Antioxidative

ฤทธต์ิ ้านอนมุ ูลอสิ ระและองคป์ ระกอบทางเคมีของ สารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์จากเห็ดป่ากนิ ได้ Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharide extracts from wild edible mushrooms นางสาววชริ าภรณ์ ชใู จ อาจารย์ที่ปรกึ ษา ดร.สมจินตนา ทวีพานชิ ย์ ภาควชิ าเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวทิ ยาลัยอุบลราชธานี

Outline 1 ท่มี าและความสาคัญ 2 วิธีการทดลอง 3 ผลและอภปิ รายผลการทดลอง 4 สรปุ ผลการทดลองและขอ้ เสนอแนะ1

ท่มี าและความสาคญั อนุมูลอสิ ระ (Free radical)2

ท่มี าและความสาคญั ท่มี าของอนมุ ลู อสิ ระ3

ท่มี าและความสาคัญ สารต้านอนุมูลอิสระ คือสารท่ีทาหน้าที่ ป้องกนั ไม่ใหพ้ วกอนมุ ูลอสิ ระก่อตวั ขึ้น โดยจะทาการยับยั้งปฏิกิริยาลูกโซ่ของ อนุมูลอิสระ และหยุดการก่อตัวใหม่ของอนุมูล อิสระช่วยซ่อมแซมความเสียหายท่ีเกิดจากตัว อนมุ ลู อิสระท่ีไปทาลายเซลล์ต่างๆ ในร่างกาย4

ท่มี าและความสาคัญ แหลง่ ของสารตา้ นอนมุ ลู อสิ ระ5

ทม่ี าและความสาคัญ สารกลุ่มพอลีแซคคาไรด์ สารกลมุ่ ไตรเตอรป์ ีนอยด์ สารออกฤทธ์ิทีส่ าคัญในเห็ด กรดไขมัน โปรตีน : เล็กตนิ6

ทมี่ าและความสาคัญ -เพม่ิ ประสทิ ธภิ าพของเซลลค์ ุ้มกัน -กระตุ้นวงจรการทางานของระบบ ธรรมชาติให้ทาหนา้ ท่ีทาลายเซลล์ ภมู คิ มุ้ กันในรา่ งกายเพ่มิ ปรมิ าณ แปลกปลอมทเ่ี ขา้ ส่รู ่างกาย7

งานวจิ ยั ทเี่ ก่ยี วขอ้ ง ผู้วจิ ยั ช่อื งานวิจัย ผลการศกึ ษาI. Orhan และคณะ การศกึ ษาฤทธ์ติ า้ นอนุมลู อิสระและ P. sulphureushaving สามารถ การยบั ย้งั เอนไซม์ ยับย้ัง AChE ท่ีดีท่ีสุด และ P. Acetylchlolinesterese voluatus มีความสามารถในการ ในเห็ด 4 สกลุ กาจัดอนุมูลอิสระ DPPH ได้ดี ทส่ี ดุชลดา จัดประกอบ และ การศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและ สารสกัดเอทานอล มีฤทธ์ิต้านคณะ ฤทธ์ติ า้ นการกอ่ กลายพนั ธ์ขุ องสารสกัด อนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการก่อ จาก Phellinus rimosus กลายพนั ธท์ุ ี่ดีท่ีสดุกลมุ่ นักศกึ ษามหาวิทยาลัย การศึกษาฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและ สารสกัดหยาบเอทานอลมีฤทธิ์อุบลราชธานี สารต้านอนุมูลอิสระของสารสกัดเห็ด ต้านอนุมูลอิสระและสารต้าน ปา่ กนิ ได้ อนุมลู อสิ ระสงู สดุ8

