistant N. gonorrhoeae) ซึ่ง� เชื้อ� ดื้อ� ยา tetracycline ในความเข้้มข้้นสููงโดยมีียีนี ควบคุมุ อยู่ �บนพลาสมิิด Tetracycline (คา MIC) คา MIC คา MIC คา MIC คา MIC ≤ 0.25 µg/ml 0.5-1 µg/ml 2-8 µg/ml ≥ 16 µg/ml รายงานผล (S) รายงานผล (I) รายงานผล (R) รายงานผล (R) Non TRNG Non TRNG tetR TRNG รููปที่่� 5.16 ผัังการแปลผลการทดสอบความไวต่่อยา tetracycline ของเชื้้�อ N. gonorrhoeae ตามค่่า MIC คู่่ม� ือื การตรวจวินิ ิิจฉัยั โรคหนองใน 103 ทางห้้องปฏิิบัตั ิิการทางการแพทย์์

เอกสารอ้า้ งอิงิ 1. World Health Organization (WHO). Laboratory diagnosis of sexually transmitted infections, including human immunodeficiency virus. Geneva: WHO document Production Services; 2013. 2. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 29th ed. Pensylvania: CLSI; 2019 3. World Health Organization (WHO). Manual for the Laboratory Identifi- cation and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. Geneva: World Health Organization; 2003. 4. มาลัยั วรวิจิ ิติ ร, วันั ทนา ปวีณี กิติ ติพิ ร, สุวุ รรณา ตระกููลสมบููรณ์,์ สุรุ างค์์ เดชศิริ ิเิ ลิศิ , คู่ม� ือื การปฏิบิ ัตั ิงิ านแบคทีเี รียี และราสำ�ำ หรับั โรงพยาบาลศููนย์แ์ ละโรงพยาบาลทั่่ว� ไป. พิมิ พ์ค์ รั้ง� ที่่� 1. กรุงุ เทพฯ: ธนาเพลส; 2557. 5. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). M22 Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard. 3rd ed. Pensylvania: CLSI; 2004 6. Centers for Disease Control and Prevention [Internet]. Division of STD Prevention, National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention. 2017 [updated 2017 Mar 31; cited 2019 May 27]. Identifi- cation of N. gonorrhoeae and Related Species; [about 1 screens]. Available from: https://www.cdc.gov/std/gonorrhea/lab/biochemical.htm 7. Centers for Disease Control and Prevention [Internet]. Division of STD Prevention, National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention. 2017 [updated 2017 Mar 31; cited 2019 May 27]. Charac- teristics of N. gonorrhoeae and Related Species of Human Origin ; [about 1 screens]. Available from: https://www.cdc.gov/std/gonorrhea/ lab/ngon.htm 104 คู่ม่� ือื การตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้้องปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

ภาคผนวก นางสาวพรทิพิ ย์์ เผ่่าผาง ดร.ธนิิษฐา ฉัตั รสุุวรรณ การเก็บ็ รัักษาเชื้้�อ N. gonorrhoeae วิิธีีการเก็็บรัักษาเชื้้�อ N. gonorrhoeae ให้้มีีชีีวิิตยืืนยาวและอยู่ �ได้้นาน เพื่่อ� ใช้ส้ ำ�ำ หรัับอ้้างอิิง หรืือเพื่่�อเก็็บไว้้ศึึกษา มีีวิิธีีการเก็็บที่่�นิยิ มใช้ก้ ันั ดังั นี้้� 1. การเก็็บรัักษาเชื้�อโดยการแช่่แข็ง็ (freezing) 2. การเก็็บรักั ษาเชื้�อใน chocolate agar slant 3. การเก็บ็ รัักษาเชื้อ� ในสภาพแห้ง้ สภาวะสููญญากาศ (lyophilized) 1. การเก็็บรักั ษาเชื้อ้� โดยการแช่่แข็ง็ (freezing) ใช้้ Sterile loop เก็บ็ เชื้อ� N. gonorrhoeae จาก chocolate agar ที่่เ� พาะ ไว้้นาน 18-24 ชั่่�วโมง ใส่่ใน cryoprotective nutritive broth ผสมกัับ 15-20% glycerol1 หรือื 10% skim milk ผสมกัับ 10% glycerol จำ�ำ นวน 1 ml ในหลอด เก็บ็ สารแช่่แข็็ง (cryogenic tube) ขนาด 2 ml สามารถเก็็บในตู้�เ้ ย็น็ -20 °C ไว้ไ้ ด้น้ าน 2 สััปดาห์์ ถ้้าต้้องการเก็็บไว้้เป็็นเวลานานให้้เก็็บที่่� -70 °C หรืือเก็็บใส่่ในถััง liquid nitrogen (-196 °C)1,2 ทั้้�งนี้้�จะต้้องวััดปริิมาตรของ liquid nitrogen อยู่ �เสมอ ไม่่ควรเปิิดถัังบ่่อย และต้้องเติมิ liquid nitrogen เมื่�อมีปี ริมิ าณเหลือื ครึ่�งถััง คู่่ม� ืือการตรวจวินิ ิิจฉัยั โรคหนองใน 105 ทางห้้องปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

