ตัวอย่าง การทำพีซีอาร์

ค่มู ือการตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือปรสิต Perkinsus Genus, P. marinus และ P.olseni ด้วยเทคนิค PCR หลักการ: Perkinsus เป็นเชือปรสิตในหอยกลุ่มหอยนำงรมและหอยสองฝำ โดย Perkinsus marinus และ P. olseni เป็นชนิดที่อยใู่ นบัญชีรำยชื่อของ OIE ในกำรตรวจวินิจฉัยดว้ ยเทคนิคพซี อี ำร์ ต้องสกัดดีเอ็นเอจำกอวัยวะ เป้ำหมำย ได้แกเ่ หงอื กและแมนเทิล และดำเนินกำรตรวจในระดบั Genus โดยใชว้ ิธีกำรของ AUDEMARD et al. (2004) ให้ PCR product ที่ 703 bp และสำมำรถตรวจแยกชนิดได้โดยใช้ primer ท่ีแนะนำตำมคู่มือกำร ตรวจของ OIE (2017) ซ่ึง P. marinus ใช้วิธีกำรของ AUDEMARD et al. (2004) และ P. olseni ใช้ วธิ ีกำรของ Moss et al. (2006) การสกัดสารพันธุกรรม:  อวัยวะท่ใี ชต้ รวจ: เหงอื ก (Gill), แมนเทิล (Mantle), ลำไส้ (Intestine) o สกัด DNA จำก Gill/Mantle/Intestine หอยด้วย DNAZol® Reagent หรอื สำรสกัด ดเี อ็นเออนื่ ๆ การท้า PCR: Primers: Primer name Sequence (53) Products 703 bp PerkITS-85F 5-CCGCTTTGTTTGGATCCC-3 Perkinsus sp. 509 bp PerkITS-750R 5’-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3’ 450 bp 471bp PmarITS-70F 5-CTTTTGYTWGAGWGTTGCGAGATG-3 Perkinsus marinus 678 bp PmarITS600R 5-CGAGTTTGCGAGTACCTCKAGAG-3 PolsITS-140F 5-GACCGCCTTAACGGGCCGTGTT-3 Perkinsus olseni PolsITS-600R 5-GGRCTTGCGAGCATCCAAAG-3 28SO-F 5-AAACCACTTAGAGGGAAAC-3 Internal control 1 28SO-R 5-CATGTTAGACTCCTTGGTC-3 EF1aO-F 5-TTCCACTGGCCATCTCATTTACAA-3 Internal control 2 EF1aO-R 5-GAAACGGCTCTCACTGTATGGTG-3 *เลือกใช้ Internal control ใหเ้ หมาะกับ PCR procuct ของแตล่ ะเช้อื ท่ตี รวจ 48

คมู่ ือการตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: Perkinsus Genus (703 bp) PCR components: Volume (µl)/reaction Final concentration DNA free water 8.50 2x PCR Master mix 12.50 5 µM Primer PerkITS-85F 0.50 0.10 µM 5 µM Primer PerkITS-750R 0.50 0.10 µM 2.5 µM Primer 28SO-F 0.50 0.05 µM 2.5 µM Primer 28sO-R 0.50 0.05 µM DNA Template 2.00 10-50 ng total Total 25.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 20 mM Tris/HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 200 µM dNTP, 0.1 µM primers, 0.025 U Taq polymerase PCR master mix: Perkinsus marinus (509 bp) PCR components: Volume (µl)/reaction Final concentration DNA free water 8.50 2x PCR Master mix 12.50 5 µM Primer PmarITS-70F 0.50 0.10 µM 5 µM Primer PmarITS600R 0.50 0.10 µM 2.5 µM Primer EF1aO-F 0.50 0.05 µM 2.5 µM Primer EF1aO-R 0.50 0.05 µM DNA Template (10-50 ng total) 2.00 Total 25.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 20 mM Tris/HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.1 µM primers and 0.025 unit Taq polymerase, PCR master mix: Perkinsus olseni (450 bp) PCR components: Volume (µl)/reaction Final concentration DNA free water 8.50 2x PCR Master mix 12.50 5 µM Primer PolsITS-140F 0.50 0.10 µM 5 µM Primer PolsITS-600R 0.50 0.10 µM 2.5 µM Primer EF1aO-F 0.50 0.05 µM 2.5 µM Primer EF1aO-R 0.50 0.05 µM DNA Template 2.00 10-50 ng total Total 25.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 20 mM Tris/HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.1 µM primers and 0.025 unit Taq polymerase, 49

คูม่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสุขภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 เตรยี ม Primer: - เตรยี ม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µl + 95 µl DEPC-treated water ดึงไปใช้ 0.5 µl/25 reaction (0.1 µM final conc.) - เตรยี ม 2.5 µM Primer: จำกStock primer 100 µM 10µL + 90 µL DEPC-treated water = 10µM  25µL + 75µL DEPC-treated water = 2.5 µM ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction (50 nMfinal conc.) PCR profile: Perkinsus genus 703 Cycle No. Temperature Time (71 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. Denature 94oC 30 s Annealing 39 55oC 30 s Extension 72oC 45 s Final Extension 1 72oC 3 min. Holding 15oC  Ref. 1 cycle of 94°C 4 min., 40 cycles of 94°C 1 min., 55°C 1 min., 72°C 1 min., 1 cycle 72°C for 10 min. PCR profile: P. marinus 509 Cycle No. Temperature Time (75 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. Denature 94oC 30 s Annealing 39 57oC 30 s Extension 1 72oC 45 s Final Extension 72oC 3 min. Holding 15oC  Ref. 1 cycle of 94°C 4 min., 40 cycles of 94°C 1 min., 57°C 1 min., 65°C 3 min., 1 cycle 65°C for 10 min. PCR profile: P. olseni 450 Cycle No. Temperature Time (75 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. Denature 94oC 30 s Annealing 39 62oC 30 s Extension 1 72oC 45 s Final Extension 72oC 3 min. Holding 15oC  Ref. 1 cycle of 95°C 4 min., 40 cycles of 94°C 1 min., 62°C 1 min., 65°C 3 min.., 1 cycle 65°C for 10 min. 50

คู่มือการตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel : 703 bp / Internal control : 471 bp Perkinsus sp. +ve : 509 bp / Internal control : 678 bp Perkinsus marinus +ve : 450 bp / Internal control : 678 bp Perkinsus olseni +ve Perkinsus (Genus) และ P. marinus AUDEMARD C., REECE K.S. & BURRESON E.M. (2004). Real-time PCR for the detection and quantification of the protistan parasite Perkinsus marinus in environmental waters. Appl. Environ. Microbiol., 70, 6611‒6618. Perkinsus olseni: MOSS J.A., BURRESON E.M. & REECE K.S. (2006). Advanced Perkinus marinus infections in Crassostrea ariakensis maintained under laboratory conditions. J. Shellfish Res., 25, 65‒72. 51

คู่มอื การตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั วน์ ้าสงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื ท่ีมีสารพันธุกรรมเปน็ RNA ชนดิ เชือ: 1. เชอื ไวรัสก่อโรคหัวเหลอื ง YHV (Yellow Head Virus type I) 2. เชอื ไวรัสกอ่ โรค TSV (Taura Syndrome Viris) 3. เชือไวรัสก่อโรคกล้ำมเนือตำย IMNV (Infectious Myonecrosis Virus) 4. เชอื ไวรสั ก่อโรค CMNV (Covert mortality nodavirus) 5. เชือไวรัสกอ่ โรคหำงขำว MrNV (Macrobrachium rosenbergii Nodavirus) 6. เชือกอ่ โรค XSV (Extra Small Virus) 7. เชอื ไวรสั ก่อโรคควงสว่ำน/โนดะไวรสั หรอื VNN (Viral Nervious Necrosis) 8. เชือกอ่ โรค TiLV (Tilapia Lake Virus) อุปกรณ์และเครื่องมือ: 1. หลอดไมโครเซนตรฟิ ิวส์หรอื หลอด PCR (Micro centrifuge tube 1.5 ml, 0.5 ml, 0.2 ml) 2. เคร่ืองดูดจ่ำยสำรอตั โนมัติ (Micropipette) 3. Pipette Tip (1000 µl, 200 µl) 4. Probe บดตวั อยำ่ ง 5. เครอื่ งหมุนเหวี่ยง (Centrifuge) แบบควบคมุ อณุ หภูมิ 6. ตปู้ ลอดเชอื (Laminar flow/PCR cabinet) 7. เครอ่ื งเพ่มิ ปริมำณสำรพันธกุ รรม (PCR machine or Thermocycler) 8. ชุดรันเจล (Gel Electrophoresis set) 9. Microwave เคร่ืองอ่ำนผลเจล (UV transilluminator) 10. ตเู้ ยน็ /ต้แู ช่แข็ง 11. เครอื่ งวัดปริมำณสำรพันธุกรรม สารเคมี: สารสกดั RNA 1. Trizol Reagent หรอื สำรอื่นๆ 1.1 Chloroform/BCP 1.2 Ethathanol 1.3 Isopropanol 1.4 DEPC-treated water 2. Spin column วธิ กี ำรสกัดขึนอยูก่ บั ผู้ผลติ แต่ละรำย 3. Autoextraction วิธีกำรสกดั ขนึ อยกู่ ับผผู้ ลติ แตล่ ะรำย 52

คูม่ ือการตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 สารท้าปฏกิ ริ ยิ า PCR และตรวจสอบผล 1. One step RT-PCR mastermix  SuperScript® III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase (Catalog no. 12574-026) หรือสำรจำกผู้ผลิตอน่ื ๆ 2. PCR Mastermix  KAPA2G Fast HotStartReadyMix with dye (2X) (Catalog no. KK5801) (Buffer, dNTPs, Taq DNA polymerase, MgCl2) หรอื  AccuStart™ II GelTrack™ PCR SuperMix (95136)  หรือสำรจำกผผู้ ลิตอน่ื ๆ 3. Primers  Operon (เยอรมนั ), Sigma (USA), Eurogentec (เบลเย่ียม), Biolegio (เนเธอแลนด)์ , BioBasic (แคนำดำ)  อ่นื ๆ 4. DEPC-treated water 5. RNAse free/ RNase remover 6. TBE buffer 7. Agarose 8. Loading dye 9. SYBR® Safe DNA gel stain 53

คูม่ ือการตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสัตว์น้าสงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การสกัด RNA จากตวั อย่างดว้ ย Trizol reagent ตัดตัวอย่ำงเปน็ ชนิ เลก็ ๆ  ชั่งตัวอย่ำง 55+5 mg ใสห่ ลอด Micro tube ขนำด 1.5 ml แช่ในนำแขง็ เพื่อรอบด  เติม Trizol® Reagent 500 µl และบดใหล้ ะเอยี ดดว้ ยแทง่ แก้วบดตวั อยำ่ ง  บ่มตวั อย่ำงใน Trizol® Reagent ทอี่ ุณหภูมิ 15 - 30oC นำน 5 นำที Centrifuge ท่ี 12,000 xg, 4oC, 10 นาที ดดู ส่วนใส (Supernatant) ใสห่ ลอด Micro tube ใหม่  แยกชนั RNA โดยเตมิ BCP (C3 H6BrCl) 100 µl เขยำ่ แรงๆ ประมำณ 15 วนิ ำที วำงทิงไว้ทีอ่ ุณหภมู ิ 15 - 30oC 2 นำที Centrifuge ที่ 12,000 xg, 4oC, 15 นาที แยกสว่ นใสชันบนสดุ ใส่ Micro tube ขนำด 1.5 ml หลอดใหม่ สำหรับสกัด RNA  ตกตะกอน RNA โดยเติม Isopropanol 250 µl พลิกหลอดตัวอย่ำงกลับไปมำเบำๆ ให้ผสมกนั วำงทีอ่ ุณหภมู ิ 15-30oC 10 นำที Centrifuge ที่ 12,000 xg, 4oC, 10 นาที ทงิ สว่ นใส ใชส้ ่วน Pellet ลำ้ ง RNA โดยเตมิ 75% Ethanol 500 µl นำหลอดไปเขยำ่ ดว้ ย Vortex Centrifuge ที่ 7,500 xg, 4oC, 5 นาที ทงิ สว่ นใส ใชส้ ว่ น Pellet วำงหลอดควำ่ ทงิ ไวป้ ระมำณ 5-10 นำที (อย่ำให้ pellet แหง้ มำก เพรำะจะทำให้ละลำยยำก และควำมบริสุทธ์ขิ อง RNA จะลดลง < 1.7)  ละลำย RNA ด้วย DEPC- treated water (ขึนอยู่กับปริมำณตะกอน RNA) ปริมำตร 50-200 µl นำไปบม่ ในเคร่ือง ท่ี 60ºC PCR นำน 10 นำที  เกบ็ RNA ในตู้เยน็ ท่ีชว่ งอุณหภูมิ 2 - 8 ºC ในกรณีท่ที ดสอบวันเดียวกับวนั ท่ีสกดั หำกยงั ไมท่ ดสอบหรอื หลังกำรทดสอบแลว้ ให้เก็บในตแู้ ช่แขง็ (FZ-4) ท่อี ณุ หภูมไิ มส่ งู กวำ่ -18 ºC 54