งานวจิ ัยที่เก่ยี วข้อง ผวู้ จิ ัย ช่อื งานวจิ ยั ผลการศึกษาPeng-Fei Tu และคณะ ศกึ ษาฤทธ์ิกระตนุ้ ภมู คิ ุม้ กนั ของพอลี พ อ ลี แ ซ ค ค า ไ ร ด์ ที่ ส กั ด ไ ด้ มี แซคคาไรดท์ ่ีสกัดไดจ้ ากเห็ด ค ว า ม ส า ม า ร ถ ใ น ก า ร เ ป็ น Sarcodon aspratus (Berk.) S. Ito. ตัวกระตนุ้ ภูมคิ ุ้มกนั ได้รนิ ฤดี โซ่มงคล และคณะ ศกึ ษาฤทธก์ิ ารเป็นแอนติออกซิแดนท์ พอลีแซคคาไรด์ของ Boletus และการกาจดั อนมุ ูลอสิ ระของพอลแี ซค sp. มีความสามารถกาจัดอนุมูล คาไรดจ์ ากเหด็ กนิ ได้ทัง้ หมด 5 ชนิด อสิ ระ DPPH สงู สดุ9

วัตถุประสงค์ และขอบเขตของงานวิจยั เพอ่ื ศกึ ษาวธิ ที เ่ี หมาะสมในการสกดั สารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์ เพอ่ื ศึกษาศักยภาพในการออกฤทธติ์ ้านอนมุ ูลอิสระในสารสกดั หยาบ พอลแี ซคคาไรด์จากเหด็ ป่ากนิ ไดจ้ านวน 16 ชนิด โดยวิธี DPPH, ABTS, FRAP, Total antioxidant activity เพื่อศึกษาสารออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ ได้แก่ ปริมาณสารประกอบฟี- นอลรวม และ ปรมิ าณสารประกอบฟลาวานอยดร์ วม เพ่ือศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของสารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์จาก เห็ดป่ากินได้ ได้แก่ ปริมาณน้าตาลรวม ปริมาณโปรตีนรวม ปริมาณ เบต้ากลูแคนรวมและศึกษาหมู่ฟงั กช์ ันดว้ ยเทคนคิ FT-IR10

การทดลองการเก็บตัวอยา่ งเหด็ ปา่ กินได้จานวน 16 ชนดิAstraeus hygrometricus Boletus colossus Heim Cantharellus cibarius. Mycoamaran thuscambodgensis (Pat.) Tricholoma crassum Berk.11

การทดลองTermitomyces clypeatus Heim Scytinopogon echinosporus Russula emetic Russula densfolia12

การทดลอง : ภาพรวม ตัวอย่างเหด็ แห้งบดละเอียดวิธสี กดั ด้วยสารละลายเบส 2 วธิ ี วิธีสกดั ด้วยนา้ ร้อน 2 วธิ ี crude polysaccharide เลอื กตวั ทาละลายท่ีเหมาะสม การศกึ ษาของสารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์ฤทธติ์ า้ นอนุมูลอิสระ สารออกฤทธิต์ า้ นอนมุ ูลอิสระ องคป์ ระกอบทางเคมี13

วิธกี ารทดลอง อบแหง้ และปน่ั ละเอียด เพือ่ เตรยี มศึกษาตอ่ ไป การเตรยี มตวั อยา่ ง14

วธิ ีการทดลอง: การสกัดสารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์วิธสี กัดดว้ ยสารละลายเบส Reflux อัตราสว่ นตัวอย่างวธิ สี กดั ด้วยนาร้อน ต่อเบสเปน็ 1:10 Reflux อตั ราส่วนตัวอยา่ ง ต่อเบสเป็น 1:20 สารสกัดหยาบพอลแี ซคคาไรด์ Reflux ท่อี ุณหภมู ิ 80 oC เปน็ เวลา 1 ช่ังโมง Autoclave ท่อี ณุ หภมู ิ 121 oC เป็นเวลา 30 นาที15

การทดลอง1. การทดสอบฤทธติ์ า้ นอนมุ ูลอิสระ DPPH• ของสารสกดั หยาบโพลแี ซคคาไรด์จากเหด็ปา่ กนิ ได้ 16 ชนิด โดยใช้วธิ ี DPPH Radical Scavenging Activity2,2-diphennyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) DPPH• (สมี ่วง) Sample DPPH (สีเหลอื ง), λ max517 nm16