2. การเก็บ็ รัักษาเชื้�้อใน chocolate agar slant เพาะเชื้�อ N. gonorrhoeae บน chocolate agar slant ที่่�บรรจุุในหลอด เก็บ็ เข้า้ ตู้อ�้ บเพาะเชื้อ� 36±1°C ใน CO2 5-10% นาน 18-24 ชั่ว� โมง เมื่อ� เชื้อ� เจริญิ แล้ว้ ค่่อยๆ เท sterile liquid paraffin ลงในหลอดให้ท้ ่่วมเชื้อ� เก็บ็ เข้า้ ตู้้อ� บเชื้�อ 36±1°C ใน CO2 5-10% เป็น็ เวลา 24 ชั่่ว� โมง แล้ว้ นำ�ำ ออกมาไว้ท้ี่่อ� ุณุ หภููมิหิ ้อ้ ง โดยสามารถเก็บ็ เชื้อ� ไว้ไ้ ด้น้ าน 5 วันั เมื่อ� ต้อ้ งการใช้เ้ ชื้อ� ที่่เ� ก็บ็ ไว้้ ให้น้ ำ�ำ sterile loop เขี่ย� เชื้อ� ในหลอดและนำ�ำ ไปเพาะบน chocolate agar เป็็นเวลา 24 หรือื 48 ชั่่�วโมง2 3. การเก็็บรัักษาเชื้้�อในสภาพแห้ง้ สภาวะสูญู ญากาศ (lyophilized) การเก็็บเชื้ �อโดยวิิธีีนี้้� เครื่�องมืืออุุปกรณ์์ และน้ำำ��ยาที่่�ใช้้กัับเครื่�องมีีราคาแพง และมีีวิิธีีการทำำ�หลายขั้ �นตอน แต่่เป็็นวิิธีีการที่่�เก็็บเชื้ �อได้้เป็็นระยะเวลานานหลายปีี โดยใช้้วิิธีีการแช่่แข็็งเชื้้�อและนำำ�ไปทำำ�ให้้แห้้งในสภาวะสููญญากาศ โดยใช้้เครื่ �อง lyophilizer3 เชื้อ� ที่่เ� ก็บ็ โดยวิธิ ีนี ี้้ส� ามารถเก็บ็ หลอดหรือื ขวดที่่ใ� ส่่เชื้อ� ไว้ท้ ี่่อ� ุณุ หภููมิหิ ้อ้ งได้้ แต่่ควรเก็็บไว้้ในตู้้�แช่่ 4-10 °C เมื่่�อจะนำำ�มาใช้้ให้้เติิมอาหารเลี้ �ยงเชื้�อชนิิดเหลว เช่่น tryptic soy broth แล้ว้ ดููดส่่วนผสมทั้้ง� หมดมาเพาะในอาหารเลี้ย� งเชื้อ� นำ�ำ เข้า้ ตู้เ�้ พาะเชื้อ� วิธิ ีนีี้้เ� หมาะสำ�ำ หรับั การขนส่่งเชื้อ� ไปยังั ที่่ห� ่่างไกล1 มีรี ายงานการศึึกษาพบว่่าวิธิ ีนีี้้ส� ามารถ เก็็บรักั ษาเชื้�อ N. gonorrhoeae ได้น้ านถึึง 6 ปีี4 106 คู่่ม� ือื การตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