คมู่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื หวั เหลือง (YHV) ด้วย nested RT-PCR หลกั การ: เชือ Yellow Head Virus (YHV) เป็นสำเหตุของโรคหัวเหลือง (Yellow Head Disease; YHD) ซึ่งมี สำรพันธุกรรมเป็นอำร์เอ็นเอ (ssRNA) ปัจจุบันปบ่งเป็น 8 genotype ท่ีอยู่ใน OIE เป็น Genotype 1 ซ่ึงพบ ในประเทศไทย เชือท่ีเป็น RNA ไม่สำมำรถเพ่ิมปริมำณสำยพันธุกรรมด้วยวิธี PCR โดยตรงได้ เน่ืองจำกเป็น สำยเด่ียว จึงต้องเพ่ิมขันตอนกำรเปลี่ยน RNA ให้เป็น Complimentary DNA (cDNA) โดยใช้เทคนิค Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) เม่ือเป็นสำยคู่จึงเข้ำกระบวนกำร PCR วิธีกำร ตรวจวนิ ิจฉัยทอ่ี งค์กำรโรคระบำดสัตว์ระหวำ่ งประเทศแนะนำใหใ้ ช้ เป็นวิธีกำรท่ีใช้เทคนิค nested RT- PCR ซึ่ง ใหผ้ ลกำรทดสอบที่ถูกต้องรวดเร็วและมีควำมจำเพำะสูง โดยใช้ชุด primer ตำมท่ีกำหนดโดยองค์กำรโรคระบำด สตั วร์ ะหวำ่ งประเทศ (OIE, 2017) ซึ่งสำมำรถตรวจเชอื GAV (Gill Associated virus) ไดด้ ้วย การสกดั สารพันธุกรรม:  อวยั วะทใ่ี ชต้ รวจ: เหงือก (Gill), ขำวำ่ ยนำ (Pleopod), Hemolymp, lymphoid organ o ลกู กุ้ง: สกดั RNA จำกลกู กุง้ ทงั ตัว ด้วย Trizol Reagent หรือ สำรสกัดอำรเ์ อน็ เออน่ื ๆ o กงุ้ ใหญ่: สกดั RNA จำก Gill, Pleopod ดว้ ย Trizol Reagent หรอื สำรสกดั อำรเ์ อน็ เออนื่ ๆ การทา้ PCR: Sequences (53) PCR step Product band 5-GACATCACTCCAGACAACATCTG-3 First step Primers: 5-GTGAAGTCCATGTGTGTGAGACG-3 794 bp Primer name 5-CATCTGTCCAGAAGGCGTCTATGA-3 YHV & GAV GY1 5-ACGCTCTGTGACAAGCATGAAGTT-3 GY4 5-GTAGTAGAGACGAGTGACACCTAT-3 Nested 277bp YHV, GY2 5-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3 406 bp GAV Y3 5-TTGACCTCCTTGATCACACC-3 G6 Internal 500 bp control EF1aS-F EF1aS-R 55

คู่มือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: First step PCR components: YHV 1ststep Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC-treated water 2.80 - 2X Reaction mix 5.00 1x 10 µM Primer GY1 0.20 0.2 µM 10 µM Primer GY4 0.20 0.2 µM 5 µM Primer EF1aS-F 0.20 0.1 µM 5 µM Primer EF1aS-R 0.20 0.1 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 0.40 2 Unit RNA Template 1.00 - Total 10.00 Ref: 50 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 35 pmol (0.35 µM) primers and 2.5 unit Taq polymerase PCR master mix: nested YHV PCR components: YHV nested Volume(µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC- treated water 1.00 - 2x PCR master mix (fast taq) 12.50 1x 10 µM Primer GY2 0.50 0.2 µM 10 µM Primer Y3 0.50 0.2 µM 10 µM Primer G6 0.50 0.2 µM 1st step PCR Product 10.00 - Total 25.00 - Ref: 50 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 35 pmol (0.35 µM) primers and 2.5 unit Taq polymerase การเตรยี ม Primer:  เตรยี ม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc.  เตรยี ม 5 µM Primer EF1aS-F/EF1aS-R: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM ดงึ ไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) 56

คมู่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สุขภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 PCR Profile: YHV794 Cycle No. Temperature Time (66 min.). RT-PCR 1 42C 30 min. 94C 2 min. Denature 94C 30 s Annealing 15 60C 30 s Extension 72C 45 s Final Extension 1 72C 7 min. Holding 15C  Ref. cDNA (1 ug RNA, 42oC 1 hr.) , 1 cycle of 95°C for 5 min., 30 cycles of 95°C 30 s, 66°C 30 s, 72°C 45 s, 1 cycle 72°C for 7 min. 1µl cDNA PCR profile: Cycle No. Temperature Time (35 min.) YHV277 Initial denaturation 1 94C 2 min. Denature 94C 30 s Annealing 30 60C 30 s Extension 72C 30 s Final Extension 1 72C 3 min. Holding 15C  Ref. 1 cycle of 95°C for 5 min., 30 cycles of 95°C for 30 s, annealing at 66°C 30 s, 72°C 45 s, 1 cycle 72°C for 7 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel : 794 bp, 277 bp YHV +ve : 406 bp GVA +ve : 500 bp Internal control COWLEY J.A., CADOGAN L.C., WONGTEERASUPAYA C., HODGSON R.A.J., SPANN K.M., BOONSAENG V. & WALKER P.J. (2004). Differential detection of gill-associated virus (GAV) from Australia and yellow head virus (YHV) from Thailand by multiplex RT-nested PCR. J. Virol. Methods, 117, 49–59. 57

ค่มู ือการตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื ทอร่าซินโดรม (TSV) ด้วย RT-PCR หลักการ: เชือ Taura Syndrome Virus (TSV) เป็นสำเหตขุ องโรคทอร่ำหรือโรคทีเอส (TS) มีสำรพันธุกรรมเป็น อำร์เอน็ เอ (ssRNA) เชอื ทเี่ ปน็ RNA ไมส่ ำมำรถเพ่ิมปริมำณสำยพันธุกรรมด้วยวิธี PCR โดยตรงได้ เพรำะเป็น สำยเดี่ยว จึงต้องเพิ่มขันตอนกำรเปล่ียน RNA ให้เป็น complimentary DNA (cDNA) โดยใช้เทคนิค Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) เม่ือเป็นดีเอ็นเอสำยคู่แล้วจึงนำตัวอย่ำงเข้ำ กระบวนกำร PCR วิธีกำรตรวจวินิจฉัยเชือทอร่ำซินโดรมที่ใช้เป็นวิธี RT-PCR ของ Solangel et al. (2009) ซง่ึ ได้พัฒนำ Primer ท่ีมคี วำมไวในกำรตรวจเชอื ที่สงู กวำ่ วิธกี ำรของ Nunanet al. (1998) ที่แนะนำโดยองค์กำร โรคระบำดสตั วร์ ะหวำ่ งประเทศ (OIE, 2017) การสกดั สารพนั ธุกรรม:  อวัยวะท่ใี ชต้ รวจ: เหงอื ก (Gill), ขำวำ่ ยนำ (Pleopod) o ลูกกุง้ : สกัด RNA จำกลกู กุง้ ทังตัว ดว้ ย Trizol Reagent หรอื สำรสกดั อำรเ์ อน็ เอชนิดอน่ื ๆ o ก้งุ ใหญ่: สกดั RNA จำก Gill, Pleopod ดว้ ย Trizol Reagent หรือ สำรสกัดอำรเ์ อน็ เอชนิดอื่นๆ การท้า PCR: Sequences (53) Product band 5-CGACAGTTGGACATCTAGTG-3 341 bp Primers: 5-GAGCTTCAGACTGCAAGTTC-3 Primer name 5-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3 500 bp TSV7171F 5-TTGACCTCCTTGATCACACC-3 TSV7511R EF1aS-F EF1aS-R PCR master mix: PCR components: TSV Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC-treated water 8.50 - 2X Reaction mix 12.50 1x 10 µM Primer TSV7171F 0.50 0.2 µM 10 µM Primer TSV7511R 0.50 0.2 µM 5 µM Primer EF1aS-F 0.50 0.1 µM 5 µM Primer EF1aS-R 0.50 0.1 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 1.00 2 Unit RNA Template 1.00 - Total 25.00 - Ref: 50 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 35 pmol (0.35 µM) primers and 2.5 unit Taq polymerase 58

คมู่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั วน์ ้าสงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การเตรียม Primer:  เตรยี ม 10µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดงึ ไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc.  เตรียม 5 µM Primer EF1aS-F/EF1aS-R: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treatedwater = 5 µM ดงึ ไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR profile: TSV TSV341 Cycle No. Temperature Time (78 min.) RT-PCR 1 42C 30 min. 94C 2 min. Denaturation 94C 30 s Annealing 39 55C 30 s Extension 72C 30 s Final Extension 1 72C 7 min. Holding 15C  Ref. 1 cycle of RT 60oC 30 min., 95°C 2 min., 39 cycles of 95°C for 45 s, 60°C 45 s, 1 cycle of 60°C 7 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel TSV +ve : 341 bp Internal control : 500 bp Solangel A. Navarro , Kathy F.J. Tang, Donald V. Lightner. 2009. An improved Taura syndrome virus (TSV) RT- PCR using newly designed primers. Aquaculture 293: 290–292. 59

คูม่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสตั ว์น้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื ไอเอม็ เอ็นวี (IMNV) ดว้ ย nested PCR (ชุด kit IMNV IQ 2000) หลกั การ IMNV เป็นเชือไวรัสทที่ ำใหเ้ กดิ โรคกลำ้ มเนือตำยหรือกล้ำมเนือขำวขุ่น จัดเป็นไวรัสชนิดอำร์เอ็นเอ กำร ตรวจวนิ จิ ฉัยต้องสกัดสำรพันธุกรรมคือ RNA ออกจำกตัวอย่ำง หลังจำกนันนำไปผ่ำนขันตอนกำรเปล่ียน RNA เป็น cDNA ก่อนจะนำไปเพ่ิมปริมำณโดยปฏิกิริยำ PCR ชุดทดสอบสำเร็จรูป IMNV IQ2000 ใช้หลักกำรของ Nested RT-PCR ในกำรตรวจวนิ จิ ฉัย ใหผ้ ลกำรตรวจทถ่ี ูกตอ้ ง แมน่ ยำ และรวดเร็ว สารเคมี: 1. ชดุ ทดสอบ IMNV IQ2000 (RT-Premix, IQzyme DNA polymerase, RT enzyme mix, Nested PCR premix, Loading dye, DNA marker, Positive) 2. DEPC-TREATED water 3. RNAse free/ RNase remover 4. TBE buffer 5. Agarose 6. SYBR® Safe DNA gel stain การสกัดสารพนั ธุกรรม  อวยั วะท่ใี ช้ตรวจ: เหงอื ก (Gill), ขำวำ่ ยนำ (Pleopod), กลำ้ มเนือ (Muscle) o ลูกกุง้ : สกดั RNA จำกลกู กงุ้ ทงั ตัว ด้วย Trizol Reagent หรือ สำรสกดั อำร์เอน็ เอชนิดอนื่ ๆ o กงุ้ ใหญ:่ สกัด RNA จำกเหงือก ขำวำ่ ยนำ หรือ กล้ำมเนอื ด้วย Trizol Reagentหรอื สำร สกดั อำรเ์ อน็ เอชนดิ อ่นื ๆ การท้า PCR: Volume (µl)/reaction 7.00 PCR master mix: 0.50 PCR components: RT-PCR 0.50 2.00 RT-PCR Premix 10.00 IQZyme DNA Polymerase (2 U/µl) RT Enzyme Mix RNA Template Total 60