การทดลอง2. การทดสอบฤทธิต์ า้ นอนมุ ูลอิสระ ABTS•+ ของสารสกดั หยาบพอลแี ซคคาไรด์ของเหด็ป่ากินได้ 16 ชนดิ โดยวิธี ABTS Cation Radical Scavenging Activity O OH N O SN S S O NS O OH Nโครงสรา้ งของ ABTS•+ (2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) ABTS AH ABTS A ABTS•+ (สเี ขียวนาเงนิ ) ABTS (ไม่มสี )ี , λ max734 nm17

การทดลอง การคานวณเปอร์เซน็ ต์การต้านอนุมูลอสิ ระ โดยวิธี DPPH Radical Scavenging Activity และ ABTS Cation Radical Scavenging Activity % DPPH Radical Scavenging Activity / = (AControl – Astd/sample) × 100% ABTS Cation Radical Scavenging Activity AControl Acontrol = Absorbance of DPPH or ABTS solution without sample Astd/sample = Absorbance of DPPH or ABTS solution with Std. solution or sample18

การทดลอง3. การทดสอบความสามารถในการรีดวิ ซ์เฟอร์รกิ ของสารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์จากเหด็ ปา่ กินได้ 16 ชนิด โดยวธิ ี Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP assay) NNN NNNN NN + antioxidant N NN - e-(III) Fe (II) FeNN N NN NNNN NNNFe3+- TPTZ (ไม่มีสี) Fe2+- TPTZ (สีมว่ งนาเงนิ ) , λ max593 nm คานวณความสามารถในการรดี วิ ซเ์ ฟอร์รกิ (FRAP value) ในหนว่ ย mg VCE/g ของสารสกัด19

การทดลอง4. การทดสอบความสามารถในการต้านอนุมลู อิสระรวม (Total antioxidant activity)ของสารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์จากเห็ดปา่ กินได้ 16 ชนดิ โดยวธิ ีPhosphomolybdate12 MoO42 - + H2PO4- + 24H+ [H2PMo12O40]- + 12H2O Mo5+ (ไม่มสี )ี Mo4+ สารละลายสเี ขียว , λ max695 nm คานวณความสามารถในการตา้ นอนมุ ลู อสิ ระรวมในหนว่ ย mg GAE/g ของสารสกัด20

การทดลอง5. การศกึ ษาปริมาณสารประกอบฟีนอลรวม (Total phenolic compoundcontent) ของสารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรดจ์ ากเห็ดป่ากนิ ได้ 9 ชนดิสเี หลืองออ่ น สีนาเงิน, λ max 765 nm คานวณความปรมิ าณสารประกอบฟีนอลรวมในหน่วย mg TAE/g ของสารสกดั21

การทดลอง6. การทดสอบเพ่ือหาปริมาณสารประกอบฟลาโวนอยด์รวม (Total flavonoidcontent) ของสารสกดั หยาบพอลีแซคคาไรด์จากเห็ดป่ากนิ ได้ 9 ชนดิ สารประกอบฟลาโวนอยด์จะเกิดสารประกอบเชิงซ้อนกับอลูมิเนียม (III) ไอออน (Aluminium ion (III), Al3+) ในสภาวะเบส แล้วให้สารประกอบเชิงซ้อนสีส้มแดง (λ max510 nm) คานวณปริมาณสารประกอบฟลาโวนอยดร์ วมในหนว่ ย mg CE / g ของสารสกดั22

การทดลอง7. การทดสอบหาปริมาณนาตาลรวม (Total sugar content) ของสารสกดั หยาบพอลแี ซคคาไรดจ์ ากเห็ดป่ากินได้ 16 ชนดิ โดยวิธี Phenol-Sulfuric method HO OH HO Phenol Yellow - Orange compound H2SO4 O FurfuralOO HO OH สเี หลอื ง-สม้ , λ max490 nm Glucose ไม่มสี ี คานวณปริมาณนา้ ตาลรวมในหนว่ ย mg Glucose/g ของสารสกัด23