วิิธีกี ารส่่งเชื้�้อเพื่่�อยืืนยัันผลการทดสอบที่่� กลุ่่ม� บางรักั โรคติิดต่่อทางเพศสัมั พันั ธ์์ การส่่งเชื้อ� N. gonorrhoeae เพื่่อ� มายืืนยัันผลการวิเิ คราะห์์ยัังห้้องปฏิิบััติิการ กลุ่่�มบางรัักโรคติิดต่่อทางเพศสััมพัันธ์์นั้้�น สามารถช่่วยในการยืืนยัันผลการเพาะเชื้ �อ และการทดสอบความไวต่่อยาต้้านจุุลชีีพ หากพบเชื้ �อที่่�มีีค่่า minimal inhibitory concentration (MIC) ตามค่่าที่่�ส่่วนกลางกำ�ำ หนด ดัังตารางที่่� 1 ตารางที่่� 1 ค่่า MIC ที่่�กำำ�หนดไว้้สำำ�หรัับการส่่งเชื้อ� เพื่่�อยืืนยันั ผลการทดสอบ4 ยาต้า้ นจุุลชีีพ ค่่า MIC ที่่�กำำ�หนด (µg/ml) Ceftriaxone > 0.25 Cefixime > 0.25 Azithromycin >1 ให้้นำำ�ส่่งมายังั ห้้องปฏิบิ ััติกิ ารกลาง เพื่่อ� ช่่วยตรวจยืืนยันั ซ้ำ��ำ และนำ�ำ มาเป็็นเชื้อ� ที่่� ใช้้ในการวิจิ ัยั ต่่อไป คู่�ม่ ือื การตรวจวิินิจิ ฉััยโรคหนองใน 107 ทางห้้องปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

ขั้้น� ตอนการส่่งเชื้อ้� เพื่่อ� ยืืนยัันที่�่ส่ว่ นกลาง ปิดิ รอยต่่อของภาชนะที่่ใ� ส่ต่ ัวั อย่า่ ง* ที่�จ่ ะนำำ�ส่่งให้้แน่่น เพื่่อ� ป้้องกัันการปนเปื้้อ� น ตัวั อย่า่ งไม่แ่ ช่แ่ ข็ง็ : บรรจุตุ ัวั อย่่างลงกล่่อง ใส่่วัสั ดุกุ ันั กระแทกให้เ้ ต็ม็ กล่่อง เพื่่อ� ป้อ้ งกัันการเคลื่�อนที่่�ของตัวั อย่่างและต้้องส่่งให้้ถึึงปลายทางภายใน 2 วััน ตัวั อย่า่ งแช่แ่ ข็ง็ : บรรจุตุ ัวั อย่่างลงในกล่่องโฟม ใส่่น้ำ��ำ เเข็ง็ แห้ง้ ให้ป้ ริมิ าณ เหมาะสมกับั จำ�ำ นวนตัวั อย่่าง ขนาดของกล่่อง และระยะเวลาในการขนส่่ง หมายเหตุุ * : ลัักษณะตัวั อย่่างที่ส�่ ่ง่ • ตัวั อย่่างเชื้อ� N. gonorrhoeae ที่่�เพาะบน chocolate agar plate (เชื้อ� อายุุประมาณ 18-24 ชม.) สามารถส่่งได้ท้ ี่่�อุณุ หภููมิิห้อ้ ง แต่่ต้อ้ ง ส่่งเป็น็ พััสดุภุ ััณฑ์์ด่่วนที่่ถ� ึึงปลายทางภายใน 1-2 วันั 5 • ตัวั อย่่างที่่เ� พาะบน chocolate agar slant (เชื้อ� อายุปุ ระมาณ 18-24 ชม.) ให้้เททัับเชื้ �อด้้วย sterile liquid paraffin จนท่่วม slant (ไม่่ต้อ้ งแช่่เย็น็ ) แต่่ต้้องส่่งให้้ถึึงปลายทางภายใน 5 วันั 2 • ตัวั อย่่างแช่่แข็ง็ เช่่น เชื้อ� ที่่บ� รรจุใุ น skim milk เป็น็ ต้น้ ต้อ้ งใส่่น้ำ��ำ แข็ง็ แห้ง้ ให้้พอเหมาะ1,5 108 คู่�ม่ ืือการตรวจวินิ ิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

