คู่มือการตรวจวินิจฉัยโรคหนองในทางห้องปฏิบัติการทางการแพทย์.

2.3 Macrolides มีีโครงสร้้างที่่�ประกอบด้้วย lactone ring ขนาดใหญ่่ และมีี amino sugar หนึ่่ง� หรือื มากกว่่ามาจับั ด้ว้ ย glycosidic bond (รููปที่่� 3.2) เช่่น erythromycin, roxithromycin, clarithomycin, azithromycin โดยออกฤทธิ์�จับั แบบ irreversible กัับ 50s subunit ของ ribosome และมีีผลยัับยั้้�งขั้ �นตอนการ translocation ในการสัังเคราะห์์โปรตีีน โดยตำำ�แหน่่งที่่�ยาไปจัับใกล้้เคีียงกัันทั้้�ง lincosamides, streptogramin B, และ chloramphenicol ยากลุ่่ม� macrolides มีีขอบข่่ายการ ออกฤทธิ์ก� ับั เชื้อ� แบคทีเี รียี แกรมบวกหลายชนิดิ โดยเฉพาะอย่่างยิ่ง� กลุ่่ม� Streptococci, Streptococcus pneumoniae, Staphylococci, Corynebacteria, Listeria และเชื้�ออื่น� ๆ บางชนิิด เช่่น Helicobacter, Legionella, Chlamydia 2.4 Lincosamides โครงสร้้างหลักั ประกอบด้ว้ ย amino acid, trans-L-4-n-propylhygric acid เชื่�อมกับั amino sugar ที่่�มีี sulfur อยู่ด� ้้วย (รููปที่่� 3.2) เช่่น lincomycin และ clindamycin ซึ่่ง� lincomycin มีผี ลข้า้ งเคียี งสููงจึึงไม่่ใช้แ้ ล้ว้ โดย clindamycin จับั กับั 50s subunit ของ ribosome ใกล้้ P site มีผี ลรบกวนการจัับของ aa-tRNA โดยแย่่ง จับั แทนและเปลี่ย� นโครงสร้า้ งของ ribosome ซึ่่ง� clindamycin มีขี อบข่่ายการออกฤทธิ์� กับั เชื้อ� แบคทีเี รียี แกรมบวกหลายชนิดิ โดยเฉพาะ S. aureus, Streptococcus และ Pneumococci แต่่ไม่่มีีผลต่่อเชื้อ� แกรมลบ 2.5 Streptogramins Quinopristin (streptogramin B)-dalfopristin (streptogramin A) เป็็นสารต้้านจุุลชีีพที่่�ออกฤทธิ์�โดยจัับกัับ 50s subunit ของ ribosome มีีขอบข่่าย การออกฤทธิ์�ต่่อเชื้ �อแกรมบวกดีี รวมทั้้�งเชื้ �อแกรมบวกดื้้�อยา เช่่น multiple drug resistance streptococci, penicillin resistant Streptococcus pneumoniae (PRSP), methicillin resistant S. aureus (MRSA) คู่ม่� ือื การตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน 45 ทางห้้องปฏิบิ ัตั ิิการทางการแพทย์์

2.6. Phenicols สารต้้านจุุลชีีพกลุ่่�มนี้้� เช่่น chloramphenicol และ thiamphenicol ออกฤทธิ์�โดยจัับแบบ reversible กัับ 50s subunit ของ ribosome ใกล้้ P site มีีผลรบกวนการจัับของ aa-tRNA โดยยัับยั้้�งการต่่อสาย peptide เป็น็ สารต้า้ นจุุลชีีพ ที่่�มีีขอบข่่ายการออกฤทธิ์�กว้้างทั้้�งแบคทีีเรีียแกรมบวกและแกรมลบ (aerobes และ anaerobes) และ Rickettsiae แต่่สารต้า้ นจุลุ ชีพี กลุ่่�มนี้้�มีผี ลข้้างเคียี งค่่อนข้า้ งรุุนแรง โดยรบกวนการทำ�ำ งานของไขกระดููกได้้ 2.7 Oxazolidinones Linezolid เป็็นสารต้้านจุลุ ชีีพที่่จ� ัับอย่่างจำำ�เพาะกัับ 23s rRNA บน 50s subunit ของ ribosome โดยมีีผลป้้องกัันการเกิดิ complex ของ 30s subunit, mRNA, initiation factor และ formyl methionyl tRNA ในการรวมเป็็น 70s ribosome ทำำ�ให้้เกิิดการยัับยั้้�งการสัังเคราะห์์โปรตีีนในขั้ �นตอนแรก จึึงออกฤทธิ์ � ในการฆ่่าเชื้�อได้้ (Bactericidal effect) จากความจำ�ำ เพาะในการจัับจึึงไม่่มีี cross- resistance กับั ยาต้า้ นจุุลชีพี อื่�น โดยออกฤทธิ์ไ� ด้้ดีีกัับแบคทีีเรีียแกรมบวกรวมทั้้ง� เชื้อ� ดื้�อยา เช่่น vancomycin resistant Enterococci (VRE) methicillin resistant S. aureus (MRSA) และเชื้อ� multiple drug resistance แกรมบวกอื่่น� ๆ 46 คู่ม�่ ืือการตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิิการทางการแพทย์์

3. Cell membrane permeability เป็็นกลุ่่�มสารต้้านจุุลชีีพที่่�มีีผลข้้างเคีียงสููง จึึงมีีการพััฒนาสารต้้านจุุลชีีพ กลุ่่�มนี้้น� ้้อย ประกอบด้ว้ ย สารต้้านจุุลชีีพกลุ่่�มหลัักคือื polypeptides 3.1 Polymyxins เช่่น polymyxin B และ polymyxin E (colistin) ออกฤทธิ์� โดยทำ�ำ ลายผนังั เซลล์บ์ างส่่วน ทำ�ำ ให้ศ้ ููนย์เ์ สียี สารในเซลล์บ์ างส่่วน มีขี อบข่่ายการออกฤทธิ์� ต่่อแบคทีเี รียี แกรมลบส่่วนใหญ่่ โดยออกฤทธิ์ไ� ด้ก้ ับั เชื้อ� Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii และแบคทีเี รีียแกรมลบดื้้�อยาด้้วย ซึ่่�ง polymyxin มีีผล โดยรบกวนการเรียี งตัวั ของเยื่�อหุ้�มเซลล์์ และเนื่่อ� งจาก polymyxin มีผี ลข้้างเคีียงสููง รวมทั้้ง� ต่่อไต (nephrotoxicity) จึึงมักั ใช้้เป็็นยาภายนอก หรือื ใช้ด้ ้ว้ ยความระมัดั ระวััง หรืือเปลี่ย� นเป็น็ รููปของเกลืือและอื่น� ๆ เพื่่อ� ให้้ความเป็น็ พิษิ ลดลง 3.2 Daptomycin สารต้้านจุุลชีีพนี้้�จััดเป็็นสาร cyclic lipopeptide ออกฤทธิ์ �โดยยาจัับกัับ membrane และมีีผลให้้มีีการเสีียโปตััสเซีียมจากเซลล์์ ทำำ�ให้้เสีียสมดุุลย์ข์ องอิอิ อน ซึ่่�งกระทบการทำ�ำ งานในการสัังเคราะห์์ DNA, RNA และ โปรตีีน ซึ่่�งเป็็นยามีีฤทธิ์�แบบฆ่่าเชื้ �อ (Bactericidal effect) และสารต้้านจุุลชีีพนี้้� ใช้้ได้้ดีีกัับแบคทีีเรีียแกรมบวก โดยรวมทั้้�งแกรมบวกดื้้�อยา เช่่น เชื้ �อ methicillin resistant Staphylococci (MRS), vancomycin resistance Enterococci (VRE), และ vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) คู่่�มืือการตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน 47 ทางห้้องปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

4. ยัับยั้�งการสัังเคราะห์์ nucleic acid 4.1 Quinolones สารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่เ� กิดิ จากการสังั เคราะห์์มีฤี ทธิ์ใ� นการยับั ยั้้ง� การคลายเกลีียวของสาย DNA ซึ่่�งในการสัังเคราะห์์ DNA ทำำ�ให้้มีีการแตกของสาย DNA เพิ่่�มขึ้น้� โดยมีผี ลต่่อเอนไซม์์ 2 ชนิิด คืือ DNA gyrase และ topoisomerase IV มีีขอบข่่ายการออกฤทธิ์ �ดีีต่่อแอโรบิิกแบคทีีเรีียแกรมลบ แต่่ไม่่ดีีนัักกัับแกรมบวก จึึงเปลี่�ยน side chain เพื่่�อให้้มีกี ารออกฤทธิ์�ที่่�ดีขี ึ้้น� จึึงมีกี ารจััดแบ่่งเป็็น 4 รุ่่น� คือื - First generation เช่่น nalidixic acid, cinoxacin ออกฤทธิ์ไ� ด้ด้ ีีกับั gram-negative bacilli ใช้้ในการรัักษาผู้้�ป่ว่ ยติิดเชื้�อในระบบทางเดินิ ปััสสาวะ - Second generation เช่่น norfloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin, enofloxacin, lomefloxacin ออกฤทธิ์ �ได้้ดีีกัับ gram-negative bacilli และแบคทีเี รีียแกรมบวกบางชนิิด ใช้้ในการรัักษาการติดิ เชื้อ� ใน ระบบทางเดิินปััสสาวะ และโรคติิดต่่อทางเพศสัมั พันั ธ์์ - Third generation เช่่น levofloxacin, sparfloxacin, gatifloxacin ออกฤทธิ์�กว้า้ งโดยออกฤทธิ์ไ� ด้ด้ ีีกับั gram-negative bacilli และแกรม บวกหลายชนิิด โดยเฉพาะอย่่างยิ่�ง Streptococcus pneumoniae จึึงใช้ใ้ นการรัักษา Community-acquired pneumonia - Fourth generation เช่่น moxifloxacin, trovafloxacin, sitafloxa- acin ขอบข่่ายการออกฤทธิ์ �กว้้างมาก ได้้ดีีทั้้�งกัับ gram-negative bacilli, gram-positive cocci และ anaerobes โดยยังั พบการดื้อ� ยาต่ำ��ำ 4.2 Ansamycins เช่่น rifampin เป็น็ สารกึ่ง� สังั เคราะห์ข์ นาดใหญ่่ เป็น็ อนุพุ ันั ธ์์ ของ rifamycin มีีขอบข่่ายการออกฤทธิ์ท� ั้้ง� gram-positive cocci, gram-negative cocci, enteric bacteria บางชนิิด, Mycobacteria, Chlamydia โดยออกฤทธิ์� จับั อย่่างแน่่นกัับ ß-subunit ของ DNA-dependent RNA polymerase จึึงยัับยั้้ง� การสังั เคราะห์์ RNA ซึ่่ง� ออกฤทธิ์แ� บบ bactericidal กัับ Mycobacteria และการที่่� ยาเข้้าสู่เ� ซลล์์ได้้ดีีจึึงใช้้กับั การรัักษา intracellular organism เนื่่อ� งจากความจำ�ำ เพาะ ของตำ�ำ แหน่่งการจับั ของ rifampin จึึงไม่่มีี cross-resistance กับั การดื้อ� สารต้า้ นจุลุ ชีพี กลุ่่ม� อื่�น แต่่เกิดิ cross-resistance กัับอนุุพันั ธ์์อื่น� ของ rifamycin ได้้ 48 คู่่ม� ือื การตรวจวินิ ิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิิบัตั ิิการทางการแพทย์์

5. ยัับยั้ง� การสัังเคราะห์์ Folic acid 5.1 Sulfonamides สารต้้านจุุลชีีพกลุ่่�มนี้้� เช่่น sulfamethoxazole, sulfadiazine, sulfisoxazole เป็็นสารที่่�มีีโครงสร้้างคล้้าย p-aminobenzoic acid (PABA) จึึงสามารถจัับกับั เอนไซม์์ dihydrofolate synthase ได้้ ซึ่่�งมีีผลยับั ยั้้�งการสร้้าง folic acid ซึ่่�งเป็็นขั้ �นตอนสำำ�คััญในการสร้้าง purines และสัังเคราะห์์ nucleic acids โดยออกฤทธิ์�แบบ bacteriostatic มีีขอบข่่ายการออกฤทธิ์�กว้้างทั้้�งแบคทีีเรีียแกรม บวก แกรมลบ Nocardia, Chlamydia trachomatis และโปรโตซัวั บางชนิดิ 5.2 Trimethoprims Trimethoprims เช่่น trimethoprim, ormethoprim ออกฤทธิ์�โดย ยับั ยั้้ง� เอนไซม์์ dihydrofolic acid reductase ซึ่่ง� เป็น็ เอนไซม์ท์ ี่่เ� ปลี่ย� น dihydrofolic acid เป็น็ tetrahydrofolic acid ซึ่่ง� เป็น็ ขั้น� ตอนในการสังั เคราะห์์ purines และ DNA ดังั นั้้น� การใช้้ trimethoprims ร่่วมกับั sulfonamides จึึงมีผี ลเสริมิ ฤทธิ์ก� ันั (synergism) ดังั นั้้น� จึึงมีกี ารใช้ย้ า trimethoprim เดี่ย� วหรือื ร่่วมกับั sulfonamides ได้้ สารต้า้ นจุลุ ชีพี ร่่วมระหว่่าง sulfonamides และ trimethoprims ที่่น� ิยิ มใช้้ เช่่น sulfamethoxazole- trimethoprim คู่�ม่ ือื การตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน 49 ทางห้้องปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

ระหวõาง sulfonamides และ trimethoprims ท่ีนิยมใชè เชõน sulfamethoxazole-trimethoprim 41 รูปรููปทที่ี่3่� 3.2.2 ตตััวัวออยย่่าõางงโคโครงรสงรส้้ารงสèาางรสตา้้ารนตจุèาุลนชีจพี ุลกลุช่่ม�ีพอื่ก�นลๆุõมนออื่นกเหๆนืนอื อจากกกเลหุ่น่ม� ือßจ-าlaกcกtaลmุõมsß- la5c0tamทคู่าsม่� งืือห้้อกงาปรตฏิริบัวตั จิิกวินิาิริจทฉัาัยงโกรคารหแนพอทงยใน์์ Antimycobacterial drugs

Antimycobacterial drugs เชื้อ� Mycobacteria มีกี ลไกการดื้อ� โดยธรรมชาติิ (intrinsic resistance) ต่่อสารต้้านจุุลชีพี หลายชนิิด โดยสารต้้านจุุลชีีพที่่�มีีผลต่่อเซลล์ท์ ี่่�มีกี ารแบ่่งตััวมัักใช้ไ้ ม่่ ได้้ผลในการรัักษาการติดิ เชื้อ� นี้้� เนื่่อ� งจากเชื้อ� นี้้เ� จริญิ ช้า้ นอกจากนี้้เ� ชื้อ� Mycobacteria เป็็นเซลล์ท์ ี่่�มีี lipid สููง และเป็็น intracellular bacteria ของ macrophage มีีผลให้้ สารผ่่านเข้้าสู่�เซลล์์ได้้ไม่่ดีี และเชื้�อชนิิดนี้้�ก็็เกิิดการดื้�อต่่อสารต้้านจุุลชีีพได้้ง่าย ดัังนั้้�น ในการรักั ษาจึึงต้อ้ งใช้ส้ ารต้า้ นจุลุ ชีพี หลายชนิดิ ร่่วมกันั ในการรักั ษา เพื่่อ� ป้อ้ งกันั การเกิดิ การดื้อ� ยา โดยต้อ้ งรักั ษาหลายเดือื น ซึ่่ง� สารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่ใ� ช้เ้ ป็น็ first line คือื isoniazid, rifampin (หรือื rifamycin ตััวอื่น� ), pyrazinamide, และ ethambutol Isoniazid Isoniazid (INH) เป็น็ สารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่อ� อกฤทธิ์ด� ีมี ากในการรักั ษา tuberculosis เนื่่อ� งจากเชื้อ� มักั ไวต่่อยา ซึ่่ง� ยานี้้ม� ีขี นาดเล็ก็ จึึงผ่่านเข้้าสู่เ� ซลล์์ macrophage ได้้ดี ี จึึงมีี ผลต่่อเชื้ �อทั้้�งที่่�อยู่�ในและนอกเซลล์์ อย่่างไรก็็ตามยานี้้�จะออกฤทธิ์�น้้อยต่่อการติิดเชื้ �อ atypical mycobacterial species โดย isoniazid เป็็น prodrug ซึ่่�งจะ active โดยอาศัยั KarG และ mycobacterial catalase-peroxidase จากนั้้น� active isoniazid จะเกิดิ covalent complex กับั acyl carrier protein (AcpM) และ carrier protein synthetase (KasA) ซึ่่ง� มีผี ลยับั ยั้้ง� การสังั เคราะห์์ mycolic acids ที่่ผ� นังั เซลล์์ และทำ�ำ ให้้ เซลล์์ตาย จึึงออกฤทธิ์�แบบ bactericidal ต่่อเชื้ �อที่่�กำำ�ลัังเจริิญเติิบโต ผลข้้างเคีียง ที่่�พบบ่่อย คืือการ induced เกิิด hepatitis Rifampin หรืือ rifamycin ตัวั อื่น� Rifampin เป็็นสารอนุุพันั ธ์ข์ อง rifamycin ซึ่่ง� ออกฤทธิ์�ได้ด้ ีกี ัับเชื้อ� หลายกลุ่่ม� ทั้้�ง gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, Mycobacteria และ Chlamydia โดยออกฤทธิ์�จับั อย่่างแน่่นกับั ß-subunit ของ DNA-dependent RNA polymerase จึึงยัับยั้้�งการสัังเคราะห์์ RNA โดยสารต้้านจุลุ ชีพี สามารถไปยัังเนื้้�อเยื่�อ ต่่างๆ และเข้า้ สู่� phagocytic cells ได้้ คู่่�มืือการตรวจวินิ ิิจฉัยั โรคหนองใน 51 ทางห้้องปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

Pyrazinamide Pyrazinamide (PZA) มีีความสััมพันั ธ์ใ์ กล้้เคีียงกับั nicotinamide โดยเป็น็ ส ารที่่ไ� ม่่มีีฤทธิ์�ในภาวะเป็น็ กลาง (neutral pH) แต่่เมื่อ� อยู่�ในภาวะเป็็นกรด (pH 5.5) จะยัับยั้้�งเชื้ �อ TB และ Mycobacteria อื่่�นบางชนิิดได้้ที่่�ความเข้้มข้้น 20 µg/ml ดัังนั้้�นเมื่่�อยาเข้้าสู่ � macrophage จึึงมีีผลต่่อเชื้ �อ Mycobacteria ในเซลล์์ได้้ โดย pyrazinamide จะถููกเปลี่ย� นเป็น็ pyrazinoic acid โดยเอนไซม์์ pyrazinamidase ที่่�ถููกควบคุุมโดยยีีน pncA ของเชื้�อ Mycobacteria โดยยานี้้�เป็็นตััวสำ�ำ คััญในการใช้ ้ ร่่วมกับั isoniazid และ rifampin ในการรัักษาระยะสั้�น (6 เดือื น) ซึ่่�งการดื้อ� อาจเกิดิ จากการลดการนำ�ำ เข้า้ หรือื mutation ของ pncA จึึงมีผี ลให้ม้ ีกี ารเปลี่ย� นยาให้้ active ลดลง โดยเกิดิ ขึ้้�นค่่อนข้้างเร็ว็ แต่่จะไม่่มีี cross-resistance กับั ยาต้า้ นวัณั โรคกลุ่่ม� อื่น� ผลข้้างเคียี งที่่�พบบ่่อย คืือ hepatotoxicity (1-5%) คลื่�นไส้้ อาเจียี น Ethambutol Ethambutol เป็น็ สารสังั เคราะห์ท์ ี่่อ� อกฤทธิ์โ� ดยการยับั ยั้้ง� เอนไซม์์ mycobact- terial arabinosyl transferases ซึ่่�งควบคุุมโดย embCAB operon โดยเอนไซม์์ มีหี น้า้ ที่่เ� กี่ย� วข้อ้ งกับั การเกิดิ polymerization ของ arabinoglycan ซึ่่ง� เป็น็ ส่่วนประกอบ ที่่ส� ำำ�คััญของผนัังเซลล์์ของเชื้�อ การดื้�อยาเกิิดจากการ mutation มีีผลให้้มีี overexp- pression ของ emb gene product ซึ่่ง� การดื้อ� ยานี้้เ� กิดิ ขึ้น�้ ง่ายในเชื้อ� เมื่อ� มีกี ารใช้เ้ พียี ง ชนิดิ เดียี วในการรักั ษาการติดิ เชื้อ� Mycobacteria จึึงมักั ให้ร้่่วมกับั ยาชนิดิ อื่่น� ผลข้า้ งเคียี ง ที่่ร� ุนุ แรงจากการใช้ค้ ือื retrobulbar neuritis มีผี ลให้ก้ ารมองเห็น็ ไม่่ดีแี ละตาบอดสีไี ด้้ Alternative second line drugs มีสี ารต้า้ นจุลุ ชีพี บางชนิดิ ใช้เ้ ป็น็ alternative drug ในกรณีทีี่่� 1) พบเชื้อ� ดื้อ� ยากลุ่่ม� first line 2) ในรายที่่ก� ารรักั ษาไม่่ได้ผ้ ลในทางคลิินิกิ ในการรักั ษาด้้วย conventional therapy 3) ในรายที่่�ผู้้�ป่่วยแพ้้ยาที่่�ใช้้ในการรัักษาอย่่างรุุนแรง 4) มีี guideline สำ�ำ หรัับการดููแลเรื่อ� งความเป็็นพิษิ ยาที่่�ใช้้ เช่่น 52 คู่�่มืือการตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