การทดลอง8. การทดสอบหาปรมิ าณโปรตีนรวม (Total protein content) ของสารสกัดหยาบพอลแี ซคคาไรด์จากเหด็ ปา่ กนิ ได้ 16 ชนิด โดยวิธี Lowry-Folin’s method OC OC CO NH Cu2+ NH HN + Folin ciocalteau OH- 2 RHC RHC CHR O NH Cu2+ OO NH HN โปรตนี (ไมม่ ีส)ี สารประกอบเชงิ ซ้อนของโปรตีน กบั copper (II) (สีนาเงิน), λ max600 nm คานวณปรมิ าณโปรตีนรวมในหนว่ ย mg BSA/ g ของสารสกัด24

การทดลอง9. การทดสอบเพือ่ หาปรมิ าณเบต้ากลูแคนรวม (Total betaglucan content)ของเห็ดป่ากินได้ 16 ชนดิ ชัง่ นาหนกั คานวณ % Yield ของเบตา้ กลูแคน สกดั ด้วย Sodiumcarbonate bicarbonate buffer อัตราสว่ น 1:10 (%w/v)25

การทดลอง10. การศกึ ษาองคป์ ระกอบทางเคมขี องสารสกดั หยาบพอลีแซคคาไรด์จากเห็ดป่ากนิ ได้10 ชนิด ด้วยเทคนคิ Fourier-transform infrared (FT-IR) spectrophotometry ตัวอยา่ งสารสกดั หยาบ KBr pellet FT-IR spectrophotometer พอลีแซคคาไรด์ผสมกบั (เลขคลนื่ 400-4000 cm-1) KBr ในอตั ราสว่ น 1 : 10026

ผลการทดลอง : รอ้ ยละผลิตภัณฑข์ องการสกดั หยาบพอลแี ซคคาไรด์% Yield of crude polysaccharide extract 120 สกัดด้วยสารละลายเบส 100 97.99 สกัดดว้ ยนารอ้ น 80 60 57.3 40 20 0 Crude polysaccharide extract27

ผลการทดลอง : วธิ ีการสกัดและตวั ทาละลายที่เหมาะสมDPPH radical scavenging activity (% ) 35 สกดั ด้วยสารละลายเบส, ตวั ทาละลายนา 30 สกดั ดว้ ยสารละลายเบส, ตัวทาละลาย เมทานอล/นา 25 สกดั ด้วยนาร้อน, ตัวทาละลายนา 20 สกัดด้วยนาร้อน, ตวั ทาละลาย เมทานอล/นา 15 10 เหด็ ผึงข้าวจา้ ว เหด็ ผึงตองเทา เหด็ ผงึ ขาว เหด็ ผงึ นกยูง เห็ดหาฟาน 5 0 เหด็ เผาะฝ้าย Crude polysaccharide extract28

ผลการทดลอง : DPPH assayDPPH radical scavenging activity (%) 45.00 40.00 39.44 35.00 30.00 25.00 24.53 20.00 15.74 14.07 19.73 18.30 11.48 16.14 15.00 11.82 12.00 10.00 8.09 9.11 4.88 5.00 1.31 2.57 0.00 0.27 -5.00 Crude polysaccharide extract29

ผลการทดลอง : ABTS assay% ABTS Radical cation scavenging activity (%) 90 81.62 81.91 80 70.59 70 66.75 60.03 60 56.2 53.03 52.05 50.27 50 43.69 45.57 41.46 40 32.61 28.59 32.32 30 26.64 20 10 0 Crude polysaccharide extract30

ผลการทดลอง : FRAP assay 1000.00 900.00 841.66FRAP Value (mg VCE/g extract) 800.00 739.30 757.83 713.55 700.00 683.70 670.95 600.00 566.30 537.34 567.98 571.95 556.75 523.50 500.00 402.40 420.77 411.26 400.00 400.60 300.00 200.00 100.00 0.00 Crude polysaccharide extract31