การเตรียี มอาหารเลี้้ย� งเชื้�อ้ 1. Bangrak I medium 36 g ส่่วนประกอบ GC agar base (OXOIDTM) 500 ml 2% Hemoglobin solution (w/v) 5 ml Bangrak enrichment 5 ml 25% Dextrose 10 ml ACLT inhibitor 480 ml Distilled water วิธิ ีีเตรียี ม 1. ชั่�ง GC agar base 36 g และเติิมน้ำ�ำ�กลั่่�น 480 ml ใน erlenmeyer flask ขนาด 2000 ml 2. เตรียี ม 2% hemoglobin solution โดย ชั่่ง� hemoglobin 10 g และเติิม น้ำ��ำ กลั่่น� 500 ml ใน erlenmeyer flask ขนาด 1000 ml ละลาย hemoglobin ด้้วย magnetic stirrer นาน 30 นาทีี 3. นำำ�ส่่วนประกอบในข้้อ 1 และ 2 ทำำ�ให้้ปราศจากเชื้�อด้้วยเครื่�องนึ่่�งฆ่่าเชื้�อ (autoclave) ที่่�อุุณหภููมิิ 121˚C เป็็นเวลา 15 นาทีี1 เมื่ อ� เสร็็จแล้ว้ นำ�ำ ไปแช่่ ใน water bath ให้อ้ าหารเลี้ย� งเชื้อ� เย็็นลงประมาณ 50-55 ˚C6 4. ผสม Bangrak enrichment และ 25% Dextrose ให้้เข้้ากันั จากนั้้�นเติมิ ลงใน GC agar base 5. เติมิ 1% ACLT inhibitor ลงใน GC agar base แล้ว้ ผสมให้้เข้้ากันั 6. เติิม 2% hemoglobin solution ลงใน GC agar base ผสมให้้เข้า้ กััน เทลงใน sterile petri dish ประมาณ 15-20 ml/plate1 โดยระวัังไม่่ให้้ เกิิดฟองอากาศ คู่�่มือื การตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน 109 ทางห้อ้ งปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

7. ทิ้้�งให้้อาหารเลี้้�ยงเชื้้�อแข็็งตััวที่่�อุุณหภููมิิห้้อง และบรรจุุใส่่ถุุงพลาสติิก ปิดิ ปากถุุงให้้สนิทิ ก่่อนจะนำ�ำ ไปเก็บ็ ที่่� 2-8˚C6 หมายเหตุุ: ห้้องปฏิิบััติิการสามารถใช้้ Modified Thayer-Martin medium แทน Bangrak I medium ได้้ 2. Chocolate agar ส่่วนประกอบ GC agar base (OXOIDTM) 36 g 2% Hemoglobin solution (w/v) 500 ml Bangrak enrichment 5 ml 25% Dextrose 5 ml Distilled water 490 ml วิิธีเี ตรียี ม 1. ชั่ง� GC agar base 36 g และเติิมน้ำ��ำ กลั่่�น 490 ml ใน erlenmeyer flask ขนาด 2000 ml 2. เตรีียม 2% hemoglobin solution โดยชั่่�ง hemoglobin 10 g และเติิมน้ำำ��กลั่่�น 500 ml ใน erlenmeyer flask ขนาด 1000 ml ละลาย hemoglobin ด้้วย magnetic stirrer นาน 30 นาทีี 3. นำำ�ส่่วนประกอบในข้้อ 1 และ 2 ทำำ�ให้้ปราศจากเชื้�อด้้วยเครื่�องนึ่่�งฆ่่าเชื้�อ ที่่อ� ุณุ หภููมิิ 121˚C เป็็นเวลา 15 นาทีี1 เมื่ อ� เสร็็จแล้้ว นำ�ำ ไปแช่่ใน water bath ให้้อาหารเลี้�ยงเชื้�อเย็น็ ลงประมาณ 50-55 ˚C6 4. ผสม Bangrak enrichment และ 25% dextrose ให้เ้ ข้า้ กันั จากนั้้น� เติมิ ลงใน GC agar base 110 คู่่ม� ือื การตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