ค่มู ือการตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: Volume (µl)/reaction PCR components: Nested 14.00 1.00 Nested PCR Premix 10.00 IQZyme DNA Polymerase (2 U/µl) 25.00 RT-PCR product Total PCR profile: Cycle No. Temperature Time (51 min.) IMIQ-RT 1 42C 30 min. Hot start 94C 2 min. 15 94C 20 s Denaturation 62C 20 s Annealing 1 72C 30 s Extension 1 72C 30 s Final Extension 20C 30 s 15C  Holding PCR profile: Cycle No. Temperature Time (36 min.) IMIQ-N 94C 20 s Denaturation 30 62C 20 s Annealing 72C 30 s Extension 1 72C 30 s FnalExtension 1 20C 30 s 15C  Holding 61

ค่มู อื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel ตัวอย่ำงท่ีติดเชือไอเอม็ เอน็ วจี ะปรำกฏแถบแบนที่ 255, 510 bp โดย - 255 bp หมำยถงึ ตดิ เชือปริมำณนอ้ ย - 510 bp หมำยถึงตดิ เชือปริมำณมำก - ตวั อย่ำงท่ีเปน็ negative จะตอ้ งปรำกฏแบนที่ 680 bp Lane 1: IMNV ve(+) standard, 2000 copies/reaction Lane 2: IMNV ve(+) standard, 200 copies/reaction Lane 3: IMNV ve(+) standard, 20 copies/reaction Lane 4: Negative control (yeast tRNA or ddH2O) Lane 5: Sample of severe IMNV infection Lane 6: Sample of light IMNV infection Lane 7: IMNV negative sample Lane M: Molecular weight marker, 848 bp, 630 bp, 333 bp 62

คู่มอื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สุขภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือไอเอม็ เอ็นวี (IMNV) ด้วย nested PCR (OIE) หลกั การ IMNV เป็นเชอื ไวรัสทที่ ำให้เกิดโรคกลำ้ มเนอื ตำยหรือกล้ำมเนือขำวขุ่น จัดเป็นไวรัสชนิดอำร์เอ็นเอ กำร ตรวจวินิจฉัยต้องสกัดสำรพันธุกรรมคือ RNA ออกจำกตัวอย่ำง หลังจำกนันนำไปผ่ำนขันตอนกำรเปลี่ยน RNA เป็น cDNA ก่อนจะนำไปเพ่ิมปริมำณโดยปฏิกิริยำ PCR วิธีกำรตรวจท่ีองค์กำรโรคระบำดสัตว์แนะนำ (OIE, 2017) ให้ใช้สำหรับตรวจเชือ IMNV คือ Nested RT-PCR ตำมวิธีกำรของ POULOS B.T. & LIGHTNER D.V. (2006) ดังรำยละเอยี ดดงั นี สารเคมี: 1. PCR mastermix 2. DEPC-TREATED water 3. RNAse free/ RNase remover 4. TBE buffer 5. Agarose 6. SYBR® Safe DNA gel stain การสกัดสารพันธุกรรม  อวยั วะท่ใี ช้ตรวจ: เหงอื ก (Gill), ขำว่ำยนำ (Pleopod), กลำ้ มเนอื (Muscle) o ลูกกงุ้ : สกดั RNA จำกลูกก้งุ ทังตวั ด้วย Trizol Reagent หรือ สำรสกดั อำร์เอ็นเอชนิดอนื่ ๆ o กงุ้ ใหญ:่ สกดั RNA จำกเหงือก ขำว่ำยนำ หรอื กลำ้ มเนือ ด้วย Trizol Reagentหรือ สำร สกดั อำรเ์ อน็ เอชนิดอนื่ ๆ การท้า PCR: Sequence (53) Products 5-CGACGCTGCTAACCATACAA-3 328 bp Primers: 5-ACTCGGCTGTTCGATCAAGT-3 139 bp Primer name 5-GGCACATGCTCAGAGACA-3 500 bp 5-AGCGCTGAGTCCAGTCTTG-3 4587F 5-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3 5-TTGACCTCCTTGATCACACC-3 4914R 4725 NF 4863 NR EF1aS-F EF1aS-R 63

ค่มู อื การตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: First step Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration PCR components: IMNV 1ststep DEPC-treated water 2.80 - 2X Reaction mix 5.00 1x 10 µM Primer 4587F 0.20 0.2 µM 10 µM Primer 4914R 0.20 0.2 µM 5 µM Primer EF1aS-F 0.20 0.1 µM 5 µM Primer EF1aS-R 0.20 0.1 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 0.40 2 Unit RNA Template 1.00 - Total 10.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 300 mM dNTP, 2.5 mM manganese acetate, 0.465 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase, PCR master mix: nested IMNV PCR components: IMNV nested Volume(µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC- treated water 0.50 - 2x PCR master mix 12.50 1x 10 µM Primer 4725 NF 1.00 0.4 µM 10 µM Primer 4863 NR 1.00 0.4 µM 1st step PCR Product 10.00 - Total 25.00 - Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.465 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase, 0.5 µl First step product การเตรยี ม Primer:  เตรียม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM  ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction = 0.2 µM final conc. และ 1.0 µl/25 µl reaction = 0.4 µM final conc.  เตรียม 5 µM Primer EF1aS-F/EF1aS-R: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) 64

คมู่ ือการตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสัตว์น้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน์ ้า กรมประมง ปี 2561 PCR Profile: Cycle No. Temperature Time (60 min.) IMNV 328 RT-PCR 1 60C 30 min. 95C 2 min. Denature 95C 15 s Annealing 15 60C 30 s Extension 68C 45 s Final Extension 1 68C 5 min. Holding 15C  Ref. 1 cycle of RT 60oC 30 min., 95°C for 2 min., 39 cycles of 95°C for 45 s, annealing at 60°C 45 s, 1 cycle of 60°C 7 min. PCR profile: IMNV 159 Cycle No. Temperature Time (45 min.) Initial denaturation 1 95C 2 min. Denature 95C 30 s Annealing 30 60C 30 s Extension 72C 15 s Final Extension 1 72C 3 min. Holding 15C  Ref. 1 cycle 95°C for 2 min., 39 cycles of 95°C for 30 s, annealing at 65°C 30 s, 72oC 30 s, 1 cycle of 72°C 2 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel IMNV +ve: : 328 bp และ 139 bp หรือ 139 bp Internal control : 500 bp POULOS B.T. & LIGHTNER D.V. (2006). Detection of infectious myonecrosis virus (IMNV) of penaeid shrimp by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Dis. Aquat. Org., 73, 69–72. 65

ค่มู ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสขุ ภาพสตั ว์น้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ Covert mortality nodavirus (CMNV) ดว้ ย nested RT-PCR หลักการ: เชือ CMNV เป็นสำเหตุของโรค Covert Mortality Syndrome หรือโรคตำยจมจัดเป็นไวรัสชนิดอำร์ เอน็ เอ ขนำดอนุภำคประมำณ 32-33 nm มีขนำดใหญก่ ว่ำ MrNVและ PvNV เป็นเชือท่ีทำให้เกิดโรคกล้ำมเนือ ตำยพบทังใน L. vannamei, F. chinensisand M. japonicas เป็นเชือที่ค้นพบโดยนักวิจัยจำกประเทศจีน จำก ตัวอย่ำงกุ้งที่มีอำกำรตำยด่วน โดยกุ้งจะมีอำกำรกล้ำมเนือตำย (whitish abdominal muscle) ตับฝ่อ (atrophied hepatopancreas) โตช้ำ (slow growth) ตัวนิ่ม (soft shell) ทำให้กุ้งตำย 80-90% โดยมีลักษณะ ตำยจมก้นบ่อ หรือ “bottom death” อุณหภูมิสูงและปริมำณไนไตรท์สูง ทำให้กุ้งตำยเร็วขึน พบมำกในกุ้งอำยุ 60-80 วัน เป็นเชือในกลุ่ม Alpha nodavirus มีสำรพันธุกรรมเป็น RNA ซ่ึงไม่สำมำรถเพิ่มปริมำณสำย พันธุกรรมด้วยวิธี PCR โดยตรงได้ เน่ืองจำกเป็นสำยเดียว จึงต้องเพิ่มขันตอนกำรเปล่ียน RNA ให้เป็น Complimentary DNA (cDNA) โดยใช้เทคนิค Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT- PCR) เพ่ือให้เป็นสำยคู่ จำกนันจึงเข้ำกระบวนกำร PCR ที่เรียกว่ำ nested RT- PCR โดยใช้ primer 2 คู่ คู่ นอกขนำดยำวสำหรับ first step PCR (619 bp) และ คู่ในเป็น primer คู่ที่สันกว่ำ สำหรับ nested PCR (165 bp) (Zhang et al., 2014) การสกัดสารพันธุกรรม:  อวัยวะท่ีใช้ตรวจ: Haemolymp, Cephalothorax (Gill/Hepatopancrease/Lymphoid organ) o ลูกกุ้ง : สกัด RNA จำกลกู กงุ้ ทงั ตัว ดว้ ย Trizol Reagent หรือ สำรสกัดอำรเ์ อ็นเออื่นๆ o กงุ้ ใหญ:่ สกัด RNA จำกเหงือกหรือตบั ดว้ ย Trizol Reagentหรอื สำรสกัดอำรเ์ อน็ เออน่ื ๆ การท้า PCR: Sequences (53) First step Product 5-AAATACGGCGATGACG-3 619 bp Primers: 5-ACGAAGTGCCCACAGAC-3 Nested 165 bp Primer name 5-CACAACCGAGTCAAACC-3 Internal 500 bp CMNV6197F1 5-GCGTAAACAGCGAAGG-3 control CMNV6197R1 5-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3 CMNV1657F2 5-TTGACCTCCTTGATCACACC-3 CMNV1657R2 EF1aS-F EF1aS-R 66

คู่มอื การตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: First step Volume (µl)/reaction Final concentration PCR components: 1st step DEPC-treated water 2.80 - 2X Reaction mix 5.00 1X 20 µM Primer CMNV619F1 0.20 0.4 µM 20 µM Primer CMNV619R1 0.20 0.4 µM 5 µM Primer EF1aS-F 0.20 0.1 µM 5 µM Primer EF1aS-R 0.20 0.1 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 0.40 RNA Template 1.00 Total 10.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 150 mM dNTP, 4 mM MgCl2, 0.4 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase, 0.5 µl First step product PCR master mix: nested Volume (µl)/reaction Final concentration PCR components: nested DEPC-treated water 1.50 - 2x PCR Master mix 12.50 1X 20 µM Primer CMNV165F2 0.50 0.4 µM 20 µM Primer CMNV165R2 0.50 0.4 µM 1st step PCR product 10.00 Total 25.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.465 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase, 0.5 µl First step product การเตรยี ม Primer:  เตรียม 20 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 50 µL + 200 µL DEPC-treated water = 20 µM ดงึ ไปใช้ 0.2 µl/10 µl และ 0.5µl/25 µl reaction = 0.4 µM final conc.  เตรียม 5 µM Primer EF1aS-F/EF1aS-R: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM  50 µL + 50 µL DEPC-treated water = 5 µM ดึงไป ใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) 67

คู่มอื การตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 PCR Profile: First step CMNV 619 Cycle No. Temperature Time (66 min.) RT-PCR 1 50C 30 min. 94C 4 min. Denature 94C 30 s Annealing 15 45C 30 s Extension 72C 40 s Final Extension 1 72C 7 min. Holding 15C  Ref. 1 cycle of RT 50oC 60 min., 94°C 4 min., 35 cycles of 94°C 30 s, 45°C 30 s, 72°C 40 s, 1 cycle of 72°C 7 min. PCR Profile: nested Cycle No. Temperature Time (47 min.) 4 min. CMNV 165 20 s 20 s Initial denaturation 1 94C 40 s 3 min. Denature 94C  Annealing 30 50C Extension 72C Final Extension 1 72C Holding 15C Ref. 1 cycle 94°C 4 min., 30 cycles of 94°C 20 s, 50°C 20 s, 72°C 40 s, 1 cycle of 72°C 7 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel : 619 bp first step / 165 bp nested CMNV +ve : 500 bp internal control  619 bp  165 bp Zhang, Q., Liu, Q., Liu, S., Yang, H., Liu, S., Zhu, L., Huang, J., 2014. A new nodavirus is associated with covert mortality disease of shrimp. J. Gen. Virol. 95: 2700–2709. 68