- Ethionamide มีีความใกล้้เคีียงกัับ isoniazid และยัับยั้้�งการสัังเคราะห์์ mycolic acid เช่่นกันั - Capreomycin เป็็นสารต้้านจุุลชีีพที่่�ยัับยั้้�งการสัังเคราะห์์ peptide ของโปรตีีน โดยยานี้้เ� ป็็นยาฉีีดที่่ส� ำำ�คัญั ในการรัักษาผู้�้ ป่่วยวัณั โรคที่่�ดื้�อยา - Cycloserine เป็น็ สารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่ย� ับั ยั้้ง� การสังั เคราะห์ผ์ นังั เซลล์ ์ มีผี ลต่่อเชื้อ� Mycobacteria หลายชนิดิ แต่่มีีผลข้้างเคีียงต่่อระบบประสาทส่่วนกลางได้้ - Aminosalicylic acid (PAS) เป็็นสารต้้านจุุลชีีพกลุ่่�มยัับยั้้�งการสัังเคราะห์์ Folic acid เนื่่�องจากมีีโครงสร้้างคล้้าย PABA ซึ่่�งเป็็นยาที่่�ออกฤทธิ์�ได้้ดีี มากกับั เชื้อ� Mycobacteria เกือื บทั้้ง� หมด - Kanamicin & amikacin โดย kanamicin ใช้้รักั ษาวัณั โรคที่่เ� กิดิ จากเชื้อ� ดื้อ� streptomicin จากปััญหาการพบอุุบััติิการณ์์ของเชื้�อดื้ �อยาหลายชนิิดสููงขึ้้�น (multipledrug-resistant tuberculosis) ทำ�ำ ให้้ amikacin มีบี ทบาทมากขึ้น�้ เนื่่�องจากอุุบััติิการณ์์ของเชื้ �อดื้ �อ amikacin ต่ำำ�� และ amikacin ยัังใช้้กัับ atypical mycobacteria ได้ด้ ้ว้ ย โดยมักั ใช้้ amikacin ร่่วมกับั ยาอื่น� 2-3 ชนิดิ - Fluoroquinolones ออกฤทธิ์ �กัับ atypical mycobacteria ได้้ด้้วย โดยใช้้ยากลุ่่�มนี้้�ร่่วมกัับยาอื่ �น 2-3 ชนิิดโดยมัักใช้้ร่่วมในการรัักษากรณีีพบ เชื้อ� ดื้อ� ยา first line โดย moxifloxacin เป็น็ ตัวั ที่่อ� อกฤทธิ์ต� ่่อ M. tuberculosis ดีีที่่ส� ุุดในยากลุ่่�มนี้้� - Linezolid มีกี ารใช้ร้่่วมกับั ยา second และ third line ในการรักั ษาการติดิ เชื้อ� ชนิดิ multidrug-resistance ผลข้้างเคียี งของการใช้้ยานาน คือื การกดไข กระดููก ดัังนั้้�นยานี้้�ควรจะใช้้เป็็นตััวสุุดท้้ายที่่�ใช้้ในการรัักษาการติิดเชื้ �อดื้้�อ first และ second line - Rifabutin เป็น็ อนุพุ ันั ธ์ข์ อง rifamycin โดยออกฤทธิ์ไ� ด้ด้ ีตี ่่อ M. tuberculosis, M. avium intracellulare และ M. fortuitum โดยออกฤทธิ์ �เหมืือน rifampin และเกิดิ cross-resistance กับั rifampin ยานี้้�ใช้้ได้ผ้ ลดีีมากใน การป้อ้ งกันั และรักั ษาการติดิ เชื้อ� โรค disseminated atypical mycobacteria ในผู้�้ ป่ว่ ยเอดส์ท์ี่่ม� ีี CD4 <50 cells/µl และใช้ป้ ้อ้ งกันั การเกิดิ tuberculosis ได้้ คู่�่มือื การตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน 53 ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิิการทางการแพทย์์

- Rifapentine เป็น็ analog ของ rifampin จึึงมีฤี ทธิ์ย� ับั ยั้้ง� RNA polymerase โดยให้้ผลดีีมากกับั M. tuberculosis และ M. avium โดยยานี้้ม� ีี cross- resistance ระหว่่าง rifampin และ rifapentine นอกจากนี้้�ยานี้้ม� ีี toxicity เหมือื น rifampin ด้ว้ ย โดยยานี้้อ� าจใช้ใ้ นการรักั ษาการติดิ เชื้อ� Mycobacteria ที่่ไ� วต่่อยา rifampin เมื่อ� ใช้ต้ ่่อเนื่่อ� งหลังั จาก 2 เดือื น อย่่างไรก็ต็ ามในผู้�้ ป่ว่ ยเอดส์์ พบว่่ามีีอุุบััติิการณ์์การติิดเชื้ �อซ้ำำ��สููงด้้วยเชื้ �อดื้้�อยา rifampin จึึงไม่่ควรใช้้ ในการรัักษาการติดิ เชื้อ� ในผู้�้ ป่่วยกลุ่่ม� นี้้� กลไกการดื้อ�้ สารต้้านจุุลชีีพ การดื้ �อสารต้้านจุุลชีีพของเชื้�อเกิิดขึ้้�นจากการที่่�เชื้�อที่่�ไวมีีการเปลี่�ยนแปลงทาง พันั ธุกุ รรม โดยยีนี ดื้อ� สารต้า้ นจุลุ ชีพี อาจอยู่บ� นโครโมโซมหรือื พลาสมิดิ ก็ไ็ ด้ ้ซึ่่ง� การดื้อ� ยา อาจเป็็นผลจากการเกิิด mutation ของลำำ�ดัับเบสบนโครโมโซม หรืือการแลกเปลี่ย� น ยีีนดื้้�อสารต้้านจุุลชีีพระหว่่างแบคทีีเรีีย (horizontal gene transfer) โดยวิิธีี transformation, transduction หรืือ conjugation 1. Transformation เป็็นการส่่งต่่อยีีนโดยยีนี ดื้�อยาอยู่�ในรููปของ free DNA โดยอาจเป็็นส่่วนของโครโมโซมหรืือพลาสมิดิ แล้้วมีีการยีีนเข้้าสู่�เซลล์์ตััวรัับ (recipient) โดยยีีนสามารถสอดแทรกรวมกัับ genomic DNA ของเชื้อ� ได้้ โดยลำ�ำ ดับั เบสใน genomic DNA กับั insertion sequence ต้อ้ งคล้า้ ยคลึึงกันั เพื่่�อให้้ DNA ใหม่่เข้้าไปแทนที่่�และแลกเปลี่ �ยนกัับ DNA เก่่าของเชื้ �อได้้ โดยเกิิดทั้้�งในแบคทีีเรีียแกรมบวกและแกรมลบที่่�อยู่ �ในสกุุลเดีียวกัันหรืือ ใกล้้เคียี งกััน 2. Transduction เป็น็ วิธิ ีีการส่่งต่่อยีนี โดยยีีนดื้อ� ยาอยู่�กัับ bacteriophage และเมื่่�อ phage ไปอาศััยแบคทีีเรีียเซลล์์ใหม่่ก็็จะนำำ�ยีีนดื้้�อยาไปด้้วย โดยยีนี ดื้อ� ยาจะสอดแทรกกับั genomic DNA ของแบคทีเี รียี การแลกเปลี่ย� น 54 คู่�่มืือการตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

ยีีนดื้�อยาโดยวิิธีกี ารนี้้�เกิดิ ได้ท้ ั้้�งแบคทีเี รีีย แกรมบวกและแกรมลบ แต่่ต้อ้ ง เป็น็ ชนิดิ ที่่�ไวรัสั อาศัยั และเจริิญเติิบโตได้้ 3. Conjugation เป็น็ วิธิ ีกี ารส่่งต่่อยีนี ระหว่่างแบคทีเี รียี โดยผ่่านทาง sex pili เป็น็ ตัวั เชื่อ� มระหว่่างเซลล์ท์ ั้้ง� สอง ถ้า้ ยีนี ดื้อ� ยาอยู่บ� น conjugative plasmid จะสามารถส่่งต่่อการดื้ �อยาได้้โดยตรงและอาจเป็็นการถ่่ายทอดการดื้ �อยา หลายชนิดิ พร้อ้ มกันั ได้้ แต่่สำ�ำ หรับั ยีนี ดื้อ� ยาอยู่บ� น non-conjugative plasmid อาจถููกส่่งไปยังั เซลล์ต์ ัวั รับั ได้โ้ ดยอาศัยั ร่่วมไปกับั การส่่งต่่อของ conjugative plasmid เชื้�อจุุลชีีพที่่ม� ีียีีนดื้�อสารต้้านจุุลชีีพ พบการแสดงออกด้้านกลไกทางชีีวเคมีี ได้ห้ ลายแบบ โดยการดื้�อสารต้า้ นจุุลชีีพหนึ่่�งชนิดิ อาจเกิิดได้้จากกลไกหลายแบบ และ กลไกที่่�พบบ่่อยในเชื้ �อแต่่ละชนิิดอาจมีีความแตกต่่างกัันได้้ ซึ่่�งกลไกที่่�พบบ่่อยที่่�ก่่อให้้ เชื้�อดื้�อสารต้า้ นจุุลชีพี คืือ 1. Drug inactivation or modification (การทำำ�ลายยา) เชื้้�อดื้้�อยาหลายชนิิดมีีการสร้้างเอนไซม์์มาทำำ�ลายสารต้้านจุุลชีีพได้้ เช่่น การสร้้าง ß-lactamases ของเชื้้�อเพื่่�อทำำ�ลายสารต้้านจุุลชีีพกลุ่่�ม ß-lactams โดยเมื่อ� ทำ�ำ ลาย penicillin เกิดิ เป็็น penicilloic acid และทำำ�ลาย cephalosporin เกิิดเป็็น cephalosporic acid ซึ่่�งไม่่มีีฤทธิ์�ต้้านเชื้ �อ โดยเอนไซม์์ ß-lactamase มีหี ลายชนิิดดังั นั้้น� ความสามารถในการทำำ�ลาย ß-lactams จึึงแตกต่่างกัันได้้ตามชนิดิ ของเอนไซม์์ เช่่น ถ้้าเชื้อ� สร้้าง extended spectrum ß-lactamases มีีผลให้เ้ ชื้�อดื้อ� ß-lactams เกือื บทั้้ง� หมด ยกเว้น้ cephamycin และ carbapenems ซึ่่ง� ß-lactamase พบได้้ทั้้�งในเชื้ �อแบคทีีเรีียแกรมบวกและแกรมลบ นอกจากนี้้� พบเชื้ �อสร้้างเอนไซม์์ chloramphenicol acetyltransferase (CAT) ซึ่่ง� ทำำ�ลายสารต้้านจุุลชีพี chloramp- phenicol ได้ห้ รือื เชื้อ� สร้า้ งเอนไซม์ท์ ี่่ท� ำ�ำ ให้เ้ ปลี่ย� นโครงสร้า้ งสารต้า้ นจุลุ ชีพี aminoglyc- cosides ด้ว้ ยการเกิดิ acetylation, adenylation หรืือ phosphorylation ทำำ�ให้ ้ สารต้า้ นจุุลชีีพออกฤทธิ์�ไม่่ได้้อีีกต่่อไป คู่�ม่ ืือการตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน 55 ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

รูปที่ 3.3 ตัวอยõางการสรèางเอนไซมของเชื้อซึ่งมีผลในการทำลายสารตèานจุล ชีพรู(ูปWที่a่� l3s.h3 Cตั.ัวNอยa่่าtงuกreารส2ร0้้า0ง0เอ;4น0ไซ6ม:์์ข7อ7ง5เ-ชื้7�อ8ซึ่1่�ง)ม.ีีผลในการทำำ�ลายสารต้้านจุุลชีีพ (Walsh C. Nature 2000;406: 775-781). 2. Modified target sites (การเปลยี่ นแปลงเปาà ของสารต'านจลุ ชีพ) 2. Moกdาifรiอedอกtaฤrทgeธtิ์ขsอitงeสsา(รกตาèารนเปจลีุล่่ย� ชนีพแปตลèองเงป้จา้ ับขอกงับสเาปร=าต้ห้านมจาุุลยชีี(พt)arget sites) ไดè จึงจะสกาามรอาอรถกฤททำธงิ์ �าขนองไสดาè รดตัง้้านนั้นจุเุลมชื่อีีพม ีกต้า้อรงเจปัับลกัี่ยับนเปแ้้าปหลมงาขยอง(tเaปrg=าeหtมsาiยteจs)ึงมไดีผ้้ ล ตõอจึกึงาจระสจาับมขารอถงทำส�ำ งาารนตไดèา้้ นดัังจนัุ้ล้�นชเมืีพ่ อ� มีเีกชาõนรเปเลอี่�ยนนไแซปมลง ขtrอaงnเปs้้าpหeมpาtยi dจึึaงsมีeีผล(ตp่่อeกnาiรcจiัlบั lin binขdอiงnสgารpต้rา้ oนtจeุุลinชีีพs, เPช่่BนPเsอ)นเไปซมìน์์ เtปra=าnหspมeาpยtใidนaกsาeร(จpับeขniอciงllสinารbตinèาdนinจgุลชpีพroกteลinุõมs,ß- lacPtBaPms)sเปเ็มน็ ื่เอป้เ้าชหื้อมาSยใtนaกpาhรyจัlับoขcอoงสcาcรuต้s้านaจuุลุ rชeีพี uกsลุ่่ไ�มดßèร-ัlบaยctีนamms eเมื่cอ� Aเชื้ท�อ ำSใtaหpèมhีกyl-าร สรèlาoงcoPcBcPu2s aau(หreรuือs เไรด้ีย้รัับกยีวีนõา mPBecPA2’ทำ)ำ�ใมห้ีผ้มีลกี าใรหสèเรช้า้ ื้งอดPBื้อPส2าaร(ตหèราืือนเรจียี ุลกวช่่าีพPกBลPุõม2’)ß - lacมtีaีผmลใหs้้เทชื้ง้ั�อหดื้้ม�อสดา(รmต้้าeนtจhุุลicชีilีพliกnลุ่่r�มesßis-ltaacntatmStsa ทัp้้�งhหyมloด c(omcectuhsicailulirneuress,isMtaRnStA ) หpสนnาอรรชม(กSeืกอสีtนาตีผuเาิกaรดิลหรèmาอpเืาตใป่ันน้h่หรง��นoล้ีy่ืตจอ้เเนย�้nชlืน้ปุ้จลoนอ�อiกaาลcแกชาeoกปเSีี่รพยหc,tลสันrนทßcงงNัืeือuเเ-แำpปค.lจs้ใatปรา้ gาoหาขcaกoละcอ tèuเnoหงaชงß์rcoส์โme-pื้อcคlาureauรrsดรscphตs,้ืt้งอเtา้oaiชสMdpนยmeõนonจรRาaุsgลุeกè าSelชuพyAัเงนีชพีmc่)ข่ดบนaทเ้ืoำออnหกใช�ำ ัnน)นังรใõนืหpเiือกa้ปPเ้็เeกชeชน็กาื่้B่nาอ�,นราDPรดi ืดNcร้เ-sอ� กปaiเ.ื้อlยาlปลมlaีรg่าiต�ลnย-เีoผDพปõอนี่ยnล-กลบีแสl่oนaย�ใใาปrานcหแนrรล รhกแมปเè เงีตoาผปีปชโลรeèลคาลลืด้งอืaใ้รนงอ�หีข่ยeขง้ตจเ้S่สอ อนช่ดือุ้ืลรtงอ�ง้้แ้สr้า�อชเeาDกปDงิีรพpขดิ-p-ลตaอกt้aพelา้งoางalnนเชaรc-ปiจDดPc-ืนoุ้ลุDอ�i-=BาlcaิดชตlP-ข่ีlic่พีanอaอsอul ื่ นaงs glycopeptides, การเปลี่�ยนแปลงของเอนไซม์์ DNA gyrase และ topoisomerase49 IV มีีผลให้้เชื้�อเกิิดการดื้ �อต่่อ fluoroquinolone, การเปลี่�ยนแปลงของ ß-subunit ของ RNA polymerase มีผี ลให้เ้ ชื้อ� เกิดิ การดื้อ� ต่่อ rifampin และการเปลี่ย� นแปลงของ dihydrofolate reductase มีผี ลให้เ้ ชื้�อเกิิดการดื้อ� ต่่อ trimethoprim 56 คู่่�มืือการตรวจวิินิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้้องปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

เปลี่ยนแปลงของ ß-subunit ของ RNA polymerase มีผลใหèเชื้อเกิดการด้ือ ตõอ rifampin และการเปลี่ยนแปลงของ dihydrofolate reductase มีผลใหè เช้ือเกิดการดือ้ ตõอ trimethoprim รูปท่ี 3.4 ตัวอยõางการการเปลี่ยนแปลงเป=ามีผลใหèเชื้อดื้อสารตèานจุลชีพ (Waรูlูปsทhี่่� 3C..4N ตัaวั tอuย่r่าeงก2า0ร0ก0าร;เป40ลี่ย�6น:7แ7ป5ล-ง7เป8้า้1ม)ี.ีผลให้้เชื้�อดื้�อสารต้้านจุุลชีพี (Walsh C. Nature 2000; 406:775-781). สารจอ ุีต33ลุกี .วèา.ช ิีDนธิพี ีeหี จสDเกูcูซนกงึุลา่er่พง�าลeรชเcรอกaลทีพทิrีทดิs่ีO)e่่ี่ย�่ยสeจ�จaาdาะูงาจsกจอพeuะกอะอยpdากัยทับรtฤยับัaมuี่จ้ที้kปีย�งpะธิe์กรก�ั้งิอtมิาร(กaอรากะkาณเกาทจeรรรฤสบิเลติาญท่จ(ด่รกอรหธตก้กิญิา์กรา้าืาือนรรรหรผทจะลเ่ำุรจา่ลุำ�ทรดือนลชิีญิบกพีขาทยตขอใาำนเองõอชรลื้เสงซก�อผาเาชลืไาย้รlาดอ�ลร้ต์เ้ น้ล์ชเด้าจัจดำงันขื้อำ�ลรนัจเ้ไอ้งุิญน�ปดุล ็งทก็นชขèำีสำ�าจตีอ้ใรพา้อำหเดงื้ข้เงรเ้้เอ� ปชม้าืช้ตีขอ�เีปìนื้ซออ'ไารมลตงิ่นิมดเ่ลชèถอื์าู้ังจ์)ูอ� งณกนยทุลมัี่บัส่ั้นยพ� ีปชัา้กบ้รง�บรีพ่าตหิม่้รอ้ารเืานขดอืยณ ้ือ'า ของถูเูชกทื้อำำ�ทลี่พายบบเชืõอ้้�อยดื้อ้�อีกยวาิธหีหลนายึ่งชเกนิิดิดจพาบวก่่กาารเกมิิดีปจราิมกาลณดกสาารรผ่ต่าèานนขจอุลงยชาีพเขใ้น้าเเซซลลล์ล์ ลเชด่่นลง ทำใกหาèเรชเปื้อลไี่ม�ยõถนูกแปยับลงยขั้งอหงรือpoถrูกinทsำ ซลึ่่า�งยเป็เ็นชโื้อปดรตื้อีีนยทาี่่ห�พบลาไดย้้ตชานมิดรููพในบเยวื่ �อõาหุ้เ�มกเิดซจลาล์ก์เพลื่่�อดลกด า ร ผõานกขารอเขง้า้ยขาอเขงสèาาเรซต้ลา้ ลนจุเลุ ชชõีนพี ก(เชา่่นร เปกาลรดี่ยื้อ� นcแhปloลrงaขmอpงhepnoicrionl)sหซรืึ่งอื เกปาìนรมโีปีปั๊๊ม� รเตพื่่ีนอ� ขทับั ี่พสบารไดè ต้า้ นจุลุ ชีพี ออกนอกเซลล์ใ์ นปริมิ าณที่่ม� ากกว่่าการ เข้า้ เซลล์์ (เช่่น การดื้อ� tetracycline) 50 คู่ม�่ ือื การตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน 57 ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