5. เติิม 2% hemoglobin solution ลงใน GC agar base ผสมให้เ้ ข้้ากััน เทลงใน sterile petri dish ประมาณ 15-20 ml/plate1 โดยระวัังไม่่ให้้ เกิดิ ฟองอากาศ 6. ทิ้้�งให้้อาหารเลี้้�ยงเชื้้�อแข็็งตััวที่่�อุุณหภููมิิห้้อง และบรรจุุใส่่ถุุงพลาสติิก ปิิดปากถุงุ ให้ส้ นิทิ ก่่อนจะนำ�ำ ไปเก็บ็ ที่่� 2-8˚C6 3. GC agar 36 g ส่่วนประกอบ GC agar base (OXOIDTM) Bangrak enrichment 5 ml 25% Dextrose 5 ml Distilled water 990 ml วิิธีเี ตรีียม 1. ชั่�ง GC agar base 36 g และเติมิ น้ำำ��กลั่่น� 990 ml ใน erlenmeyer flask ขนาด 2000 ml 2. ทำำ�ให้้ปราศจากเชื้�อด้้วยเครื่�องนึ่่�งฆ่่าเชื้�อ ที่่�อุุณหภููมิิ 121˚C เป็็นเวลา 15 นาทีี1 เมื่่�อเสร็็จแล้้ว นำำ�ไปแช่่ใน water bath ให้้อาหารเลี้�ยงเชื้ �อเย็็นลง ประมาณ 50-55 ˚C6 3. ผสม Bangrak enrichment และ 25% dextrose ให้เ้ ข้า้ กันั จากนั้้น� เติมิ ลงใน GC agar base 4. ตวงอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อ ปริิมาตร 20-25 ml เทลงใน sterile petri dish ขนาดเส้น้ ผ่่านศููนย์ก์ ลาง 90 mm หรือื ปริมิ าตร 60 ml สำ�ำ หรับั petri dish ขนาดเส้้นผ่่านศููนย์ก์ ลาง 150 mm2 โดยระวัังไม่่ให้้เกิิดฟองอากาศ 5. ทิ้้�งให้้อาหารเลี้้�ยงเชื้้�อแข็็งตััวที่่�อุุณหภููมิิห้้อง และบรรจุุใส่่ถุุงพลาสติิก ปิิดปากถุุงให้้สนิิท ก่่อนจะนำ�ำ ไปเก็บ็ ที่่� 2-8˚C6 หมายเหตุุ: อาหารเลี้ย� งเชื้�อแบบเพลทสามารถเก็็บไว้ไ้ ด้น้ าน 1 เดือื น6   คู่ม่� ือื การตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน 111 ทางห้้องปฏิิบัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

การควบคุุมคุณุ ภาพอาหารเลี้้�ยงเชื้อ�้ 1. การทดสอบการปราศจากเชื้อ้� อาหารเลี้�ยงเชื้�อทุุกชนิิดก่่อนใช้้ต้้องนำำ�มาทดสอบสภาวะปราศจากเชื้�อ โดยนำำ� อาหารเลี้ �ยงเชื้ �อมา 5% ของจำำ�นวนอาหารที่่�เตรีียม บ่่มที่่�ตู้้� incubator 36±1°C นาน 18-24 ชั่่�วโมง5 ส่่วนอาหารที่่�เหลือื เก็บ็ ในตู้�้เย็น็ ที่่�อุณุ หภููมิิ 2-8˚C โดยคว่ำำ��หน้้า อาหารลงและทดสอบคุุณภาพอาหารก่่อนนำำ�ไปใช้้6 2. การทดสอบคุณุ ภาพของอาหารเลี้ย� งเชื้้อ� การทดสอบคุุณสมบััติิของอาหารเลี้้�ยงเชื้้�อเป็็นการทดสอบคุุณสมบััติิของ อาหารแต่่ละชนิดิ โดยใช้เ้ ชื้อ� สายพันั ธุ์�มาตรฐาน เมื่อ� ห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารเตรียี มอาหารเพาะเชื้อ� เสร็็จแล้้ว ต้้องทำำ�การควบคุุมคุุณภาพ โดยดููการเจริิญเติิบโตของแบคทีีเรีียในอาหาร แต่่ละชนิดิ นั้้น� โดยใช้ท้ั้้ง� เชื้อ� สายพันั ธุ์�ที่ส� ามารถเจริญิ ได้บ้ นอาหารเลี้ย� งเชื้อ� และสายพันั ธุ์� ที่่�ถููกยัับยั้้�งการเจริิญเติิบโต มาทำำ�การทดสอบแต่่ละครั้ �ง5 สำำ�หรัับเชื้ �อที่่�ใช้้ควบคุุม การทดสอบค่่าความไวต่่อยาต้า้ นจุุลชีพี ต้อ้ งให้ผ้ ลการทดสอบอยู่�ในช่่วงที่่�กำำ�หนดตาม มาตรฐาน เช่่น Clinical and laboratory standards institute (CLSI) โดยเชื้�อที่่�ใช้้ ในการทดสอบอาหารแต่่ละชนิดิ แสดงในตารางที่่� 2 1,6,7 112 คู่ม่� ืือการตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิิบัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