คูม่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั ว์น้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ MrNV ดว้ ย nested RT-PCR หลักการ: MrNV (Macrobrachium rosenbergii nodavirus) เป็นเชือก่อโรคหำงขำว (white tail) หรือ กลำ้ มเนือขำว (white muscle) ในกุ้งก้ำมกรำม เป็นเชือไวรัสท่ีมีสำรพันธุกรรมเป็น RNA สำมำรถถ่ำยทอดเชือ ผ่ำนทำงพ่อแมพ่ นั ธม์ุ ำยงั ลูกก้งุ กำรตรวจต้องสกัด RNA จำกตัวอย่ำงแล้วนำไปตรวจวิเครำะห์ด้วยเทคนิค PCR ตำมวิธกี ำรของ OIE (2017) ซงึ่ เป็นวธิ ขี อง SUDHAKARAN et al., (2006) การสกดั สารพนั ธุกรรม:  อวยั วะท่ีใชต้ รวจ: ขำว่ำยนำ (Pleopod), เหงือก (gill) o ลูกกุ้ง: สกัด RNA จำกลูกกุ้งทงั ตัวด้วยสำรสกัด RNA เช่น TriZol® Reagent หรอื สำรอน่ื ๆ o กงุ้ ใหญ:่ สกัด RNA จำกเหงอื ก/ขำว่ำยนำ/กล้ำมเนอื ดว้ ยสำรสกัด RNA เชน่ TriZol® Reagent หรอื สำรอืน่ ๆ การทา PCR: Sequences (53) First step Product 5-GCGTTATAGATGGCACAAGG-3 425 bp Primers: 5-AGCTGTGAAACTTCCACTGG-3 Primer name nested 205 bp MrNVf-F 5-GATGACCCCAACGTTATCCT-3 148 bp 5-GTGTAGTCACTTGCAAGAGG-3 Internal MrNVf-R 5-GGTGCTGGACAAGCTGAAGGC-3 control 5-CGTTCCGGTGATCATGTTCTTGAT-3 MrNVn-F MrNVn-R EF1aMr-F EF1aMr-R PCR master mix: First step Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration PCR components: MrNV 1ststep DEPC-treated water 2.80 - 2X Reaction mix 5.00 1x 10 µM Primer MrNVf-F 0.20 0.2 µM 10 µM Primer MrNVf-R 0.20 0.2 µM 5 µM Primer EF1aMr-F 0.20 0.1 µM 5 µM Primer EF1aMr-R 0.20 0.1 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 0.40 2 Unit RNA Template 1.00 - Total 10.00 Ref: 50 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 4 mM MgCl2, 0.4 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase, 0.5 µl First step product 69

คู่มอื การตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: nested MrNV PCR components: MrNV Volume(µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC- treated water 1.50 - 2x PCR master mix (fast taq) 12.50 1x 10 µM MrNVn-F 0.50 0.2 µM 10 µM MrNVn-R 0.50 0.2 µM 1st step PCR Product 10.00 - Total 25.00 - Ref: 20 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 4 mM MgCl2, 1 µM primers and 1.25 unit Taq polymerase, 0.5 µl First step product 2 µl pcr product การเตรียม Primer:  เตรียม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM  ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc.  เตรียม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM  ดงึ ไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR Profile: Cycle No. Temperature Time (54 min.) MrNV 425 RT-PCR 1 52C 30 min. 94C 2 min. Denature 94C 30 s Annealing 15 55C 30 s Extension 72C 30 s Final Extension 1 72C 7 min. Holding 15C  Ref. RT-PCR 1 cycle 52°C 30 min., 95°C 2 min., 30 cycles of 94°C 40 s, 55°C 40 s, 68°C 1 min., 1 cycle of 68°C 10 min. 70

คมู่ อื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สุขภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 PCR profile: MrNV 205 Cycle No. Temperature Time (35 min.) 2 min. Initial denaturation 1 94C 30 s 30 s Denature 94C 30 s 3 min. Annealing 30 55C  Extension 72C Final Extension 1 72C Holding 15C Ref. 1 cycle 94°C 4 min., 35 cycles of 95°C 1 min., 55°C 1 min., 72°C 1 min., 1 cycle of 72°C 10 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel : 425 bp และ 205 bp หรอื 205 bp : 148 bp MrNV +ve Internal control SUDHAKARAN R., ISHAQ AHMED V.P., HARIBABU P., MUKHERJEE S.C., SRI WIDADA J., BONAMI J.R. & SAHULHAMEED A.S. (2006). Experimental vertical transmission of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extrasmall virus (XSV) from brooders to progeny in Macrobrachium rosenbergii and Artemia. J. Fish Dis., 29, 1–9. 71

ค่มู ือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสขุ ภาพสตั วน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ XSV ดว้ ย nested RT-PCR หลักการ: XSV (Extra small virus) เป็นเชือก่อโรคหำงขำว (white tail) หรือกล้ำมเนือขำว (white muscle) ในกุ้งก้ำมกรำม เป็นเชือไวรัสท่ีมีสำรพันธุกรรมเป็น RNA สำมำรถถ่ำยทอดเชือผ่ำนทำงพ่อแม่พันธ์ุมำยังลูกกุ้ง กำรตรวจต้องสกัด RNA จำกตัวอย่ำงแล้วนำไปตรวจวิเครำะห์ด้วยเทคนิค PCR ตำมวิธีกำรของ OIE (2017) ซ่ึงเปน็ วิธขี อง SUDHAKARAN et al., (2006) การสกดั สารพันธุกรรม:  อวัยวะท่ีใชต้ รวจ: ขำวำ่ ยนำ (Pleopod), เหงอื ก (gill) o ลูกกุ้ง: สกัด RNA จำกลกู กุ้งทังตัวด้วยสำรสกัด RNA เช่น TriZol® Reagent หรอื สำรอนื่ ๆ o กุ้งใหญ:่ สกัด RNA จำกเหงือก/ขำว่ำยนำ/กล้ำมเนือดว้ ยสำรสกัด RNA เชน่ TriZol® Reagent หรือ สำรอนื่ ๆ การทา PCR: Sequences (53) First Product 5-CGCGGATCCGATGAATAAGCGCATTAATAA-3 step 546 bp Primers: 5-CCGGAATTCCGTTACTGTTCGGAGTCCCAA-3 236 bp Primer name 5-ACATTGGCGGTTGGGTCATA-3 nested 148 bp 5-GTGCCTGTTGCTGAAATACC-3 XSVf-F 5-GGTGCTGGACAAGCTGAAGGC-3 Internal 5-CGTTCCGGTGATCATGTTCTTGAT-3 control XSVf-R XSVn-F XSVn-R EF1aMr-F EF1aMr-R PCR master mix: First step Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration PCR components: XSV 1ststep DEPC-treated water 2.80 - 2X Reaction mix 5.00 1x 10 µM Primer XSVf-F 0.20 0.2 µM 10 µM Primer XSVf-R 0.20 0.2 µM 5 µM Primer EF1aMr-F 0.20 0.1 µM 5 µM Primer EF1aMr-R 0.20 0.1 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 0.40 2 Unit RNA Template 1.00 - Total 10.00 Ref: 50 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 4 mM MgCl2, 0.4 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase, 0.5 µl First step product 72

คู่มอื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: nested XSV PCR components: XSV nested Volume(µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC- treated water 1.50 - 2x PCR master mix (fast taq) 12.50 1x 10 µM XSVn-F 0.50 0.2 µM 10 µM XSVn-R 0.50 0.2 µM 1st step PCR Product 10.00 - Total 25.00 - Ref: 20 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 4 mM MgCl2, 1 µM primers and 1.25 unit Taq polymerase, 0.5 µl First step product 2 µl pcr product การเตรยี ม Primer:  เตรียม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM  ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc.  เตรียม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM  ดงึ ไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR Profile: Cycle No. Temperature Time (54 min.) XSV 546 RT-PCR 1 52C 30 min. 94C 2 min. Denature 94C 30 s Annealing 15 60C 30 s Extension 72C 45 s Final Extension 1 72C 7 min. Holding 15C  Ref. RT-PCR 1 cycle 52°C 30 min., 95°C 2 min., 30 cycles of 94°C 40 s, 55°C 40 s, 68°C 1 min., 1 cycle of 68°C 10 min. 73

คูม่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 PCR profile: XSV 236 Cycle No. Temperature Time (35 min.) 2 min. Initial denaturation 1 94C 30 s 30 s Denature 94C 15 s 3 min. Annealing 30 60C  Extension 72C Final Extension 1 72C Holding 15C Ref. 1 cycle 94°C 4 min., 35 cycles of 95°C 1 min., 55°C 1 min., 72°C 1 min., 1 cycle of 72°C 10 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel XSV +ve : 546 bp และ 236 bp หรือ 236 bp Internal control : 148 bp SUDHAKARAN R., ISHAQ AHMED V.P., HARIBABU P., MUKHERJEE S.C., SRI WIDADA J., BONAMI J.R. & SAHULHAMEED A.S. (2006a). Experimental vertical transmission of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) from brooders to progeny in Macrobrachium rosenbergii and Artemia. J. Fish Dis., 29, 1–9. 74

คู่มอื การตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื MrNV และ XSV ด้วย Multiplex RT-PCR หลกั การ: MrNV (Macrobrachium rosenbergii nodavirus) และ XSV (Extra small virus) เป็นเชือก่อโรค หำงขำว (white tail) หรือกล้ำมเนือขำว (white muscle) ในกุ้งก้ำมกรำม เป็นเชือไวรัสท่ีมีสำรพันธุกรรมเป็น RNA สำมำรถถำ่ ยทอดเชือผ่ำนทำงพ่อแมพ่ นั ธุม์ ำยังลกู ก้งุ กำรตรวจต้องสกัด RNA จำกตัวอย่ำงแล้วนำไปตรวจ วิเครำะห์ด้วยเทคนิค RT-PCR ตำมวิธีกำรของ OIE (2017) โดยเป็นวิธีกำรของ YOGANANDHAN et al., (2005) การสกดั สารพันธุกรรม:  อวัยวะทีใ่ ชต้ รวจ: ขำว่ำยนำ (Pleopod), เหงือก (gill) o ลกู กงุ้ : สกัด RNA จำกลูกกุ้งทังตัวดว้ ยสำรสกดั RNA เช่น TriZol® Reagent หรอื สำรอน่ื ๆ o กุ้งใหญ่: สกัด RNA จำกเหงอื ก/ขำวำ่ ยนำ/กล้ำมเนอื ด้วยสำรสกัด RNA เช่น TriZol® Reagent หรอื สำรอ่ืนๆ การทา PCR: Sequences (53) First step Product 5-GATACAGATCCACTAGATGACC-3 681 bp Primers: 5-GACGATAGCTCTGATAATCC-3 Primer name 5-GGAGAACCATGAGATCACG-3 nested 500 bp 5-CTGCTCATTACTGTTCGGAGTC-3 148 bp MrNV-F 5-GGTGCTGGACAAGCTGAAGGC-3 Internal 5-CGTTCCGGTGATCATGTTCTTGAT-3 control MrNV-R XSV-F XSV-R EF1aMr-F EF1aMr-R PCR master mix: PCR components: Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC-treated water 7.00 - 2X Reaction mix 10.00 1x 10 µM Primer MrNV-F 0.20 0.2 µM 10 µM Primer MrNV-R 0.20 0.2 µM 10 µM Primer XSV-F 0.20 0.2 µM 10 µM Primer XSV-R 0.20 0.2 µM 5 µM Primer EF1aMr-F 0.20 0.1 µM 5 µM Primer EF1aMr-R 0.20 0.1 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 0.80 2 Unit RNA Template 1.00 - Total 20.00 Ref: 50 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 4 mM MgCl2, 0.4 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase, 0.5 µl First step product 75