chloramphenicol) หรือ การมีปûΩมเพื่อขับสารตèานจุลชีพออกนอกเซลลใน ปริมาณท่มี ากกวาõ การ เขèาเซลล (เชõน การด้ือ tetracycline) รูปรทููปี่ 3ที่.่� 53.ภ5าภพาแพสแดสงดกงการารมมีปีีปั๊ûΩม๊�มเเพพื่่ือ� ขขัับบสสาารรต้ต้าèานนจุุลจชุลีีพชมีพีีผมลีผใหล้้เใชืห้ �อèเดชื้้�อื้อสดาื้อรตส้้าานรจตุุลèาชนีีพจุล ชพี (W(WalashlshC.CN.aNtuaretu2r0e002;04060:;470765-:77871)5.-781). กดèาวรย กกเลากพรไลกผอิ่มลืไ่ิ่กปนน�ติ นอๆสอรอา ื่นิกมกบร้จๆจา้าตั้งาาณง� กบตกเช้ก่กน้่กèานลาใงลหsไร้ไuกม้เผกีดชlปีัfลดoõนังริิตักงnมิ ลก่asสา่umลณาาสวlõาูรifูขdวo้ตง้eาขจnั้งงsะèาต aตม้ทงี้ำนmèโีนต�ำ ค ใèนใมiรหdีห้งีส้กeสมèมาารsีก้มรีปา้ พาางมรรครบีโถิมลพคก้แา้าาบรยย่ณร่งงกสดืสจ้าสาั้�อบัรรรูงสตเัèาด้อจาง�็งื้อน็ตระค้ตน้ไสท้ซล้า าดมำèนาั์รงัแ์ใยจตนหัุลุ้้สลน�èาะèสชานกเีชาีพืรา้จอ�มรตขุลเเาอจั้พงิชร่ร่งติม� ีพญิเถปèชนื้ขเแร�อติอมิิดยดบิ้าง้ัวõงงโณเตยนจช ั ้ับนื้อ เอ็นต่่อไไซปมไดแ้้ ลเช่ะ่นเ ชกื้าอรเเจพิ่่ร�มิรญะเดัตับิบขอโงตตpaõอpไaป-aไmดèinเoชbõนenกzoาiรcเพacิ่มidระ(PดABับAข) อหงรืือpเaพิ่่p�มa - amปinริิมoาbณeเnอ็็นzoไซiมc์์เพaื่่c�อiแdข่่ง(กPัับAปBรAิิม)าณหรยืาอ เกพ็็จิ่มะปทำรำ�ใิมห้า้เชณื้ �อเเอจร็นิิญไซเติมิบเโพตตื่อ่่อแไขปõงไกด้้เับช่่นปกรัันิมาเณช่่นยา ก็จกะาทรเำพิ่ใ่�มหdèเชihื้อydเrจoรfoิญlaเtตeิบreโdตuตcõอtaไsปeไ(ดDHèเชFRõน) กก็ัน็จะทเำช�ำ ใõนห้้เชกื้อ� าดืร้ �อเพtr่ิมimdetihhoypdrrimofolate reductase (DHFR) ก็จะทำใหเè ช้อื ดือ้ trimethoprim 51 58 คู่ม่� ืือการตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

การดื้�อ้ สารต้า้ นจุุลชีพี ของเชื้�อ้ หนองใน โรคหนองในเป็น็ เชื้อ� ก่่อโรคติดิ ต่่อทางเพศสัมั พันั ธ์ท์ี่่ร� ักั ษาได้้ (curable sexually transmitted diseases) เกิดิ จากเชื้อ� หนองใน (Neisseria gonorrhoeae) โดยเชื้�อ N. gonorrhoeae และ Haemophilus ducreyi เป็็นเชื้�อก่่อโรคที่่�สำ�ำ คััญที่่�มีกี ารดื้�อ ยาสููง ทำำ�ให้้ยากแก่่การรัักษาและควบคุุม โดยเชื้ �อหนองในมีีการพััฒนาการดื้ �อยาได้้ หลายชนิดิ และที่่�สำ�ำ คััญ ได้้แก่่ 1. Penicillins การดื้ �อยา Penicillins ในเชื้�อหนองในมีีการระบาดทั่่�วโลก ซึ่่�งยีีนดื้ �อยาที่่ � พบมีีทั้้�งที่่�อยู่่�บนพลาสมิิดและโครโมโซม โดยการระบาดด้้วยการสร้้างเอนไซม์ ์ penicillinase ที่่�เรีียกว่่า penicillinase producing N. gonorrhoeae (PPNG) มียี ีนี ควบคุมุ อยู่บ� นพลาสมิดิ และเอนไซม์ท์ี่่พ� บส่่วนใหญ่่เป็น็ penicillinase ชนิดิ TEM-1 ซึ่ง� เป็็นชนิิดของเอนไซม์ท์ ี่่พ� บได้้บ่่อยที่่�สุุดในเชื้อ� แบคทีเี รีีย โดยเอนไซม์์ penicillinase ชนิดิ TEM-1 เป็น็ ชนิดิ ที่่ส� ามารถย่่อยได้เ้ ฉพาะ narrow spectrum penicillins (กลุ่่ม� 2b) เช่่น penicillin, ampicillin และ amoxycillin เป็น็ ต้น้ นอกจากนี้้ � มีกี ารพบเอนไซม์ช์ นิดิ TEM-135 ในเชื้ �อหนองใน โดยเอนไซม์์นี้้�มีีความแตกต่่างกัับเอนไซม์์ชนิิด TEM-1 ในตำำ�แหน่่งของกรดอะมิิโนที่่� 182 โดยเปลี่ �ยนจาก methionine เป็็น threonine (Met182Thr) ซึ่่ง� เอนไซม์น์ ี้้�ยัังคงคุุณสมบััติิของการย่่อยได้้เฉพาะ narrow spectrum penicillins (กลุ่่ม� 2b) ซึ่่ง� พลาสมิดิ พาหะของเอนไซม์์ penicillinase ที่่พ� บในเชื้อ� หนองใน มีีได้้หลายชนิิด คืือ Africa, Asia, Toronto, Rio, Nimes, New Zealand และ Johannesberg โดยการระบาดของเชื้�อ PPNG เกิดิ จากการพบพลาสมิิดชนิดิ Africa, Asia, หรืือ Toronto สำำ�หรัับกรณีพี บยีนี ดื้�อยาบนโครโมโซมเกิิดจากกลไกอื่่�นๆ ที่่ไ� ม่่ใช่่ การสร้า้ งเอนไซม์ซ์ึ่ง� มียี ีนี ควบคุมุ อยู่บ� นโครโมโซม จึึงเรียี กว่่า chromosomal mediated resistance N. gonorrhoeae (CMRNG) เช่่น การกลายพันั ธุ์�ของ PBP-1 และ PBP-2 ทำ�ำ ให้ล้ ดการจับั ของยา penicillins ต่่อเป้า้ หมาย โดย PBP-1 และ PBP-2 มีกี ารควบคุมุ ด้ว้ ยยีนี ponA และ penA ตามลำ�ำ ดัับ นอกจากนี้้� พบความเกี่ย� วข้้องกัับยีีนหลายชนิิด คู่�่มือื การตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน 59 ทางห้้องปฏิบิ ัตั ิิการทางการแพทย์์

เช่่น การกลายพันั ธุ์�ของ penB และ penC (pilQ) มีีผลต่่อ porin โดยมีีผลลดการเข้้า ของยาสู่�เซลล์์ได้ห้ ลายชนิิด จึึงมีผี ลให้้เกิิดการดื้อ� ต่่อยา penicillins, tetracyclines, และ quinolones สำำ�หรัับการกลายพันั ธุ์�ของ mtr มีีผลกระตุ้�นต่่อ MtrCDE efflux pump ซึ่่�งมีีผลให้้เกิดิ การดื้อ� ต่่อยา ß-penicillins, tetracyclines และ quinolones โดยในเชื้อ� ตัวั เดียี วกันั อาจพบการดื้อ� ยา penicillins ทั้้ง� PPNG และ CMRNG ร่่วมกันั ได้้ 2. Tetracyclines การดื้อ� ยา tetracyclines ในเชื้�อหนองในพบระบาดทั่่�วโลก โดยการดื้อ� ยา มีียีีนที่่�เกี่ �ยวข้้องได้้ทั้้�งบนโครโมโซมและพลาสมิิด โดยยีีนบนโครโมโซมเกี่ �ยวข้้องกัับ การกลายพัันธุ์�ของ mtr และ penB ซึ่่�งก่่อให้เ้ กิดิ การดื้อ� ยาในความเข้้มข้น้ ต่ำ�ำ� ในขณะ ที่่�ยีีนควบคุุมที่่�อยู่ �บนพลาสมิิด เกิิดจากมีียีีน tetM ใน 24.5 Mda conjugative plasmid โดยพบชนิิดหลัักของ tetM 2 ชนิิด คืือ Dutch และ America ซึ่่�งมีี ความแตกต่่างของลำำ�ดัับเบสเล็็กน้อ้ ย โดยการดื้อ� ยาที่่ม� ีียีนี บนพลาสมิดิ ก่่อให้้เกิิดการ ดื้อ� ยาในความเข้ม้ ข้น้ สููง เรียี กเชื้อ� กลุ่่ม� นี้้ว� ่่า tetracycline-resistant N. gonorrhoeae (TRNG) โดยยีีน tetM มีีการระบาดในเชื้�อประจำำ�ถิ่่�นของระบบสืืบพัันธุ์์� ซึ่่�งการมีียีีน บนพลาสมิดิ ร่่วมกับั การมีี selective pressure เนื่่อ� งจากการใช้ย้ ากลุ่่ม� tetracyclines ในการรัักษาโรคติิดต่่อทางเพศสััมพันั ธ์์ก่่อให้้เกิิดการระบาดของเชื้�อ TRNG 3. Quinolones การดื้้�อยากลุ่่�ม quinolones ของเชื้ �อหนองใน (quinolone-resistant N. gonorrhoeae, QRNG) มีียีีนควบคุุมอยู่บ� นโครโมโซม โดยมีีกลไกที่่�พบหลััก คืือ กลายพัันธุ์�ของยีีน gyrA และ parC ซึ่�งมีผี ลให้้การจับั ของยาที่่�เป้้าหมายลดลง (target alteration) โดยการกลายพันั ธุ์�ของยีนี gyrA มีผี ลต่่อ DNA gyrase subunit A (GyrA) โดยพบตำำ�แหน่่งการกลายพัันธุ์�ของกรดอะมิิโนที่่�พบบ่่อย คืือ serine ที่่�ตำำ�แหน่่ง 91 60 คู่�่มือื การตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

(Ser-91) และ aspartic acid ที่่ต� ำ�ำ แหน่่ง 95 (Asp-95) ในขณะที่่ก� ารกลายพันั ธุ์�ของยีนี parC มีผี ลต่่อ DNA topoisomerase IV โดยพบตำ�ำ แหน่่งการกลายพันั ธุ์�ของกรดอะมิโิ น ที่่�พบบ่่อย คืือ Asp-86 Ser-87, Ser-88 และ Gly-91 ซึ่่�งการกลายพัันธุ์�ของ DNA topoisomerase IV ร่่วมด้ว้ ยทำ�ำ ให้เ้ พิ่่ม� ความเข้ม้ ข้น้ สููงขึ้�น้ นั่่�นคือื การดื้�อยาในความ เข้้มข้น้ สููงขึ้้น� เมื่อ� มีีการกลายพันั ธุ์�หลายเป้้าหมาย (alteration in multiple targets) ในขณะที่่�กลไกจาก efflux pump พบการดื้�อยาในความเข้้มข้น้ ต่ำ�ำ� ซึ่่ง� มีกี ารรายงาน พบเชื้อ� QRNG สููงขึ้้�นและมีี MIC สููงขึ้�้นด้ว้ ย 4. Spectinomycin และ aminoglycosides ยา spectinomycin เป็น็ ยาที่่อ� อกฤทธิ์ไ� ด้ด้ ีใี นการรักั ษาการติดิ เชื้อ� หนองใน โดยพบเชื้ �อดื้้�อยาเป็็นครั้�งคราว ซึ่่�งการดื้้�อยากลุ่่�มนี้้� มีียีีนควบคุุมอยู่ �บนโครโมโซม โดยเกิิดจากการกลายพันั ธุ์�ของ ribosomal genes โดยการดื้อ� ยา spectinomycin เกิิดจากการกลายพันั ธุ์�ของยีนี spc ในขณะที่่ก� ารดื้อ� ยา aminoglycosides เกิดิ จาก การกลายพันั ธุ์�ของยีนี kan นอกจากนี้้� พบว่่า เชื้อ� ที่่ม� ีคี ่่า MIC สููงขึ้น�้ ของยา gentamicin เกี่�ยวข้้องกับั กลไกของ porin ด้ว้ ย 5. Macrolides ยา azithromycin ซึ่่�งเป็น็ อนุพุ ันั ธ์ข์ อง erythromycin เป็น็ ยาที่่ใ� ช้้ในการ รักั ษาการติดิ เชื้อ� หนองในได้ด้ ีี โดยยานี้้เ� ป็น็ ยาที่่ใ� ช้ใ้ นการรักั ษาการติดิ เชื้อ� Chlamydia trachomatis สำ�ำ หรับั เชื้อ� ดื้อ� ยาพบยีนี ควบคุมุ การดื้อ� ยา อยู่บ� นโครโมโซม โดยเกี่ย� วข้อ้ ง กัับการกลายพัันธุ์�ของ 23sRNA rrl ซึ่่�งควบคุุมโดยยีีน mtrR และ mtrC นอกจากนี้้� เกี่ �ยวข้้องกัับการกลายพัันธุ์�ของ ermB, ermC และ ermF มีีผลเกิิด methylase ของเป้า้ หมายในการจัับของยา ทำำ�ให้้ยาจัับได้ล้ ดลง คู่ม�่ ือื การตรวจวิินิิจฉััยโรคหนองใน 61 ทางห้อ้ งปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

6. Sulphonamide-trimethoprim combinations Sulfamethoxazole -trimethoprim (cotrimoxazole) เคยเป็็นยาที่่�นำ�ำ มาใช้ใ้ นการรักั ษาการติดิ เชื้อ� หนองใน ซึ่่ง� ต้อ้ งใช้ห้ ลาย dose จึึงทำ�ำ ให้ง้่ายต่่อการพัฒั นา การดื้ �อยาเนื่่�องจากปััญหาในการควบคุุมดููแลเรื่�องการใช้้ยา โดยยีีนควบคุุมการดื้�อยา อยู่บ� นโครโมโซม โดยเกิดิ จากการสังั เคราะห์ส์ ารตั้ง� ต้น้ p-aminobenzoic acid (PABA) ในปริมิ าณมากกว่่าปกติ ิซึ่่ง� เกิดิ จากการกลายพันั ธุ์�ของยีนี dihydropteroate synthetase 7. Chloramphenicol /Thiamphenicol Chloramphenicol เป็น็ ยาที่่น� ำ�ำ มาใช้ใ้ นการรักั ษาการติดิ เชื้อ� ในหลายประเทศ และมีกี ารกล่่าวถึึงประสิทิ ธิภิ าพในการรักั ษาการติดิ เชื้อ� หนองใน โดยการดื้อ� ยา พบว่่ามีี ยีีนควบคุุมอยู่ �บนโครโมโซม โดยเกี่ �ยวข้้องกัับการกลายพัันธุ์�ของยีีน penB, mtrR และ chl 8. Cephalosporins ปััจจุบุ ัันใช้้เป็็น first-line ในการรัักษาหนองใน โดยการดื้อ� ต่่อ penicillins ของเชื้อ� พบการเกิดิ cross-resistance กับั ยา cephalosporins รุ่่น� แรกได้้ โดยเกิดิ การเปลี่ �ยนแปลงของเป้้าหมาย (target alteration) ทำำ�ให้้ยาเข้้าสู่ �เซลล์์ได้้ลดลง โดยขณะนี้้� พบเชื้อ� ให้ผ้ ลไวต่่อยาลดลง (decreased susceptible) เพิ่่ม� ขึ้น�้ ซึ่่ง� เกิดิ จาก การกลายพันั ธุ์�ของยีนี บนโครโมโซม กลไกที่่�พบเกิิดจาก mosaic และ non mosaic ของยีนี penA นอกจากนี้้� เกี่ย� วกับั การกลายพัันธุ์�ของยีนี penB, ponA, และ mtrR 62 คู่�่มือื การตรวจวิินิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

เอกสารอ้า้ งอิิง 1. Katzung BG, edtor. Basic & clinical Pharmacology 10th ed. New York: McGraw-Hill Companies;2007. 2. Sabiha Y. Essack SY. The development of ß-lactam antibiotics in response to the evolution of ß-lactamases. Pharmaceutical Research 2001; 18 (10): 1391-1399. 3. Nora De Souza MV. New Fluoroquinolones: a class of potent antibiotics. Mini-Reviews inMedicinal Chemistry 2005; 5: 1009-1017. 4. Floss HG, Yu TW. Rifamycins-Mode of action, resistance, and biosynthesis. Chem Rev 2005;105: 621-632. 5. Zhanel GG, Walters M, Noreddin A, Vercaigne LM, Wierzbowski A, Embil JM, Gin AS, Douthwaite S, Hoban DJ. The Ketolides: A Critical Review. Drugs 2002; 62 (12): 1771-1804. 6. Lambert PA. Bacterial resistance to antibiotics: modified target sites. Adv Drug Deliv Rev 2005;57(10): 1471-85 7. Ang JY, Ezike E, Asmar BI. Antibacterial resistance. Indian J Pediatr. 2004; 71(3): 229-39. 8. Sefton AM. Mechanisms of antimicrobial resistance: their clinical relevance in the new millennium. Drugs. 2002; 62(4): 557-66. 9. Rice L. Evolution and clinical importance of extended-spectrum ß-lactamases. Chest 2001; 119 (suppl 2): 391s–396s. 10. Walsh C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 2000; 406: 775-781. 11. Lewis DA, Sheila A Lukehart SA. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae and Treponema pallidum: evolution, therapeutic challenges and the need to strengthen global surveillance. Sex Transm Infect 2011; 87: ii39-ii43. คู่�ม่ ือื การตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน 63 ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

12. World Health Organization. Emergence of multi-drug resistant Neisseria gonorrhoeae – Threat of global rise in untreatable sexually transmitted infections. [document on the Internet]. 2011 [cited 2012 May 3]. Available from: http://www.who.int/reproduc- tivehealth/publications/rtis/who_rhr_11_14/en/index.html 13. Allen VG, Farrell DJ, Rebbapragada A, Tan J, Tijet N, Perusini SJ, Towns L, Lo S, Low DE, Melano RG. Molecular Analysis of Antimicrobial Resistance Mechanisms in Neisseria gonorrhoeae Isolates from Ontario, Canada. Antimicrob Agents Chemother; 2011: 703-712. 14. Cole MJ, Chisholm SA, Hoffmann S, Stary A, Lowndes CA, Ison CA, the European Surveillance of Sexually Transmitted Infections Network. European surveillance of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae. Sex Transm Infect 2010; 86: 427-432. 15. Su X, Jiang F, Qimuge, Dai X, Sun H, Ye S. Surveillance of antimicrobial susceptibilities in Neisseria gonorrhoeae in Nanjing, China, 1999-2006. Sex Trans Dis; 2007, 34 (11): p.000-000 16. Vernel-Pauillac F, Nandi S, Nicholas RA, Cyrille Goarant C. Genotyping as a tool for antibiotic resistance surveillance of Neisseria gonorrhoeae in New Caledonia: evidence of a novel genotype associated with reduced penicillin susceptibility. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52 (9): 3293-3300. 17. Bala M, Sood S. Cephalosporin resistance in Neisseria gonorrhoeae. J Glob Infect Dis. 2010 Sep; 2(3): 284-90. 18. Ohnishi M, Ono E, Shimuta K, Watanabe H, Okamura N. Identification of TEM-135 beta-lactamase in penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae strains in Japan. Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54 (7): 3021-3. 64 คู่�ม่ ืือการตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