ตารางที่่� 2 แสดงเชื้อ� ที่่�ใช้แ้ ละผลการควบคุุมคุุณภาพภายในของอาหารเลี้�ยงเชื้�อ อาหารเลี้ �ยงเชื้อ้� เชื้้อ� ที่ใ�่ ช้ท้ ดสอบ ATCC No. ผลการทดสอบ Bangrak I medium N. gonorrhoeae 43069 เชื้ �อเจริญิ Staphylococcus epidermidis 12228 เชื้ �อไม่่เจริิญ Proteus mirabilis 43071 เชื้ �อไม่่เจริญิ Candida albicans 10231 เชื้ �อไม่่เจริญิ Chocolate agar N. gonorrhoeae 43069 เชื้ �อเจริญิ Haemophilus influenzae 10211 เชื้อ� เจริิญ GC agar N. gonorrhoeae 49226 เชื้�อเจริิญและ ค่่าความไว ต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีีพ ของเชื้อ� มาตรฐาน อยู่ �ในช่่วง ที่่ก� ำำ�หนด คู่่�มืือการตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน 113 ทางห้้องปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

วิธิ ีกี ารเตรีียมน้ำ��ำ ยาต่่างๆ 1. 1% Oxidase test 1. ชั่�งสาร N, N-dimethylaniline 0.3 g ใส่่ใน erlenmeyer flask ขนาด 125 ml 2. เติิมน้ำ�ำ�กลั่่น� 30 ml ผสมให้้ส่่วนผสมเข้้ากันั ด้้วยเครื่�อง magnetic stirrer เป็น็ เวลาประมาณ 10 นาทีี 3. นำ�ำ กระดาษฟอยด์ห์ ่่อรอบๆ erlenmeyer flask และปิดิ ฝาไว้เ้ พื่่อ� ป้อ้ งกันั แสง 4. ติดิ ฉลาก ล็อ็ ต วันั ที่่ผ� ลิติ วันั หมดอายุแุ ละเก็บ็ รักั ษาในตู้เ�้ ย็น็ อุณุ หภููมิิ 2-8˚C มีอี ายุกุ ารเก็บ็ 2 สััปดาห์์ 2. 10% Skim milk with 10% glycerol 1. ชั่�ง skim milk (OxoidTM) 10 g ใส่่ใน erlenmeyer flask ขนาด 500 ml 2. เติมิ น้ำ��ำ 90 ml ผสมส่่วนผสมให้เ้ ข้า้ กันั ด้ว้ ยเครื่อ� ง magnetic stirrer เป็น็ เวลา 10 นาทีี 3. เติิม glycerol ลงไป 10 ml และคนต่่อไปอีกี ประมาณ 10 นาทีี 4. บรรจุุ skim milk ปริมิ าตร 1 ml ในหลอดเก็็บสารแช่่แข็ง็ ใส่่ลงกล่่องแล้ว้ ทำ�ำ ให้ป้ ราศจากเชื้อ� ด้ว้ ยเครื่อ� งนึ่่ง� ฆ่า่ เชื้อ� ที่่อ� ุณุ หภููมิิ 121˚C เป็น็ เวลา 5 นาที8ี 5. เก็บ็ รักั ษาในตู้เ�้ ย็น็ อุณุ หภููมิิ 2-8˚C สามารถเก็บ็ ไว้ใ้ ช้ไ้ ด้น้ านประมาณ 2 เดือื น6 114 คู่�่มือื การตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

3. Mueller-Hinton broth 1. ชั่ง� Mueller-Hinton broth base (BBLTM) 11 g เทลง erlenmeyer flask ขนาด 1000 ml 2. เติิมน้ำ�ำ�กลั่่น� 500 ml ใส่่ magnetic bar วางบนเครื่�อง magnetic stirrer เป็น็ เวลา 10 นาทีี 3. บรรจุุใส่่หลอดแก้้วมีีฝาเกลีียว (screw cap tube) หลอดละ 2.5 ml ปิดิ จุุกให้แ้ น่่น 4. ทำ�ำ ให้ป้ ราศจากเชื้อ� ด้ว้ ยเครื่อ� งนึ่่�งฆ่า่ เชื้อ� ที่่อ� ุณุ หภููมิิ 116-121˚C เป็็นเวลา 10-15 นาที9ี 5. ติดิ ฉลาก ล็อ็ ตที่่ผ� ลิติ วันั ที่่ผ� ลิติ วันั หมดอายุุ และเก็บ็ รักั ษาในตู้เ�้ ย็น็ อุณุ หภููมิิ 2-8˚C มีอี ายุกุ ารเก็บ็ นาน 2 เดืือน6 คู่ม�่ ือื การตรวจวิินิจิ ฉััยโรคหนองใน 115 ทางห้้องปฏิิบัตั ิิการทางการแพทย์์