คู่มือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 การเตรียม Primer:  เตรียม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM  ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc.  เตรียม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM  ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR Profile: MrNV 681 & XSV 500 Cycle No. Temperature Time (101 min.) RT-PCR 1 52C 30 min. 94C 2 min. Denature 94C 30 s Annealing 35 55C 30 s Extension 72C 45 s Final Extension 1 72C 7 min. Holding 15C  Ref. RT-PCR 1 cycle 52°C 30 min., 95°C 2 min., 30 cycles of 94°C 40 s, 55°C 40 s, 68°C 1 min., 1 cycle of 68°C 10 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel : 681 bp : 500 bp MrNV +ve : 148 bp XSV +ve Internal control YOGANANDHAN K., SRI WIDADA J., BONAMI J.R. & SAHUL HAMEED A.S. (2005). Simultaneous detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by a single tube, one-step multiplex RT-PCR assay. J. Fish Dis., 28, 1–5. 76

คมู่ ือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ PvNV ด้วย nested RT-PCR หลกั การ: โรคกล้ำมเนือขำวขุ่นที่เกิดจำกเชือโนดะไวรัสในกุ้งขำวแวนนำไม Penaeus vannamei nodavirus (PvNV) หรือ Litopenaeus vannamei nodavirus (LvNV) พบครังแรกในกุ้งขำวแวนนำไมที่เลียงใน Belize ใน ปี 2004 ลักษณะอำกำรของกุ้งคือเนือเยื่อบริเวณส่วนหำงของกุ้ง (ปล้องสุดท้ำย) มีสีขำว (white, opaque lesions in the tails) คล้ำยกับกำรติดเชือไอเอ็มเอ็นวี (IMNV) แต่ตรวจไม่พบเชือ IMNV ทังโดย PCR และ In situ hybridization มีกำรสร้ำง cDNA library จำก total RNA ของเลือดกุ้งท่ีแสดงอำกำรของโรค และใช้ 1 clone gene ท่ีให้ช่ือว่ำ PvNV-4 ยำว 928 bp นำไปตรวจสอบลำดับเบส พบว่ำคล้ำยกับเชือ MrNV (Macrobrachium rosenbergii nodavirus) ในกงุ้ ก้ำมกรำม (69%) เมื่อนำ PvNV-4 ไปทำ hybridization กับ เนือเย่ือกุ้งท่ีแสดงอำกำรพบว่ำให้ผลเป็นบวก เมื่อนำ PvNV-4 ไปออกแบบ primer และตรวจสอบเชือด้วยวิธี PCR ในกงุ้ ขำวแวนนำไมและกงุ้ กุลำดำที่ challenge ด้วยเชือดังกล่ำวพบว่ำให้ผลบวก ลักษณะกล้ามเนอื ขาวบรเิ วณส่วนหางของกงุ้ ขาวแวนนาไมทตี่ ดิ เชอื PvNV การสกัดสารพนั ธุกรรม:  อวัยวะที่ใชต้ รวจ: ขำวำ่ ยนำ, เหงือก, เลือด o ลกู กงุ้ : สกัด RNA จำกลูกกงุ้ ทังตัวดว้ ยสำรสกัด RNA เชน่ TriZol® Reagent หรือสำรอนื่ ๆ o ก้งุ ใหญ:่ สกดั RNA จำกเหงือก/ขำวำ่ ยนำ/กล้ำมเนอื ด้วยสำรสกดั RNA เชน่ TriZol® Reagent หรือสำรอืน่ ๆ 77

คมู่ ือการตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 การทา PCR: Sequences (53) First step Product 5-CTGTCTCACAGGCTGGTTCA-3 339 bp Primers: 5-CCGTTTGAATTTCAGCAACA-3 Primer name 5-CAAAACTGTGCCTTTGATCG-3 nested 246 bp PvNV339F 5-GCCTTATCCACACGAACGTC-3 PvNV339R PvNV246NF PvNV246NR EF1aS-F 5-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3 Internal 500 bp EF1aS-R 5-TTGACCTCCTTGATCACACC-3 control PCR master mix: First step PvNV Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration PCR components: PvNV1ststep 2.80 - 5.00 1x DEPC-treated water 2X Reaction mix 10 µM Primer PvNV339F 0.20 0.2 µM 0.2 µM 10 µM Primer PvNV339R 0.20 0.1 µM 0.1 µM 5 µM Primer EF1aMr-F 0.20 2 Unit 5 µM Primer EF1aMr-R 0.20 - Superscript III RT/Platinum Taq Mix 0.40 RNA Template 1.00 Total 10.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.2 µM primers and 2 unit Taq polymerase PCR master mix: nested PvNV PCR components: PvNV nested Volume(µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC- treated water 1.50 - 2x PCR master mix (fast taq) 12.50 1x 10 µM PvNV246F 0.50 0.2 µM 10 µM PvNV246R 0.50 0.2 µM 1st step PCR Product 10.00 - Total 25.00 - Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.2 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase การเตรียม Primer:  เตรียม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM  ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc.  เตรียม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM  ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) 78

ค่มู ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 PCR Profile: PvNV 339 Cycle No. Temperature Time (56 min.) RT-PCR 1 55C 30 min. 94C 2 min. Denature 94C 15 s Annealing 15 55C 30 s Extension 68C 30 s Final Extension 1 68C 5 min. Holding 15C  Ref. 1cycle of RT- PCR at 55oC 30 min., 94°C 4 min, 40 cycles of 94°C for 15 s, 55°C 30 s, 68°C 30 s, 1 cycle of 68°C 5 min. PCR profile: PvNV246 Cycle No. Temperature Time (46 min.) 5 min. Initial denaturation 1 94C 30 s 30 s Denature 94C 15 s 3 min. Annealing 30 60C  Extension 72C Final Extension 1 72C Holding 15C Ref. 1 cycle 94°C 5 min., 30 cycles of 94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s, 1 cycle of 72°C 7 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel : 339 bp และ 246 bp หรอื 246 bp : 500 bp PvNV +ve Internal control Kathy F. J. Tang*, Carlos R. Pantoja, Rita M. Redman, Donald V. Lightner. 2007. Development of in situ hybridization and RT-PCR assay for the detection of a nodavirus (PvNV) that causes muscle necrosis in Penaeus vannamei. Dis Aquat Org 75: 183–190, 2007 79

คู่มอื การตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสตั ว์น้าสงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือวเี อ็นเอ็น (VNN) ด้วย RT-PCR หลกั การ: วีเอ็นเอ็น (Viral Nervous Necrosis; VNN) หรือ Viral encephalopathy and retinopathy (VER) เป็นโรคติดเชือไวรัสท่ีพบกำรระบำดในปลำทะเลมำกกว่ำ 30 ชนิดทั่วโลก อยู่ในครอบครัวโนดะไวรัส (Family Nodaviridae) เป็น ssRNA virus อวัยวะเป้ำหมำยคือสมองและตำ กำรตรวจเชือชนิดนีจึงต้องสกัด RNA จำก สมองหรือตำมำตรวจสอบ เป็นโรคที่เคยอยู่ในบัญชีรำยช่ือของ OIE แต่ปัจจุบันถูกถอนชื่อออกไป แต่ยังปรำกฎ ข้อมูลอยู่บน website ของ OIE วิธีกำรตรวจที่ใช้เป็นวิธีกำรของ Roongkamnertwongsa et al. (2005) ซ่ึง สำมำรถตรวจเชือ VNN สำยพนั ธ์ุของประเทศไทยไดม้ ำกกวำ่ วิธีกำรทก่ี ำหนดใน OIE การสกดั สารพันธกุ รรม:  อวัยวะท่ีใช้ตรวจ: สมอง (Brain) ตำ (Eye) ไต (Kidney) o สกัด RNA จำกสมอง ตำ ไต ด้วย Trizol Reagent หรอื สำรสกัดอำร์เอน็ เอชนิดอ่นื ๆ การท้า PCR: Sequence (53) Products 5-GGGACAGGAACAGACGGATA-3 Primers: 5-AACAGGCAGCAGGATTTGAC-3 Single step 770 bp 5-CCCATCTACGAGGGCTAT-3 Primer name 5-ATGTCACGCACGATTTCC-3 Internal control 146 bp 5-CTTCACCACCACAGCCGAGA-3 ปลำกะรงั VNN770-F 5-TGCCGATGGTGATGACCTGT-3 VNN770-R Internal control 157 bp ß-actinGr 1F ปลำกระพงขำว ß-actinGr 1R ß-actinSb1F ß-actinSb q1R PCR master mix: PCR components Volume (µl)/reaction Final concentration DEPC-treated water 8.50 - 1X 2X Reaction mix 12.50 0.2 µM 0.2 µM 10 µM Primer VNN770-F 0.50 0.1 µM 0.1 µM 10 µM Primer VNN770-R 0.50 5 µM Primer ß-actin 1F 0.50 5 µM Primer ß-actin 1R 0.50 Superscript III RT/Platinum Taq Mix 1.00 RNA Template 1.00 Total 25.00 Ref: 50 µl reaction mixture, 400 mM dNTP, 2.5 mM MgCl2, 0.6 µM primers 80

คู่มือการตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสขุ ภาพสตั วน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 การเตรียม Primer: - เตรียม Primer จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc. - เตรียม ß-actin 1F/ß-actin 1R Primer: จำกStock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM  50 µL + 50 µL DEPC-treated water = 5 µM ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR profile: VNN770 Cycles No. Temperature Time (105 min.) RT-PCR 1 42C 30 min. 94C 2 min. Denaturation 94C 30 s Annealing 39 55C 30 s Extension 72C 45 s Final Extension 1 72C 5 min. Holding 15C  Ref. 1 cycle of RT- PCR 50oC 30 min., 95oC 15 min., 39 cycles of 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 1 min., 1 cycle of 72°C 10 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel VNN +ve : 770 bp, : 146 internal control (Grouper) : 157 bp internal control (Seabass) Roongkamnertwongsa, S., S. Kanchanakhan, Y. Danayadol and S. Direkbusarakom. 2005. Identification of a betanodavirus isolated from viral nervous necrosis disease in red-spotted grouper (Epinephelus coioides) cultured in Thailand using PCR and sequence analysis. In P. Walker, R. Lester and M.G. Bondad-Reantaso (eds). Diseases in Asian Aquaculture V, pp. 207-216. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila 81

ค่มู อื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สุขภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ Tilapia Lake Virus (TiLV) ด้วย RT-PCR (Eyngor et al. 2014) หลกั การ: เชือ Tilapia lake virus มีสำรพันธุกรรมเป็นอำร์เอ็นเอ (RNA) เชือท่ีเป็น RNA ไม่ สำมำรถเพิ่มปริมำณสำยพันธุกรรมด้วยวิธี PCR โดยตรงได้ เพรำะเป็นสำยเด่ียว จึงต้องเพิ่ม ขันตอนกำรเปล่ียน RNA ให้เป็น complimentary DNA (cDNA) โดยใช้เทคนิค Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) เม่ือเป็นดีเอ็นเอสำยคู่แล้วจึงนำ ตัวอย่ำงเข้ำกระบวนกำร PCR วิธีกำรตรวจวินิจฉัยเชือ TiLV ที่ใช้เป็นวิธี RT-PCR ของ Eyngor et al. (2014) การสกัดสารพันธกุ รรม:  อวัยวะท่ีใช้ตรวจ: สมอง (Brain), ตบั (Liver), ไต (Kidney) o สกัด RNA จำกสมอง ตบั ด้วย Trizol Reagent หรอื สำรสกดั อำรเ์ อ็นเอชนดิ อ่ืนๆ การทา้ PCR: Sequences (53) Product band 5-GTTGGGCACAAGGCATCCTA-3 250 bp Primers: Primer name 5-TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT-3 ME1 7450/150R/ME2 PCR master mix: Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration PCR components: TiLV 9.50 - DEPC-treated water 12.50 1x 2X Reaction mix 0.50 10 µM Primer NM-CLU7-SF1 0.50 0.2 µM 10 µM Primer NM-CLU7-SR1 1.00 0.2 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 1.00 2 Unit RNA Template 25.00 Total - - การเตรียม Primer:  เตรียม 10µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc. 82