บทที่�่ 4 การทดสอบความไวต่อ่ สารต้้านจุุลชีพี ของเชื้้�อแบคทีเี รียี (Antimicrobial susceptibility testing) นางสาวมณีีมณฑ์์ โคเบนท์์ ผศ. ดร. รััตนา ลาวังั การทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุุลชีีพของเชื้ �อแบคทีีเรีียเป็็นขบวนการสำำ�คััญ สำ�ำ หรับั การประเมินิ ความสามารถของสารต้า้ นจุลุ ชีพี ในการยับั ยั้้ง� การเจริญิ หรือื ฆ่า่ เชื้อ� แบคทีีเรีียที่่�แยกได้้จากสิ่่�งส่่งตรวจ เพื่่�อให้้แพทย์์ใช้้เป็็นข้้อมููลประกอบการตััดสิินใจ เลือื กชนิดิ และระดับั ของสารต้า้ นจุลุ ชีพี ต่่อเชื้อ� แบคทีเี รียี ที่่เ� หมาะสำ�ำ หรับั การรักั ษาผู้�้ ป่ว่ ย รวมทั้้ง� ใช้้ในการศึึกษาแนวโน้ม้ การดื้�อยาของเชื้อ� ด้ว้ ย อย่่างไรก็ต็ าม การทดสอบความ ไวต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีพี ของเชื้อ� แบคทีเี รียี จัดั เป็น็ การทดสอบทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ าร การแปล ผลการทดสอบความไวต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีพี ของเชื้อ� แบคทีเี รียี อาศัยั การอ้า้ งอิงิ กับั ค่่ามาตรฐาน ซึ่ง� ถููกกำ�ำ หนดโดยหน่่วยงานสากล ที่่น� ิยิ มใช้ค้ ือื มาตรฐานของ Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ของประเทศสหรััฐอเมริิกา วิิธีีการทดสอบและค่่า มาตรฐานในการแปลผลมีีความแตกต่่างกัันไปตามชนิิดของเชื้ �อแบคทีีเรีียและชนิิด ของสารต้า้ นจุลุ ชีพี โดยการทดสอบจำ�ำ เป็น็ ต้อ้ งทำ�ำ ด้ว้ ยวิธิ ีมี าตรฐานที่่�กำำ�หนดไว้้ เพื่่อ� ให้้ สามารถเปรีียบเทียี บผลกัับค่่าอ้้างอิิงได้้ วิธิ ีีการทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุลุ ชีีพของเชื้�อ้ แบคทีีเรีีย การทดสอบความไวสามารถทำำ�ได้้หลายวิิธีี เมื่่�อพิิจารณาตามความละเอีียด ของผลการทดสอบแบ่่งได้้เป็็น 2 กลุ่่ม� คืือ 1. แบบกึ่่ง� ปริิมาณวิิเคราะห์์ (semiquantitative method) 2. แบบปริิมาณวิิเคราะห์์ (quantitative method) คู่�่มืือการตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน 65 ทางห้อ้ งปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

1. การทดสอบความไวแบบกึ่�่งปริิมาณวิิเคราะห์์ เป็็นวิิธีที ดสอบความไวอย่่างง่ายๆ และสะดวก นิิยมใช้ใ้ นกรณีตี ่่อไปนี้้� 1.1 ต้้องการทดสอบกัับแบคทีีเรีียหลายๆ สายพันั ธุ์� 1.2 ต้อ้ งการทดสอบผลเพีียงคร่่าวๆ ว่่าเชื้�อดื้อ� หรือื ไม่่ดื้้�อต่่อยา 1.3 ต้้องการทดสอบความไวกัับสารต้า้ นจุุลชีพี หลายชนิดิ แบคทีีเรีียที่่�นำำ�มาทดสอบด้้วยวิิธีีนี้้�จะต้้องสามารถเจริิญได้้ดีีในอาหารเลี้ �ยงเชื้�อ ทั่่ว� ๆ ไปและมีอี ัตั ราการเจริญิ เติบิ โตอย่่างสม่ำ��ำ เสมอ การทดสอบความไวแบบกึ่่ง� ปริมิ าณ วิิเคราะห์์ที่่�นิิยมใช้้ในปััจจุุบัันคืือ disk diffusion method หรืือ agar diffusion method 1.1. Disk diffusion method หรืือ Kirby Bauer’s method Disk diffusion method เป็็นวิิธีกี ารทดสอบความไวของเชื้�อแบคทีีเรียี ต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีพี เชิงิ คุณุ ภาพ และได้ร้ ับั การรับั รองเป็น็ วิธิ ีมี าตรฐานโดยสถาบันั ควบคุมุ มาตรฐานทางห้้องปฏิิบัตั ิิการ CLSI ซึ่่�งนานาชาติิยอมรับั และนิิยมใช้้ในงานประจำ�ำ วััน ของห้อ้ งปฏิบิ ััติิการต่่างๆ ทั่่ว� โลก เนื่่อ� งจากเป็็นวิิธีที ี่่�ทำำ�ได้ง้่าย สะดวก รวดเร็ว็ ผลที่่ไ� ด้้ มีีความสอดคล้้องกัับค่่าความเข้้มข้้นต่ำำ��สุุดของสารต้้านจุุลชีีพที่่�สามารถยัับยั้้�งการ เจริิญเติบิ โตของเชื้อ� ได้้ (minimal inhibitory concentration; MIC) และเป็็นข้อ้ มููล เบื้้อ� งต้้นแก่่แพทย์ใ์ นการเลือื กใช้ย้ ารัักษาผู้�้ ป่่วย 1.1.1 หลักั การ Disk diffusion method มีีหลัักการของการทดสอบ คืือสารต้้านจุุลชีีพที่่�ทราบความเข้ม้ ข้น้ จะแพร่่ทุุกทิิศทาง ออกจากแผ่่นกระดาษกรอง รููปกลม (disk) เพื่่�อไปยัับยั้้�งการเจริิญเติิบโตของแบคทีีเรีียที่่�เพาะเลี้ �ยงบนผิิวหน้้า อาหารแข็็ง ความเข้้มข้้นของสารต้้านจุุลชีีพสููงสุุดจะอยู่ �ใกล้้ disk และลดลงตาม ระยะห่่างจาก disk โดยสารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่ม� ีนี ้ำ��ำ หนักั โมเลกุลุ ขนาดใหญ่่จะเคลื่อ� นที่่ช� ้า้ กว่่า สารต้้านจุุลชีีพที่่�มีีน้ำำ��หนัักโมเลกุุลขนาดเล็็ก หลัังจากอบเพาะเลี้ �ยงเชื้ �อในสภาวะที่่ � เหมาะสมแล้ว้ จะนำำ�จานอาหารออกมาตรวจวััดขนาดเส้น้ ผ่่านศููนย์ก์ ลางของวงใสรอบ disk ที่่เ� กิดิ จากเชื้อ� แบคทีเี รียี ถููกยับั ยั้้ง� การเจริญิ (inhibition zone) เป็น็ หน่่วยมิลิ ลิเิ มตร และนำำ�ไปเปรีียบเทีียบกัับขนาดเส้้นผ่่านศููนย์์กลางในตารางแปลผลมาตรฐาน 66 คู่ม�่ ือื การตรวจวิินิจิ ฉััยโรคหนองใน ทางห้้องปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

ใน CLSI guideline รายงานผลเชิิงคุุณภาพเป็็นไว (susceptible; S), ไวปานกลาง (intermediate; I) ดื้้อ� (resistant; R) ไม่่ไว (nonsusceptible; NS) หรือื (susceptible- dose dependent (SDD) ไว (susceptible; S) หมายถึึงแบคทีีเรีียที่่�ทำำ�การทดสอบถููก ยัับยั้้�ง การเจริิญด้้วยสารต้้านจุุลชีีพอยู่ �ในระดัับไม่่เกิินค่่าจุุดตััดความไวของยา และ สามารถใช้้ยาในปริิมาณปกติิเพื่่�อยัับยั้้�งการเจริิญของเชื้ �อ ซึ่่�งบ่่งชี้ �ว่่าน่่าจะสามารถ ใช้ย้ าในการรัักษาทางคลิินิิกได้้ ไวปานกลาง (intermediate; I) หมายถึึง แบคทีีเรียี ที่่�ทำำ�การ ทดสอบถููกยัับยั้้ง� การเจริิญด้ว้ ยระดับั ของสารต้า้ นจุุลชีีพในระดับั สููงกว่่าระดัับที่่บ� ่่งชี้ว� ่่า เชื้อ� มีีความไวต่่อยา แต่่ต่ำ�ำ�กว่่าระดัับที่่�บ่่งชี้ว� ่่าเชื้�อดื้�อต่่อยา ดื้้�อ (resistant; R) หมายถึึงแบคทีีเรียี ที่่ท� ำำ�การทดสอบถููกยับั ยั้้ง� การเจริิญด้้วยสารต้้านจุุลชีีพอยู่ �ในระดัับสููงกว่่าระดัับของยาที่่�สามารถใช้้ได้้อย่่าง ปลอดภััยในเนื้้�อเยื่ �อหรืือสููงกว่่าค่่าจุุดตััดความไวของยาและปริิมาณยาที่่�ใช้้ไม่่สามารถ ยัับยั้้ง� การเจริิญของเชื้�อซึ่ง� บ่่งชี้ว� ่่าไม่่ควรใช้ย้ าดัังกล่่าวในการรักั ษาทางคลินิ ิกิ ไม่ไ่ ว NS (nonsusceptible) หมายถึึง แบคทีเี รียี ที่่ท� ำ�ำ การทดสอบ มีีค่่า MICs ที่่�สููงกว่่าหรืือขนาดของ inhibition zone แคบกว่่าค่่าจุุดตััดความไว (breakpoint susceptible) ที่่�กำำ�หนดในเชื้ �อที่่�การแปลผลเฉพาะที่่�ให้้ผลไวต่่อยา เนื่่�องด้้วยอุุบัตั ิิการณ์์ของเชื้อ� ดื้�อยายัังพบน้อ้ ยมากหรือื ไม่่พบเลย SDD (Susceptible dose dependent) หมายถึึง แบคทีีเรียี ที่่ท� ำ�ำ การทดสอบมีคี ่่าจุดุ ตัดั ความไว ที่่ใ� ห้ผ้ ลไวต่่อยาที่่ท� ดสอบเมื่อ� ใช้ใ้ นปริมิ าณที่่แ� นะนำ�ำ ให้ใ้ ช้้เพื่่อ� การรักั ษาผู้�้ ป่ว่ ย 1.1.2. ปัจั จัยั สำ�ำ คัญั เกี่ย�่ วกับั การทดสอบวิธิ ีี disk diffusion method การทดสอบความไวด้้วยวิิธีี disk diffusion การแปลผลขึ้�้นอยู่�กัับ ขนาดของ inhibition zone ดัังนั้้�น เราจึึงควรทราบปััจจััยที่่�มีีผลต่่อขนาดของ inhibition zone ซึ่่ง� มีหี ลายปััจจัยั ดังั นี้้� คู่ม่� ือื การตรวจวิินิจิ ฉััยโรคหนองใน 67 ทางห้้องปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

1. อาหารเลี้้�ยงเชื้้�อ (test medium) อาหารมาตรฐานสำำ�หรัับ ทดสอบความไวต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีพี ของแบคทีเี รียี คือื Mueller-Hinton agar (MHA) ที่่ม� ีี pH 7.2-7.4 และมีีการควบคุุมปริิมาณไอออนประจุุบวก (cation) ได้้แก่่ แคลเซีียม (Ca2+) ไม่่เกิิน 25 mg/l และแมกนีีเซีียม (Mg2+) ไม่่เกิิน 12.5 mg/l และกำำ�หนดให้ ้ อาหารเลี้ย� งเชื้อ� ปราศจากไทมีนี และไทมิดิ ีนี เพราะอาหารเลี้ย� งเชื้อ� ที่่ม� ีไี ทมีนี และไทมิดิ ีนี จะมีผี ลยับั ยั้้ง� การออกฤทธิ์ข� องซัลั โฟนาไมด์แ์ ละไตรเมโทพิมิ ความหนาของอาหารเลี้ย� ง เชื้�อมีีการกำำ�หนดมาตรฐานความหนาของอาหารเลี้ �ยงเชื้�อเป็็น 4 mm เตรีียมโดยใช้้ อาหารเลี้ย� งเชื้�อปริิมาตร 25 ml ในจานอาหารที่่ม� ีีขนาดเส้้นผ่่านศููนย์์กลาง 100 mm และใช้อ้ าหารเลี้ย� งเชื้อ� ปริมิ าตร 60 ml ในจานอาหารที่่ม� ีขี นาดเส้น้ ผ่่านศููนย์ก์ ลาง 150 mm ผิิวหน้้าของอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อต้้องเรีียบและมีีระดัับสม่ำำ��เสมอไม่่เอีียงลาดก่่อนนำำ�มาใช้ ้ ควรไว้ท้ ี่่�อุุณหภููมิิห้อ้ งและผึ่�งผิิวหน้้าอาหารเลี้ย� งเชื้อ� ให้้แห้้งก่่อน 2. สารต้้านจุุลชีีพ (antimicrobial disk) มีีลัักษณะเป็็น disk ขนาดเส้้นผ่่านศููนย์์กลาง 6 mm รายละเอีียดบนแผ่่นสารต้้านจุุลชีีพประกอบด้้วย ชื่อ� ย่่อและปริมิ าณยา แหล่่งที่่�มาของยาที่่�ใช้ท้ ดสอบควรได้ม้ าตรฐานและมีกี ารควบคุุม คุุณภาพทางห้้องปฏิิบััติิการการเก็็บรัักษา disk ควรเก็็บในกล่่องที่่�มีีสารดููดความชื้�น (desiccator) ที่่�อุุณหภููมิิ -20 °C จนกว่่าจะนำำ�มาใช้้ เมื่อ� นำ�ำ แผ่่นสารต้า้ นจุลุ ชีีพออก มาใช้้แล้้วสามารถเก็บ็ ที่่�อุุณหภููมิิ 2-8 °C ก่่อนนำำ�มาใช้้จะต้้องวางที่่�อุณุ หภููมิหิ ้้องอย่่าง น้้อย 1 ชั่่�วโมง ก่่อนใช้้งานเพื่่�อป้้องกัันการควบแน่่นของไอน้ำำ�� พบว่่าการนำำ�ส่่งและ การเก็็บสารต้้านจุุลชีีพที่่�ไม่่ถููกวิิธีีจะทำำ�ให้้สารต้้านจุุลชีีพเสื่ �อมคุุณภาพก่่อนถึึงวัันหมด อายุ ุ การใช้้ ในการทดสอบที่่ใ� ช้้ disk ที่่�เสื่�อมคุณุ ภาพหรืือหมดอายุ ุ มีผี ลทำ�ำ ให้ข้ นาด เส้้นผ่่านศููนย์ก์ ลางของวงใสที่่�เชื้�อถููกยับั ยั้้�งการเจริญิ (inhibition zone) เล็ก็ กว่่าความ เป็็นจริงิ ทำำ�ให้้การรายงานผลผิิดพลาดได้้ 3. ปริมิ าณเชื้อ�้ แบคทีีเรีีย (inoculum size) การเตรียี มแบคทีเี รียี สามารถทำ�ำ ได้้ 2 วิิธี ี คือื 3.1. การเตรีียมเชื้้�อด้้วย วิธิ ีี broth culture method - เลือื กโคโลนีทีี่่ม� ีลี ักั ษณะเหมือื นกันั 3 ถึึง 5 โคโลนีโี ดยใช้้ loop แตะส่่วนบนของโคโลนีี ใส่่ในอาหารเพาะเชื้ �อ 68 คู่ม่� ือื การตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

เช่่น tryptic soy broth หลอดละ 2 ml อบเพาะเลี้ย� งที่่� อุุณหภููมิิ 35 °C ประมาณ 2-5 ชั่่�วโมง วิิธีี broth culture method ไม่่แนะนำำ�ให้้ใช้้ในการเตรีียมเชื้ �อ Staphylococcus spp., Haemophilus spp., Streptococcus spp. และ N. gonorrhoeae เพื่่อ� ทดสอบความไวต่่อสารต้า้ นจุุลชีพี ด้ว้ ยวิธิ ีนี ี้้� 3.2 การเตรีียมเชื้�้อด้ว้ ย วิิธีี colony suspension - ใช้เ้ ชื้อ� isolated colony ซึ่ง� เพาะบนอาหารเลี้ย� งเชื้อ� ชนิดิ nonselective medium เช่่น blood agar เป็น็ เวลา 18-24 ชั่่�วโมง ใส่่ใน NSS หรืือ Mueller-Hinton broth เพื่่อ� ใช้ป้ รับั ความขุ่น� โดยวิธิ ีี colony suspens- sion นี้้ส� ามารถใช้เ้ ตรียี มเชื้อ� ทั่่ว� ไป รวมทั้้ง� เชื้อ� เจริญิ ยาก เพื่่�อใช้ท้ ดสอบความไวต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีีพ นำำ�เชื้�อที่่�เตรีียมมาปรัับเทีียบความขุ่�นให้้เท่่ากัับ 0.5 McFarland standard No.1 ซึ่่�งจะมีีจำำ�นวนแบคทีีเรีียประมาณ 1.5×108 CFU/ml การเทีียบความขุ่�นควร ทำำ�ในที่่ท� ี่่ม� ีแี สงสว่่างเพียี งพอโดยใช้ก้ ระดาษขาว ที่่ม� ีเี ส้น้ ตรงทึึบสีีดำำ�เป็น็ ฉากหลังั เทียี บ ความขุ่ �นโดยดููจากความชััดของเส้้นสีีดำำ�ผ่่านหลอดเชื้ �อ หากเชื้ �อมากเกิินไปจะทำำ�ให้้ เห็็นเส้้นสีีดำำ�ชััดเจนน้้อยกว่่าหลอด 0.5 McFarland standard No.1 ในกรณีีนี้้�ให้้ เจือื จางเชื้�อด้้วยการเติิม NSS หรือื Mueller-Hinton broth เพิ่่�ม แต่่ถ้า้ เป็น็ colony suspension แล้้วเชื้�อน้อ้ ยเกินิ ไปให้้เพิ่่�มเชื้�อลงในหลอดหรือื ถ้้าเป็น็ broth culture method เชื้ �อน้้อยเกิินไปแสดงว่่าเชื้ �อที่่�ได้้ไม่่อยู่ �ในช่่วง log phase ให้้เริ่�มต้้นตั้ �งแต่่ การเตรียี มเชื้�อใหม่่ หากใช้ว้ ิิธีีการเทีียบความขุ่�นอาจทำ�ำ ได้้โดยวััดด้้วยเครื่อ� ง spectrop- photometer ที่่ค� วามยาวคลื่�น 625 นาโนเมตร จะได้ค้ ่่าดููดกลืนื แสง (OD) ประมาณ 0.08-0.10 จำำ�นวนแบคทีีเรีียที่่�ใช้้ทดสอบ ถ้้าใช้้แบคทีีเรีียจำำ�นวนมากเกิินไปจะทำำ�ให้ ้ inhibition zone แคบ และถ้า้ ใช้้จำ�ำ นวนแบคทีีเรียี น้อ้ ยเกิินไปจะได้้ inhibition zone กว้้างกว่่าความเป็็นจริงิ คู่ม�่ ืือการตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน 69 ทางห้้องปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

4. อุุณหภููมิิ (temperature) โดยทั่่�วไปควรอบเพาะเลี้ �ยงเชื้�อที่่� ทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุุลชีีพของเชื้�อแบคทีีเรีียที่่�อุุณหภููมิิ 35 °C แต่่เกณฑ์์การ ยอมรัับของเชื้ �อและยาแต่่ละชนิิดมีีความแตกต่่างกััน เช่่น Staphylococcus spp. อบเพาะเลี้�ยงที่่� 35±2 °C และ N. gonorrhoeae 36±1 °C อุุณหภููมิทิ ี่่�ไม่่เหมาะสมมีี ผลต่่อการเจริิญของเชื้อ� ซึ่่�งทำ�ำ ให้้ความไวต่่อยาเปลี่�ยนแปลงไปได้้ 5. ระยะเวลาอบเพาะเชื้อ�้ (incubation period) อาจแตกต่่างกันั ในเชื้ �อและยาแต่่ละชนิิด และมีีผลต่่อการแปลผลความไวต่่อยาได้้ โดยทั่่�วไปควร อบเพาะเชื้�อเป็น็ เวลา 16-18 ชั่่�วโมง แต่่เชื้�อ N.gonorrhoeae อบที่่� 20-24 ชั่่�วโมง 6. การควบคุมุ คุณุ ภาพ โดยใช้เ้ ชื้อ� มาตรฐานดำ�ำ เนินิ การควบคู่่ก� ับั ระบบ ซึ่่ง� วิิธีกี ารทดสอบและการแปลผลเป็น็ ไปโดยวิิธีีเดียี วกันั หรืือเป็น็ ไปตามเกณฑ์์ ที่่ย� อมรับั ได้้ของ CLSI ซึ่่�งผลการควบคุุมคุุณภาพต้อ้ งผ่่าน ถึึงจะดำ�ำ เนินิ การรายงานผล การทดสอบได้้ การทดสอบและการแปลผลนี้้�ใช้ต้ าม CLSI กำำ�หนด วิิธีีการทดสอบ 1. หลังั จากเทียี บความขุ่น� กับั 0.5 McFarland standard No.1 (suspension solution) แล้้ว ให้เ้ พาะลงบนอาหารเลี้�ยงเชื้อ� ที่่เ� หมาะสม โดยใช้้ sterile swab size M จุ่่�มลงใน suspension solution หมุนุ swab หลายๆ ครั้ง� เพื่่�อให้้เชื้ �อซึึมเข้้าให้้ทั่่�ว แตะ swab กัับผิิวด้้านในของหลอดแล้้วหมุุนให้้ swab พอหมาดๆ นำำ�มาป้้ายเป็็น 3 ระนาบ ทำำ�มุมุ 60 องศาในแต่่ละครั้�ง ให้้เชื้ �อกระจายทั่่�วผิิวของอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อแล้้วป้้ายรอบขอบด้้านในของ อาหารเพาะเชื้อ� อีีกครั้�งหนึ่่�ง 2. ใช้้ forcep ที่่ท� ำ�ำ ให้ป้ ราศจากเชื้อ� คีบี disk มาวางบนผิวิ ของอาหารเลี้ย� งเชื้อ� ที่่ป� ล่่อยให้้ผิวิ อาหารเลี้ย� งเชื้อ� แห้ง้ แต่่ห้า้ มเกิิน 15 นาที ี กดเบาๆ ให้้แผ่่น disk ติดิ กับั อาหารเลี้ย� งเชื้อ� ถ้า้ ใช้จ้ านเลี้ย� งเชื้อ� ขนาดเส้น้ ผ่่านศููนย์ก์ ลาง 100 มิลิ ลิิเมตร ไม่่ควรวาง disk เกิิน 5 ชนิิด ถ้า้ ใช้จ้ านเพาะเชื้อ� ขนาดเส้้นผ่่าน ศููนย์์กลาง 150 มิลิ ลิิเมตรไม่่ควรวาง disk เกินิ 12 ชนิดิ สำ�ำ หรับั เชื้อ� S.pneumoniae, N. gonorrhoeae และ Haemophilus spp. ถ้า้ ใช้จ้ านเพาะเชื้อ� ขนาดเส้น้ ผ่่านศููนย์ก์ ลาง 100 มิลิ ลิเิ มตร ไม่่ควรวาง disk เกิิน 4 ชนิิด ถ้้าใช้้จานเพาะเชื้�อขนาดเส้้นผ่่านศููนย์์กลาง 150 มิิลลิิเมตร ไม่่ควรวาง disk เกิิน 9 ชนิิด 70 คู่่�มืือการตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