การเตรีียม McFarland Standard McFarland standard เป็็นมาตรฐานที่่�ใช้้เทีียบความขุ่ �นของ ตbจchะาaมเclกotลิeำิดrำ�riตดidัaะับe ซกึต)่ั่อ�ง้้นเแ�งป็ขแล็นอตะ่่ง สn1าBuร%aลmSะObHลe4า2Srย(ทOBี1่่�ปa4-1rร(i0uะsuกmโอlดfบuยsดu้rกi้วlาcfยรaเta1พeิ่c.่�ม)1i 7dอทัำ5ัต)ำ�%รใเาหมื้ส่B่่้ ่�อวasผนoCสขllu2อมt(งกiboััaนBnrแa iขuุCล่้m่�นl้ว2 ในส่่วนผสมดัังแสดงในตารางที่่� 3 จากนั้้�นทำำ�การแบ่่งใส่่หลอดแก้้ว ปิิดฝาหลอดด้้วยพาราฟิิล์์มเพื่่�อป้้องกัันการระเหย McFarland standard สามารถเก็บ็ รัักษาไว้ไ้ ด้น้ านถึึง 6 เดืือน ที่่อ� ุณุ หภููมิิ 22-25 ºC ในสภาวะที่่�ไม่่มีีแสง และก่่อนการใช้้ในแต่่ละครั้ �งควร นำำ�หลอด McFarland standard มาผสมเพื่่�อให้้ตะกอน barium sulfate ที่่�อยู่� ก้้นหลอดกระจายตััวในสารละลาย1 116 คู่่�มือื การตรวจวิินิจิ ฉััยโรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

ตารางที่่� 3 การเตรีียม McFarland standard และจำำ�นวนแบคทีีเรียี เปรียี บเทียี บกัับ ความขุ่�นของ McFarland standard หมายเลขต่่างๆ1 McFarland Barium chloride Sulfuric acid จำำ�นวนแบคทีีเรีีย standard dehydrate (1%) (108 CFU/ml) Number (1.175%) (ml) (ml) 1.5 0.5 0.5 99.5 3 1 0.1 9.9 6 2 0.2 9.8 9 3 0.3 9.7 12 4 0.4 9.6 15 5 0.5 9.5 18 6 0.6 9.4 21 7 0.7 9.3 24 8 0.8 9.2 27 9 0.9 9.1 30 10 1.0 9.0 คู่�ม่ ืือการตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน 117 ทางห้้องปฏิิบัตั ิิการทางการแพทย์์

การย้อ้ มสีีแกรม (Gram stain) การย้อ้ มแกรมเป็น็ วิธิ ีกี ารที่่ใ� ช้แ้ ยกเชื้อ� แบคทีเี รียี ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารจุลุ ชีวี วิทิ ยา โดยอาศัยั รููปร่่าง ขนาด การเรียี งตัวั และการติดิ สีแี กรม ซึ่่ง� มีปี ระโยชน์ใ์ นการช่่วยวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองในจากสิ่่ง� ส่่งตรวจโดยตรงได้อ้ ย่่างรวดเร็ว็ การย้อ้ มสีดี ้ว้ ยวิธิ ีกี ารที่่ถ� ููกต้อ้ งจึึงมีี ความสำำ�คัญั อย่่างมากในการตรวจหาเชื้อ� N. gonorrhoeae6 โดยมีีขั้�นตอนดัังนี้้� วิธิ ีีการย้้อมสีีแกรม6 1. Smear เชื้ �อหรืือสิ่ �งส่่งตรวจลงบนสไลด์์ให้้กระจายตััวแล้้วทิ้้�งไว้้ให้้แห้้งที่่� อุณุ หภููมิหิ ้้อง 2. Fix สไลด์ด์ ้้วยความร้้อนโดยผ่่านเปลวไฟ 2-3 ครั้�งและปล่่อยให้้สไลด์์เย็็น ก่่อนนำ�ำ ไปย้้อมสีี 3. หยด working crystal violet solution ลงบนสไลด์์ทิ้้�งไว้้ประมาณ 1 นาทีแี ล้้วล้้างน้ำ��ำ สะอาด 4. หยด Gram’s iodine บน slide ทิ้้ง� ไว้ป้ ระมาณ 1 นาทีีแล้ว้ ล้้างน้ำ�ำ� สะอาด 5. Decolorize ด้้วย acetone alcohol แล้้วล้้างน้ำ��ำ สะอาดทันั ทีี 6. ย้้อมทับั ด้้วย safranin 30 วินิ าทีี ล้า้ งน้ำ�ำ�สะอาดแล้ว้ ผึ่�งให้แ้ ห้ง้ นำำ�ไปดููด้ว้ ย กล้้องจุุลทรรศน์์ด้้วยกำำ�ลัังขยาย 10x10 เท่่า จากนั้้�นดููรายละเอีียดด้้วย กำำ�ลังั ขยาย 10x100 เท่่า 118 คู่่�มืือการตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้้องปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