คู่มอื การตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สขุ ภาพสัตว์น้าสงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 PCR profile: TiLV Cycle No. Temperature Time TiLV250 1 50C 15 min. 95C 2 min. RT-PCR 35 95C 30 s 1 56C 30 s Denaturation 72C 1 min. Annealing 72C 1 min. Extension 15C Final Extension  Holding การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel TiLV +ve : 250 bp (B) Detection of TiLV by PCR. Total RNA was extracted from brains of TiLVinfected fish (lanes 1 to 7) and a healthy fish (lane 10), as well as from E-11 and primary tilapia brain infected cell cultures (lanes 8 and 9, respectively), and wasused as a template for cDNA generation. A 250-bp fragment was amplified with the ME1 (GTTGGGCACAAGGCATCCTA) and clone 7450/150R/ME2 (TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT) primers. Marina Eyngor, Rachel Zamostiano,b Japhette Esther Kembou Tsofack,b Asaf Berkowitz,a Hillel Bercovier,c Simon Tinman,d Menachem Lev,e Avshalom Hurvitz,f Marco Galeotti,g Eran Bacharach,b Avi Eldara 2014. Identification of a Novel RNA Virus Lethal to Tilapia. Journal of Clinical Microbiology 52 (12): 4137– 4146. Chiraporn Phuyindee, Sasimanas Unajak and Prapansak Srisapoome. 2011. Molecular Characterization and Expression Analysis of a cDNA Encoding Immunoglobulin (Ig) M Heavy Chain Secreted Form of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) .Proceedings of 49th Kasetsart University Annual Conference: Fisheries. 53 pages. 83

ค่มู อื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 (A) Tilapia disease outbreak in a commercial pond results in massive mortality (August 2013) (B) Diseased tilapia demonstrating shrinkage of the eye and loss of ocular functioning (phthisis bulbi). (C) Gross pathology of skin includes multifocal to coalescing dermal erosions and ulcers (arrowheads; courtesy of Nathan Wajsbrut) 84

คมู่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ัยสุขภาพสัตว์น้าสงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ Tilapia Lake Virus (TiLV) ดว้ ย Semi-nested RT-PCR (Dong et al., 2017) หลักการ: เชือ Tilapia lake virus มีสำรพนั ธุกรรมเปน็ อำรเ์ อน็ เอ (RNA) เชอื ที่เป็น RNA ไมส่ ำมำรถเพิ่มปรมิ ำณ สำยพันธุกรรมด้วยวิธี PCR โดยตรงได้ เพรำะเป็นสำยเด่ียว จึงต้องเพิ่มขันตอนกำรเปลี่ยน RNA ให้เป็น complimentary DNA (cDNA) โดยใช้เทคนิค Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT- PCR) เม่ือเป็นดีเอ็นเอสำยคู่แล้วจึงนำตัวอย่ำงเข้ำกระบวนกำร PCR วิธีกำรตรวจวินิจฉัยเชือ TiLV ท่ีใช้เป็นวิธี RT-PCR ของ Dong et al. (2017) การสกดั สารพนั ธกุ รรม:  อวยั วะทใ่ี ช้ตรวจ: สมอง (Brain), ตบั (Liver), ไต (Kidney), เมอื ก (Mucus) o สกดั RNA จำกสมอง ตบั ด้วย Trizol Reagent หรือ สำรสกดั อำร์เอ็นเอชนิดอนื่ ๆ การท้า PCR: Sequences (53) Product band Primers: 5-TATGCAGTACTTTCCCTGCC-3 415 bp Eyngor et al. 2014 5-GTTGGGCACAAGGCATCCTA-3 Tsofack et al. 2016 Primer name 5-TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT-3 5-GTTGGGCACAAGGCATCCTA-3 250 bp Eyngor et al. 2014 Nested ext-1 Tsofack et al. 2016 ME1 7450/150R/ME2 ME1 PCR master mix: RT-PCR PCR components: TiLV Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC-treated water 8.50 - 2X Reaction mix 12.50 1x 10 µM Primer Nested ext-1 1.00 0.4 µM 10 µM Primer ME1 1.00 0.4 µM Superscript III RT/Platinum Taq Mix 0.50 1 Unit RNA Template 1.50 100-400 ng Total 25.00 - Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.6 mM MgSO4, 0.4 µM primers and 1 unit Taq polymerase 85

คมู่ อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: Semi-nested PCR components: TiLV Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DEPC-treated water 8.00 - 2X PCR mix 10.00 1x 10 µM Primer 7450/150R/ME2 0.50 0.25 µM 10 µM Primer ME1 0.50 0.25 µM First step procuct 1.00 - Total 20.00 - Ref: 20 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.25 µM primers and 1 unit Taq polymerase การเตรียม Primer:  เตรียม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดึงไปใช้ 1.00 µl/25 µl reaction = 0.4 µM และ 0.5 µl/20 µl reaction = 0.25 µM final conc.  เตรยี ม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treatedwater = 5 µM ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.1 µM final conc. PCR profile: TiLV-First step Cycle No. Temperature Time (67 min.) RT-PCR 1 50C 30 min. 94C 2 min. Denaturation 94C 30 s Annealing 30 60C 30 s Extension 30 s 72C Final Extension 1 72C 5 min. Holding 15C  Ref. 1 cycle of RT- PCR 50oC 30 min, 94oC 2 min., 25 cycles of 94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s, 1 cycle of 72°C 5 min. TiLV-Nested Cycle No. Temperature Time (42 min.) 2 min. Initial Denature 94C 30 s 30 s Denaturation 94C 30 s Annealing 35 60C 5 min. Extension 72C  Final Extension 1 72C Holding 15C Ref. 94oC 2 min., 25 cycles of 94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s, 1 cycle of 72°C 5 min. 86

ค่มู ือการตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสตั ว์น้าสงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel TiLV +ve : 415 bp first step/ 250 nested Dong H.T., S. Siriroob, W. Meemettab, W. Santimanawong, W. Gangnonngiw, N. Pirarat,P. Khunrae, T. Rattanarojpong, R. Vanichviriyakit, S. Senapin. 2017. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture 476: 111–118. Eyngor, M., Zamostiano, R., Kembou Tsofack, J.E., Berkowitz, A., Bercovier, H., Tinman, S., Lev, M., Hurvitz, A., Galeotti, M., Bacharach, E., Eldar, A., 2014. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. J. Clin. Microbiol. 52, 4137-4146. Tsofack, J.E.K., Zamostiano, R., Watted, S., Berkowitz, A., Rosenbluth, E., Mishra, N., Briese, T., Lipkin, W.I., Kabuusu, R.M., Ferguson, H., Del Pozo, J., Eldar, A., Bacharach, E., 2016. Detection of tilapia lake virus (TiLV) in clinical samples by culturing and nested RTPCR. J. Clin. Microbiol. doi:10.1128/JCM.01808-16. 87

คู่มอื การตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน์ ้า กรมประมง ปี 2561 ภาคผนวก 1 การเตรียมสารเคมี เพื่อเป็นคู่มือในกำรเตรียมสำรเคมีสำหรับงำนทดสอบเชือด้วยเทคนิค PCR ให้ม่ันใจว่ำสำรเคมีที่ใช้ในกำร ทดสอบมีกำรเตรียมท่ีถูกต้อง ไม่ทำให้ผลกำรทดสอบผิดพลำด ใช้สำหรับกำรเตรียมสำรที่ใช้ในงำนทดสอบเชือ ดว้ ยเทคนิคพีซีอำร์ เคร่อื งมอื /อุปกรณ์ 1. เครอื่ งชั่ง 3 ตำแหน่ง 2. หม้อน่ึงฆำ่ เชอื ดว้ ยไอนำ (Autoclave) 3. เครื่องวัด pH 4. ตเู้ ยน็ 5. Micropipette ขนำด 0-10 µl, 0-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl 6. Tip ขนำด 0-10 µl, 0-200 µl และ100 - 1,000 µl (ผ่ำนกำรนึ่งฆำ่ เชอื ด้วยไอนำท่อี ณุ หภูมิ 121°C ควำมดัน 15 ปอนดต์ อ่ ตำรำงนิว 15 นำที และอบใหแ้ ห้งท่ี 80ºC นำน 7- 18 ช่ัวโมง) 7. เคร่อื งแกว้ ได้แก่ ขวดรูปชมพู่ กระบอกตวง สารเคมี 1. 10X TBE Buffer (1.0 M Tris, 0.9 M Boric Acid, 0.01 M EDTA) (Invitrogen 15581-004) หรอื จำกผผู้ ลติ อน่ื ๆ 2. SYBR® Safe DNA Gel Stain “10,000x concentration in DMSO” (Invitrogen S33102) หรือ จำกผูผ้ ลติ อ่ืนๆ 3. NaOH (Sigma, S-5881) หรอื จำกผผู้ ลิตอื่นๆ 4. Ethanol 100% Merck (C2H5OH) หรอื จำกผู้ผลติ อืน่ ๆ 5. Agarose (Molecular Biology Grade) (Vivantis, PC0701) หรอื จำกผู้ผลติ อน่ื ๆ 6. นำกล่ันปลอดเชอื (Distilled water) ผำ่ นกำรนึง่ ฆำ่ เชอื ดว้ ยไอนำ (Autoclave) ทีอ่ ุณหภูมิ 121ºC ควำมดนั 15 ปอนดต์ ่อตำรำงนวิ 15 นำที 88

คู่มือการตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สขุ ภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 วธิ กี ารเตรียมสาร 1. TBE Buffer 1X 1.1 เท 10X TBE Buffer ปริมำตร 100 ml ใส่ในกระบอกตวงท่ีผำ่ นกำรฆำ่ เชือ เจอื จำงด้วยนำกลั่น ปลอดเชือ 900 ml ผสมใหเ้ ขำ้ กนั ปรับปริมำตรใหไ้ ด้ 1000 ml 1.2 ติดขวดสำรเคมดี ว้ ยฉลำกตดิ ขวดสำรเคมี (FWI-Sign) เกบ็ ที่อณุ หภูมหิ ้อง 2. สารละลาย 8 mM NaOH, pH 9 (ปรมิ าตร 1 ลติ ร) 2.1 ชง่ั NaOH 0.32 g ละลำยในนำกล่ันปลอดเชือ 900 ml 2.2 ปรบั pH ใหไ้ ด้ 9 แลว้ เติมนำกล่นั ปลอดเชอื ใหไ้ ดป้ รมิ ำตร 1000 ml 2.3 นำสำรละลำยกรองผ่ำนตวั กรอง 0.45 ไมครอน 2.4 ติดขวดสำรเคมดี ว้ ยฉลำกตดิ ขวดสำรเคมี (FWI-Sign) เกบ็ ท่ี 4oC 3. 1.5 % Agarosegel in 1x TBE buffer, pH8.0 เติม SYBR® Safe DNA Gel Stain 3.1 ชั่ง Agarose 1.5 g ใส่ขวดแกว้ รปู ชมพู่ขนำด 250 ml 3.2 เตมิ 1x TBE buffer, pH 8.0 100 ml ต้มใหเ้ ดอื ดจนละลำยหมด 3.3 เตมิ SYBR® Safe DNA Gel Stain 4 l ผสมใหเ้ ขำ้ กนั 3.4 วำงไวจ้ นกระทั่งอณุ หภมู ิ 50-70 ºC เทใสบ่ ลอ็ กเจล ทงิ ไว้ใหเ้ ย็น 4. Ethanol 75% 4.1 เท absolute ethanol ปรมิ ำตร 750 ml ใส่ในกระบอกตวงทผ่ี ่ำนกำรฆำ่ เชอื เจือจำงดว้ ยนำกลั่น ปลอดเชือปริมำตร 250 ml ผสมใหเ้ ข้ำกนั 4.2 ติดขวดสำรเคมีด้วยฉลำกตดิ ขวดสำรเคมี (FWI-Sign) เก็บท่อี ณุ หภมู หิ อ้ ง 4.3 แบ่งสำรท่ตี ้องกำรใชง้ ำนใสข่ วดดูแรนที่ผำ่ นกำรฆำ่ เชือ ตดิ ขวดสำรเคมดี ้วยฉลำกติดขวดสำรเคมี (FWI-Sign) เก็บที่อุณหภมู ิ 4 oC 89