3. นำ�ำ จานเพาะเชื้อ� ที่่ไ� ด้้ อบเพาะเลี้ย� งที่่อ� ุณุ หภููมิิ 35 °C เป็น็ เวลา 16-18 ชั่่ว� โมง (เกณฑ์ก์ ารยอมรับั ของเชื้อ� และยาแต่่ละชนิดิ มีคี วามแตกต่่างกันั ) ภายใน 15 นาทีี หลังั จากวางแผ่่นยาเสร็จ็ เรียี บร้อ้ ยแล้ว้ โดยวางคว่ำ�� ให้ด้ ้า้ นที่่เ� ป็น็ อาหารเลี้ย� งเชื้อ� อยู่ข� ้า้ งบน 4. การทดสอบความไวต่่อสารต้า้ นจุลุ ชีพี ในแต่่ละครั้ง� ควรทดสอบกับั แบคทีเี รียี สายพันั ธุ์�มาตรฐานควบคู่่ไ� ปด้ว้ ยเพื่่อ� ตรวจสอบความถููกต้อ้ งของการทดสอบ 5. นำำ�จานเพาะเชื้้�อที่่�อบเพาะเลี้้�ยงครบเวลามาวััดเส้้นผ่่านศููนย์์กลางของ inhibition zone เป็น็ ค่่ามิลิ ลิิเมตรโดยใช้เ้ ครื่�องมืือวัดั ขนาดที่่ไ� ด้ม้ าตรฐาน vernier, calipers หรืือไม้้บรรทััด เราสามารถวััดขนาดของ inhibition zone จากด้้านหน้้าหรืือด้้านหลัังจานเพาะเชื้ �อหากเป็็นอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อใส แต่่ถ้า้ เป็น็ อาหารเลี้ย� งเชื้อ� ที่่ม� ีเี ลือื ดผสมจะต้อ้ งวัดั จากด้า้ นหน้า้ ของจานเพาะ เชื้�อถ้้าเตรีียมเชื้�อได้้ถููกต้้อง เชื้�อจะขึ้้�นอย่่างสม่ำำ��เสมอไม่่มีีช่่องว่่างระหว่่าง โคโลนีี และขอบของ inhibition zone จะชัดั เจน รรูปููปทที่�่ ่ี 44..11 กกาารรททดดสสออบ บDiDffiuffsuiosnionmemtheothdod ทที่่�มีม่ าา:: hhttttppss::////mmiiccrroobbeeoonnlilninee.c.coomm/w/wp-pc-ontent/uploads/2013/07/Muller- Hcoinnt6ot.enn-Atน/guำaผpr.gลloifท.a ่ีวdัดs/ไ2ด0èม1า3เ/ท0ีย7บ/Mกัuบlคleõาrใ-นHตinาtรoาnง-แAคูท่ปg่�มาืaงือลหr้กผอ้.าgงลรปiตfมฏ.ริิบวาัจัตติวิกิินริาจิ รฐฉทัายัาโงนรกคตาหราแนพมองทเใกนย์์ณฑ7 1

6. นำำ�ผลที่่�วััดได้้มาเทีียบกัับค่่าในตารางแปลผลมาตรฐานตามเกณฑ์์ CLSI guideline โดยผลของเชื้อ� ควบคุมุ ต้้องอยู่�ในเกณฑ์ย์ อมรัับได้้ เนื่่�องจาก CLSI guideline มีีการปรัับปรุุงและเปลี่ �ยนแปลงข้้อมููลการ แปลผลและการรายงานผลให้้ถููกต้้องเป็็นปััจจุุบัันเพื่่�อให้้สอดคล้้องกัับการรัักษาเชื้ �อ แบคทีีเรีียแต่่ละชนิิดจากผู้้�ป่่วยทุุกปีี ทำำ�ให้้ผู้้�ปฏิิบััติิงานจำำ�เป็็นจะต้้องติิดตามข้้อมููล เหล่่านี้้เ� พื่่อ� นำำ�มาประยุกุ ต์์ใช้้ในห้้องปฏิบิ ัตั ิิการต่่อไป 2. แบบปริิมาณวิเิ คราะห์์ (quantitative method) เป็็นการทดสอบที่่�ให้้ผลเป็็นค่่าความเข้้มข้้นของสารต้้านจุุลชีีพที่่�น้้อยที่่�สุุดที่่� สามารถยับั ยั้้ง� การเจริญิ ของแบคทีเี รียี โดยการผสมสารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่ม� ีคี วามเข้ม้ ข้น้ จาก สููงไปหาต่ำ�ำ�กัับอาหารเลี้ย� งเชื้อ� แล้ว้ ใส่่เชื้อ� ลงไป นำำ�ไปอบเพาะเชื้อ� ข้า้ มคืนื ในตู้้อ� บ 35 °C ทำำ�การตรวจหาความเข้้มข้้นต่ำำ��สุุดของสารต้้านจุุลชีีพที่่�สามารถยัับยั้้�งการเจริิญของ เชื้�อที่่ท� ดสอบ เรีียกว่่า minimum inhibitory concentration (MIC) และในบางวิธิ ีี จะทราบค่่าความเข้ม้ ข้น้ ของสารต้า้ นจุลุ ชีพี น้อ้ ยที่่ส� ุดุ ที่่ส� ามารถฆ่า่ แบคทีเี รียี นั้้น� ได้เ้ รียี ก ว่่า minimum bactericidal concentration (MBC) การทดสอบความไวแบบปริมิ าณ วิิเคราะห์น์ ี้้�มีีขั้�นตอนและวิิธีกี ารยุ่�งยากกว่่าแบบกึ่่ง� ปริมิ าณวิเิ คราะห์์การทราบค่่า MIC หรือื MBC เพื่่�อพิิจารณาให้้ปริิมาณยาที่่ถ� ููกต้้องเหมาะสมในการรักั ษา นอกจากนี้้ก� าร ทดสอบความไวแบบปริิมาณวิิเคราะห์์ยัังเป็็นวิิธีีที่่�นิิยมใช้้ในการศึึกษาสารต้้านจุุลชีีพ ชนิดิ ใหม่่กับั แบคทีเี รียี ชนิดิ ต่่างๆ เพื่่อ� ดููค่่า MIC ซึ่่ง� ค่่า MIC ยิ่ง� น้อ้ ยจะแสดงถึึงประสิทิ ธิภิ าพ ที่่ด� ีขี องสารต้้านจุลุ ชีีพนั้้น� นอกจากนี้้�ยัังใช้้การหาค่่า MIC เป็็นการตรวจยืืนยัันการดื้ �อยาของแบคทีีเรีีย บางชนิิดที่่ไ� ม่่สามารถแปลผลการทดสอบจากวิิธีี disk diffusion ได้้ 72 คู่�ม่ ือื การตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

สารต้้านจุลุ ชีีพที่ท�่ ดสอบ สารต้้านจุุลชีีพที่่�นำำ�มาทดสอบเป็็นผงมาตรฐานอ้้างอิิงทางห้้องปฏิิบััติิการ (laboratory reference standard powder) ซึ่่�งต้้องปราศจากสารที่่�มีีฤทธิ์�ต้้าน จุุลชีีพปนเปื้้�อน โดยซื้ �อจากบริิษััทที่่�ผลิิตยาหรืือสารเคมีีที่่�เชื่ �อถืือได้้ ซึ่่�งจะมีีข้้อมููล เกี่ย� วกับั ส่่วนประกอบของสารเคมี,ี การเก็บ็ รัักษา, ความคงตััว, ความแรง (potency), คุณุ สมบััติิในการละลาย, วัันหมดอายุุ และข้อ้ มููลอื่น� ๆ การเลืือกระดัับความเข้้มข้้นของสารต้้านจุุลชีีพที่่�จะทดสอบนั้้�น ควรให้้ ครอบคลุุมจุดุ ตััด (cut off หรืือ break point) ที่่ใ� ช้้ในการแปลผล โดยทั่่�วไปนิิยมเลือื ก ความเข้้มข้้นของสารต้า้ นจุลุ ชีีพระหว่่าง 0.125 ถึึง 256 ไมโครกรัมั ต่่อมิิลลิลิ ิติ ร การเตรียี มสารละลายของผงยาต้า้ นจุลุ ชีพี ควรคำ�ำ นวณปริมิ าณยาที่่ต� ้อ้ งการชั่ง� จากค่่า potency ที่่บ� อกไว้ใ้ นฉลากข้า้ งขวดยา ซึ่่ง� นิยิ มบอกเป็น็ ค่่าไมโครกรัมั ต่่อมิลิ ลิกิ รัมั คำำ�นวณน้ำ�ำ� หนักั ที่่ต� ้้องชั่ง� ได้จ้ ากสููตรนี้้� W= VxC P W = น้ำำ��หนักั ของผงยาที่่�ต้้องนำำ�มาละลาย (เป็น็ มิิลลิกิ รัมั ) P = ค่่า potency ของยา (ไมโครกรัมั ต่่อมิลิ ลิิกรััม) C = ความเข้้มข้น้ ของสารละลายยา (ไมโครกรััมต่่อมิิลลิกิ รัมั ) V = ปริมิ าตรของสารละลายที่่ต� ้้องการ (มิลิ ลิิลิิตร) Dilution method เป็็นวิิธีีมาตรฐานในการทดสอบความไวของเชื้ �อแบคทีีเรีียต่่อ สารต้า้ นจุลุ ชีพี เชิงิ ปริมิ าณประกอบด้ว้ ยวิธิ ีี broth dilution, agar dilution และ E test คู่่ม� ืือการตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน 73 ทางห้้องปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

2.1 Broth dilution เป็น็ การเจือื จางสารต้า้ นจุุลชีีพในอาหารเลี้ย� งเชื้อ� เหลว ทำำ�ได้้ 2 วิธิ ีี 2.1.1 Broth macrodilution method ทำ�ำ การทดสอบในหลอดทดลอง ซึ่�งมีีวิธิ ีกี ารดังั นี้้� การเตรีียมอาหารเลี้ �ยงเชื้�้อ อาหารมาตรฐานที่่�ใช้้ในการทดสอบ broth dilution คืือ cation-adjusted Mueller-Hinton broth (CAMHB) ที่่ม� ีกี ารควบคุุมพีีเอช ปริมิ าณไอออนประจุบุ วก (cation) และไทมิดิ ีนี (thymidine) จากบริษิ ัทั ผู้�้ ผลิติ ถ้า้ ต้อ้ งการทดสอบเชื้อ� กลุ่่ม� เจริญิ ยากจะต้อ้ งเติมิ สารส่่งเสริมิ การเจริิญ หรืือใช้้อาหารชนิิดที่่ท� ำำ�ให้้เชื้อ� เจริญิ ได้้ดีี ปริิมาณ อาหารที่่ใ� ช้ใ้ นการทดสอบมีคี วามแตกต่่างกันั ทำ�ำ ให้จ้ ำ�ำ แนกวิธิ ีี broth dilution ออกเป็น็ 2 วิิธีี คืือ Broth macrodilution (tube dilution) test วิิธีีนี้้�จะทำำ�การทดสอบในหลอด ทดลองขนาด 13 × 100 mm โดยใช้้อาหารเหลวปริิมาณ 1-2 ml ต่่อหลอดทดลอง Broth microdilution test วิธิ ีีนี้้�จะทำ�ำ การทดสอบในถาดหลุมุ พอลิิสไทรีนี ขนาดเล็ก็ (polystyrene microtiter tray) ที่่ม� ีีหลุมุ ทดลอง 80-100 หลุุม (ส่่วนใหญ่่ 96 หลุมุ ) โดยใช้้อาหารเหลวปริิมาณ 0.1 ml/หลุุม การเตรีียมสารต้้านจุลุ ชีีพ สารต้า้ นจุุลชีีพ จะต้อ้ งเป็น็ ผงสารต้า้ นจุุลชีพี มาตรฐาน (standard powder) ที่่�มีคี วามบริิสุุทธิ์� ไม่่มีีแป้ง้ หรือื น้ำ�ำ�ตาล หรืือสารอื่น� ปนเปื้�้อน เตรียี มสารต้้านจุลุ ชีพี ให้้ มีีความเข้้มข้้นเป็็น 40 เท่่าของความเข้้มข้้นสููงสุุดที่่�ต้้องการทดสอบเพื่่�อเป็็น stock และเมื่อ� ต้้องการทดสอบให้ใ้ ช้้ 1 ml ใส่่ในหลอดที่่� 1 และใส่่อาหารเลี้ย� งเชื้�อ Cation- adjusted Mueller-Hinton broth (CAMHB) pH 7.2-7.4 1 ml จากนั้้�นใช้้สารต้า้ น จุุลชีีพในหลอดที่่� 1 ใส่่ในหลอดที่่� 2, 3, 4 หลอดละ 1 ml. และใส่่อาหารเลี้�ยงเชื้�อ cation-adjusted Mueller-Hinton broth (CAMHB) pH 7.2-7.4 หลอดละ 1, 3, 7 ml ในหลอดที่่� 2, 3, 4 ตามลำ�ำ ดับั จากนั้้น� ใช้ส้ ารต้า้ นจุลุ ชีพี หลอดที่่� 4 แบ่่งใส่่ในหลอดที่่� 5, 6, 7 หลอดละ 1 ml และใส่่ CAMHB หลอดละ 1, 3, 7 ml ในหลอดที่่� 5, 6, 7 74 คู่�ม่ ืือการตรวจวินิ ิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

ตามลำ�ำ ดัับ จากนั้้�นใช้้สารต้้านจุลุ ชีีพหลอดที่่� 7 แบ่่งใส่่ในหลอดที่่� 8, 9, 10 หลอดละ 1 ml และใส่่ CAMHB หลอดละ 1, 3, 7 ml ในหลอดที่่� 8, 9, 10 ตามลำำ�ดัับ ซึ่ �งความเข้้มข้้นของทุุกหลอดเป็็น 2 เท่่า ซึ่่�งเมื่่�อเติิมเชื้ �อที่่�เตรีียมไว้้จะทำำ�ให้้เจืือจาง ได้้ความเข้้มข้้นตามต้้องการ เช่่น ตััวอย่่างการเตรีียมสารต้้านจุุลชีีพเพื่่�อใช้้ทดสอบหา ค่่าความเข้ม้ ข้น้ สููงสุุดที่่� 128 µg/ml เป็น็ ดัังตาราง ตารางที่่� 4.1 การเตรีียมสารต้้านจุลุ ชีีพเพื่่อ� ใช้ท้ ดสอบหาค่่าความเข้้มข้้นสููงสุุดที่่� 128 µg/ml โดยวิธิ ีี broth dilution Antimicrobial solution ปริิมาตร ความเข้ม้ ข้น้ CAMHB สุุดท้า้ ย หลอดที่�่ ความเข้ม้ ข้น้ Source ปริมิ าตร (µg/ml) (µg/ml) 9 1 512 1 5120 Stock 1 3 256 7 128 2 512 หลอดที่่� 1 1 1 64 3 32 3 512 หลอดที่่� 1 1 7 16 1 8 4 512 หลอดที่่� 1 1 3 4 7 2 5 64 หลอดที่่� 4 1 1 6 64 หลอดที่่� 4 1 7 64 หลอดที่่� 4 1 8 8 หลอดที่่� 7 1 9 8 หลอดที่่� 7 1 10 8 หลอดที่่� 7 1 คู่�ม่ ืือการตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน 75 ทางห้อ้ งปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

การเตรีียมเชื้้�อแบคทีีเรีีย เตรียี มเชื้อ� แบคทีเี รียี ได้จ้ ากทั้้ง� วิธิ ีี colony suspensionและ วิธิ ีี broth culture method โดยนำ�ำ แบคทีเี รียี ทดสอบที่่เ� ตรียี มได้ม้ าปรับั ความขุ่น� ให้เ้ ท่่ากับั 0.5 McFarland standard No.1 แล้้วนำำ�มาเจืือจาง 1:100 ในน้ำำ��เกลืือปราศจากเชื้�อจะได้้แบคทีีเรีีย จำ�ำ นวนประมาณ 106 CFU/ml ควรทดสอบแบคทีเี รียี สายพันั ธุ์�มาตรฐานควบคู่่ไ� ปด้ว้ ย ทุกุ ครั้�ง เพื่่อ� ตรวจสอบความถููกต้อ้ งของการทดสอบ วิธิ ีีทดสอบ นำำ�สารต้้านจุุลชีีพที่่�เตรีียมไว้้แล้้วตามลำำ�ดัับ (1-10) มาใส่่ในหลอดปราศจาก เชื้�อหลอดที่่� 1-10 หลอดละ 1 ml และ หลอดที่่� 11, 12 ให้ใ้ ส่่ CAMHB หลอดละ 1 ml จากนั้้น� เติิมเชื้อ� แบคทีีเรีียที่่ป� รัับความขุ่น� แล้ว้ ในหลอดที่่� 2-11 หลอดละ 1 ml นั้้�นคืือ หลอดที่่� 11 มีีอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อและแบคทีีเรีียจึึงเป็็นหลอดควบคุุมผลบวก (positive control) หลอดที่่� 12 จะมีแี ต่่อาหารเลี้ย� งเชื้อ� และหลอดที่่� 1 จะมีแี ต่่อาหาร เลี้�ยงเชื้อ� และสารต้า้ นจุุลชีพี จึึงเป็น็ หลอดควบคุมุ ผลลบ (negative control) นำำ�ไป อบเพาะเลี้ย� งที่่� 35 °C เป็น็ เวลา 16-20 ชั่่�วโมง - แบคทีีเรีียสายพัันธุ์�มาตรฐานที่่�ใช้้เป็็นตััวควบคุุม ควรมีีค่่า MIC อยู่�ในช่่วงที่่� มาตรฐานกำำ�หนด จึึงจะอ่่านค่่าความเข้้มข้้นของสารต้้านจุุลชีีพน้้อยที่่�สุุดที่่� ยัับยั้้�งการเจริิญของแบคทีีเรีียได้้ โดยสัังเกตความขุ่ �นของอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อ หลอดที่่�ไม่่ขุ่่�นจะไม่่มีีการเจริิญของแบคทีีเรีีย โดยความเข้้มข้้นต่ำำ��สุุดที่่�ยัับยั้้�ง เชื้�อได้ใ้ ห้้อ่่านผลเป็็นค่่า MIC - กรณีีต้้องการอ่่านค่่า MBC นำำ�อาหารเลี้�ยงเชื้�อจากหลอดที่่�ไม่่ขุ่่�นทั้้�งหมดมา หลอดละ 10 µl เพาะในอาหารเลี้ย� งเชื้อ� ที่่ไ� ม่่มีสี ารต้า้ นจุลุ ชีพี แล้ว้ อบเพาะเลี้ย� ง ที่่� 35 °C เป็็นเวลา 16-20 ชั่่�วโมง อ่่านค่่าความเข้้มข้้นของสารต้้านจุุลชีีพ น้อ้ ยที่่ส� ุุดที่่�แบคทีเี รียี ไม่่เจริญิ หรือื เจริญิ น้อ้ ยกว่่าร้้อยละ 0.1 เป็น็ ค่่า MBC 76 คู่ม�่ ือื การตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ัตั ิิการทางการแพทย์์