ผลการทดลอง : Total antioxidant activity 120.00Total antioxidant activity (mg GAE/g extract) 100.00 95.12 90.88 90.56 87.87 69.84 81.22 80.00 67.61 66.51 60.00 55.61 47.28 49.96 44.72 46.44 50.50 38.93 40.00 20.38 20.00 0.00 Crude polysaccharide extract32 33

ผลการทดลอง : Total phenolic compound contentTotal phenolic content (mg TAE/g extract) 80.00 69.26 70.00 60.00 55.48 57.49 50.00 44.34 47.00 40.00 41.69 38.30 31.78 30.00 22.70 20.00 10.00 0.00 Crude polysaccharide extract33

ผลการทดลอง : Total flavonoid compound contentTotal Flavonoid content (mg CE/g extract ) 18.00 15.35 16.00 14.00 11.74 12.00 10.00 8.94 8.00 6.00 4.55 4.00 3.31 3.14 2.13 2.00 0.64 0.37 0.00 Crude polysaccharide extract34 35

ผลการทดลอง : Total sugar contentTotal sugar content (mg Glucose/g extract) 300.00 250.00 199.33 196.99 201.12 173.81 236.20 200.00 214.38 164.37 175.73 150.00 140.80 132.98 108.72 129.76 100.00 84.56 70.30 66.17 50.00 10.59 0.00 Crude polysaccharide extract35

ผลการทดลอง : Total protein content 250.00Total protein content (mg BSA/g extract) 205.61 200.00 192.20 171.36 153.41 142.20 142.61 150.00 120.79 138.20 100.00 99.35 95.23 91.01 110.07 104.91 72.76 87.79 50.00 14.65 0.00 Crude polysaccharide extract36

ผลการทดลอง : Total betaglucan contentTotal betaglucan content (g/100 g dry weigh 25.00 21.00 sample) 20.00 15.00 12.62 10.98 10.21 10.00 8.38 6.03 2.50 2.83 5.38 5.09 2.56 5.00 0.00 1.31 3.54 2.19 1.25 0.00 Crude polysaccharide extract37

ผลการทดลอง : สเปกตรมั FT-IR O-H stretching, N-H stretching -C=O stretching, -N-H bending%T a) b) c) 100 d) e) f) g) 50 h) i) j) 0 4000 3000 2000 1000 Wavenumber (cm-1)อนิ ฟาเรดสเปคตรัมของสารสกัดพอลแี ซคคาไรด์ของเหด็ ปา่ กนิ ได้ (a) เห็ดเผาะฝ้าย (b) เหด็ ผึ้งน้าครามกระเปาะเหลือง (c) เหด็ ผ้งึ ทาม (d) เหด็ ผง้ึ ขาว (e) เห็ดมันปูเหลือง (f) เหด็ หนวดแมว (g) เหด็ หาฟาน (h) เหด็ ก่อแดง (i) เห็ดปลวก (j) เห็ดตีนแรด38 39

ผลการทดลอง : ตัวอยา่ งสเปกตรัม FT-IR 6 β-glycosidic linkage 4 Transmittance (%) 2 0 890 -2 920 -4 2935 1409 α-glycosidic linkage -6 -8 -C-H stretching ของ CH21641 1030 -10 -12 3393 1087 -14 3500 O-H str-eCtc=hOin, =g,CN=-CHssttrreettcchhiningg, N-H bending 4000 -C-O-C stretching, -C-O-H stretching 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumber (cm-1) อนิ ฟาเรดสเปคตรัมของสารสกดั หยาบพอลแี ซคคาไรด์ของเห็ดผง้ึ นา้ ครามกระเปาะเหลือง39