คูม่ ือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สุขภาพสตั วน์ ้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 ภาคผนวก 2 วธิ กี ารลดปัญหาการปนเป้ือนงานพซี ีอาร์ 1. แบ่งพนื ท่ีกำรทำงำน 1.1 Pre-PCR area - กำรเตรียมสำรเคม,ี อุปกรณ์ - กำรสกดั ตัวอย่ำง - กำรเตรียม PCR cocktail - กำรลงเคร่อื งทำปฏกิ ิรยิ ำ PCR 1.2 Post-PCR area - กำรตรวจสอบผลกำรทดสอบโดยกำร Run electrophoresis gel 2. กำรใชป้ เิ ปตทปิ ทมี่ ีใสก้ รองภำยใน (Aerosol resistant tip/filter tip) 3. กำรแบ่งนำยำลงหลอดเลก็ ๆ (Aliquots) 4. กำรใชต้ ัวควบคุมรว่ มในกำรทำพีซอี ำร์ 1.1 ตัวควบคุมชนดิ บวก (Positive control) ควรเลือกใช้ตัวอยำ่ งทใ่ี ห้ผลบวกออ่ นๆ แตส่ มำ่ เสมอ 1.2 ตัวควบคมุ ชนดิ ลบ (Negative control) - Distilled water - Reagent blank 5. กำรปฏบิ ัตงิ ำนท่ีเข้มงวดและระมัดระวงั 1.1 สวมและเปล่ยี นถุงมือบ่อยๆ 1.2 เปิด-ปดิ หลอดดว้ ยควำมระมดั ระวงั 1.3 เตรียม PCR cocktail สำหรบั ตวั อยำ่ งหลำยๆ ตัวอยำ่ ง 1.4 กำรเช็ดทำควำมสะอำดพืนผวิ พืนท่กี ำรทำงำน 6. กำรตรวจสอบกำรปนเป้ือนของละอองลอย (aerosol) นำหลอด microtube เปลำ่ ทส่ี ะอำดมำเปดิ ฝำตังทิงไวใ้ นบรเิ วณทตี่ อ้ งกำรประมำณ 6 ชั่วโมง จำกนนั จึงเตมิ นำสะอำดจำนวนเลก็ น้อยลงในหลอดและนำนำสว่ นหนง่ึ จำกหลอดมำทำ PCR 90

คมู่ อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 ภาคผนวก 3 เทคนิคปลอดเชือ (Aseptic technique) หมำยถงึ วธิ กี ำรปฏบิ ตั ิเพ่อื ลดควำมเสยี่ งตอ่ กำรติดเชอื ท่ีจะเกิดกบั เคร่อื งมอื เครื่องใช้ และส่ิงแวดล้อม  เทคนิคทำใหป้ ลอดเชือแบง่ ออกเป็น 2 ชนดิ 1. เทคนิคการทา้ ใหส้ ะอาด (Clean technique) หมำยถึงวธิ ีกำรปฏบิ ัตพิ นื ฐำนในกำรลดจำนวนเชือโรคหรือ ป้องกนั กำรแพรก่ ระจำยของเชอื โรคทงั ทำงตรงและทำงอ้อม เช่น กำรล้ำงมือ กำรลำ้ ง กำรเชด็ กำรทำ ควำมสะอำดเคร่อื งมือเครอื่ งใช้ กำรใส่เสอื แลป 2. เทคนิคการทา้ ใหป้ ลอดเชอื (Sterile technique) หมำยถึงวธิ กี ำรปฏิบัตเิ พอื่ ใหเ้ ครอื่ งมอื เครอ่ื งใช้ปลอดเชือ (sterile) หลกี เล่ยี งกำรปนเป้อื น (contamination) เช่น moist heat sterilization (เข้ำ autoclave), เขำ้ ตอู้ บ( hot air oven), กำรกรองด้วย bacterial filter ขนำด 0.22 ไมครอน  กำรทำลำยเชือสำมำรถทำได้หลำยรปู แบบ 1. การใชค้ วามรอ้ น แบ่งเป็น 1.1 ควำมรอ้ นแห้งได้แกก่ ำรเผำ และ กำรอบแหง้ - กำรอบแห้ง (Oven) 2-4 ชม. นำที 160 องศำเซลเซียส 1.2 ควำมรอ้ นชืนคือกำรฆำ่ เชือโดยกำรต้ม กำรนงึ่ - กำรตม้ ด้วยควำมร้อนท่ี 50-60 องศำเซลเซียส 30 นำที สำมำรถฆำ่ เชือไวรสั ไดแ้ ตถ่ ้ำจะ ใหฆ้ ำ่ ไดส้ มบรู ณต้องใช้ Autoclave - กำรนง่ึ ฆำ่ เชอื (Autoclave) ท่เี วลำ และอุณหภมู ติ ำ่ งๆ  3 นำที 134 องศำเซลเซียส  10 นำที 126 องศำเซลเซยี ส  15 นำที 121 องศำเซลเซยี ส  25 นำที 115 องศำเซลเซียส 2. การใช้ความร้อนแสง (ultraviolet) - เชือไวรสั แตล่ ะชนิดจะไวต่อคลน่ื แสง UV ที่ไมเ่ ทำ่ กัน - แสง UV มคี วำมยำวคล่ืนตงั แต่ 100-400 nm แต่หลอด UV ทีใ่ ช้สว่ นใหญค่ วำมยำว คล่ืน 234 nm สำมำรถทำลำยดเี อ็นเอสำยคูแ่ ละสำยยำวไดด้ ีกวำ่ สำยสนั - แสง UV จะฆำ่ เชอื ได้เฉพำะพนื ผิวเท่ำนัน ไมส่ ำมำรถแทรกผำ่ นตวั กลำงที่เปน็ ของแหลว หรอื ของแข็งได้ 3. การใช้สารเคมี มหี ลกั กำรคือละลำยไขมันในเปลือกชนั นอกหรือทำใหโ้ ปรตนี และกรดนิวคลีอิก (สำร พนั ธุกรรม) ของเชือเสยี สภำพ 1.1 สำรฆำ่ เชือ (antiseptic) คอื สำรเคมที ี่ทำลำยหรอื ยับยังกำรเจรญิ ของเชือจุลชพี ทท่ี ำให้ เกิดโรค 91

คูม่ ือการตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 1.2 สำรทำให้ปรำศจำกเชือหรือสำรล้ำงเชือ (disinfectants) เป็นสำรเคมีทใี่ ช้ฆ่ำหรือทำลำย จลุ ชีพ ใชก้ ับสิง่ ไมม่ ชี วี ติ เชน่ พนื หอ้ ง เครื่องมือ เครอ่ื งใช้ 2. กลมุ่ ของสารยับยงั และฆา่ เชอื ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการทดสอบไวรสั 2.1 แอลกอฮอลลท์ ี่นิยมใช้มี 2 ชนิดคือ Ethanol และ Isopropanol - ควำมเขม้ ขน้ 70% เปน็ ระดบั ที่เหมำะสมเนอื่ งจำกมีปรมิ ำณแอลกอฮอลน์ ้อยทีส่ ุดที่จะ ได้ผลดที สี่ ดุ และมปี ริมำณนำท่พี อเหมำะทีจ่ ะทำใหผ้ ิวหนงั เปยี กได้ดี ช่วยให้แอลกอฮอล์ แทรกซมึ กระจำยตวั ไดด้ ีและระเหยช้ำๆ ไมเ่ ป็นอนั ตรำยตอ่ ผวิ หนงั - แอลกอฮอลล์ 70% เป็นไดท้ ังสำรยบั ยงั และฆำ่ เชือ สำมำรถทำลำยแบคทเี รยี แกรมบวกแก รมลบ เชอื รำ และไวรสั บำงชนดิ ท่มี ไี ขมันไดโ้ ดยจะละลำยไขมนั ในเปลือกชนั นอกของไวรัส แตไ่ ม่ทำลำยสปอร์ ไมต่ กคำ้ งบนวสั ดุท่ีใช้ 2.2 ฮาโลเจน ไดแ้ ก่ คลอรนี 0.5-1.0 % สำมำรถทำลำยไวรสั ได้ - ในห้องปฏิบตั กิ ำรส่วนใหญ่ ใช้ Hyter ซึ่งเปน็ Sodium hypochlorite (6% Chlorine w/w) ใช้ 20-100 มล./นำ 1 ลิตร สำมำรถทำลำยแบคทเี รยี แกรมลบ แกรมบวก เชอื รำ ไวรัส 2.3 สารออกซิไดซ์ ไดแ้ ก่ Dettol 99% ประกอบดว้ ย 4.8% ของ สำร Chloroxylenol ซึ่ง ทำลำยเชอื แบคทีเรยี เชือรำ แตไ่ มท่ ำลำยไวรสั ใชส้ ำหรับเชด็ พืนผวิ โตะ๊ ท่ที ำงำน  กำรทำลำยจลุ ินทรียห์ รอื กำรฆำ่ เชอื โรค (Disinfection) มหี ลำยวิธไี ดแ้ ก่ กำรใชส้ ำรเคมี และ กำรใช้วธิ ที ำงกำยภำพ (ใช้ควำมร้อน) กำรกำจดั จุลนิ ทรยี ด์ ้วยสำรเคมีแบง่ ออกเป็น 2 ประเภท  ประเภทแรกเปน็ สำรเคมีทีใ่ ช้กำจัดจลุ ินทรีย์บนพืนผวิ วตั ถุ (Disinfectants) เชน่ พนื ห้อง พนื ผวิ โตะ๊ เครื่องมอื ขวดนมเด็ก หรือเคร่ืองมอื แพทย์ เดทตอลจดั เปน็ Disinfectants มีสำรทเ่ี ป็นตัว กำจัดจลุ ินทรยี ์ ชอื่ วำ่ \"Paracchlorometacresol เป็นสำรเคมที มี่ ีคลอรนี เป็นองค์ประกอบ โดย ละลำยในนำมนั สน \"pine oil\" และนำ  ประเภทที่สองเปน็ สำรเคมีกำจดั จุลนิ ทรีย์ทอ่ี ยู่บนผวิ หนงั และสว่ นต่ำงๆของร่ำงกำย (Antiseptics) เช่น แอลกอฮอลเ์ ช็ดแผล นำเกลอื ล้ำงแผล ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซดท์ ่ีใช้ล้ำง บำดแผล เปน็ ตน้  ระดับควำมรุนแรงของกำรฆ่ำเชือมี 3 ระดบั  ระดับที่ 1 กำรทำลำยเชือระดับสูง นำยำฆ่ำเชือระดับสูงมีช่ือเรียกเฉพำะว่ำ \"Chemosterilant ใช้ฆ่ำเชือเคร่ืองมือแพทย์ท่ีเข้ำสู่ร่ำงกำย ที่รู้จักกันดีได้แก่ คลอรีนไดออกไซด์ ไฮโดรเจนเปอร์ ออกไซด์ เปอร์อะซิติกเอซิด และ กลูตำรัลดีไฮด์ ซ่ึงทำง The U.S. Environmental Protection Agency หรือชื่อย่อว่ำ EPA ซึ่งเป็นหน่วยงำนท่ีดูแลด้ำนสิ่งแวดล้อมของ 92