2.1.2 Broth microdilution method เป็็นวิิธีีหาค่่า MIC และ MBC เหมืือนกัับ broth macrodilution method ต่่างกัันที่่�ภาชนะที่่�ใช้้ในการทดสอบ และปริิมาตรของเชื้�อ ยา และอาหารเลี้�ยงเชื้�อ วิิธีนี ี้้จ� ะทดสอบในmicrotiter plates ทำำ�ให้้ประหยััดปริิมาณของสารต้้านจุุลชีีพและปริิมาณอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อ ซึ่่�งหลัักการ เตรีียมสารต้้านจุุลชีีพ การเตรีียมแบคทีีเรีียที่่�จะทดสอบ ชนิิดของอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อ การอบเพาะเชื้้�อ การอ่่านและแปลผล ทำำ�เช่่นเดีียวกัับการทดสอบแบบ broth macrodilution method 2.2 Agar dilution method เป็็นการทดสอบความไวต่่อสารต้้านจุุลชีีพโดยเจืือจางสารต้้านจุุลชีีพใน อาหารเลี้ �ยงเชื้ �อชนิิดแข็็ง แล้้วเพาะแบคทีีเรีียบนผิิวอาหารเลี้ �ยงเชื้ �อเป็็นจุุดๆ โดยใช้้ เครื่ �องมืือ inoculum replicating apparatus ซึ่่�งมีี multipoint inoculator โดยหลัักการทดสอบ agar dilution จะเหมืือนกับั broth dilution แต่่จะแตกต่่างกััน ที่่ข�ั้น� ตอนการผสมสารต้า้ นจุลุ ชีพี ความเข้ม้ ข้น้ ต่่างๆ รวมกับั อาหารเลี้ย� งเชื้อ� ที่่ห� ลอมเหลว เป็น็ เนื้้อ� เดียี วกันั ก่่อน รอให้อ้ าหารแข็ง็ ก่่อนที่่จ� ะเพาะเชื้อ� ทดสอบลงไปโดยใช้เ้ ครื่อ� งมือื พิิเศษภายหลังั การบ่่มเชื้�อเป็น็ เวลา 16-20 ชั่่�วโมง ถ้้าความเข้้มข้้นของสารต้า้ นจุลุ ชีีพ สามารถยับั ยั้้�งการเจริิญได้้จะไม่่เห็็นโคโลนีีเจริิญขึ้น้� มาบนอาหารเลี้�ยงเชื้�อ รายงานผล เป็น็ ค่่าความเข้ม้ ข้้นต่ำ�ำ� สุุดของสารต้้านจุลุ ชีพี ที่่ย� ับั ยัังการเจริญิ ของเชื้อ� ได้้ (MIC) หน่่วย µg/ml การเตรีียมสารต้้านจุลุ ชีีพ จะต้อ้ งทราบค่่า potency ของสารต้้านจุุลชีพี คำ�ำ นวณปริิมาณผงมาตรฐานที่่� ต้อ้ งชั่ง� จากค่่า potency, ความเข้ม้ ข้น้ สููงสุดุ ที่่ต� ้อ้ งการและปริมิ าตรของสารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่ต� ้อ้ งการใช้ ้ การคำ�ำ นวณนี้้จ� ะต้อ้ งเตรียี มสารต้า้ นจุลุ ชีพี มีคี วามเข้ม้ ข้น้ เป็น็ 40 เท่่าของ ความเข้ม้ ข้น้ สููงสุุดที่่�ต้้องการทดสอบ ในการเตรีียมความเข้้มข้้นของสารตานจุุลชีพี ทำำ� โดยใช้้ stock ปริมิ าตร 2, 1, 1 ml ใส่่ในหลอดที่่� 1, 2, 3 และใส่่ตัวั ทำำ�ละลาย (diluent) ซึ่ง� ส่่วนใหญ่่จะใช้น้ ้ำ�ำ� กลั่่�นในการเจือื จาง ปริมิ าตรหลอดละ 2, 3, 7 ml ใส่่ในหลอดที่่� 1, คู่ม�่ ืือการตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน 77 ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

2, และ 3 ตามลำำ�ดัับ จากนั้้�นใช้้สารต้้านจุุลชีีพในหลอดที่่� 3 ปริิมาตร 2, 1, 1 ml ใส่่ในหลอดที่่� 4, 5, 6 และใส่่ตััวทำำ�ละลายหลอดละ 2, 3, 7 ml ในหลอดที่่� 4, 5, และ 6 ตามลำ�ำ ดับั จากนั้้น� ใช้ส้ ารต้า้ นจุลุ ชีพี ในหลอดที่่� 6 ปริมิ าตร 2, 1, 1 ml แบ่่งใส่่ในหลอดที่่� 7, 8, 9 และใส่่ตัวั ทำ�ำ ละลายหลอดละ 2, 3, 7 ml ในหลอดที่่� 7, 8, และ 9 ตามลำ�ำ ดับั ซึ่ �งความเข้้มข้้นของทุุกหลอดเป็็น 10 เท่่า ซึ่่�งเมื่่�อเติิมเชื้ �ออาหารเลี้ �ยงเชื้ �อชนิิดแข็็งที่่� เตรีียมไว้้จะทำำ�ให้้เจืือจางได้้ความเข้้มข้้นที่่�ต้้องการ เช่่น ตััวอย่่างการเตรีียมสารต้้าน จุุลชีพี เพื่่�อใช้้ทดสอบหาค่่าความเข้้มข้น้ สููงสุดุ ที่่� 128 µg/ml เป็น็ ดัังตาราง ตารางที่่� 4.2 การเตรียี มสารต้า้ นจุลุ ชีีพเพื่่อ� ใช้้ทดสอบหาค่่าความเข้ม้ ข้น้ สููงสุุดที่่� 128 µg/mL โดยวิธิ ีี agar dilution Antimicrobial solution ปริมิ าตร ความเข้ม้ ข้้น Diluent สุดุ ท้้ายที่่� 1:10 หลอดที่�่ ความเข้ม้ ข้น้ Source ปริมิ าตร (µg/ml) 2 ใน agar 3 (µg/ml) 1 5120 Stock 2 7 2 256 2 5120 Stock 1 3 128 7 64 3 5120 Stock 1 2 32 3 16 4 640 หลอดที่่� 3 2 7 8 4 5 640 หลอดที่่� 3 1 2 1 6 640 หลอดที่่� 3 1 7 80 หลอดที่่� 6 2 8 80 หลอดที่่� 6 1 9 80 หลอดที่่� 6 1 78 คู่�่มือื การตรวจวินิ ิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิิการทางการแพทย์์

การเตรีียมอาหารเลี้ �ยงเชื้้�อ อาหารมาตรฐานที่่ใ� ช้้ในการทดสอบ คืือ Mueller-Hinton agar โดยนำ�ำ มาต้ม้ 121 °C 15 นาทีี ให้ล้ ะลายแล้้วแบ่่งใส่่หลอด หลอดละ 18 ml นำำ�ไปนึ่่ง� ทำำ�ลายเชื้�อ แล้ว้ ทำ�ำ ให้้อุณุ หภููมิลิ ดลงถึึงประมาณ 50 °C โดยแช่่ใน water bath นำำ�ยาที่่�เจืือจางแล้้วแต่่ละความเข้ม้ ข้น้ มา 2 ml ใส่่ในหลอดอาหารเลี้�ยงเชื้�อผส มให้เ้ ข้า้ กัันแล้ว้ เทลงในจานเพาะเชื้อ� ที่่�ปราศจากเชื้�อ และใช้้ตััวทำ�ำ ละลาย 2 ml ใส่่ใน หลอดอาหารเลี้ย� งเชื้อ� ผสมให้เ้ ข้า้ กันั แล้ว้ เทลงในจานเพาะเชื้อ� ที่่ป� ราศจากเชื้อ� (positive control) ตั้้�งไว้ใ้ ห้อ้ าหารเลี้�ยงเชื้�อแข็ง็ และตากผิวิ หน้้าอาหารเลี้�ยงเชื้�อให้แ้ ห้้ง การเตรีียมเชื้อ้� แบคทีีเรีีย เตรีียมเชื้ �อโดยวิิธีี direct colony หรืือ broth culture method ให้้ได้้ เชื้ �อที่่�ความขุ่ �นเท่่ากัับ 0.5 McFarland standard No.1 ซึ่่�งจะมีีเชื้ �อประมาณ 108 CFU/ml นำำ�มาเจือื จาง 1:10 ด้ว้ ยน้ำ��ำ เกลือื ปราศจากเชื้อ� จะได้ค้ วามเข้ม้ ข้น้ ของเชื้อ� เป็น็ 107 CFU/ml เมื่ �อนำ�ำ multipoint inoculator มาแตะเชื้อ� นี้้จ� ะมีีเชื้�อติดิ มาประมาณ 1 µl ปริิมาณเชื้ �อสุุดท้้ายที่่�อยู่ �บน agar dilution plate เท่่ากัับ 104 CFU/spot เมื่่�อปรัับความขุ่ �นและเจืือจางแล้้วควรนำำ�มาทดสอบภายใน 15 นาทีี เพื่่�อป้้องกััน การเปลี่ย� นแปลงของจำำ�นวนเชื้�อแบคทีีเรียี วิิธีีการทดสอบ นำำ�แบคทีีเรีียที่่�เตรีียมแล้้วมาเพาะบนอาหารเลี้้�ยงเชื้้�อที่่�มีีสารต้้านจุุลชีีพ โดยอาจใช้้ลููปที่่เ� ทียี บมาตรฐาน (calibrated loop) ปิิเปตต์อ์ ัตั โนมัตั ิิ หรืือ inoculum replicating apparatus โดยนำำ�แบคทีีเรีียมาใส่่ในหลุุมๆ ละ 500 µl จากนั้้�นนำำ� multipoint inoculator แตะเชื้้�อในหลุุมแล้้วนำำ�ไปแตะบนผิิวอาหารเลี้้�ยงเชื้้�อ ปลายของ multipoint inoculator จะถ่่ายโอนเชื้อ� มาได้ป้ ระมาณ 1 µl ทำ�ำ ให้ไ้ ด้เ้ ชื้อ� ใน แต่่ละจุุดประมาณ 104-105 CFU ควรหยดเชื้ �อบนผิิว agar ที่่�เป็็น control plate ซึ่ง� ไม่่มียี าต้้านจุุลชีีพ ก่่อน plate ที่่ม� ีียาโดยเรีียงจากยาเข้ม้ ข้น้ น้้อยไปมาก นอกจากนี้้� ควรทดสอบกับั แบคทีีเรีียสายพันั ธุ์�มาตรฐานควบคู่่ไ� ปด้ว้ ย เพื่่�อตรวจสอบความถููกต้อ้ ง คู่�่มือื การตรวจวินิ ิิจฉัยั โรคหนองใน 79 ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

ของการทดสอบ เมื่อ� หยดเชื้�อเสร็็จแล้้วควรวางจานเพาะเชื้อ� ในระนาบให้้หยดเชื้�อแห้้ง แล้ว้ จึึงคว่ำ��ำ จานเพาะเชื้�อ นำำ�ไปอบเพาะเลี้�ยงที่่� 35 °C เป็็นเวลา 16-20 ชั่่�วโมง การอ่่านและแปลผล อ่่านค่่าความเข้ม้ ข้น้ ของสารต้า้ นจุลุ ชีพี น้อ้ ยที่่ส� ุดุ ที่่แ� บคทีเี รียี ไม่่เจริญิ เป็น็ ค่่า MIC โดยค่่า MIC ที่่�ได้้นี้้�จะมีีความถููกต้้องเชื่ �อถืือได้้ เมื่่�อแบคทีีเรีียสายพัันธุ์�มาตรฐาน ซึ่�งใช้้เป็็นตััวควบคุุมได้้ค่่า MIC อยู่�ในช่่วงที่่�มาตรฐานกำำ�หนด ค่่า MIC ที่่�ได้้สามารถ นำ�ำ ไปแปลผลเป็น็ ไว ไวปานกลาง ไม่่ไว หรือื ดื้อ� ได้จ้ ากตารางมาตรฐานที่่ก� ำ�ำ หนดค่่า cut off หรืือ breakpoint 2.3 Epsilometer test (E test) ได้้มีีการพััฒนาวิิธีีการทดสอบ MIC ให้้สะดวกขึ้้�น ซึ่่�งพััฒนาขึ้้�นโดยใช้้ หลักั การแพร่่กระจายของสารต้า้ นจุลุ ชีพี มีคี วามสะดวกในการปฏิบิ ัตั ิเิ หมือื นการทดสอบ disk diffusion method และรายงานผลเป็น็ ค่่า MIC เหมือื นการทดสอบ broth หรือื agar dilution method โดยการใช้แ้ ถบพลาสติกิ (strip) ที่่ม� ีคี ุณุ สมบัตั ิไิ ม่่ดููดซับั น้ำ��ำ ขนาด 5×50 มิิลลิิเมตร โดยด้า้ นหนึ่่ง� เคลืือบไว้ด้ ้้วยสารต้้านจุลุ ชีพี ที่่�มีคี วามเข้ม้ ข้น้ ลดลงอย่่าง ต่่อเนื่่�องจากความเข้้มข้้นมากไปหาน้้อย อีีกด้้านหนึ่่�งมีีตััวเลขและสเกลบอกค่่าความ เข้ม้ ข้น้ ของสารต้า้ นจุลุ ชีีพที่่ต� ำำ�แหน่่งต่่างๆ (continuous concentration gradient) วางแถบสารต้้านจุุลชีีพบนผิิวหน้้าของอาหารเลี้�ยงเชื้�อ Mueller-Hinton agar ที่่�ทำำ� การเพาะเชื้�อแบคทีเี รีียโดยวิิธีีเดียี วกับั การทดสอบ disk diffusion method แล้้วนำ�ำ plates ไปอบเพาะเลี้ย� งในสภาวะที่่เ� หมาะสมของเชื้อ� แต่่ละสายพันั ธุ์์� ถ้า้ สารต้า้ นจุลุ ชีพี สามารถยัับยั้้�งการเจริิญของเชื้�อได้้ จะเกิิดวงใสรููปหยดน้ำำ�� (inhibition ellipse zone) เนื่่อ� งจากความเข้ม้ ข้น้ ของสารต้า้ นจุลุ ชีีพบนแถบไม่่เท่่ากันั ตลอดทั้้�งแถบ ลักั ษณะของ inhibition zone จึึงไม่่เป็็นวงกลมแต่่จะเป็็นรููปหยดน้ำ�ำ� โดยบริเิ วณที่่�มีีสารต้้านจุลุ ชีพี เข้ม้ ข้น้ สููงจะโค้ง้ กว้า้ ง และแคบลงตามความเข้ม้ ข้น้ ของสารต้า้ นจุลุ ชีพี ที่่ล� ดลง จุดุ ความ เข้้มข้้นน้้อยที่่ส� ุดุ ที่่�แบคทีเี รียี ไม่่สามารถเจริญิ ได้ต้ รงปลายรููปหยดน้ำ��ำ ดังั รููป อ่่านเป็็นค่่า MIC 80 คู่ม�่ ือื การตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

รรูปููปทที่ี่�่44..22ก กาารรททดดสสออบบ EEppssililoommeetetretretsets(Et (tEestte) st) ทที่มี ่่�มาา: :hhttttppss::////ppbbss..ttwwiimmgg..ccoomm//mmeeddiai/aC/ZCYZRY9RjL9WjLAWAAAANAsqNJs.jqpJg..jpg. สต ะััดดขั้ว้�นกตวติอวธิ ีัดนิธนี ี้ข้ีนย�มุ่ี�ัง้นี้มีข้ยอ้ตีขาดอèอกีคีนดใืือนีคยสกุืõองาายสมราาาเกจมรืใือถานจรรกถาางายสรรงาาเาจยรนตือง้ผา้าจลนนาเจผงปุ็สุลลน็ าชเคี่ปร่ีพาตìนMèาปคนรIõาCจะMุหลโดชยICัยัดีพเเโปวด็ปน็ลยราวิเะใธิปีนหีทีì่น่กยท� ำวาัด�ำ ิธรไเทีทดว้ง้ดลี่ท่าสาำยใอไนดบสก èงะõาาแดยรลวกะ ทสดาสมอารบถนแำ�ำลมะาสทาดมสาอรบถกนับั ำเมชื้าอ� ทแบดคสทอีเีบรียีกทับั่่ว�เชไปื้อรแวบมคทั้้ทง� ีaเรnียaทerั่วoไbปeรsวมแลทะั้งMayncaoebroacbteesria แแลต่ะ่มีีขM้้อyด้c้อoยbคืaือctรeาrคiaาแแถตบõม Eีขèอteดsèอt ยค่ค่อือนขร้้าางคแาพแงถแบละEค-tวeาsมtเขค้้มõอข้น้นขที่่èา�สงาแมพารงถวแััดลไะด้้มีี คคววาามมเจขำำ�èกมัดัขขึèน้�้นทอี่สยู่า�กัมบั าแรถถบ วEัดไteดsèมtีคขวอางมแตจ่่ลำะกบัดริขิษัึ้นัทอยูõกับแถบ E-test ของแตõละ บริษทั คู่�ม่ ืือการตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน 81 81 ทางห้้องปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

เอกสารอ้้างอิงิ 1. World Health Organization (WHO). Laboratory diagnosis of sexually transmitted infections, including human immunodeficiency virus. Geneva: WHO document Production Services; 2013. 2. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 29thed. Pensylvania: CLSI; 2019 3. World Health Organization (WHO). Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing World. Geneva: World Health Organization; 2003. 4. มาลัยั วรวิจิ ิติ ร, วันั ทนา ปวีณี กิติ ติพิ ร, สุวุ รรณา ตระกููลสมบููรณ์,์ สุรุ างค์์ เดชศิริ ิเิ ลิศิ , คู่่�มืือการปฏิิบััติิงานแบคทีีเรีียและราสำำ�หรัับโรงพยาบาลศููนย์์และโรงพยาบาล ทั่่�วไป. พิมิ พ์์ครั้�งที่่� 1. กรุุงเทพฯ: ธนาเพลส; 2557. 5. Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). M22 Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard. 3rd ed. Pensylvania: CLSI; 2004 6. เกษแก้ว้ เพียี รทวีชี ัยั , นิชิ า เจริญิ ศรี,ี โชติชิ นะ วิไิ ลลักั ขณา, วิทิ ยาแบคทีเี รียี วินิ ิจิ ฉัยั . พิิมพ์์ครั้�งที่่� 1. ขอนแก่่น: มหาวิิทยาลััยขอนแก่่น; 2552. 7. วัชั รินิ ทร์ ์ รังั ษีภี าณุรุ ัตั น์,์ อิสิ ยา จันั ทร์ว์ ิทิ ยานุชุ ิติ , พรทิพิ ย์ ์พึ่่ง� ม่่วง, สมหญิงิ งามอุรุ ุเุ ลิศิ , สุมุ ลรัตั น์ ์ ชููวงษ์ว์ ัฒั นะ, การวินิ ิจิ ฉัยั โรคติดิ เชื้อ� แบคทีเี รียี ทางการแพทย์.์ พิมิ พ์ค์ รั้ง� ที่่� 4. กรุงุ เทพฯ: จุุฬาลงกรณ์์มหาวิทิ ยาลัยั ; 2556. 82 คู่่�มืือการตรวจวิินิิจฉัยั โรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิิบัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