สรปุ ผลการทดลองวธิ กี ารทดสอบ ผลการทดสอบ DPPH สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผ้ึงขาว 39.44 ± 1.37 % รองลงมา คือ สารสกัดพอลีแซค- คาไรด์ของเห็ดผึ้งตองเทา 24.53 ± 0.41 % โดยเทียบกบั สารมาตรฐาน Trolox® ABTS สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผ้ึงนกยูงขนแดง 81.91 ± 0.07 % รองลงมา คือ สารสกัด พอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผึ้งขาว 81.62 ± 0.51 % โดยเทียบกับสารมาตรฐาน Trolox® FRAP สารสกดั พอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผึ้งข้าวจ้าวมีค่า FRAP value สูงสุดเท่ากับ 841.66 ± 20.08 mg VCE/g extract รองลงมา คือ สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผ้ึงขาว 757.83 ± 1.01 mg VCE/g extract โดยเทยี บกบั สารมาตรฐาน L-ascorbic acid Total สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเหด็ ผง้ึ ข้าวจ้าว มคี วามสามารถในการต้านอนุมูลอิสระรวมสูงสุดantioxidant คือ 95.1 ± 0.53 mg GAE/g extract รองลงมา คือ สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผ้ึง ขาว 90.88 ± 0.17 mg GAE/g extract โดยเทียบกบั สารละลายมาตรฐาน Gallic acid activity40

สรปุ ผลการทดลอง วิธีการทดสอบ ผลการทดสอบTotal Phenolic สารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผ้ึงข้าวจ้าวมีปริมาณฟีนอลรวมสูงสุด มีค่าเท่ากับ compound 69.26 ± 4.59 mg TAE/g extract รองลงมา คือสารสกัดหยาบพอลีแซคคาไรด์ของเห็ด หนวดแมว 57.49 ± 1.08 mg TAE/g extractTotal flavonoid สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดถ่านมีปริมาณฟลาโวนอยด์รวมสูงสุดซึ่งมีค่าเท่ากับ compound 15.36 ± 0.14 mg CE/g extract รองลงมา คือ สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผึ้งขาว 11.74 ± 0.02 mg CE/g extract41

สรุปผลการทดลองวิธีการทดสอบ ผลการทดสอบ Total sugar สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดปลวกขา้ วดอ มปี รมิ าณนา้ ตาลรวมสูงสดุ มีค่าเท่ากบั content 236.20 ± 4.52 mg Glucose/g extract และรองลงมา คือ สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของ เห็ดตนี แรด 214.38 ± 4.05 โดยเทียบกบั สารละลายมาตรฐาน GlucoseTotal protein content สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ดหนวดแมว มปี ริมาณโปรตนี รวมสูงสดุ มีค่าเทา่ กบั 205.61 ± 9.03 mg BSA/g extract และรองลงมา คือ สารสกดั พอลีแซคคาไรด์ของเห็ดผ้งึ ขาว Total beta 192.20 ± 9.61 โดยเทียบกบั สารละลายมาตรฐาน Bovine serum albumin glucan สารสกดั พอลีแซคคาไรค์ของเหด็ ผ้งึ ตอง มปี รมิ าณเบต้ากลูแคนรวมสูงสดุ มีค่าเท่ากบั 21.00สเปกตรมั FT-IR g/100 g ของนา้ หนกั ตวั อยา่ งแหง้ และรองลงมา คือ สารสกัดพอลีแซคคาไรด์ของเห็ด หนวดแมว 12.62 g/100 g ของนา้ หนกั ตวั อยา่ งแหง้ เปน็ สารประกอบเชิงซอ้ นทีป่ ระกอบด้วยสัญญาณวงอะโรมาตกิ และเอสเทอร์ รวมท้งั โปรตีน และสารประกอบพอลีฟนี อล พนั ธะระหวา่ งนา้ ตาลของพอลีแซคคาไรด์ทีป่ ระกอบไปด้วยทงั้ β-glycosidic linkage และ α-glycosidic linkage42

ขอ้ เสนอแนะ อาจจะต้องแยกสารบริสุทธ์ิพอลีแซคคาไรด์ให้บริสุทธิ์แล้วทาการศึกษา เปรียบเทียบฤทธติ์ ้านอนุมูลอิสระและการศึกษานาตาลท่ีเป็นองค์ประกอบของ พอลแี ซคคาไรด์ต่อไป43 44