คูม่ อื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ ้า กรมประมง ปี 2561 สหรฐั อเมรกิ ำ ไดย้ อมรับว่ำนำยำเคมเี หล่ำนีเปน็ ทังนำยำที่ทำให้ปรำศจำกเชอื (คือทำใหเ้ ชอื ตำย หมด) และเป็นนำยำทำลำยเชือ (คอื ทำให้เชอื บำงสว่ นตำย)  ระดับท่ี 2 กำรทำลำยเชือระดบั กลำง ได้แก่ แอลกอฮอล์เข้มข้นร้อยละ 60-90 ซึ่งอำจจะเป็น เอทำนอลหรือไอโซโพรพำนอลก็ได้ นอกจำกนีมีสำรที่มีคลอรีนเป็นองค์ประกอบ (เช่น เดท ตอล) พวกทม่ี ีฟนี อลเปน็ องค์ประกอบหรือพวก ไอโดฟอร์ (idophor) นำยำฆ่ำเชือระดับกลำงนี แม้ว่ำจะมีประสิทธิภำพในกำรทำลำยเชือไวรัสได้กว้ำงขวำง รวดเร็ว แต่ก็ยังไม่สำมำรถทำลำย เชือไวรัสไดท้ กุ ชนิด  ระดับที่ 3 กำรทำลำยเชือระดับต่ำ เป็นกำรทำลำยจุลินทรีย์ประเภทแบคทีเรีย ไวรัส และรำ บำงชนิด แต่ไม่สำมำรถทำลำยจุลินทรีย์ท่ีมีควำมคงทนอย่ำงพวก tubercle bacilli หรือพวก สปอร์ของแบคทีเรียได้ นำยำฆ่ำเชือในกลุ่มนีได่แก่ สำรประกอบควอเทอนำรี แอมโมเนียม (quaternary ammonium compound) สำรเคมีกลุ่มนีใช้ท่ัวไปในนำยำทำควำมสะอำด หลำย ประเภท (ถ้ำสังเกตฉลำกผลิตภัณฑ์ชักล้ำงจะพบว่ำมีส่วนผสมของสำรตัวนี) นอกจำกนีก็มีพวก ไอโดฟอร์ พวกสำรประกอบฟีนอล ซ่ึงสองตัวนีเป็นทังสำรเคมีท่ีอยู่ในประเภทกำรทำลำย ระดับกลำงและระดับต่ำ ซ่ึงกำรแสดงฤทธิ์กำรทำลำยจะอยู่ในระดับใดนันขึนอยู่กับควำมเข้มข้น ที่ใช้ 93

คู่มือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสขุ ภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 ภาคผนวก 4 การล้างอปุ กรณ์ส้าหรบั งาน PCR  RNASE เป็นเอนไซม์ทที่ ำให้ RNA เสยี สภำพ DNASE เป็นเอนไซมท์ ีท่ ำให้ DNA เสียสภำพ  กำรทำงำนกับ RNA และ DNA จงึ ตอ้ งมีวิธกี ำรล้ำงอุปกรณ์เพอื่ กำจดั และลดกำรปนเป้อื นของ RNASE และ DNASE  นำ (DEPC treated water) มี 2 รูปแบบ o แบบสำเร็จรูป พรอ้ มใชง้ ำน o เตรียมเองโดย Treated นำกลั่นด้วยสำร DEPC (Diethyl pyrocarbonate) solution 0.1% นำน 2 ชั่งโมง  Autoclave 121oC 15 นำที เพื่อหยดุ กำรทำงำนของ DEPC  DEPC (Diethyl pyrocarbonate) มี 2 รูปแบบ ผง (Powder) และ สำรละลำย (Solution)  วิธีกำรกำจดั RNASE และ DNASE จำกอปุ กรณ์ (Utensils) o ลำ้ งด้วยนำยำล้ำงอุปกรณ์ ล้ำงดว้ ยนำกลั่น แชใ่ น 0.1% DEPC 2 ช่ัวโมง  Autoclave 121oC 15 นำที เพื่อหยดุ กำรทำงำนของ DEPC อบแห้ง 94

คูม่ ือการตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 ภาคผนวก 5 ปญั หาการรันเจล ปญั หา สาเหตุ การแก้ไข ไม่ปรากฏแบน DNA DNA วงิ่ เลยแผน่ เจล รันเจลใหม่ ใหส้ งั เกตสขี อง loading dye หรือ แบนไมช่ ัด ในกำรรัน สีฟำ้ 2/3 สีแดง 4/5 (Low intensity of all ปรมิ ำณตัวอยำ่ งทโี่ หลดนอ้ ยเกนิ ไป เพ่มิ ปริมำณตวั อยำ่ งทโี่ หลด or some of the ปัญหำจำกสยี อ้ ม DNA bands) 1. ใช้ตำม protocol แถบ DNA กระจำยในเจล 2. เพม่ิ ระยะเวลำในกำรยอ้ ม 1. หลีกเลี่ยงกำรรันเจลหรือยอ้ มสที ่ีนำน เกนิ ไป 2. หลกี เลีย่ งกำรทงิ เจลไวน้ ำนกอ่ นกำร ถ่ำยภำพ แบนหรอื สายดีเอน็ เอ ปริมำณตัวอยำ่ งท่โี หลดมำกเกนิ ไป ลดปรมิ ำณตวั อย่ำง เป็นแถบหนา (Smeared DNA จำนวนรอบ PCR มำกเกนิ ไป ลดจำนวนรอบ PCR bands) ควำมเขม้ ขน้ เกลอื สงู เกินไป - ตวั อย่ำง DNA 1. ตกตะกอนและล้ำง DNA ด้วย ethanol - PCR product เพอ่ื ลดปรมิ ำณเกลอื 2. - ปรับ Mg ใหเ้ หมำะสม - Vortexl สำรกอ่ นใชง้ ำน DNA เสยี สภำพจำก nuclease 1. ใช้ buffer ใหม่ในกำรรันเจล 2. ใช้เจลท่ีเตรียมใหม่ 3. ใช้หลอดและอปุ กกรณท์ ส่ี ะอำดในกำรรนั เจล กำรปนเปื้อน RNA 1. วดั ควำมบรสิ ทุ ธ์ขิ องตวั อยำ่ ง 2. ใช้เอนไซม์ในกำรกำจัด RNA เจลมปี ัญหำ 1. ใชเ้ จลที่แขง็ ตวั ดี 2. วำงหวใี หต้ รงในขันตอนกำรเตรียมเจล สภำวะกำรรนั เจลไม่เหมำะสม 1. ใช้ buffer ที่เตรียมใหม่ 2. ใช้ buffer ชนดิ เดยี วกันในกำรเตรยี มเจล และรนั เจล 3. ใช้ buffer ปริมำณมำกพอให้เจลทังแผ่น จมอยใู่ ต้ buffer 4. ไม่ใช้ Voltage สูงเน่ืองจำกทำให้ DNA Denature 95

คูม่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตว์น้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 ปญั หา สาเหตุ การแก้ไข แบนผดิ ปกติ DNA เสียสภำพจำกกำรใช้ ปรบั ลดกระแสไฟท่ีใช้ในกำรรนั เจล (Atypical banding กระแสไฟในกำรรนั pattern) เจลสงู เกนิ ไป เกิดแบนผิดปกติ สภำวะกำรรันเจลไม่เหมำะสม แบนแยกไม่ชดั เจน - Voltage /Time สูงเกนิ ไป - Voltage /Time ตำ่ เกนิ ไป Buffer ไม่เหมำะสม 1. TAE เหมำะกับตย. ท่ีมีขนำดใหญ่กว่ำ 1500 bp ควำมเขม้ ข้นเกลอื ในตัวอยำ่ งสงู เกนิ ไป 2. TBE เหมำะกับตย. ที่มีขนำดเล็กกว่ำ 1500 bp ตกตะกอนและล้ำง DNA ด้วย ethanol เพอื่ ลดปริมำณเกลือ แบนโค้ง (แบนยมิ ) ปริมำณ Buffer น้อย เจลไมจ่ มใต้ เพม่ิ ปริมำณ buffer Curved DNA bands buffer ตวั อยำ่ งทโี่ หลดน้อยเกนิ ไป 1. เพ่มิ ปริมำณตัวอยำ่ งที่โหลดใหไ้ ด้ 1/3 DNA ค้างบนหลมุ เจล ของหลมุ เจล (DNA remains in สภำวะกำรรันเจลไม่เหมำะสม แผน่ เจลมีฟองอำกำศหรอื ส่งิ 2. เจอื จำงตัวอยำ่ งดว้ ย 1x loading dye the gel) สกปรกในเนือเจล ใช้ voltage ตำ่ ๆ หลำยๆ นำที ในช่วงแรก ของกำรรนั เจล ตวั อย่ำง DNA ปนเปื้อน -ใช้นำและอุปกรณเ์ ตรยี มเจลทสี่ ะอำด -เทเจลช้ำๆ เพอื่ ไมใ่ หเ้ กิดฟองอำกำศ กำรละลำยของเจลไมด่ ี -ใช้ pipette tip ทำลำยฟองอำกำศก่อนเจ ลแขง็ ตัว โหลด DNA มำกเกนิ ไป 1. DNA ทรี่ ันต้องไมต่ กตะกอน 2. เพม่ิ ขนั ตอนกำรลำ้ ง DNA (75% ethanol) เพอ่ื ลดกำรปนเป้อื น 1. เอำหวอี อกหลงั จำกเจลแข็งตวั ดีแล้ว 2. เติม buffer เพือ่ เลยี งหลุมเจลหลงั แขง็ ตัว โหลดตัวอยำ่ งในปรมิ ำณใกลเ้ คยี งกบั ladder 96

ค่มู อื การตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 ภาคผนวก 6 ตัวอยา่ งแบบบนั ทึกการแปลผลการทดสอบ หน้า …..../….... แบบบนั ทกึ การแปลผลการทดสอบเชื้อ Enterocytozoon hepatopanaei (EHP) ด้วยเทคนคิ PCR ว/ด/ป ท่ีรับตวั อยา่ ง.....29.../11/60................................................ ว/ด/ป ทีท่ ดสอบ…1./12/60..................................... ว/ด/ป ท่ีแปลผลการทดสอบ....1../12/60...................................... ว/ด/ป ทีส่ ง่ ผลทดสอบ…1/12/60.......................................... ข้อมูลการทดสอบ วตั ถปุ ระสงค์ วธิ ีการ สารเคมี ผู้ผลิต lot no. Expired date สกดั สารพนั ธกุ รรม Auto extraction TACO extraction kit TACO 80816 2018-08 ทาปฏิกริ ิยา PCR nested PCR GelTrack PCR Supermix Quanta 21552 07/20 ตรวจสอบผล PCR Gel electroPhoresis 1.5% agarose gel Vivantis A7030-17 January 2021 1x TBE buffer Invitrogen 1806106 2018-06 การเพม่ิ ปริมาณสารพนั ธกุ รรม ย่ีหอ้ …………………………………………………………………… รุ่น........................................................................ ผลการทดสอบ: ภาพเจลหมายเลข 7071 ลา้ ดับท่ี หมายเลขบน รหสั ตัวอยา่ ง รายละเอยี ดตัวอยา่ ง ผลการทดสอบ (+ve/-ve) ภาพเจล น้ากลนั่ ฆ่าเช้ือ 514 bp 148 bp 401 bp P+ (NJ250) 1M Rb 2 N Negative control -ve -ve -ve ลกู กงุ้ ขาว +ve +ve +ve 3 P Positive control ลกู กงุ้ ขาว -ve -ve -ve ลกู กงุ้ ขาว -ve -ve +ve 4 Rb Reagent blank ลกู กงุ้ ขาว -ve -ve +ve ลกู กงุ้ ขาว +ve +ve +ve 5 1 P.101.365.12.60 ลกู กงุ้ ขาว +ve +ve +ve ลกู กงุ้ กลุ าดา +ve +ve +ve 6 2 P.101.366.12.60 ลกู กงุ้ กลุ าดา +ve +ve +ve ลกู กงุ้ กลุ าดา -ve -ve +ve 7 3 P.102.367.12.60 ลกู กงุ้ กลุ าดา -ve -ve +ve ลกู กงุ้ ขาว -ve -ve +ve 8 4 P.102.368.12.60 ลกู กงุ้ ขาว -ve -ve +ve ลกู กงุ้ ขาว -ve -ve +ve 9 5 P.102.369.12.60 ลกู กงุ้ ขาว -ve -ve +ve ลกู กงุ้ กลุ าดา -ve -ve +ve 10 6 P.102.370.12.60 ลกู กงุ้ กลุ าดา -ve -ve +ve -ve -ve +ve 11 7 P.103.371.12.60 +ve +ve +ve 12 8 P.103.372.12.60 13 9 P.103.373.12.60 14 10 P.103.374.12.60 15 11 P.104.375.12.60 16 12 P.104.376.12.60 17 13 P.104.377.12.60 18 14 P.104.378.12.60 19 15 P.105.379.12.60 20 16 P.105.380.12.60 หมายเหตุ M= Marker, N=Negative control, P= Positive control, Rb = Blank, dup=duplicate, -ve = ไมพ่ บเช้ือ, +ve = พบเช้ือ 97