บทที่่� 5 การเพาะเชื้้อ� และการทดสอบความไวต่อ่ สารต้า้ นจุลุ ชีพี ของเชื้อ้� N. gonorrhoeae นายพงศธร แสงประเสริฐิ ผศ. ดร. รััตนา ลาวััง การเพาะเชื้�อ้ (culture method) วิธิ ีกี ารเพาะเชื้อ� ถือื เป็น็ วิธิ ีมี าตรฐานอ้า้ งอิงิ (reference method) ในการวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน ซึ่่�งเป็น็ วิิธีที ี่่ถ� ููกต้้องและแม่่นยำ�ำ กว่่าวิิธีกี ารอ่่านผลจาก Gram stain แต่่วิิธีี การเพาะเลี้ย� งเชื้อ� จะค่่อนข้า้ งซับั ซ้อ้ นกว่่าเชื้อ� แบคทีเี รียี อื่น� ๆ เพราะเชื้อ� N. gonorrhoeae เป็็นเชื้�อที่่�ต้้องการอาหารพิิเศษในการเจริิญ และในบรรยากาศที่่�ใช้้เพาะเลี้�ยงเชื้�อต้้อง มีีความชื้ �นเพีียงพอ มีีปริิมาณ CO2 (5-10%) อาหารเลี้ �ยงเชื้ �อที่่�สามารถใช้้ในการ เพาะเลี้ �ยงได้้ดีี เช่่น chocolate agar ซึ่่�งส่่วนใหญ่่ใช้้ในการเพาะเชื้ �อจากตััวอย่่าง ตรวจที่่�ปราศจากเชื้อ� เช่่น เลือื ด หรือื ใช้้ subculture แต่่ในกรณีีที่่ต� ้้องการเพาะเลี้�ยง เชื้ �อจากหนองหรืือสารคััดหลั่ �งในผู้้�ป่่วยที่่�มีีเชื้ �อประจำำ�ถิ่่�น อาจจำำ�เป็็นต้้องใช้้อาหาร เลี้ �ยงเชื้ �อที่่�มีีส่่วนผสมของสารยัับยั้้�งเชื้ �ออื่ �นๆ ก่่อน เช่่น Modified Thayer-Martin media (MTM), Bangrak I media (สููตรอาหารที่่ก� ลุ่่ม� บางรักั โรคติดิ ต่่อทางเพศสัมั พันั ธ์์ ปรัับใช้้) ซึ่่�งวิธิ ีีการเพาะเชื้�อประกอบด้้วยหลายขั้�นตอน คืือ คู่ม่� ืือการตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน 83 ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

1. การเก็บตัวอยาl งจากผ'ปู วj ย สามารถเกบ็ หนองหรอื สารคัดหลง่ั จากผปูè ¢วยชายและผปèู ¢วยหญงิ ไดè จ1า.กกาทรõอเกป็บ็ สû ตสัวั าอวยะ่่าง(uจrาeกtผhู้้r�ปa่ว่ )ย, ชõองคลอด (vagina), ปากมดลกู (endocervix), คค(ตทท c่ำอดั่oำ�อวหแาnปััหรลjสu(หน่ังสp่่nจนสงาhัcาทักวาี่a่กt ะม�มirีผv(yีคา(ruaèปูeรnวrlถcาxว¢e)มtเ)ยtuก,hเเ็แสปm็ีบr่ลaย�ìนหท)èว)ง,,ต น ปวชฝโ่นèา่อีา=ดอีรยงยง(หขหaคลเกนึน้bลรง็ื็บืบcออักกหeดสบัน sนาต(svรอ(M)ำraคงeแัgแTหัดcหiลMnรหtืนะือauลั)õงส่mห่,เ�งทาปยืรจ่ร)่ีม�อาือ,าคกคีับกดัุมวBุตผหฝูดา้aา้�ลล¶มปัnู่่ง�ู่ว(เgกcจสย( rao(าย่ีaชeกbnkงnาผjcูยdu้�้eIโปแon่ด่วsMcลcsยยetะ)eแเirvกผdvลู้a้บ็้�i้วiปxแla่)ปห)่วล้,้ายนเเคะปปยหอ็อล็นนì ญง(งิตรpหเ้บิงย้นปูhรนื่อ ตaอืไขึบrดวัสM้y้้�นุต้จาnTZกราาxัMับก), (หรูปรืือท่ี 5B.a1n)gแraลkะนI ำMสõงeหdอèiaงปเปฏ็็นบิ รูตัูปิกตัาัวรทZนั ท(รูีูปในที่่ก� ร5ณ.1ีท) ่ไีแมลõสะานมำำ�สา่่รงถห้ล้องงสปง่ิ ฏสิิบõงัตัติริกวาจรทบัันนทีี pใlนaกtรeณีไทีีด่่ไ� โèม่ด่สยาตมรางรใถหลèใงชสิ่èง� tส่r่งaตnรsวpจoบrนt pmlaetediไuด้mโ้ ดยเตชรõนงใหS้tใ้ ชu้้atratnหspรoือrtAmmeideisumแลเชะ่่น นSำtuสaงõ หrtèอหงรปือื ฏิบAmตั กิ ieาsรภแาลยะในำนำ�ส่่ง6ห้้องชป่ัวฏโิมิบังตั ิิกาซร่งึ ภสาายมใานรถ6 เชัก่่�วบ็ โรมักงษ ซึ่า่�งสสภามาพารใถนเตก็èเู็บยรั็นักทษ่ีา อสุณภหาพภใูมนิตู2้�้เ-ย8็น็ °ทีC่่�อุณุไดหกè ภูõอูมนิิ 2น-ำ8ส°งõ C ได้้ก่่อนนำำ�ส่่ง รรููปปู ทีท่่� ่ี 55..11 แแสสดดงงลัลกั ักษษณณะะกการารstsrtereakakเปเ็ป็นìนรููปรตูปััวตัวZZหหนนองอหงรหืือรสือาสราคัรดั คหัดลั่ห�งจลาง่ั กจผาู้�้กป่่วย แล้ว้ ป้้ายลงบนผูปèMว¢ TยMแลหèวรืปอื =าBยaลnงgบrนakMI MTMedหiaรอื Bangrak I Media เดM ชั2ังื้อo.ภ วd2าิMธิi.คีfีกioผeหหาวนddลลรัธิวiัเงังfพกีกTiจจe)าhาาา dกรกะaก่่เเyไTอลพไีดe้ด้นhย� ้าตrèัตนaง-ะัวำMเyัว�ำเชอืลeเอ้aขยอ�้ ่้้ียrr่ย้าา-tงNตMõาiงูn้เจง้�.ช aจiาgnMอื้rกาotciกผenuNูn้้d�ผobป.่Miูèป่วaragrยt¢วehooท(ยีdo่Mnr่�ทieoaTsใี่aหtrMs้(rre้Mteh)rcaeoTrหkoaMeรskืaเือs)ปเe็ปห็sนBtìนรรarููeปือnรaตูgปัkBrัวต aaอkัวีnZกี g ZIคrบaรMั้บน�งkeหนอIdนาอึ่M่iห�งaาาeห(ร(รdาูวูเิปiรลิธีaี้ทเีเี�ย่ลต่(� งวีร้ย5เีชีิยธ.ืง้2ี�มอ) เ(เiรตnพืปู่รc่�อทียuใbมี่ห5้aด้ต.ัt2ัวังo)อภrยเา่พ่(าคตั้งอื่ �งผตใอนุรหุณววตè จหกทวัีภ่)อู่�ปูมกย้ิ้าิ õาõอย3งน6ลต±งนรบ1ำวนเจ°ขอCทèาาี่ปหตแ=าลาèู ยiระnกลcCรงuะบObจน2aา ทอีtย่่oาต� ั5หrัว%าอใหรอ)กèกหcรมาrะาoกจหsาห้sอ้ยลังsตังปtจัวrฏeาอิกิบaอนััkัต้กิ้�นกิ มอานาีำกรำ�ไคหเมข่ร้ล่้ามั้งีงัตตีูหู้จ้้�้� นาCCกึ่งOO22 incubator สามารถประยุกุ ต์ใ์ ช้้ candle jar แทนได้้ โดยมีีวิธิ ีกี ารเตรีียมดัังนี้้� 84 84 คู่่ม� ือื การตรวจวินิ ิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้อ้ งปฏิิบััติกิ ารทางการแพทย์์

1. วาง plates ลงใน candle jar ใหèเหลือพื้นที่วõางพอที่จะวางเทียน ลงไป 2. วางสำลีชุบน้ำหมาดๆ ลงไปในกระป«อง (เพื่อใหèมีความชื้นเพียงพอ 1. วตางõอกplาaรtเeจsรลิญงขในองcเaชnื้อdlNe.jagroใnหo้เ้ rหrลhือืoพeื้้�นaทeี่่�ว)่่าองาพจอบที่่ร�จระจวุลางงเใทนีียขนวลดงเไพปื่อ 233.. .cเวจุจจกปoาดุรงิุดาn=อเิญสทรเtำงีำ�ทaยีเขกลผmนีียอันีชาสุนงiกีบุใnเีขนสหชา้aื้าำีขร�อtมำ��วeาหใèขcนวNมoอใก.าnนงรดเtgกะทๆaoปรm๋ียnะ๋อลนoปiงงnrแจไ«อraปละhง้tใ้วทแoeนปลeำิกดิ ใaèวรฝหปeะาèบป)§ดใ๋ห๋อรฝอ้รงส้าายนใจ(ิหาเทิบพืกèส่ร่อ�รานรอใศจิทหุจ้ภุลม้นีรงาคีกใอวยว่น่จใาาขนนมเวทชกกีืด้ยีน�รวเนะเพõาืพ่จ่เปี�อทยีะ«อปดงีย้ังพ้อบันม งอจกกีตั่ะC่าันอดรOกกเับผา2ารรา ไ(หหสปามาร้กม้ขะใอาชม้งรเ้าทเถีณทยีียียนับน3สียจอีื–่ะั้งน� ทก5ๆำำ�าอใ%รหาเ้จบ้ (ทรรหำิญร�ำ ายใกขหา้ใอกเ้ กชงาิดิèเศเทชคภืีว้ยอาันันยNพใสิน.ษิ ีอกgทีื่น่รo่ส� ะๆnาปมo๋ออ๋ าrางrรhมจถีoีทยัCeบัำยOัaใ้้ห2ง�eกèเปกไารดริดะเè จคมตริวาèอญิ ณันงข พรอ3ะิษง-ว5เทชังื%้่ีอ� Nอ.ยgõาoใnหoèเrทrhียoนeลaèมeแไลดะ้ ้ เตว้้อèนงระยวังัะอพย่อ่าปใหร้เ้ะทีมยี านณล้ไม้ มแõวลาะงเชว้้นิดรกะับยะpพlaอtปeระมมาากณ 44. .Nไนำมเนเ่ำ�.่พกวไำgาินปาไoงะไปใชnปิสเ่ดิใ่ชoใกเสนัพrอ้ื บõัrใhรน iNpnาolc.ะieanuหgatceboาeuanมกb2tาoo4apกrr-tเrl ก4ตohaัิ้นิ8้troง� e ไอชeตปัุุ่่ณa�วทเั้งพโอeหำมรจุณภางู2ูาะ)มห4ิกหปิ -ภพา4รกูมะล8 pมิปาชlสารaั่วณตะtโe ิกมม 3ทอางำ6�ำ)ณาจจ±าจ3ก1ะพ6ไ°ลหC+ามส(1ปตไè ิดกิก°ตè)อCิาิจจ(ะปจเะพกไตาหะิจมเ้ะชไ้ื้ด�อ้)้ รูปู ทรี่�่ปู 5ท.2่ี 5แ.ส2ดแงลสัักดษงลณกั ะษกณาระcกrาoรsscsrotrsesakstใrหe้้เaชื้kอ� กใหระèเชจ้ือายกตรัวัะจจาากยตัตัววั จZากตัว Z 85 คู่ม่� ือื การตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน 85 ทางห้อ้ งปฏิิบััติิการทางการแพทย์์

หลังจากเพาะเชื้อนาน 24-48 ช่วั โมงแลèว สามารถนำเช้ือออกมาเพือ่ การวนิ จิ ฉัยไดè โดยมีข้ันตอน ดังนี้ 3. การวิินิิจฉัยั เชื้อ�้ N. gonorrhoeae วิ3ินิ.ิจ1ฉั.ยั ลสไหดัังก้ล้ัเโัษงกดจณตยามลกะีีขเักัโ้พ�นคษาตโณะอลเนชนะื้ �อโีขดคันอังโานีงล้้น�เนช2ีื้อ4-N4.8 gชัo่่�วnโoมrงrแhลo้้วeaสeามมารักถพนำบำ�เลชื้ัก�อษออณกะมากเลพื่่ม�อกนาูนร ขอบเ3ร.ีย1บ สสังั ีนเก้ำตตลัาักลษเณทาะโเคมโลื่อนสีีõองดูภายใตèแสงไฟจะเห็นความวาวสะทèอน แสงได è โค โลัลักนษีอณาะจโมคโีหลลนีาีขยอขงนเชื้า�อดNต.ั้งgแoตnõขoนrrาhดoe0a.5e –มััก2พmบลmัักษหณาะก เกลินม2นูู4น ขชอั่วบโเมรีียงแบ ลสèวีีน้เำำ�ม�ตื่อาใลชเè ทloาoเpมื่่�อเขส่่ี่ยอจงดะููภพาบยวใõาต้โ้แคสโงลไนฟีมจะีคเวห็า็นมคเหวานมียววาวเสมะื่อทพ้้อบนโแคสโงลไนด้ี้ aโเขคีทสg่ย�โaงดลจrสนสะ(ีCัยพอีอAใาบบวห)จ่ ม่ใอèาีีนsกีหีโคuคขลโbรัาั้นล้ง�ยcนตจีึขuึมีงอีนlจคี tนาะวuดสต าrตัามeõ้อ้มเง� หไาบแปนรตีน่ถ่ไยีขดทวนcèดเาhใมสืด่นoอ�อ 0กcพบ.oร5บใน-ณlโ2aคขั้ีtสน�โmeลิต่งนmสอีaสี นgõงหงaตตส่า่ัrอยัรกไใว(เปหCกจ้ิไ้นิAsดท้u)้2ีใ่ไb4นอดc กชีกèัจu่่รว�lคาณtโกีuมรสีิrง่ั้งeง�คแจส ่ลอ่บึง้งว้นตจ(รเะcpมืว่hสhอ�จทoีใาa่ชc่ม้rไ� ้oyดlา้olnจ้ aรoาxtถpกe) คแอล(pะhทaวrาyรnหx)นแักละ(ทreวcาtรuหmนััก) (บreาcงtคuรmั้ง)ย าบาปงฏคริชั้ง� ีวยนาะปทฏิิชี่ใีสวี นõละงไที่ป่ใ� สใ่่นลงอไาปหในาอราเลหี้ยารงเเลีช้ย� ื้อง เชืไ้อ�มไõมส่่สาามมารรถถยัยับยัับ้้�งยเชื้ั้งอ� เอื่ช�นื้ไอด้อห้ ืม่นดไ ดจะèหพมบดเชื้�อจอื่ะ�นพปะบปเนชอื้อยู่�กอับั ื่นเชื้ปอ� ะNป. นgoอnยoูõกrrhับoเeชaื้อe จเทำดำีNจNำ�่�ำ �ยนำใ..วหเว้gขป้กgนoอìนาoมงnรตnาเดoชูืกèอูo้โอ�rหคงrrrโhรhืลsือouนoบีebียeาaาcaงกeuคขeึรl้ั้(t้น� �งรจu ขจึูป้ึrำ้ึ�นeงทจปนำบี่�ำกว5เนคป.็น3ล็นุMุม)ตม้เ้อTเชาืน้งM�อกื่sอuหNกงbจ.อõรcานguื อกoltเnบuพทor่ือาerำr ใงใhหบหคoนèไèกeดรMaาèโั ค้TeรงMโดขล( ูโรกูนึู่ค้ป่นอีเโทดีน่ปล่�ย่ี เน5กพวื่.ี่ยข3�อค)าอใหลกง้เไ้นเุขืด่มช่้�อึ้โ้น้อื เคงจชโจลาื้ อึนงกี ี ลักษณะโคโลนเี ช้อื N. gonorrhoeae ลกั ษณะโคโลนเี ชือ้ N. gonorrhoeae ไมมõ แี บคทีเรยี ชนดิ อนื่ ปน มีแบคทเี รยี ชนดิ อน่ื ปน รูปู ที่�่ 5.3 แสดงลักั ษณะโคโลนีเี ชื้อ� N. gonorrhoeae ที่่ไ� ม่่มีแี ละมีเี ชื้อ� แบคทีเี รียี ชนิดิ อื่่น� 8ป6น 86 คู่�่มือื การตรวจวิินิิจฉััยโรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ััติิการทางการแพทย์์

หมายเหตุุ : ในการอ่่านผลเพาะเชื้อ� ที่่ไ� ด้จ้ ากผู้�้ ป่ว่ ย ควรอ่่านผลหลังั จากเพาะเชื้อ� ประมาณ 48 ชั่่�วโมง เพราะจะทำ�ำ ให้้โคโลนีีที่่�อ่่านผล มีีขนาดใหญ่่ ง่่ายต่่อการแยกออก จากโคโรลูปนีทีขี่อ5ง.แ3บแคสทดีีเงรีลียักตัษัวอณื่ �นะๆโคแโลลนะีสเชาื้อมาNร.ถgเลoืnือoกrโrคhโoลeนaีeีที่่�ตท้้อี่ไงมกõมาีแรลมะามsีเuชื้bอculture ได้ง้่าย ลแดบคกทารีเรcยี oชนnิดtaอmนื่ ปinนate จากเชื้อ� ตัวั อื่น� (แต่่ไม่่ควรทิ้้ง� ไว้เ้ กินิ 48 ชม.) หากต้อ้ งการ subculture ให้้ได้้เชื้อ� pure เพื่่�อเก็บ็ stock culture หรืือเพื่่�อทดสอบอื่่น� ๆ โดยทั่่ว� ไป จะใช้เ้ วลาเพาะเหชื้มอ� านยาเนหปตรุ :ะใมนากณา ร1อ8õา-2น4ผ ชลั่่เว� พโมาะงเ(ชหื้อาทกเี่ไกดินิ èจา2ก4ผ ชัู่èป่ว� ¢วโมยงคเชวื้รอ� อจõาะนตผายลบางส่่วน ไม่่เหมาหะลแังกจ่่ากากรเพนำา�ำ ะมเชาทื้อปดรสะอมบา ณโด4ย8เฉชพั่วาโมะงอยเ่พ่ารงายิ่ะง� จ ะกาทรำทใหดèโสคอโลบนคีทวี่อาõามนไผวลต่่อมสีขานราตด้า้ นจุลุ ชีพี สัังเกตไใดห้จ้ ญาõ กงõาเมยื่ �อตõอเขีก่�ยาโรคแโยลกนอีีบอกนจาpกlโaคtโeล นจีขะอมีงีคแวบาคมทหีเรนียืืดตมัวอาื่นกกๆว่่แาลปะกสตาิมิ าเกรถาะเลกือัันกเป็น็ ก้อ้ น และละ(โลแคาตโยลõไนมในõีทคนวี่ต้ำรèอำ��ทเงกกิ้งลไาืวรอื èเมกหาินรืsอื 4uส8bาcชรuมลlt.ะ)uลหreาายกไดอตื่èงèอน� õางยๆกลาไรดด้กย้sาuารbกccuolntutarme iใnหaèไtดeèเชจื้อากpเชuื้อreตัวเพอ่ืน่ือ (สเ เท่ขตฉำ่ีอ่ิำ�ย�ดิพงใสเหดาีชูืู้้แีะภ้เอ� ชดขืาเปแสเl้ใ3 oปก�อหองยกังร.้o็บìน )กเ2ใงะõกก้ กรpตกเูม3รา รู้sชตืปก้èอร้.ะาtะเ2ล�อปGไนoขนณรจ้จ้่ด.่ใc้าีำ่ายrอป้าาèจนแGakมยงเ1ง=ายยาชลกกาmrโจ8ยcลกตเaุื้อะทุคลัลuุป่โเmล-่ัวใ็ดคโมมม�lทหน็sะลt2สโื่อuขtรèกลลฟแอ4นsอaเrิรีอราtนขลeยบลิีทูiaศชียะ่์ง่nีที่ยะก่�ม์i�สั่วใจนหัโnโี่นส์นนNัดโบางครก์ำมงนำยยสำ�เeือาโ�ำสัปงเำ้เลสลงัยเi็ปฉัยsเัพน็นๆ(ไกงัพsหìน(ลื่อคีขบ (ลeสูราา่ฟสีูดทยู�ือนrะีเกป์(ีเ§ลทi์ดไgหาอทaเวมปpกrยสารยาaงบิlนือนอsõานa้ก1mำาpงfสบำ��t้ำi02ลยงeาxpตตอ’4ๆ0ิ่งมร sืา่.นาจกxลขชก่ลรลn(ะๆ่ะ(รนูั่ปาวอ)ูม)oeลูรปโ โวาบนีคาgiมทดบlงดทยนaีวนงนย่ดกf่ำเอi�าtสทำ�สลสeสเ5iมื่น้ชvไมอมั่lวน้ไ.ลหๆdื้eอ4ลบไขาผดนปจ่))ยนคด่ไd าท้์ะืจดดจวา้อท์นiีี่ตหะะpยèม่าด่มห�ศาใมาพยาlูเูชยแoสกนยกดไบèเวบèนกcกนดลยวตน์าัoผรวล้ำก้์õอกังำõาõามcกาลส�ำ�สษนปเกcลõวพาลาศณiกัั(่นนร)ง่าว ูนต่ตซิไะะึ�น1ิธ่ไวิย่èาีง�เเมเีตไèนชปกกcจวแ็õเา้ืล้อจmนหา็ะ้ลมแุลาะนมเเèวชง ปชกภลืาซา้ใึ็้อ่�ีพันนชน็้ว่1ะาง� แèใคสลชัก้ผากั ้รมlนษoมาวณoลรกบpถะ) รููปที่่� 5.4 แสดงลัักษณะเชื้อ� ในกลุ่่�ม Neisseria spp. เป็น็ แกรมลบ(ตัวั เชื้อ�87ติิดสีแี ดง) รููปร่่างกลม อยู่ก� ันั เป็น็ คู่ๆ� (gram negative diplococci) 100X คู่ม่� ือื การตรวจวิินิจิ ฉััยโรคหนองใน 87 ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