การควบคุุมคุุณภาพของสีีแกรม การควบคุุมคุุณภาพของสีีย้้อมควรทดสอบสีีย้้อมกัับเชื้�อที่่�ให้้ผลบวกและเชื้�อที่่� ให้้ผลลบ สััปดาห์์ละหนึ่่�งครั้ �งและทุุกครั้ �งเมื่่�อมีีการจััดซื้้�อสีีย้้อมใหม่่หรืือเตรีียมสีีใหม่่5 โดยเชื้อ� ที่่ใ� ช้ท้ ดสอบและผลการทดสอบแสดงในตารางที่่� 45,6 ตารางที่่� 4 แสดงเชื้อ� ที่่�ใช้้และผลการควบคุุมของสีีย้้อมแกรม เชื้้อ� ที่ใ�่ ช้ท้ ดสอบ ATCC No. ผลการทดสอบ Escherichia coli 25922 Gram-negative bacilli Staphylococcus aureus หรืือ 25923 Gram-positive cocci Staphylococcus epidermidis 12228 คู่�่มือื การตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน 119 ทางห้้องปฏิิบัตั ิิการทางการแพทย์์

เอกสารอ้้างอิงิ 1. World Health Organization (WHO). Manual for the Laboratory Identifi- cation and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. Geneva: World Health Organization; 2003. 2. World Health Organization (WHO). Laboratory diagnosis of sexually transmitted infections, including human immunodeficiency virus. Geneva: WHO Document Production Services; 2013. 3. รวิวิ รรณ อาจสํําอาง. การเก็บ็ รักั ษาเชื้อ� อ้า้ งอิงิ (Maintenance and Preservation of reference cultures). [ออนไลน์์]. 2555 [เข้้าถึึงเมื่่�อ 16 มีีนาคม 2555] เข้้าถึึงได้้จาก: http://www.dss.go.th/dssweb/st-articles/files/bsp_N_ YmZm_reference_culturer.pdf 4. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). M100 Performance Standards for Antimocrobial Susceptibility Testing. 29th ed. Pensylvania: CLSI; 2019. 5. กรมวิทิ ยาศาสตร์ก์ ารแพทย์.์ คู่่ม� ือื มาตรฐานห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารจุลุ ชีวี วิทิ ยาทางการแพทย์์ และสาธารณสุขุ . พิมิ พ์ค์ รั้ง� ที่่� 1. กรุงุ เทพฯ: เท็ก็ ซ์แ์ อนด์เ์ จอร์น์ ัลั พับั ลิเิ คชั่น� ; 2560. 6. มาลัยั วรวิจิ ิติ ร, วันั ทนา ปวีณี กิติ ติพิ ร, สุวุ รรณา ตระกููลสมบููรณ์,์ สุรุ างค์์ เดชศิริ ิเิ ลิศิ , คู่ม� ือื การปฏิบิ ัตั ิงิ านแบคทีเี รียี และราสำ�ำ หรับั โรงพยาบาลศููนย์แ์ ละโรงพยาบาลทั่่ว� ไป. พิมิ พ์ค์ รั้ง� ที่่� 1. กรุงุ เทพฯ: ธนาเพลส; 2557. 7. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). M22 Quality Control for Commercially Prepared Microbiological culture media; Approved Standard. 3rd ed. Pensylvania: CLSI; 2004. 8. Bridson EY. The OXOID manual. 9th ed. Hampshire: OXOID Limited; 2006. 9. Zimbro MJ, Power DA. Difco & BBL manual: manual of microbiological culture media. 2nd ed. Sparks, MD: Becton Dickinson and Co.; 2009. 120 คู่�่มือื การตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิิบัตั ิกิ ารทางการแพทย์์