3.3 การทดสอบทางชีวี เคมีีเชื้้อ� N. gonorrhoeae การทดสอบทางชีวี เคมีี หลายการทดสอบ (ตารางที่่� 5.1) โดยมีกี ารทดสอบ ทางชีวี เคมีีที่่�สำำ�คััญ เช่่น 3.3.1 Oxidase test หากบน plate มีโี คโลนีขี องเชื้อ� จำ�ำ นวนมากสามารถหยดน้ำ��ำ ยา 1% oxidase ลงบนโคโลนีีที่่�ต้้องการทดสอบ โดยตรง (วิิธีีเตรีียมดัังภาคผนวก) โคโลนีี ของเชื้อ� N. gonorrhoeae จะเปลี่ย� นเป็น็ สีมี ่่วงเข้ม้ ภายในเวลา 10 วินิ าทีี หากมีโี คโลนีี ที่่�สงสััยในปริิมาณน้้อยให้้แตะโคโลนีีเชื้ �อมาป้้ายบนกระดาษกรองที่่�ชุุบน้ำำ��ยา 1% oxidase จะเปลี่ย� นเป็็นสีีม่่วงเข้ม้ ภายในเวลา 10 วิินาทีี เช่่นกััน (รููปที่่� 5.5) หากมีีเชื้�อ เพีียงโคโลนีเี ดียี ว ให้้ subculture ไว้ก้ ่่อนเพื่่�อทดสอบในวันั ถััดไป Positive Negative Positive Negative ร1ูปู%รนทปูีำ้ ่O�่ยท5าx่ี .5i51d.5%aแsแสOeสดxดงiงdปปaฏฏsิeิกกิ ิิรริ ิิยิยาากกาารรททดดสสออบบทาทงาชงีวชเีคีวมเคีขมอีีขงเอชง้ือเชืN้�อ. gNo.nogorrhnooerraheoกeบั ae กับั น้ำำ��ยา แโโoหคคตxม่ตโโนใโโi่คหคาdลลถõอ้ำูโèโหยูนนaยไลกลีีปเยเsาีีเเนจนหปดeลดีร่ีใีเิตงย�นลนีชุิญ่ลไหุว้ำย�ดปื้:องยขทมนèามใไัาอานนัNบปเีอยปดง1ท.กป็ย้เเ%็นgหีช่รไ้วõารื้มoสณงต�อยะีีnõoไนดีุมเเดีทำ:ชoพxีèอืื่�ำ้า่่èหiใ่�r�อ dยอ�ณprนยแhชaทlก1ดคสsoaนดรeินรetดโึิดณ่สeคอ้ง�ำaงลือ่หยโีทeว่งเ่ล�น่าบพนาไี่ึตน่อปp่ใ่า�งม่นีเยlปใขะอaปาหูõรเแtอ้ไแลชpeะ้ปืปย้งตี้่ย�อมl้ากเaนõถา pพยใtมณเูกหีleาโปีเaเคะèชไคืìนจ้tดเอโร�อeรชสลèโึ่งาอิญืค้อืีดห่นจห�นีโำทนจีใมลาๆนึ่งับแะนีเก ชขดสมขดีเคึ้ีอื้อด้ด้าีโน้�èวรึงอี่ค่ยนงย�งคื่นววโpททเีีลลõขา่่ชๆlุ่่ห��ไaใุมนอื้อมนีt่ขยทงีเ่eัชไ้ชึเ้นดื้้pง�ดชนน�อห้ค้lื้้อหิpดำaาล��ำเNtยอlกุพมยeaืคด่น.ทืา่อtนรอ้eลgั้งทำึ่งใาoำ��งหทดใpจไยnหสèี่หปจlป้าao้หอะย=ามtrบีมดeยยมrอี ีhดายน่o้่แาำe�ำ�ยงยaนก้าeอ้ใหย1้อ้ไ%ดย1ู้่� ้ 88 ทคู่า�่มงือืห้อ้ก3งา.ป3รตฏ.ิ2รบิ ัว.ตั Sจิกิวuิปินาิpรจิ=าทฉeยัายัrเงชoโกรื้อxคาoลรหแงlนพบอtทeนงยใsสน์์tไล(3ด0ท%ี่สะอHา2ดOแ2ล)èวหยดน้ำยา 30% H2O2 หรือ 3% H2O2 (catalase test) ลงไป สังเกตปฏิกิริยา หากเปìนเชื้อ N.

3.3.2 Sป้u้ายpเeชื้r�อoลxงoบlนtสeไsลtด์(์ที3่่ส� 0ะ%อาHดแ2Oล้ว้2)หยดน้ำ��ำ ยา 30% H2O2 หรือื 3% H2O2 (catalase test) ลงไป สังั เกตปฏิกิ ิริ ิิยา หากเป็็นเชื้�อ N. gonorrhoeae จะพบ ว่่าเกิิดฟองอากาศปริิมาณมากทันั ทีที ี่่ห� ยดน้ำำ�� ยา (4+) หากเป็็นเชื้�อ N. meningitidis หรืือ species อื่่น� ๆ อาจจะพบว่่าเกิดิ ฟองอากาศช้า้ ๆ เพีียงเล็็กน้อ้ ย (1+) (รููปที่่� 5.6) ปฏิกิริยา 1+ ปฏกิ ริ ิยา 4+ รHูปู 2Oที่2�่รก5ูปับ.6ท3ี่ 0แ5%ส.6ดHแงปส2Oฏดิ2งิกิปริ ิฏยิ ิกากริ ยิาารกทาดรสทอดบสทอาบงทชีาวี งเชควี มีเีขคอมงีขเอชื้งอ� เชNอ้ื . Ng.ognoonrrohrroheoaeea eกับั 30% หมายเหตุ : ไมคõ วรหยดนำ้ ยา 30% H2O2 ลงบน colony เชื้อโดยตรง ปหมฏิาิกิยเขิรพิเอิยหรงาาตแุpะุ:รlเไaมงมt่ือ่eคอเกวาตริดจาหปเยกยิฏหิดดิกนรฟ้ิรำอื อำ��ิยเยกงาาอแดิ ราก3งกา0ราอ%ศาcกจoHเรnก2ะtOิดaเดฟ2m็็นอลinงทำอaบำ�tานใeกห้าcไ้เศดชoื้èก�อloรใะnนเyสด่่ว็นเชนื้ทอ� อืำ่โ่�ในดหๆยèเตชขรื้องอในงเสพpõวรนlาaะอtเื่นeมื่ๆP�อตoเกาsิิดยi tive หรือื เกิิดการ c3o.3n.t3a.mCainrbaotehyไดd้้rate utilization test วิธีนี้ใชèหลักการของความสามารถในการหมัก (ferment) tน แi ขg้neำlลอำ��udsตะงtcicเเาoโชปืaลด้ s�อลtกีย e่oล �ยูกซ ึrู(น่าโ ่Gถ�คง รส้)ีส้าทสีจ 3fทนlจอเsเmาไaดeปชา.tืะ ้ดด้าำร3ecrกส�อ้ลaสตmลจสเ้ส. trอ3สีlพ่ยioีาาะอใltี บีแe ามeนoลsยีชลบมnดจeาCวสขงsèาิlกtระางิธeตoอีaจrย(ีัาเถรaใีนLวัoนีาrงปจชร้(ถp้็้bเ)ใ�เMกpใf้้ะน็ำดชชsieชีo้สdfแตมtส)ยี้หื้อeเrีèนีeีแhขmลาีสเีวsrmล่้ำrหด่ัmซีy่uยละวiักตelโงลidึ่โcงeชมนcืกnดeาเคสอืrrrนปีผลlาtoยnoโaางopรìลสินดกstนรtgohข cโeนมeสลนานl้ำด้peaอuรำีเขีเะตั��ำ(้ ยนrชnuหงcทSเลอbาตขเคืo้oอไีtล)่ชดลาoงืายด�i้วlsมือlแยนกอ�สลh้โeiาè rำางzลจคลอำช�y�eทมNaะ(ะูโโdตบน1dโGสำลคิ.tมดrาอิดใlา)iนaสgนlเียสaoลหีัาoมปto้mไเี cเõว้nชจeดoèืาส�นช้nìtนนโอ�ใaรèเpoืา้อไดtชotพผมlถ้ดeรset้iยr้จีสยnาใose ้rลrsปนทhาtงaมds1tำะก(ตกกepo�ำ iขโLcลตlัใวดาeiอo)aิcd(หาเรMa้ยิจงothดแย้สหoนeะกopmียล)ามr้ำ ทNpวc าัะsรักiจตถจoucH.รมดละา โีาèrlาcทgดีะส(กสaoลpfเroเ ลยอeดtปoาชchneกาโrมบcsสhìืน้emดอoยาeaากaoอnกยrรสrรgepาrc(bบทoปรถhาaSรonHoดlดจrมก)oใltfhชสaแrตะe)eแแาเ้e ปty้อนนลaิrรลจใบ้็้edำmdำชน็บถeำะะ�ะ��ำ�õงarè ตกตเeaปgราา็ntaน็ดลลetr ใสใõ นหลอดนำ้ ตาล G, 3M6,±S1°หCรือใชLèเวเลมาื่อเใพสคูท่เõี่�มยาชืงอืง้อืห้กอ้เ3าสง0รปรตฏ็จนริิบวแัาจตัลิทวกิิวèนิ ีิาสิจ–รฉาทัยัม2าโงารกชคราัห่ถวรแนโนพมอำงทงเใขนย์กèา์ ็ 89 incubator อุณหภูมิ สามารถอõานผลไดè (รูปที่ 5.7) หรืออาจใชèการทดสอบ Cysteine

แบ่่งใส่่ในหลอดน้ำำ��ตาล G, M, S และ L เมื่่�อใส่่เชื้้�อเสร็็จแล้้วสามารถนำำ�เข้้า incubatotrry อpุtุณicหaภsููeมิิ a3g6a±r1(°CCTAใช้)เ้ วทลี่มาีนเพ้ีำียตงาล30G,นMาท,ี-ี S2 ชหั่่ร�วือโมLง กค็็สวาามมาเขรถèมอข่่าèนนผ1ล-ได้้ Mอ((รตุูุณูป,ารหSที่า่ภ� แูง5ูทมลี.ิ่7่ิ�2C3ะ31)%6D6)Lห±C±รค1ือ1ือ(ว°°ยตอCCาูาõามใใรจใเชหชขาใ้้ชèเเ้งèม้ใ้ววทก้สขลล้าõ่ีเน้าา1รชท)ื12้อ2ด-44ใ2ส นช%ัชอ่ป่ว�ั่วบรโอ โมิมมCยู่งง�าy ใถsณึหถึt้งeใ้ึงมอส่iอ่่่nาาเõาชนกืe้น�อผtใผแลrนyลลไปดpไèว้ดร้tินแiมิècแำลาaเะลณsขแeะมèาปแาaลปiกgnผ aลcแลrผuลก(้ลbCว้ากนaรTำาทAtำ�รoเ)ดข ทr้ทสีา้่ด่ออม� iีสุบณnีน้กอำcำ��ัหบuับตภ bกาCลaูับมtDิ oGCr, รรููปูปทที่ี่�่ 55..77 แแสสดดงงผผลลกกาารรททดดสสออบบกการาหรหมัมักนกั้ำน��ำ ต้ำาตลาขลอขงอเชงื้เ�อชN้ือ.Ng.ognoonrrohrorheaoeeae ตารางที่่� 5.1 การทดสอบทางชีวี เคมีี ของเชื้อ� Neisseria spp. Species Acid From* ReNidturcattieon GMS F L Pforloy-smaScucchraorisdee DNase Superoxol Pigment ReCsiolsitsatinnce N. gonorrhoeae + - - - - - - - Strong (4+) - R (\"explosive\") N. gonorrhoeae + - - - - - subspecies kochii - - Strong (4+) - R 90 คู่่ม� ืือการตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน 91 ทางห้อ้ งปฏิบิ ััติกิ ารทางการแพทย์์

Species Acid From* ReNidturcattieon GMS F L Pforloy-smaScucchraorisdee DNase Superoxol Pigment ReCsiolsitsatinnce N. meningitidis + + - - - - - - Weak (1+) to - R strong (4+) N. lactamica ++- -+ - - - Weak (1+) to + R strong (3+) N. polysaccharea + + - - - - + - Weak (1+) to - (R) strong (3+) N. cinerea - - - - - - - - Weak (2+) - (R) N. flavescens - - - - - - + - Weak (2+) + S N. mucosa + + + + - + + - Weak (2+) d S N. subflava ++- - - - - - Weak (2+) + S biovar subflava N. subflava + + - + - - - - Weak (2+) + S biovar flava N. subflava ++++- - + - Weak (2+) + (R) biovar perflava N. sicca + + + + - - + - Weak (2+) - S N. elongata ----- - - + - -S M. catarrhalis ----- + - + Weak (1+) to - (R) Strong (3+ to 4+) K. denitrificans + - - - - + - - - - R *Acid From ; G = Glucose, M = Maltose, S = Sucrose, F = Fructose และ L = Lactose ที่ม่� า http://www.cdc.gov/std/gonorrhea/lab/biochemical.htm คู่่ม� ืือการตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน 91 ทางห้้องปฏิบิ ัตั ิิการทางการแพทย์์

4. การทดสอบ ß-lactamase test เช้ือ N. gonorrhoeae การทดสอบการดื้อตõอยา penicillin โดยเกิดจากกลไกการสรèาง เอนไซม β -lactamase มาทำลายโครงสรèางของยา penicillin โดยการดื้อตõอ ใßพย4น-า.lเล ชaืก้าอc�pา4สteรNa.มก1ทnm.ดิา.gดicรaoAสทiทsnlอcelำดoiบiไndสrดมrอhißใèหาmนบoท-ลำleเกำ�eaาชaลาcยtื้อeรrาtวia ยดcืธิด้N้m้โ�อีว้คเm.ยตชaร่่gกองõนseoลสeยtnไรhา้กt้านoีeoง้rp้sเข�drกtehอิดิnoเขงชึืยi้e้cน�้อ�้ าaiจlNelาpiกn.eยดgีnèวนีโoiดcยทnี่iย่กlอ�olเยiลูrกn่ิบ�rไิดhกนโจoดนพาeยี้เกลaกกกาาeิดสลรขมดไืิ้กดิึ้น�อ กทตจ่ำ่าอา�ำ รไยกดสา้ยห้ร้ีน้าลpงทาeเยnี่ออวiินยcธิ ีiีไูõบเlซชl่i่นนมn์ ์ หลกั การคอื enzyme penicillinase จะยอõ ย penicillin เปìน penic4il.o1i cAaccididim(eกtรrดic) mทeดtสhอoบdโดยการหยดน้ำยา bromocresol purple (BCP) ล งบ นหลกักัรกะาดราคษือื กeรnอzงymแลeèวpปe=าnยiโcคilโliลnนasขี eอ งจเะชย่่้อื ลยงpบeนnกicรilะliดnาเษป็กน็ รpอeงnหicาilกoสicี aแนsวpขtcลจrาõ้อriaว้dาoเงiชปกnd(้กสกอ้ืา้ีuรรชยมีน่ะcด่นโว้ีิดคi)สงnิดททโาเรีgลป่ษด่าè็เ�น็นNสงรบีีขีเยีสอ.รีออกีเบgิเวหนงว่โo่เลดไณาชืืnซ้ือยอ�pทoมกงลer่ีปา งr(βnรรh=าบูห-ูiปยcloนยaiทเีleก่ดชcl่น�iaรt้้ือn5ำะae��ำaเ.ด8mยปs()าาeลPaษแbยี่PspกสrนeNorรดoจmGอเงdปางว)่ouก่ìนาหccสเrชาiืs้eีมnกอ�tsสgวõrนoีีa้ง้ขีN�liเnสอpป.รงugนì้ชกา้ orนสpงรnเเีlะิดอeหoดทนrล(าrBเี่ไhือษรซCoียงบมP์รeก์)ิ(aßวเิลรว-eõางูปณlบทapีท(นc่P่e่ีtก�ปPa้n5รNา้miะ.ยcG8ดaเi))ชlาืs้lอ�ษieแnเกสปaเรปดsลอี็่eน็งย�ง ß -lactamase Positive ß -lactamase Negative รูรูปูปทีท่�่ ี่55.8.8แแสสดดงปงปฏิฏิกิริกิ ิิยิรายิ กาากราทรดทสดอสบอทบาทงชาีีวงเชควี มีเีขคอมงีขเชอื้อ� งเชN้ือ. gNo.ngoorrnhooreraheo eกัaบั นe้ำำ��กยบั า bนroำ้ ยmาobcreosmolopcruerpsolel p(BuCrPp)le (BCP) 4.2 ทดสอบโดยวิิธีี chromogenic cephalosporin 93 การทดสอบโดยใช้้น้ำำ��ยา nitrocefin solution หรืือ cefinase disk® (มีียา nitrocefin อยู่ �) ทำำ�โดยการป้้ายโคโลนีีของเชื้้�อลงบนแผ่่น disk หากเชื้้�อ สร้า้ งเอนไซม์์ ß-lactamase จะย่่อยสลาย nitrocefin เปลี่ย� นเป็น็ สีแี ดง (รููปที่่� 5.9) แสดงว่่าเชื้อ� N. gonorrhoeae เป็็น strain ที่่�ดื้อ� ต่่อยา penicillin ชนิดิ PPNG 92 คู่ม่� ืือการตรวจวิินิจิ ฉัยั โรคหนองใน ทางห้้องปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

ที่ 5.9) แสดงวõาเชื้อ N. gonorrhoeae เปìน strain ที่ดื้อตõอยา penicillin ชนดิ PPNG รปู ทรูีู่ป5ที.่9่� 5แ.9สดแสงปดงฏปิกฏิิริกิิยิริาิยกาการารททดดสสออบบททาางงชีชีวีวเคเคมีมีขอีขงอเชงื้ �เอช้อืN.Ng.ognoonrrohorrehaoee กaัับ e กบั cceefifninasaesedisdki®sk® 55.. กากรคาวรบคควุุมบคุคุณมุ ภคาณุพกภาารเพพกาะาเรชื้เ้อ� พาะเช้ือ ควบเ คุลคีุ้ณย� ุมภงเคเาชนื้พุณอ�เื่อนใทืี่นภ่่่�องเ� ทตางดุุรกพดขีè้วัีย้้วใ้มยน�ยนตววใิทชอิธิธ้ีุกเ้ีนกีกชื้า ข�อทาัร้ั้นส้รง�เาพตเอยพาอาพะัหานันเชาะื้ธุร์�อ�ทเมเชปลาีั้ง้ย�ตืร้องะอรปเฐกชาื้ารอ�อหนะบ า ดกกด้ราั้วังอรเภยลยบ้หาอ้ี้ยคดมลงผสาèวเีนชยี ยแวขื้อั้ลหก�น ะสลกต่ก่อาาวานรรนยคยก ขจวาึèอัึ้นบรงมคคตตุ้สวุม้ออบีคงคุแนมุณุีมุลีกภคจะาุาุณรึกงพคตภาอวราèาอบพหคคงุใาวมนุมรบ ีก คาุมร คุณกภาารพผลอิิตานห้ำำ��ายราทเลดี้ยสงอเบชทื้อาทงชีี่เีวตเครมียี ีมจะใใชช้เ้è ชืช้อ� ื้อสสายาพยัันพธุ์ัน�มธาตุมราฐตานรฐ คาือื นNด. ังgoภnาoคrผrhนoวeกaeสõวน การAคTวCบCค4ุม30ค6ุณ9 ภาพในการผลิตน้ำยาทดสอบทางชีวเคมี จะใชèเชื้อสายพันธุ มาตรฐาน คอื N. gonorrhoeae ATCC 43069 94 คู่่ม� ืือการตรวจวินิ ิจิ ฉััยโรคหนองใน 93 ทางห้้องปฏิิบัตั ิกิ ารทางการแพทย์์

รปู ท่ี 5.10 แสดงข้ันตอนการเพาะเช้อื และยนื ยันเชอื้ N. gonorrhoeae รูปู ที่่� 5.10 แสดงขั้�นตอนการเพาะเชื้อ� และยืืนยันั เชื้อ� N. gonorrhoeae 94 คู่่�มืือการตรวจวินิ ิจิ ฉัยั โรคหนองใน 95 ทางห้อ้ งปฏิบิ ัตั ิกิ ารทางการแพทย์์